Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Podsumowanie

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Streszczenie

Obecnie powszechnie uznaje się, że modyfikacje potranslacyjne (PTM) odgrywają integralną rolę w regulacji struktury i funkcji białka, co może być niezbędne dla roli danego białka zarówno fizjologicznie, jak i patologicznie. Wzbogacenie PTM jest często konieczne podczas badania statusu PTM białka docelowego, ponieważ PTM są często przejściowe i mają stosunkowo niską liczebność. Podczas wzbogacania o PTM białka docelowego napotyka się wiele pułapek, takich jak niezgodność buforu, przeciwciało białka docelowego nie jest kompatybilne z IP, utrata sygnału PTM i inne. Stopień trudności jest zwiększany podczas badania wielu PTM, takich jak acetylacja, ubikwitynacja, SUMOylacja 2/3 i fosforylacja tyrozyny dla danego białka docelowego. Badanie kombinacji tych PTM może być konieczne, ponieważ przesłuchy między PTM są powszechne i mają kluczowe znaczenie dla regulacji białek. Często te PTM są badane w różnych do lizy i z unikalnymi składami inhibitorów. Aby uprościć ten proces, opracowano unikalny system lizy denaturującej, który skutecznie izoluje i konserwuje te cztery PTM; Umożliwiając w ten sposób badanie potencjalnych przesłuchów w pojedynczym systemie lizy. Unikalny system filtrów został opracowany w celu usunięcia z lizatu zanieczyszczającego genomowego DNA, który jest problematycznym produktem ubocznym denaturacji. Solidne matryce powinowactwa ukierunkowane na każdy z czterech PTM zostały opracowane we współpracy z systemem buforowym, aby zmaksymalizować wzbogacenie i wykrywanie stanów endogennych tych czterech PTM. Ten kompleksowy zestaw narzędzi do wykrywania PTM usprawnia proces uzyskiwania krytycznych informacji o tym, czy białko jest modyfikowane przez jeden lub więcej z tych PTM.

Wprowadzenie

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) to wysoce regulowane zmiany w białku, w wyniku których modyfikacja jest dodawana lub usuwana w określony sposób. PTM są często dynamicznymi, przejściowymi zmianami, które znacząco zmieniają strukturę białka, interakcje z białkami partnerskimi i lokalizację przestrzenną, a ostatecznie umożliwiają białku pełnienie różnych funkcji1^,2,3,4. PTM są tak obfite, że zwiększają liczbę unikalnych form białek (lub proteoform) z około 30 000 produktów genów do ponad miliona proteoform^5,6. Identyfikacja PTM i określenie ich wpływu na białko docelowe ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologicznych i patologicznych funkcji białka^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Prace nad wybranymi białkami, takimi jak tubulina, p53 i receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), wyjaśniły regulacyjne role PTMs^15,16,17. Badania te ujawniły fakt, że regulacja tych białek zachodzi przez wiele PTM, a w wielu przypadkach modyfikacje te działają wspólnie, aby promować określoną funkcję. Nowe badania wykazały, że zarówno kooperacyjny, jak i ujemny przesłuch PTM może wystąpić na kilku różnych białkach^{18,19,20,21,22,23,24,25}. Jednak profile PTM większości białek są zbudowane na podstawie kilku badań, w których wykorzystano różne modele i unikalne warunki. Posiadanie zoptymalizowanego systemu do badania wielu PTM w jednym systemie byłoby bardzo korzystne dla uzyskania wglądu w potencjalne przesłuchy PTM dla docelowego białka.

Jednym z wyzwań związanych z badaniem PTM w jednym systemie jest to, że konkretne PTM są badane przy użyciu odrębnych lizy. Na przykład, wykorzystanie takich jak RIPA lub NP-40, które są powszechnie używane do badań fosforylacji lub ubikwitynacji, może być niewystarczające do badania labilnego PTM, takiego jak mały modyfikator podobny do ubikwityny (SUMO)ylation²⁶. Ponadto niedenaturujące są nieodpowiednie do dysocjacji interakcji białkowych i mogą prowadzić do fałszywie dodatniej identyfikacji PTM²⁷. Preferowane może być badanie PTM w denaturującym buforze do lizy, ponieważ jest on znacznie lepszy w izolowaniu białek ze wszystkich przedziałów komórkowych²⁸, zdysocjuje większość interakcji białkowych i zahamuje proteazy, które zmieniają stany PTM, takie jak deSUMOylazy ²⁶; Jednak denaturacja może zagrozić integralności określonych odczynników powinowactwa, takich jak ubikwityna wiążąca narzędzia oparte na domenie²⁷. Opracowanie systemu lizy podobnego do denaturacji w celu badania wielu PTM białka w systemie kompatybilnym z odczynnikiem powinowactwa byłoby bardzo korzystne dla badań przesłuchów PTM.

