Artykuł metodologiczny

Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

DOI:

10.3791/56919

⸱

2 stycznia 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność systemów in vivo utrudnia rozróżnienie między aktywacją a hamowaniem receptora Notch odpowiednio przez trans- i cis-ligandy. W tym miejscu przedstawiamy protokół oparty na testach agregacji komórek in vitro do jakościowej i półilościowej oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami w porównaniu z cis-ligandami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja Notch to ewolucyjnie zachowany system komunikacji komórka-komórka, szeroko stosowany w rozwoju zwierząt i utrzymaniu dorosłych. Interakcja receptora Notch z ligandami z sąsiednich komórek indukuje aktywację szlaku sygnałowego (transaktywację), podczas gdy interakcja z ligandami z tej samej komórki hamuje sygnalizację (cis-inhibicję). Właściwa równowaga między transaktywacją a inhibicją, pomaga ustalić optymalne poziomy sygnalizacji Notch w niektórych kontekstach podczas rozwoju zwierząt. Ze względu na nakładające się na siebie domeny ekspresji Notch i jego ligandów w wielu typach komórek oraz istnienie mechanizmów sprzężenia zwrotnego, badanie wpływu danej modyfikacji potranslacyjnej na interakcje trans- i cis-interakcje Notch i jego ligandów in vivo jest trudne. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystania komórek Drosophila S2 w testach agregacji komórek w celu oceny wpływu strącenia modyfikatora szlaku Notch na wiązanie Notch z każdym ligandem w trans i cis. Komórki S2 stabilnie lub przejściowo transfekowane wektorem wyrażającym Notch są mieszane z komórkami wyrażającymi każdy ligand Notch (S2-Delta lub S2-Serrate). Transwiązanie między receptorem a ligandami powoduje tworzenie heterotypowych agregatów komórkowych i jest mierzone pod względem liczby agregatów na ml złożonych z >6 komórek. Aby zbadać hamujący wpływ cis-ligandów, komórki S2 koeksprymujące Notch i każdy ligand miesza się z komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi, a liczbę agregatów określa się ilościowo, jak opisano powyżej. Względny spadek liczby agregatów spowodowany obecnością cis-ligandów stanowi miarę hamowania wiązania trans za pośrednictwem cis-ligandów. Te proste testy mogą dostarczyć półilościowych danych na temat wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych na wiązanie Notch z jego ligandami i mogą pomóc w rozszyfrowaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wpływu takich manipulacji in vivo na sygnalizację Notch.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja Canonical Notch to mechanizm komunikacji między komórkami krótkiego zasięgu, który wymaga fizycznego kontaktu sąsiednich komórek, aby ułatwić interakcję między receptorami Notch i ich ligandami1. Interakcja receptora Notch (obecnego na powierzchni komórek odbierających sygnał) z ligandami (obecnymi na powierzchni komórek wysyłających sygnał) inicjuje sygnalizację Notch i jest znana jako transaktywacja2. Z drugiej strony, interakcja między Notch i jego ligandami w tej samej komórce prowadzi do zahamowania szlaku Notch i jest znana jako cis-inhibibition3. Równowaga między oddziaływaniami trans- i cis jest wymagana, aby zapewnić optymalną sygnalizację Notch zależną od ligandu4. Drosophila ma jeden receptor Notch i dwa ligandy (Delta i Serrate), w przeciwieństwie do ssaków, które mają cztery receptory Notch i pięć ligandów [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 i DLL4]5. Dzięki tej prostocie model Drosophila oferuje łatwość analizowania/badania wpływu modyfikatorów szlaku na interakcje Notch-ligand, a następnie na sygnalizację Notch. W pewnych kontekstach podczas rozwoju zwierząt (w tym rozwoju skrzydeł u Drosophila), zarówno interakcje cis, jak i trans są zaangażowane w osiągnięcie prawidłowej sygnalizacji Notch i losu komórki1,6. Ważne jest, aby rozróżnić wpływ modyfikatorów szlaku Notch w tych kontekstach na cis- i trans-interakcje Notch z jego ligandami.

