Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56919

⸱

2 stycznia 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Złożoność systemów in vivo utrudnia rozróżnienie między aktywacją a hamowaniem receptora Notch odpowiednio przez trans- i cis-ligandy. W tym miejscu przedstawiamy protokół oparty na testach agregacji komórek in vitro do jakościowej i półilościowej oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami w porównaniu z cis-ligandami.

Streszczenie

Sygnalizacja Notch to ewolucyjnie zachowany system komunikacji komórka-komórka, szeroko stosowany w rozwoju zwierząt i utrzymaniu dorosłych. Interakcja receptora Notch z ligandami z sąsiednich komórek indukuje aktywację szlaku sygnałowego (transaktywację), podczas gdy interakcja z ligandami z tej samej komórki hamuje sygnalizację (cis-inhibicję). Właściwa równowaga między transaktywacją a inhibicją, pomaga ustalić optymalne poziomy sygnalizacji Notch w niektórych kontekstach podczas rozwoju zwierząt. Ze względu na nakładające się na siebie domeny ekspresji Notch i jego ligandów w wielu typach komórek oraz istnienie mechanizmów sprzężenia zwrotnego, badanie wpływu danej modyfikacji potranslacyjnej na interakcje trans- i cis-interakcje Notch i jego ligandów in vivo jest trudne. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystania komórek Drosophila S2 w testach agregacji komórek w celu oceny wpływu strącenia modyfikatora szlaku Notch na wiązanie Notch z każdym ligandem w trans i cis. Komórki S2 stabilnie lub przejściowo transfekowane wektorem wyrażającym Notch są mieszane z komórkami wyrażającymi każdy ligand Notch (S2-Delta lub S2-Serrate). Transwiązanie między receptorem a ligandami powoduje tworzenie heterotypowych agregatów komórkowych i jest mierzone pod względem liczby agregatów na ml złożonych z >6 komórek. Aby zbadać hamujący wpływ cis-ligandów, komórki S2 koeksprymujące Notch i każdy ligand miesza się z komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi, a liczbę agregatów określa się ilościowo, jak opisano powyżej. Względny spadek liczby agregatów spowodowany obecnością cis-ligandów stanowi miarę hamowania wiązania trans za pośrednictwem cis-ligandów. Te proste testy mogą dostarczyć półilościowych danych na temat wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych na wiązanie Notch z jego ligandami i mogą pomóc w rozszyfrowaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wpływu takich manipulacji in vivo na sygnalizację Notch.

Wprowadzenie

Sygnalizacja Canonical Notch to mechanizm komunikacji między komórkami krótkiego zasięgu, który wymaga fizycznego kontaktu sąsiednich komórek, aby ułatwić interakcję między receptorami Notch i ich ligandami1. Interakcja receptora Notch (obecnego na powierzchni komórek odbierających sygnał) z ligandami (obecnymi na powierzchni komórek wysyłających sygnał) inicjuje sygnalizację Notch i jest znana jako transaktywacja2. Z drugiej strony, interakcja między Notch i jego ligandami w tej samej komórce prowadzi do zahamowania szlaku Notch i jest znana jako cis-inhibibition3. Równowaga między oddziaływaniami trans- i cis jest wymagana, aby zapewnić optymalną sygnalizację Notch zależną od ligandu4. Drosophila ma jeden receptor Notch i dwa ligandy (Delta i Serrate), w przeciwieństwie do ssaków, które mają cztery receptory Notch i pięć ligandów [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 i DLL4]5. Dzięki tej prostocie model Drosophila oferuje łatwość analizowania/badania wpływu modyfikatorów szlaku na interakcje Notch-ligand, a następnie na sygnalizację Notch. W pewnych kontekstach podczas rozwoju zwierząt (w tym rozwoju skrzydeł u Drosophila), zarówno interakcje cis, jak i trans są zaangażowane w osiągnięcie prawidłowej sygnalizacji Notch i losu komórki1,6. Ważne jest, aby rozróżnić wpływ modyfikatorów szlaku Notch w tych kontekstach na cis- i trans-interakcje Notch z jego ligandami.