Chociaż denaturujące mają kluczowe zalety w porównaniu z niedenaturującymi do badania PTM, są one rzadziej używane ze względu na ich istotne wady, takie jak niekompatybilność z konwencjonalnymi testami białkowymi, znaczne zanieczyszczenie genomowym kwasem dezoksyrybonukleinowym (DNA) i zakłócenie działania odczynników immunoprecypitacyjnych (IP)²⁹. Te wady mogą skutkować wydłużonym czasem przygotowania i potencjalnym uszkodzeniem docelowych białek podczas ścinania genomowego DNA. Dwie powszechnie stosowane metody cięcia DNA to liza strzykawką i sonikacja²⁹. Obie metody wymagają rozległej optymalizacji i często brakuje im precyzyjnej odtwarzalności. Alternatywne metody usuwania genomowego DNA obejmują dodawanie DNAz; Może to jednak wymagać dodatkowej optymalizacji i zmian w składzie bufora. Ostatecznie prosta i powtarzalna metoda usuwania zanieczyszczenia genomowego DNA byłaby korzystna podczas pracy z denaturującymi lizy do badań PTM.

Celem tej techniki jest opracowanie systemu do izolowania i badania ubikwitynacji (Ub), fosforylacji tyrozyny (pY), SUMOylacji 2/3 (SUMO 2/3) i acetylacji (Ac) PTM w jednym systemie, aby lepiej badać przesłuchy PTM dla docelowego białka. Ten system wykrywania PTM został wykorzystany do szybkiego zbadania endogennego profilu PTM kilku docelowych białek w jednym systemie. Zidentyfikowano nowy wgląd w potencjalne przesłuchy^30,31. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj technika ulepsza istniejące metody badania PTM i przesłuchów PTM na trzy różne sposoby: 1) opracowano unikalny bufor denaturujący, który izoluje białka ze wszystkich przedziałów komórkowych, a jednocześnie jest kompatybilny z odczynnikami powinowactwa PTM, 2) opracowano unikalny system filtrów, który szybko usuwa zanieczyszczenie genomowego DNA z denaturowanych lizatów z wysoką odtwarzalnością i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, oraz 3) Solidne kulki powinowactwa, system lizy i odczynniki hamujące są kompatybilne; w ten sposób upraszcza izolację tych czterech PTM dla białka docelowego, aby zmaksymalizować wzbogacenie PTM i skutecznie badać potencjalne przesłuchy.

Protokół

1. Przygotowanie próbki: Hodowla komórkowa

1. Wyhoduj cztery 150-milimetrowe płytki komórek A431 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.
   1. Zwiększ liczbę komórek A431 do 50% konfluencji.
   2. Surowica ogranicza cztery płytki komórek A431 za pomocą DMEM bez surowicy przez 24 godziny.
   3. Dwie płytki komórek A431 należy traktować 33,3 mg/ml naskórkowego czynnika wzrostu przez 1 godzinę. Pozostałe dwie płytki należy pozostawić nieleczone.
      UWAGA: Przedstawione tutaj warunki wzrostu komórek i leczenia stanowią przykład; Jednak metodologia ta ma zastosowanie do wielu różnych typów komórek i warunków leczenia.
2. Przygotować do wybuchu i rozcieńczania z inhibitorami (Tabela 1). Połącz 2,895 ml buforu do lizy blastR z 15 μl inhibitora fosfatazy tyrozynowej, 30 μl inhibitora deubikwitynazy i deSUMOylazy, 30 μl inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) i 30 μl koktajlu inhibitorów proteazy.
   1. Połączyć 9,65 ml buforu rozcieńczającego blastR z 50 μl inhibitora fosfatazy tyrozynowej, 100 μl inhibitora deubikwitynazy i desumo-ylazy, 100 μl inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) i 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy.
      UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby uzyskać informacje o składzie buforu i inhibitorze.
3. Odlej pożywkę hodowlaną i umieść komórki na lodzie. Następnie przemyj komórki dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
   1. Usuń jak najwięcej PBS przed dodaniem buforu do lizy blastR, aby zmaksymalizować lizę komórek.
      UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.
4. Dodać 600 μl buforu do lizy blastR na każdą płytkę o średnicy 150 mm. Wielkość bufora opiera się na oczekiwanym uzysku białka (tabela 2).
   1. Zlikwiduj komórki za pomocą skrobaka do komórek. Lisat stanie się lepki z powodu lizy jądrowej.
5. Użyj odciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść surowy lizat do filtra blastR, który został umieszczony w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml (Rysunek 1). W tym przypadku używana jest probówka sokoła o pojemności 15 ml.
6. Użyj dostarczonego tłoka filtra, aby całkowicie skompresować filtr blastR i zebrać przepływ lizatu, w tym wszelkie pęcherzyki, w probówce o pojemności 15 ml (Rysunek 1).
7. Opcjonalnie: Przenieść oczyszczony lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować lizat przy stężeniu około 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
   1. Przenieść supernatant do nowej probówki Falcon o pojemności 15 ml.
8. Rozcieńczyć sklarowany lizat buforem rozcieńczającym do strzału R do końcowej objętości 3 ml na każdą płytkę o średnicy 150 mm. Ostateczna objętość opiera się na oczekiwanej wydajności białka (tabela 2).
   UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ ostateczny skład buforu będzie miał wpływ na rygorystyczność reakcji IP.
9. Określić ilościowo stężenie białka (sekcja 2).