Nasza grupa wcześniej informowała, że dodanie reszty węglowodanowej zwanej ksylozą do Drosophila Notch negatywnie reguluje sygnalizację Notch w pewnych kontekstach, w tym rozwoju skrzydeł7. Utrata shams (enzymu, który ksylozyluje Notch) prowadzi do fenotypu "utraty żyły skrzydła"7. Niedawno wykorzystano eksperymenty z dawkowaniem genów i analizę klonalną, aby wykazać, że utrata pozorów wzmacnia izolowanie Notch za pośrednictwem Delta. Aby rozróżnić, czy wzmocniona sygnalizacja Notch w mutantach pozornych jest wynikiem zmniejszonego hamowania cis, czy zwiększonej transaktywacji, przeprowadzono badania ektopowej nadekspresji ligandów Notch w dyskach wyobrażeniowych skrzydeł larwalnych przy użyciu sterownika dpp-GAL4. Eksperymenty te dostarczyły dowodów sugerujących, że Shams reguluje trans-aktywację Notch przez Delta, nie wpływając na inhibicję Cis Notch przez ligandy8. Jednak regulacje sprzężenia zwrotnego i efekty endogennych ligandów mogą komplikować interpretację badań nad nadekspresją ektopową1,6,9.

Aby rozwiązać ten problem, użyto komórek Drosophila S210, które zapewniają prosty system in vitro do badań interakcji Notch-ligand11,12. Komórki S2 nie wyrażają endogennego receptora Notch i liganda Delta11 i wyrażają niski poziom Serrate13, co nie wpływa na eksperymenty agregacji ligandu Notch8. Dlatego komórki S2 mogą być stabilnie lub przejściowo transfekowane przez Notch i / lub pojedyncze ligandy (Delta lub Serrate) w celu wytworzenia komórek, które wyrażają wyłącznie receptor Notch lub jeden z jego ligandów lub ich kombinację. Mieszanie komórek S2 eksprymujących Notch z komórkami S2 eksprymujących ligand powoduje powstawanie heterotypowych agregatów, w których pośredniczy wiązanie receptor-ligand11,12,14. Kwantyfikacja tworzenia agregatu dostarcza miary trans-wiązania między Notch a jego ligandami15 (Rysunek 1). Podobnie, komórki S2 mogą być współtransfekowane z ligandami Notch i Delta lub Serrate (tj. cis-ligandami). Ligandy cis-ligandy w tych komórkach S2 eksprymujących Notch znoszą wiązanie Notch z trans-ligandami i powodują zmniejszone tworzenie agregatów8,12,14. Względny spadek tworzenia agregatów spowodowany przez cis-ligandy stanowi miarę hamującego wpływu cis-ligandów na wiązanie między Notch i trans-ligandami (Rysunek 2). W związku z tym wykorzystano testy agregacji komórek w celu zbadania wpływu utraty ksylozylacji na interakcje trans- i cis między Notch i jego ligandami.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół testów agregacji komórek, mający na celu ocenę wiązania Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy przy użyciu komórek Drosophila S2. Jako przykład podajemy dane, które pozwoliły nam określić wpływ ksylozylacji Notch na wiązanie między Notch a trans-Delta8. Te proste testy zapewniają półilościową ocenę interakcji Notch-ligand in vitro i pomagają określić mechanizmy molekularne leżące u podstaw działania in vivo modyfikatorów szlaku Notch.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie dwuniciowego RNA (dsRNA) do pozorowanego knockdownu

  1. Amplifikacja produktów metodą PCR
    1. Użyj genomowego DNA typu dzikiego, żółtego, białego (y w) i pAc5.1-EGFP jako matrycy i następujących par starterów do amplifikacji fragmentów DNA stosowanych w syntezie dsRNA. Użyj następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 30 s), wyżarzanie (58 °C, 30 s) i rozciąganie (72 °C, 1 min).
      Wzmocnione startery dsRNA białka zielonej fluorescencji (EGFP) (5'-3')-
      Elementarz do przodu- GAAATTAATACGACTACTATAGGGGGGGGGGGAGCAAGGGCGAGGAG
      Odwrócony starter- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams startery dsRNA (5'-3')-
      Podkład do przodu- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Odwrócony starter- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      UWAGA: EGFP dsRNA jest stosowany jako kontrola ujemna.
  2. Żelowe oczyszczanie produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu produktu komercyjnego zdolnego do transkrypcji z promotora T7 zgodnie z protokołem producenta.
  4. Oczyść dsRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  5. Oceń skuteczność pozorowanego knockdownu, wykonując następujące kroki (1.5.1-1.5.5).
    1. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.
    2. Dodać 7,5 μg EGFP lub pozorowanego dsRNA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Zebrać komórkę kontrolną (poddaną działaniu EGFP dsRNA) i pozorować komórki S2 poddane działaniu dsRNA poprzez delikatne pipetowanie, a następnie granulowanie przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C i proces izolacji RNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.
    4. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru i przetworzyć 100 ng RNA do 1-etapowego qRT-PCR przy użyciu dostępnych w handlu odczynników qPCR i startera/sond oraz następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 15 s) i wyżarzanie/wydłużanie (60 °C, 1 min).
      UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat zestawów starter/sonda oraz instrumentu używanego do pozorowania i kontrolnych eksperymentów qRT-PCR w tych badaniach.
    5. Oblicz względne poziomy mRNA pozorów za pomocą metody 2-ΔΔCT 16.