Nasza grupa wcześniej informowała, że dodanie reszty węglowodanowej zwanej ksylozą do Drosophila Notch negatywnie reguluje sygnalizację Notch w pewnych kontekstach, w tym rozwoju skrzydeł7. Utrata shams (enzymu, który ksylozyluje Notch) prowadzi do fenotypu "utraty żyły skrzydła"7. Niedawno wykorzystano eksperymenty z dawkowaniem genów i analizę klonalną, aby wykazać, że utrata pozorów wzmacnia izolowanie Notch za pośrednictwem Delta. Aby rozróżnić, czy wzmocniona sygnalizacja Notch w mutantach pozornych jest wynikiem zmniejszonego hamowania cis, czy zwiększonej transaktywacji, przeprowadzono badania ektopowej nadekspresji ligandów Notch w dyskach wyobrażeniowych skrzydeł larwalnych przy użyciu sterownika dpp-GAL4. Eksperymenty te dostarczyły dowodów sugerujących, że Shams reguluje trans-aktywację Notch przez Delta, nie wpływając na inhibicję Cis Notch przez ligandy8. Jednak regulacje sprzężenia zwrotnego i efekty endogennych ligandów mogą komplikować interpretację badań nad nadekspresją ektopową1,6,9.

Aby rozwiązać ten problem, użyto komórek Drosophila S210, które zapewniają prosty system in vitro do badań interakcji Notch-ligand11,12. Komórki S2 nie wyrażają endogennego receptora Notch i liganda Delta11 i wyrażają niski poziom Serrate13, co nie wpływa na eksperymenty agregacji ligandu Notch8. Dlatego komórki S2 mogą być stabilnie lub przejściowo transfekowane przez Notch i / lub pojedyncze ligandy (Delta lub Serrate) w celu wytworzenia komórek, które wyrażają wyłącznie receptor Notch lub jeden z jego ligandów lub ich kombinację. Mieszanie komórek S2 eksprymujących Notch z komórkami S2 eksprymujących ligand powoduje powstawanie heterotypowych agregatów, w których pośredniczy wiązanie receptor-ligand11,12,14. Kwantyfikacja tworzenia agregatu dostarcza miary trans-wiązania między Notch a jego ligandami15 (Rysunek 1). Podobnie, komórki S2 mogą być współtransfekowane z ligandami Notch i Delta lub Serrate (tj. cis-ligandami). Ligandy cis-ligandy w tych komórkach S2 eksprymujących Notch znoszą wiązanie Notch z trans-ligandami i powodują zmniejszone tworzenie agregatów8,12,14. Względny spadek tworzenia agregatów spowodowany przez cis-ligandy stanowi miarę hamującego wpływu cis-ligandów na wiązanie między Notch i trans-ligandami (Rysunek 2). W związku z tym wykorzystano testy agregacji komórek w celu zbadania wpływu utraty ksylozylacji na interakcje trans- i cis między Notch i jego ligandami.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół testów agregacji komórek, mający na celu ocenę wiązania Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy przy użyciu komórek Drosophila S2. Jako przykład podajemy dane, które pozwoliły nam określić wpływ ksylozylacji Notch na wiązanie między Notch a trans-Delta8. Te proste testy zapewniają półilościową ocenę interakcji Notch-ligand in vitro i pomagają określić mechanizmy molekularne leżące u podstaw działania in vivo modyfikatorów szlaku Notch.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie dwuniciowego RNA (dsRNA) do pozorowanego knockdownu

  1. Amplifikacja produktów metodą PCR
    1. Użyj genomowego DNA typu dzikiego, żółtego, białego (y w) i pAc5.1-EGFP jako matrycy i następujących par starterów do amplifikacji fragmentów DNA stosowanych w syntezie dsRNA. Użyj następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 30 s), wyżarzanie (58 °C, 30 s) i rozciąganie (72 °C, 1 min).
      Wzmocnione startery dsRNA białka zielonej fluorescencji (EGFP) (5'-3')-
      Elementarz do przodu- GAAATTAATACGACTACTATAGGGGGGGGGGGAGCAAGGGCGAGGAG
      Odwrócony starter- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams startery dsRNA (5'-3')-
      Podkład do przodu- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Odwrócony starter- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      UWAGA: EGFP dsRNA jest stosowany jako kontrola ujemna.
  2. Żelowe oczyszczanie produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu produktu komercyjnego zdolnego do transkrypcji z promotora T7 zgodnie z protokołem producenta.
  4. Oczyść dsRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  5. Oceń skuteczność pozorowanego knockdownu, wykonując następujące kroki (1.5.1-1.5.5).
    1. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.
    2. Dodać 7,5 μg EGFP lub pozorowanego dsRNA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Zebrać komórkę kontrolną (poddaną działaniu EGFP dsRNA) i pozorować komórki S2 poddane działaniu dsRNA poprzez delikatne pipetowanie, a następnie granulowanie przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C i proces izolacji RNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.
    4. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru i przetworzyć 100 ng RNA do 1-etapowego qRT-PCR przy użyciu dostępnych w handlu odczynników qPCR i startera/sond oraz następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 15 s) i wyżarzanie/wydłużanie (60 °C, 1 min).
      UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat zestawów starter/sonda oraz instrumentu używanego do pozorowania i kontrolnych eksperymentów qRT-PCR w tych badaniach.
    5. Oblicz względne poziomy mRNA pozorów za pomocą metody 2-ΔΔCT 16.