2. Test ilościowy białka

UWAGA: Użyj standardowego kolorymetrycznego testu ilościowego białka, aby określić ilościowość białka. W tym przypadku oznaczanie ilościowe białka jest oznaczane za pomocą precyzyjnego zaawansowanego testu białek czerwonych.

1. Dodaj 1 ml precyzyjnego czerwonego zaawansowanego odczynnika do oznaczania białek do każdej z dwóch kuwet o pojemności 1 ml.
2. Wymieszać 10 μl buforu do lizy blastR i 40 μl buforu rozcieńczającego blastR w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
   UWAGA: Zostanie to wykorzystane do odczytu ślepej próbki białka.
3. Dodać 20 μl mieszaniny buforowej do lizy/rozcieńczania (z kroku 2.2) do pierwszej kuwety i wymieszać, odwracając dwa do trzech razy.
4. Dodać 20 μl rozcieńczonego lizatu komórkowego (z eksperymentu) do drugiej kuwety, mieszając jak wyżej.
5. Próbki inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
6. Ślepa próba spektrofotometru z próbką mieszaniny buforu do lizy/rozcieńczania (od etapu 2.3).
7. Zmierzyć absorbancję próbki lizatu (od etapu 2.4) przy długości fali 600 nm.
8. Oznaczyć stężenie białka lizatu w następujący sposób;
   odczyt próbki OD₆₀₀ x 5 = stężenie białka w mg/ml
   UWAGA: Odczyty OD poniżej 0,05 lub powyżej 0,5 są zbliżone do pojemności zakresu liniowego testu białka. W przypadku odczytów >0,5 próbki można rozcieńczyć. W przypadku odczytów <0,05 można dodać więcej lizatu do precyzyjnego czerwonego zaawansowanego odczynnika do oznaczania białek (do 50 μl). W tabeli 3 przedstawiono mnożniki służące do przeliczania odczytów spektrofotometru na stężenie białka lizatu mg/mL. Jeśli na jednej płytce nie ma wystarczającej ilości białka, zaleca się użycie 2 lub więcej płytek na IP. W takim przypadku płytki będą zbierane szeregowo, przenosząc oryginalne 300 μl buforu do lizy między płytkami.
9. Na podstawie stężenia białka rozcieńczyć próbkę mieszanką buforową (1 część lizy blastR: 4 części rozcieńczenia blastR) do pożądanego stężenia końcowego (zwykle 1 mg/ml).
10. Zamroź zatrzaskowo porcje próbek, które nie zostaną natychmiast wykorzystane.
    1. Próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C.
    2. Przejdź do sekcji 3.

3. Test immunoprecypitacji (IP)

UWAGA: Stężenia kulek powinowactwa, stężenia lizatu i czasy inkubacji są zalecanymi wytycznymi i mogą być unikalne dla każdego białka docelowego i konkretnego PTM, który jest badany.

1. Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi koraliki powinowactwa Ub, koraliki powinowactwa pY, koraliki powinowactwa SUMO 2/3 i koraliki powinowactwa Ac, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce.
2. Dla każdego testu IP, podwielokrotną zawiesinę kulek do oddzielnych 1,5 ml probówek mikrowirówek na lodzie (probówka IP). Tutaj dodaj 20 μl kulek powinowactwa do ubikwityny, 30 μl kulek powinowactwa fosfotyrozyny, 40 μl kulek powinowactwa SUMOylation 2/3 lub 50 μl kulek powinowactwa do acetylacji do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
   UWAGA: Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z zalecaną objętością zawiesiny stopki do użycia dla każdego koralika o powinowactwie.
3. Kilkakrotnie odwróć probówki z odczynnikami zawierającymi kulki kontrolne ubikwitynacji IP i kulki kontrolne IgG, aby upewnić się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w probówce.
4. Podwielokrotne kulki kontrolne na reakcję kontrolną w celu określenia niespecyficznego wiązania (probówka kontrolna IP). W tym przypadku dodaj 20 μl kulek kontrolnych Ub, 30 μl kulek kontrolnych pY, 40 μl kulek kontrolnych SUMO 2/3 lub 50 μl kulek kontrolnych Ac do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
   UWAGA: Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z zalecaną objętością zawiesiny stopki do użycia dla każdego rodzaju stopki powinowactwa.
5. Zaoszczędź niewielką ilość lizatu (20 μl), aby działała jako kontrola lizatu wejściowego Western Blot. Dodać 5 μl buforu do 5 próbek i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min.
   UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.
6. Dodaj lizat do każdej lampy IP i kontroluj lampę IP. W tym przypadku użyto 1 mg lizatu na IP i reakcję kontrolną, co dało w sumie 8 reakcji IP.
   UWAGA: Jako punkt wyjścia zaleca się 1,0 mg lizatu na test. Wymagana ilość lizatu będzie się różnić w zależności od obfitości zmodyfikowanego białka docelowego.
7. Inkubować probówki na platformie obrotowej w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. W tym przypadku zastosowano rotator rurowy ATR przy prędkości 22.
8. Zbierać kulki przez odwirowanie w temperaturze 3.000 - 5.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
9. Odessać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.
10. Płukać kulki w 1 ml buforze do płukania blastR (na tym etapie inhibitory nie są konieczne) przez 5 minut na platformie obrotowej o temperaturze 4 °C.
11. Zbierać kulki przez odwirowanie w temperaturze 3.000 - 5.000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
12. Odessać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.
13. Powtórz krok prania (kroki 3.10 - 3.12) jeszcze dwa razy.
14. Po ostatnim myciu całkowicie usunąć supernatant buforowy. Dopuszczalne jest minimalne rozerwanie granulki kulki (do 5% straty). Usunąć resztki supernatantu za pomocą końcówki ładującej białko o drobnym otworze.
15. Dodać 30 μl buforu elucyjnego do elucji perełkowej i ponownie zawiesić kulki, delikatnie stukając/przesuwając bok probówki. Na tym etapie NIE WOLNO używać pipety.
    UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.
16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
17. Delikatnie przenieś zawiesinę każdej kulki do 1,5 ml kolumny wirowej mikrowirówki, która została umieszczona w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Zaleca się odcięcie końcówki pipety transferowej w celu delikatniejszego przenoszenia.
18. Wirować przy 9 000 - 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu pobrania próbki IP.
19. Dodać 2 μl 2-merkaptoetanolu do każdej próbki i dobrze wymieszać.
    UWAGA: Wygodnie jest zdjąć pokrywkę z kolumny wirującej i użyć jej do zakręcenia probówki zbiorczej do dalszego przetwarzania.
20. Umieścić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze suchej masy.
21. W razie potrzeby przechowywać próbki w temperaturze -70 °C i zatrzymać się w tym miejscu lub przejść do przeprowadzania SDS-PAGE, transferu i analizy western blot (sekcja 4).