2. Ocena wiązania między receptorem Notch a trans-ligandami

  1. Przygotuj komórki odbierające sygnał (komórki S2 wyrażające receptor Notch).
    1. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 S2 i stabilnych komórek S2-Notch w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna.
      UWAGA: W przypadku komórek S2-Notch, które są dostępne w Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), dodaj 200 nM metotreksatu w pożywce. Aby przygotować roztwór podstawowy metotreksatu o stężeniu 0,5 mM, należy najpierw przygotować roztwór metotreksatu o stężeniu 20 mM w 250 μl 1 M NaOH. Następnie rozcieńczyć ten roztwór do 0,5 mM w 1 M roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym i przechowywać w temperaturze -20 °C. W komórkach S2-Notch ekspresja białka Notch jest pod kontrolą promotora metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.
    2. Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
      UWAGA: CuSO4 służy do indukowania ekspresji białek kontrolowanych przez promotor metalotioneiny.
  2. Przygotuj komórki wysyłające sygnały (komórka S2 eksprymująca ligandy Delta lub Serrate).
    1. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki ~ 5 x 106 stabilnych komórek S2-Delta lub S2-SerrateTom w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna.
      UWAGA: Dodaj 200 nM metotreksatu dla komórek S2-Delta i 100 μg/ml higromycyny dla komórek S2-ząbkowanych Tomów w pożywce. Wyrażenie Delta i SerrateTom - oznaczona pomidorem, funkcjonalna wersja Serrate12 - znajduje się pod promotorem metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.
    2. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.
  3. Wykonaj agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały.
    1. Pobrać komórki S2 (kontrolne) i S2-Notch poddane działaniu dsRNA przez delikatne pipetowanie i płytkę 2,5 x 105 komórek/dołek na płytce 24-dołkowej po ręcznym zliczeniu za pomocą hemocytometru.
    2. Dodaj 5 x 105 stabilnych komórekToma S2-Delta lub S2-ząbkowanych w całkowitej objętości 200 μl pożywki Schneidera (uzupełnionej 10% FBS i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny).
      UWAGA: Cała obsługa komórek S2 (w tym posiew, indukcja i obróbka dsRNA) odbywała się pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min (942.48 rad/min).
    4. Po 1 minucie wymieszać zawartość każdej studzienki i wyjąć 20 μl w celu policzenia liczby kruszyw.
      1. Jednocześnie wykonaj reprezentatywny obraz pod odwróconym mikroskopem złożonym przy użyciu 10-krotnego powiększenia (obiektyw PLL 10/0,25).
      2. Ręcznie policz agregaty (>6 komórek) za pomocą hemocytometru.
    5. Umieść talerz na shakerze.
    6. Powtórz akwizycję i zliczanie obrazu po 5 minutach i 15 minutach agregacji.
  4. Przeprowadzić kwantyfikację wiązania trans-bindingu.
    1. Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-SerrateTom jako kontrolą tła.
    2. Obliczyć liczbę agregatów na ml między komórkami S2-Notch i S2-Delta lub S2-SerrateTom (wielkość wiązania trans).