2. Ocena wiązania między receptorem Notch a trans-ligandami

  1. Przygotuj komórki odbierające sygnał (komórki S2 wyrażające receptor Notch).
    1. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 S2 i stabilnych komórek S2-Notch w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna.
      UWAGA: W przypadku komórek S2-Notch, które są dostępne w Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), dodaj 200 nM metotreksatu w pożywce. Aby przygotować roztwór podstawowy metotreksatu o stężeniu 0,5 mM, należy najpierw przygotować roztwór metotreksatu o stężeniu 20 mM w 250 μl 1 M NaOH. Następnie rozcieńczyć ten roztwór do 0,5 mM w 1 M roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym i przechowywać w temperaturze -20 °C. W komórkach S2-Notch ekspresja białka Notch jest pod kontrolą promotora metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.
    2. Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
      UWAGA: CuSO4 służy do indukowania ekspresji białek kontrolowanych przez promotor metalotioneiny.
  2. Przygotuj komórki wysyłające sygnały (komórka S2 eksprymująca ligandy Delta lub Serrate).
    1. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki ~ 5 x 106 stabilnych komórek S2-Delta lub S2-SerrateTom w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna.
      UWAGA: Dodaj 200 nM metotreksatu dla komórek S2-Delta i 100 μg/ml higromycyny dla komórek S2-ząbkowanych Tomów w pożywce. Wyrażenie Delta i SerrateTom - oznaczona pomidorem, funkcjonalna wersja Serrate12 - znajduje się pod promotorem metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.
    2. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.
  3. Wykonaj agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały.
    1. Pobrać komórki S2 (kontrolne) i S2-Notch poddane działaniu dsRNA przez delikatne pipetowanie i płytkę 2,5 x 105 komórek/dołek na płytce 24-dołkowej po ręcznym zliczeniu za pomocą hemocytometru.
    2. Dodaj 5 x 105 stabilnych komórekToma S2-Delta lub S2-ząbkowanych w całkowitej objętości 200 μl pożywki Schneidera (uzupełnionej 10% FBS i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny).
      UWAGA: Cała obsługa komórek S2 (w tym posiew, indukcja i obróbka dsRNA) odbywała się pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min (942.48 rad/min).
    4. Po 1 minucie wymieszać zawartość każdej studzienki i wyjąć 20 μl w celu policzenia liczby kruszyw.
      1. Jednocześnie wykonaj reprezentatywny obraz pod odwróconym mikroskopem złożonym przy użyciu 10-krotnego powiększenia (obiektyw PLL 10/0,25).
      2. Ręcznie policz agregaty (>6 komórek) za pomocą hemocytometru.
    5. Umieść talerz na shakerze.
    6. Powtórz akwizycję i zliczanie obrazu po 5 minutach i 15 minutach agregacji.
  4. Przeprowadzić kwantyfikację wiązania trans-bindingu.
    1. Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-SerrateTom jako kontrolą tła.
    2. Obliczyć liczbę agregatów na ml między komórkami S2-Notch i S2-Delta lub S2-SerrateTom (wielkość wiązania trans).