4. Analiza Western Blot: Identyfikacja białka będącego przedmiotem zainteresowania

1. Oddzielić próbki za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i przenieść do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF), zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi³².
2. Użyj przeciwciała pierwszorzędowego, aby wykryć zmodyfikowane potranslacyjnie wersje białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku przeciwciało PD-L1 zastosowano do wykrywania zmodyfikowanego potranslacyjnie PD-L1.
3. Do wykrywania użyj ultraczułego odczynnika do wykrywania chemiluminescencji.
   UWAGA: Odczynnik chemiluminescencyjny powinien być stosowany w połączeniu z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP, zdolnym do wykrywania przeciwciała pierwszorzędowego.
4. Użyć objętości 2 ml odczynnika chemiluminescencyjnego na membranę transferową wielkości miniżelu (około 8 x 7 cm).
   1. Po inkubacji z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (zalecane 60 minut w temperaturze pokojowej) przemyć blot 6 x 10 min w 30 ml soli fizjologicznej z tris-bufferem tween-20 (TBST).
      UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem buforu.
   2. Bezpośrednio przed użyciem zmieszać 1 ml odczynnika chemiluminescencyjnego A z 1 ml odczynnika chemiluminescencyjnego B (wystarczy na jedną membranę o wymiarach 8 cm x 7 cm).
   3. Dodać odczynnik chemiluminescencyjny do membrany i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej przez 1 - 5 minut przed wizualizacją sygnału białkowego za pomocą kliszy rentgenowskiej lub obrazowania kamery CCD (Charge-coupled Device).
      UWAGA: Krótsze czasy inkubacji w odczynniku chemiluminescencyjnym mogą być konieczne w przypadku białek o dużej obfitości.

Wyniki

Zdolność tych narzędzi do badania przesłuchów PTM poprzez skuteczne wykrywanie tych 4 PTM jest częściowo zależna od unikalnego systemu do lizy. Bufor denaturujący blastR skutecznie izoluje białka ze wszystkich przedziałów komórkowych, podobnie jak inne denaturujące, co zapewnia pełny profil białkowy (Rysunek 2A). Dodatkowo zachowuje wysoce labilne sygnały PTM, takie jak SUMO 2/3, które są szybko zmniejszane w niedenaturujących, takich jak test radioimmunoprecypitacyjny (RIPA) (Rysunek 2B). Co ważne, po odpowiednim rozcieńczeniu nie wpływa na integralność odczynników powinowactwa, jak inne denaturujące (np. Bufor Laemmli).

Istotną przeszkodą podczas pracy z denaturującymi jest możliwość skutecznego usuwania zanieczyszczeń genomowego DNA. Konwencjonalną metodologią zmniejszania lepkości jest ścinanie DNA za pomocą igły strzykawkowej lub sonikacji próbki. Rysunek 3A pokazuje zanieczyszczenie genomowego DNA w lizacie komórkowym A431 po leczeniu filtrem BlastR, igłą strzykawki lub sonikacją. Następuje prawie całkowite usunięcie genomowego DNA za pomocą filtra BlastR, co nie ma miejsca w przypadku konwencjonalnej igły strzykawkowej lub sonikacji. Zanieczyszczenie genomowego DNA znacząco wpływa na migrację białek poprzez żel akryloamidowy SDS; jednak leczenie filtrem BlastR usuwa genomowe DNA, co skutkuje prawidłową migracją białka (Figura 3B). Zmieniona migracja spowodowana zanieczyszczeniem genomowego DNA może znacząco wpłynąć na interpretację zachodnich plam; na przykład rozmazany wzór EGFR widoczny w niefiltrowanym lizacie może być niedokładnie interpretowany jako zwiększona ekspresja w stosunku do przefiltrowanej próbki (Rysunek 3C).