3. Ocena inhibicji wiązania między Notch i Trans-ligandami przez cis-ligandy

  1. Przygotuj komórki odbierające sygnał.
    1. Płytka: 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / studzience pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.
    2. Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Współtransfekować komórki poddane działaniu dsRNA za pomocą pBluescript i pMT-Notch11 (DGRC) samodzielnie lub z pMT-Notch i pMT-Delta11 (DGRC) lub pMT-Serrate17 dla całkowitego stężenia DNA 2 μg/studnię przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: pBluescript jest używany jako kontrolka. Współtransfekowane komórki będą dalej nazywaneprzejściowymi komórkami S2-Notch&Delta lub przejściowymi S2-Notch&Ząbkowanymi.
    4. Inkubować przejściowo transfekowane komórki S2 w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    5. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
  2. Przygotować komórki wysyłające sygnał zgodnie z opisem w ppkt 2.2.
  3. Przeprowadzić agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały, jak opisano w sekcji 2.3.
  4. Określ ilościowo hamowanie wiązania trans przez cis-ligandy.
    1. Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi jako kontrolka tła.
    2. Określ ilościowo wielkość inhibicji przez cis-ligandy w następujący sposób.
      1. Zdefiniuj A jako liczbę agregacji między komórkamiprzejściowymi S2-Notch i S2-Delta.
      2. Zdefiniuj B jako liczbę agregatów między komórkami S2 przejściowo współtransfekowanymi z komórkami Notch i Delta (przejściowe S2-Notch&Delta) oraz komórkami S2-Delta.
      3. Obliczać agregacja względna C = (B x 100)/A
      4. Obliczać wielkość inhibicji przez cis-ligand (Delta lub Serrate) jako 100 – C.
        UWAGA: Na przykład, jeśli względna agregacja wynosi 45%, uważa się, że cis-ligandy hamują wiązanie trans o 55%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze obserwacje in vivo sugerowały, że utrata pozorów genu ksylozylotransferazy powoduje wzmocnienie sygnalizacji Notch z powodu zwiększonej transaktywacji Notch za pośrednictwem Delta, bez wpływu na inhibicję cis-inhibicji Notch przez ligandy8. Aby przetestować tę koncepcję, przeprowadzono testy agregacji komórek in vitro. Po pierwsze, ekspresja pozorów w komórkach S2 została zmniejszona za pomocą shams

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja Canonical Notch zależy od interakcji między receptorem Notch a jego ligandami5. Chociaż większość badań nad szlakiem Notch bierze pod uwagę przede wszystkim wiązanie Notch i ligandów w sąsiednich komórkach (trans), ligandy Notch i te same komórki oddziałują ze sobą, a te tak zwane interakcje cis mogą odgrywać rolę hamującą w sygnalizacji Notch 3,4. W związku z tym, aby rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony NIH/NIGMS (R01GM084135 do HJN) oraz Mizutani Foundation for Glycoscience (grant #110071 dla HJN) i są wdzięczni Tomowi V. Lee za dyskusje i sugestie dotyczące testów, a także Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine i The Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) dla plazmidów i linii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioWhittaker Schneider' s Pożywka Drosophila, zmodyfikowanaLonza04-351Q
HyClone Penicylina-Streptomycyna 100X roztwórGE Healthcare nauki przyrodnicze 
Płytka 6-dołkowa CELLSTARGreiner Bio-One657 160
Płytka 24-dołkowa CELLSTAR MiniGreiner Bio-One662160
VWRMarshell Sceintific12520-956
HemocytometrFisher Sceintific 267110
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD Zestaw do transkrypcjiPromegaE2311
MEGAscrip T7AmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (zestaw do oczyszczania RNA)Zymo ResearchR1054
VistaVision Mikroskop odwróconyVWR
9MP USB2.0 Mikroskop cyfrowy + zaawansowane oprogramowanieAmScopeMU-900Akwizycja obrazu za pomocą oprogramowania ToupView
Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu PureLinkInvitrogenK210012
Surowica bydlęca płoduGenDepotF0600-050
MetotreksatSigma-AldrichA6770-10
Hygromycyna BInvitrogenHY068-L6
Siarczan miedziMacron Chemikalia wysokowartościowe4448-02
Komórki S2InvitrogenR69007
S2-SerrateTom komórkiPrezent od R. Fleminga (Fleming i wsp., Rozwój, 2013)
Ogniwa S2-DeltaDGRC152
Ogniwa S2-NotchDGRC154
wektor pMT-DeltaDGRC1021Prezent od S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Ząbkowany wektorPrezent od Kena Irvine'a (Okajima i in., JBC, 2003)
pMT-Notch wektorDGRC1022Prezent od S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPPrezent od Hugo Bellena
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step ZestawApplied Biosystem1611091
Test ekspresji genów TaqMan dla CG9996 (Shams)Applied BiosystemDm02144576_g1 z barwnikiem FAM-MGB
Test ekspresji genów TaqMan dla CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1z barwnikiem FAM-MGB
Applied Biosystems 7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystem435140596-dołkowy moduł blokowy
SV30010 shaker

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygnalizacja Notchtest agregacji kom rektransaktywacjacis inhibicjakom rki Drosophila S2liczenie w hemocytometrzewytrz sarka orbitalnaodwr cony mikroskop z o onydwuniciowe RNAindukcja siarczanem miedzi

Powiązane artykuły