3. Ocena inhibicji wiązania między Notch i Trans-ligandami przez cis-ligandy

  1. Przygotuj komórki odbierające sygnał.
    1. Płytka: 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / studzience pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.
    2. Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    3. Współtransfekować komórki poddane działaniu dsRNA za pomocą pBluescript i pMT-Notch11 (DGRC) samodzielnie lub z pMT-Notch i pMT-Delta11 (DGRC) lub pMT-Serrate17 dla całkowitego stężenia DNA 2 μg/studnię przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: pBluescript jest używany jako kontrolka. Współtransfekowane komórki będą dalej nazywaneprzejściowymi komórkami S2-Notch&Delta lub przejściowymi S2-Notch&Ząbkowanymi.
    4. Inkubować przejściowo transfekowane komórki S2 w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
    5. Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
  2. Przygotować komórki wysyłające sygnał zgodnie z opisem w ppkt 2.2.
  3. Przeprowadzić agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały, jak opisano w sekcji 2.3.
  4. Określ ilościowo hamowanie wiązania trans przez cis-ligandy.
    1. Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi jako kontrolka tła.
    2. Określ ilościowo wielkość inhibicji przez cis-ligandy w następujący sposób.
      1. Zdefiniuj A jako liczbę agregacji między komórkamiprzejściowymi S2-Notch i S2-Delta.
      2. Zdefiniuj B jako liczbę agregatów między komórkami S2 przejściowo współtransfekowanymi z komórkami Notch i Delta (przejściowe S2-Notch&Delta) oraz komórkami S2-Delta.
      3. Obliczać agregacja względna C = (B x 100)/A
      4. Obliczać wielkość inhibicji przez cis-ligand (Delta lub Serrate) jako 100 – C.
        UWAGA: Na przykład, jeśli względna agregacja wynosi 45%, uważa się, że cis-ligandy hamują wiązanie trans o 55%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasze in vivo obserwacje sugerowały, że utrata genu ksylozylotransferazy pozory prowadzi do wzmocnienia sygnalizacji Notch w wyniku zwiększonego oddziaływania Delta Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.-aktywacja szlaku Notch bez wpływu na cis-hamowanie szlaku Notch przez ligandy8Aby sprawdzić tę hipotezę, in vitro przeprowadzono testy agregacji komórek. Najpierw, pozorowane zabiegi ekspresję w komórkach S...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sygnalizacja Canonical Notch zależy od interakcji między receptorem Notch a jego ligandami5. Chociaż większość badań nad szlakiem Notch bierze pod uwagę przede wszystkim wiązanie Notch i ligandów w sąsiednich komórkach (trans), ligandy Notch i te same komórki oddziałują ze sobą, a te tak zwane interakcje cis mogą odgrywać rolę hamującą w sygnalizacji Notch 3,4. W związku z tym, aby rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony NIH/NIGMS (R01GM084135 do HJN) oraz Mizutani Foundation for Glycoscience (grant #110071 dla HJN) i są wdzięczni Tomowi V. Lee za dyskusje i sugestie dotyczące testów, a także Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine i The Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) dla plazmidów i linii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioWhittaker Schneider' s Pożywka Drosophila, zmodyfikowanaLonza04-351Q
HyClone Penicylina-Streptomycyna 100X roztwórGE Healthcare nauki przyrodnicze 
Płytka 6-dołkowa CELLSTARGreiner Bio-One657 160
Płytka 24-dołkowa CELLSTAR MiniGreiner Bio-One662160
VWRMarshell Sceintific12520-956
HemocytometrFisher Sceintific 267110
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD Zestaw do transkrypcjiPromegaE2311
MEGAscrip T7AmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (zestaw do oczyszczania RNA)Zymo ResearchR1054
VistaVision Mikroskop odwróconyVWR
9MP USB2.0 Mikroskop cyfrowy + zaawansowane oprogramowanieAmScopeMU-900Akwizycja obrazu za pomocą oprogramowania ToupView
Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu PureLinkInvitrogenK210012
Surowica bydlęca płoduGenDepotF0600-050
MetotreksatSigma-AldrichA6770-10
Hygromycyna BInvitrogenHY068-L6
Siarczan miedziMacron Chemikalia wysokowartościowe4448-02
Komórki S2InvitrogenR69007
S2-SerrateTom komórkiPrezent od R. Fleminga (Fleming i wsp., Rozwój, 2013)
Ogniwa S2-DeltaDGRC152
Ogniwa S2-NotchDGRC154
wektor pMT-DeltaDGRC1021Prezent od S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Ząbkowany wektorPrezent od Kena Irvine'a (Okajima i in., JBC, 2003)
pMT-Notch wektorDGRC1022Prezent od S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPPrezent od Hugo Bellena
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step ZestawApplied Biosystem1611091
Test ekspresji genów TaqMan dla CG9996 (Shams)Applied BiosystemDm02144576_g1 z barwnikiem FAM-MGB
Test ekspresji genów TaqMan dla CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1z barwnikiem FAM-MGB
Applied Biosystems 7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystem435140596-dołkowy moduł blokowy
SV30010 shaker

Bibliografia

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja Notchtest agregacji kom rektransaktywacjacis inhibicjakom rki Drosophila S2liczenie w hemocytometrzewytrz sarka orbitalnaodwr cony mikroskop z o onydwuniciowe RNAindukcja siarczanem miedzi
Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.