Korzystając z tego zoptymalizowanego systemu wzbogacania i wykrywania PTM, można szybko określić, czy docelowe białko jest modyfikowane przez jeden lub więcej PTM. Badanie profilu PTM PD-L1 zostało niedawno przeprowadzone przy użyciu tej techniki, a wyniki pokazały, że PD-L1 był ubikwitynowany, acetylowany i fosforylowany tyrozyną w odpowiedzi na EGF (Rysunek 4). Co ważne, dane te wykazały endogenne zmiany PD-L1 PTM, które stanowiły niewielki procent całkowitego zidentyfikowanego PD-L1.

Rysunek 1: Filtrowanie genomowego DNA z lizatu komórkowego za pomocą filtra BlastR. (A) Obraz filtra BlastR. (B) Lizat jest ładowany do filtra, który został umieszczony w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. (C) Tłok umieszcza się w strzykawce, a lizat przepuszcza się przez filtr przez ściskanie. (D) Zebrać lizat, w tym wszelkie pęcherzyki, poprzez całkowite ściskanie. (E) Przefiltrowany lizat.

Rysunek 2: Porównanie buforu do lizy BlastR z alternatywnymi do lizy. Rysunek 2A zaadaptowany z Horita et al. 2017. Biosci. Rep. ³¹ (A) Komórki A431 zostały poddane lizie za pomocą BlastR, RIPA, mPER, IP, Denaturing (1% SDS) i Laemmli. Wszystkie lizaty denaturujące miały usunięte genomowe DNA za pomocą filtra BlastR. Izolację białek z markerów błonowych, cytoplazmatycznych, mitochondrialnych i jądrowych określono przy użyciu przeciwciał przeciwko odpowiednim białkom markerowym przedziału. (B) Komórki A431 poddano lizie za pomocą BlastR, RIPA i 1% buforu denaturującego SDS. Lizaty poddano immunoprecypitacji za pomocą SUMO 2/3 lub kontrolnych kulek powinowactwa IgG. Próbki oddzielono za pomocą SDS-PAGE i przeanalizowano za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała SUMO 2/3- peroksydazy chrzanowej (HRP). Pokazano reprezentatywne bloty z niezależnych eksperymentów N≥3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Filtr lizacyjny BlastR jest skuteczny w usuwaniu genomowego DNA. (A) Komórki A431 poddano lizie z denaturującym buforem do lizy. Genomowe DNA usunięto lub ścięto za pomocą filtra BlastR, igły strzykawkowej lub sonikacji przez 5, 10, 20 lub 30 sekund. 2% lizatu analizowano za pomocą bromku etydyny, elektroforezy w żelu agarozowym. (B) Lizat z komórek A431 poddany lizie z buforem denaturującym był albo niefiltrowany, albo filtrowany za pomocą filtra BlastR. Próbki oddzielono za pomocą SDS-PAGE i zwizualizowano za pomocą barwnika Coomassie. (C) Zduplikowane próbki z B oddzielono za pomocą SDS-PAGE, przeniesiono do PVDF, a białko EGFR zbadano przy użyciu przeciwciała EGFR. Pokazano reprezentatywne bloty z niezależnych eksperymentów N ≥3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych PD-L1 wywołanych przez EGF. Rysunek zaczerpnięty z Horita et al. 2017. Neoplazja30 (A). Komórki A431 z ograniczeniami w surowicy były albo niestymulowane (UT), albo stymulowane EGF przez godzinę przed lizą z buforem do lizy BlastR. WCL analizowano pod kątem poziomów PD-L1 (pasy 1,2). Kulki wiążące ubikwitynę (UBA01) wykorzystano do IPP ubikwitynowanych białek (pasy 3,4). Kulki wiążące fosfotyrozynę (APY03) zastosowano do IP białek fosforylowanych tyrozyną (pasy 5,6). Kulki wiążące SUMO 2/3 (ASM24) użyto do IP SUMOylowanych białek 2/3 (pasy 7,8). Do IP-acetylowanych białek użyto kulek wiążących acetylolizynę (AAC01) (pasy 9,10). Kulki kontrolujące wiązanie IgG zastosowano do IP niespecyficznych białek wiążących (pasy 11,12). Próbki oddzielono za pomocą SDS-PAGE i przeanalizowano metodą western blot przy użyciu przeciwciała PD-L1. Pokazano reprezentatywną plamę z niezależnych eksperymentów N ≥3. Białe gwiazdki użyto do podkreślenia prążków białkowych PD-L1 pY i Ac. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obliczenia dla bufora do lizy BlastR
	1,0 ml	2,0 ml	5,0 ml	10,0 ml
Bufor do lizy BlastR	965 μL	1930 μL	4,825 ml	9.650 ml
Inhibitor fosfatazy tyrozynowej	5 μL	10 μL	25 μL	50 μL
inhibitor deubikwitynazy/desumoylazy	10 μL	20 μL	50 μL	100 μL
Inhibitor HDAC	10 μL	20 μL	50 μL	100 μL
Koktajl inhibitorów proteazy	10 μL	20 μL	50 μL	100 μL
Obliczenia dla bufora rozcieńczającego BlastR
	4,0 ml	8,0 ml	20,0 ml	40,0 ml
Bufor do lizy BlastR	3,86 ml	7,72 ml	19,3 ml	38,6 ml
Inhibitor fosfatazy tyrozynowej	20 μL	40 μL	100 μL	200 μL
inhibitor deubikwitynazy/desumoylazy	40 μL	80 μL	200 μL	400 μL
Inhibitor HDAC	40 μL	80 μL	200 μL	400 μL
Koktajl inhibitorów proteazy	40 μL	80 μL	200 μL	400 μL

Tabela 1: Wykres przygotowania buforu do lizy i rozcieńczenia. Wykres przedstawiający stężenia inhibitorów, które należy dodać dla danej objętości buforu do lizy i rozcieńczania podczas przygotowywania do lizy komórek.

Zawartość białka w płytce	Zalecana objętość buforu do lizy BlastR	Zalecana objętość buforu rozcieńczającego BlastR
< 1 mg tabletki powlekane	Połącz białko z wielu płytek	Aby uzyskać 1,5 ml końcowej objętości
1-2 mg tabletki powlekane	300 μL	Aby uzyskać 1,5 ml końcowej objętości
2-4 mg tabletki powlekane	600 μL	Aby uzyskać 3 ml końcowej objętości
4-6 tabletki powlekane	900 μL	Aby uzyskać 4,5 ml końcowej objętości

Tabela 2: Wykres bufora do lizy/rozcieńczania BlastR. Wykres przedstawiający zalecane objętości buforu do lizy i rozcieńczania podczas otrzymywania lizatu.

Rozdział

Objętość lizatu komórkowego dodanego do 1 ml odczynnika do precyzyjnego oznaczania białek czerwonych (μl)	Mnożnik do użycia z odczytem próbki OD600
10	10
20	5
Rozdział 30	3.3
Rozdział 40	Rozdział 2.5
50	cyfra arabska

Tabela 3: Mnożniki do przeliczania odczytów spektrofotometru na mg/ml lizatu. Wykres przedstawiający liczby konwersji pomocne w obliczaniu stężenia białka.

Rozdział Rozdział

Koraliki powinowactwa	objętość gnojowicy perełkowej/IP (ml)
Ubikwitynacja	20
Fosfotyrozyna	Rozdział 30
SUMOylacja 2/3	Rozdział 40
Acetylacja	50
Koraliki kontrolne	objętość gnojowicy perełkowej/IP (ml)
Koraliki kontrolujące ubikwitynację	20
Kulki kontrolne fosfotyrsowiny	Rozdział 30
Koraliki kontrolne SUMOylation 2/3	Rozdział 40
Kulki kontrolujące acetylację	50

Tabela 4: Zalecana ilość koralików/wykres IP. Wykres przedstawiający zalecane ilości koralików powinowactwa do użycia na reakcję IP.

Dyskusja

Wstępne podejścia stosowane w celu określenia, czy białko docelowe jest modyfikowane przez PTM, można przeprowadzić przy użyciu przeciwciała swoistego dla białka docelowego dla IP, a następnie Western blot z przeciwciałem PTM (np. anty-acetylolizyna) lub przy użyciu przeciwciała PTM dla IP, a następnie Western blot z przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego^{30,31, Lokal mieszkalny 33}. Chociaż oba podejścia teoretycznie działają, wykorzystanie przeciwciała specyficznego dla białka docelowego ma więcej potencjalnych pułapek, takich jak przeciwciało może nie być kompatybilne z IP lub duże modyfikacje PTM mogą blokować miejsce rozpoznawania przeciwciał na białku docelowym^34,35. Zaletą koralików powinowactwa PTM jest to, że przeciwciało lub domeny wiążące specyficznie rozpoznają interesujący PTM; W związku z tym modyfikacje białka docelowego nie powinny wpływać na rozpoznawanie przez kulki powinowactwa. Na przykład PD-L1 Ub zidentyfikowano za pomocą opisanej tutaj techniki i zaobserwowano zarówno endogenny mono-, jak i poli-Ub (ryc. 4). Niedawna publikacja Lim et al. wykorzystano techniki Ub in vitro do zbadania PD-L1 Ub, a wynik był bardzo podobny do wyników pokazanych na rysunku 4³⁶. Co ciekawe, wykonali również IP z przeciwciałem PD-L1 w celu wzbogacenia PD-L1 z lizatu komórkowego, w którym Ub uległ nadekspresji, a MG-132 dodano w celu wzmocnienia sygnału. Wzór Ub nie był solidny i bardzo różnił się od wzorca Ub in vitro. Badania endogennego PD-L1 Ub w modelach hodowli komórkowych nie zostały przeprowadzone w Lim i wsp. w celu wyjaśnienia różnicy między ich hodowlą komórkową a danymi z badań in vitro.

Zbadanie, czy białko jest modyfikowane przez PTM, może być trudne ze względu na jego niską liczebność i przejściowy charakter^37,38 i często wymaga wzbogacenia za pomocą IP. Efektywne IP PTM wymaga optymalizacji kilku kluczowych kroków i odczynników, takich jak do lizy i odczynniki powinowactwa. Podczas badania wielu PTM białka docelowego wymagana optymalizacja prawdopodobnie wzrasta. Wykorzystanie systemu blastR lysis jest krytycznym krokiem w tym protokole, ponieważ utrzymuje on solidną zdolność IP, umożliwiając jednocześnie wykrywanie PTM pY, SUMO 2/3, Ub i Ac PTM w jednym systemie. Technika ta optymalizuje czas i zasoby wymagane do określenia, czy określone białko docelowe jest modyfikowane przez te cztery PTM, i potencjalnie zapewnia lepszy obraz przesłuchów PTM w porównaniu z porównywaniem wyników PTM wykonanych przy użyciu wielu systemów lizy. Zbadano kompatybilność systemu blastR lysis z alternatywnymi PTM, takimi jak glikozylacja; jednak nie zostało to zbadane wyczerpująco w odniesieniu do wszystkich typów PTM.

Obfite genomowe DNA może zakłócać pomiary białek przy użyciu metod kolorymetrycznych lub nanokropli, wpływać na migrację białek w żelu akrylamidowym SDS oraz zapobiegać interakcji białek i macierzy powinowactwa podczas testów IP. Opisana tutaj metoda wykorzystuje specjalistyczny filtr do skutecznego usuwania zanieczyszczenia genomowego DNA, co jest kolejnym krytycznym krokiem tego protokołu. Aby podkreślić tę kwestię, testy lepkości przeprowadzono przed i po obróbce filtrem blastR, a wyniki wykazały zmniejszenie lepkości z wysokiej lepkości do lepkości wody (dane nie pokazane). Ta zmiana lepkości została poparta wynikami na rysunku 3, pokazującymi, że prawie całe genomowe DNA zostało usunięte. Co ważne, DNA nie jest ścinane tą metodą, ponieważ jakiekolwiek ścięte DNA nie zostanie wychwycone przez filtr (dane nie są pokazane). To narzędzie jest lepsze od konwencjonalnych metod, takich jak sonikacja lub strzykawkowe ścinanie DNA, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu, jest wysoce powtarzalne i usuwa DNA zamiast go ścinać. Co więcej, nie powoduje degradacji białka w lizacie, co może nastąpić przy użyciu konwencjonalnych metod²⁹. Użycie filtra zajmuje 5 - 30 sekund na próbkę w porównaniu z alternatywnymi metodami, w których skuteczny rozkład DNA może zająć kilka minut (np. ścinanie strzykawki) i może powodować niejednorodność próbki, ponieważ zanieczyszczenia DNA pozostają w lizacie. Przeprowadzono obszerną analizę filtracji lizatu przed i po blastR i nie zaobserwowano żadnej obserwowalnej różnicy w profilu białkowym za pomocą analiz Coomassie, zachodnich specyficznych dla celu lub całkowitych i specyficznych dla celu; w związku z tym odfiltrowanie genomowego DNA mogło nie mieć wpływu na integralność profilu białkowego. Ostatecznie ten system filtrów jest korzystny dla wszelkich aplikacji zachodnich lub IP, w których obecne jest genomowe DNA i może wpływać na interpretację analizy białka.

Ważne jest, aby pamiętać, że istnieje możliwość wykrywania fałszywie ujemnego przy użyciu tej techniki, co może być częściowo spowodowane nasyceniem koralików powinowactwa, zakłóceniami miejsca wiązania lub maskowaniem PTM. Na przykład, określone białko docelowe może być modyfikowane przez Ac na bardzo niskich poziomach; w związku z tym nie można go wyizolować za pomocą kulek powinowactwa do panacetylolizyny, które zostały nasycone przez bardziej obfite białka docelowe modyfikowane Ac. Trwają badania mające na celu ocenę granic wykrywalności odczynników powinowactwa stosowanych w tym protokole, ale niedawna publikacja sugeruje bardzo solidną granicę wykrywalności. Dane wykazały, że technika ta może zidentyfikować zaledwie 17 acetylowanych cząsteczek białka docelowego na komórkę³¹. Jednak określone okoliczności, takie jak specyficzność typu komórki, przejściowe PTM w odpowiedzi na określone bodźce lub maskowanie PTM w wyniku interakcji białek, mogą skutkować fałszywie ujemnymi wynikami. Są to potencjalne pułapki tej techniki, jak również większości metod PTM IP. Dlatego zaleca się potwierdzanie wyników przy użyciu wielu podejść.

Wykazano, że modyfikacje, takie jak glikozylacja i fosforylacja, konkurują o podobne aminokwasy^39,40, a inne PTM, takie jak ubikwitynacja i fosforylacja, działają sekwencyjnie, aby regulować funkcję białka^17,41. Niedawne prace nad neuropatologicznym białkiem Tau podkreśliły znaczenie przesłuchów PTM, w których hiperfosforylacja Tau i SUMOylacja Tau wzmacniały się nawzajem⁴². Co więcej, grupa ta wykazała, że sumoylacja Tau zapobiegała poli-Ub i późniejszej degradacji Tau, co może prowadzić do agregacji. Jest to tylko jeden z wielu przykładów regulacyjnych przesłuchów PTM, a użyteczność tej techniki pomoże naświetlić znaczenie PTM i ich przesłuchów w regulacji kluczowych białek w zdrowiu i chorobie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Liza komórek/Usuwanie i analiza genomowego DNA< / silny>
1x buforowany fosforanem soli fizjologicznej (PBS)	wspólny bufor		Receptura: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
Bufor do lizy BlastR	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
Bufor do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA)	wspólny bufor		Receptura: Tris-HCl, NaCl, SDS, Deoksycholan Sodu, Igepal
Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków (mPER)	Thermofisher	78503	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
Immunoprecypitacja (IP) Przebijanie lizy		87787	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) bufor denaturujący	wspólny bufor		Receptura: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Wspólny bufor		Laemmli	Receptura: Tris-HCl, SDS, glicerol, błękit bromofenolowy
Bufor rozcieńczający BlastR	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
Inhibitor proteazy Koktajl	Cytoszkielet Inc.	PIC02
N-etylomaleimid (NEM) i N,N,N′,N′-tetrakis(2-pirydylometylo)etylenodiamina (TPEN)	Cytoszkielet Inc.
Trichostatyna A (TSA) i Cytoszkielet nikotynamidu	Inc.	TSA01
Aktywowany ortowananian sodu (Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	Skrobaki komórkowe PYI01
	Costar	3008
Filtr BlastR	Cytoszkielet Inc.	BLR02
BD Igła do strzykawki insulinowej	BD	08290-3284-11
sonikator (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precyzyjny czerwony zaawansowany odczynnik białkowy	Cytoszkielet Inc.	ADV02
Kuwety 1 ml	Fisher	14955127
Spektrofotometr (Genesys20)	Thermofisher	4001	Inne spektrofotomery mogą być używane do pomiaru stężenia białka
Agaroza	Fisher	BP1356-500
1kb Drabinka kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)	NEB	N3232L
Pudełko na żel DNA	Thermofisher	7312 B1A
Bufor Tris/Boran/EDTA (TBE)	wspólny bufor		Receptura: Tris-HCl, kwas borowy, EDTA
PTM Immunoprecypitacja
Kulki fosfotyrozyny	Cytoskeleton Inc.	APY03-koraliki Koraliki
ubikwitynacyjne	Cytoskeleton Inc.	UBA01-koraliki
SUMOylacja 2/3 koraliki	Cytoskeleton Inc.	Koraliki ASM24 Koraliki
acetylacyjne	Cytoskeleton Inc.	Koraliki AAC04 Koraliki
kontrolne fosfotyrozyny	Cytoskeleton Inc.	CIG01-koraliki Koraliki
kontrolujące ubikwitynację	Cytoskeleton Inc.	Koraliki CUB02 Koraliki
kontrolne SUMOylacja 2/3	Cytoskeleton Inc.	CIG01-koraliki Koraliki
kontrolujące acetylację	Cytoskeleton Inc.	CIG02-koraliki
Bufor myjący BlastR	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
Bufor elucyjny do kulek	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Zastrzeżona mieszanina detergentów, soli i innych dodatków buforowych
mikrowirówka	Eppendorf	5417	Można stosować inne mikrowirówki
rotator rurowy	ATR	RKVSD	Można stosować inne rotatory rurowe typu end-over-end
Wskazówki dotyczące ładowania białka	VWR	37001-150
kolumny wirujące	Cytoskeleton Inc.	SPN22
95 & deg; C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Analiza zachodnia
5x bufor próbki	wspólna receptura bufora		: błękit bromofenolowy, ditiotreitol (DTT), glicerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% żele Tris-gly	Invitrogen	XP04200BOX	Duże wgłębienia klinowe doskonale nadają się do załadunku dużych objętości
1x Wspólna	bufora		: Tris-HCl, glicyna, SDS
seeblue drabinka białkowa Life	Technologies	LC5625
do elektroforezy	Invitrogen	Xcell surelock	stosować inne ogniwa do elektroforezy, jednak są one kompatybilne z żelami Novex Wedgewell
zasilacz	Biorad	PowerPac HC	Można zastosować inne zasilacze
1x Bufor transferowy	wspólna receptura buforu		: Tris-HCl, glicyna, metanol
Komórka transferowa	Biorad	mini komórka trans-blot	Można zastosować inne komórki transferowe
Membrany Immobilon-P (PVDF)	miliporowe	IPVH 304F0
mleko beztłuszczowe	rozwijają się	813503015095
Tris buforowana sól fizjologiczna z tween (TBST)	wspólna receptura bufora		: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Odczynnik do wykrywania chemiluminescencyjnego	Cytoskeleton Inc.	CLRA/CLRB
Wzrost i leczenie komórek
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco	ATCC	30-2002
Surowica płodowa bydlęca	ATLAS&	nbsp; F-0500-A
Naskórkowy czynnik wzrostu	Cytoskeleton Inc.	CN02-A Płytki do hodowli
komórkowych 150 mm	Corning	430599