Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

Podsumowanie

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech komórek. Opisujemy metodę wykluczenia fluorescencyjnego pozwalającą na pomiar objętości neuronów in vitro w pełnym polu z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów i dynamicznych struktur implikowanych we wzroście neuronów.

Streszczenie

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech neuronów w różnych skalach czasowych. Neurony są dość wyjątkowymi komórkami pod względem ich rozszerzonych, rozgałęzionych morfologii, co w konsekwencji stwarza kilka wyzwań metodologicznych związanych z pomiarem objętości. W szczególnym przypadku wzrostu neuronów in vitro wybrana metodologia powinna obejmować submikrometryczną rozdzielczość osiową połączoną z obserwacją całego pola w skalach czasowych od minut do godzin lub dni. W przeciwieństwie do innych metod, takich jak rekonstrukcja kształtu komórki za pomocą obrazowania konfokalnego, pomiarów elektrycznych lub mikroskopii sił atomowych, niedawno opracowana metoda fluorescencji eXclusion (FXm) ma potencjał, aby sprostać tym wyzwaniom. Jednak, mimo że jest to proste w swojej zasadzie, implementacja FXm o wysokiej rozdzielczości dla neuronów wymaga wielu dostosowań i dedykowanej metodologii. Przedstawiamy tutaj metodę opartą na połączeniu wykluczenia fluorescencji, wielokompartmentowych urządzeń mikroprzepływowych o niskiej chropowatości i wreszcie mikrowzorcowania w celu uzyskania pomiarów in vitro lokalnej objętości neuronalnej. Wysoka rozdzielczość, jaką zapewnia urządzenie, pozwoliła nam zmierzyć lokalną objętość procesów neuronalnych (neurytów) oraz objętość niektórych specyficznych struktur biorących udział we wzroście neuronów, takich jak stożki wzrostu (GC).

Wprowadzenie

Dokładna wiedza na temat objętości komórkowej przyciągnęła w ostatnich latach coraz większą uwagę, napędzaną przez kwestię homeostazy wielkości komórek w mikroorganizmach jednokomórkowych ¹ i bardziej ogólnie w komórkach mitotycznych ². Jednak kwestia objętości komórki jest istotna również w przypadku komórek postmitotycznych, dla których neurony stanowią paradygmatyczny przykład.

Objętość jest rzeczywiście ważną sygnaturą fizjologicznych i patologicznych zdarzeń w różnych skalach i punktach czasowych życia neuronów, od przejściowej deformacji aksonalnej związanej z aktywnością elektryczną (skala milisekundowa) ³ do nieodwracalnego obrzęku neuronów występującego podczas bezobjawowej fazy chorób neurodegeneracyjnych (przez lata u ludzi) ⁴. Jednak największa zmiana objętości zachodzi w pośredniej skali czasowej dni lub tygodni (w zależności od rozpatrywanego organizmu) podczas wzrostu neuronów. Rozszerzona i złożona morfologia neuronów rodzi wiele problemów, wśród których znajduje się regulacja wielkości komórek. Długość i średnica aksonów są rzeczywiście ściśle regulowane in vivo, z wartościami specyficznymi dla każdego typu neuronu ^5,6.

Te problemy, skomplikowane do rozwiązania in vivo, mogą być również rozwiązane w uproszczony sposób in vitro. W tym celu potrzebna jest metoda dedykowana do pomiaru objętości wystarczająco szybka, aby śledzić dynamikę wzrostu (tj. w skali minut) i kompatybilna z obserwacją przez godziny lub dni. Na przestrzeni lat opracowano kilka metod zapewniających bezpośredni lub pośredni dostęp do objętości komórek in vitro. Rekonstrukcja komórek na podstawie obrazowania konfokalnego jest jedną z nich, ale ta metoda zakłada znakowanie i wielokrotne eksponowanie światła, wykazując ograniczoną rozdzielczość osiową około 500 nm ⁷. Zauważ, że te dwie ostatnie wady zostały częściowo przezwyciężone przez bardziej wyrafinowaną i niedawną metodę zwaną mikroskopią świetlną w kratach ⁸. Mikroskopia sił atomowych była używana ⁹, ale ta metoda skanowania jest z zasady powolna i żmudna. Co więcej, fizyczny kontakt, którego wymaga z komórką, może zakłócać pomiar, biorąc pod uwagę ekstremalną miękkość neuronów ¹⁰. Metoda pośrednia wykorzystująca impedancję lub rezonans została zastosowana dla różnych typów komórek ¹¹, ale jest niewystarczająca dla rozszerzonych komórek adhezyjnych, takich jak neurony.

Jedna z najbardziej obiecujących metod opiera się na pomiarze wykluczonej objętości komórek w zamkniętej komorze wypełnionej barwnikiem fluorescencyjnym. Metoda eXclusion fluorescencji (FXm) jest prosta w swojej zasadzie, ponieważ nie wymaga znakowania i nadaje się do szybkiego, długoterminowego obrazowania optycznego populacji komórek z potencjalnie suboptyczną rozdzielczością osiową. Dokładniej rzecz ujmując, rozdzielczość w z zależy od maksymalnego natężenia fluorescencji w komorze hodowlanej (tj. w obszarze pozbawionym komórek) podzielonego przez zakres dynamiczny kamery, chociaż kilka źródeł szumów ogranicza tę ostateczną rozdzielczość. Ta metoda okazała się bardzo skuteczna w śledzeniu objętości migrujących komórek przylegających ¹² lub w badaniu zmiany objętości podczas mitozy komórek ssaków, jak dokładnie opisano w ¹³. Jednak neurony stanowią wyzwanie metodologiczne dla FXm, biorąc pod uwagę ich rozległe rozgałęzienia na procesy submikrometryczne.

Prezentujemy tutaj metodę prowadzącą do produkcji gładkich komór FXm, aby z dużą precyzją uzyskać dostęp do objętości i wysokości gałęzi neuronalnych oraz dynamicznych struktur zaangażowanych we wzrost neuronów, takich jak stożki wzrostu.

Komory powinny mieć podobne wysokości niż mierzony obiekt, aby zoptymalizować rozdzielczość osiową. W związku z tym zaprojektowaliśmy różne urządzenia FXm charakteryzujące się centralnymi komorami pomiarowymi o trzech różnych wysokościach. Najcieńsza z nich (3 μm wysokości) jest przeznaczona do pomiaru neurytów: ta niewielka wysokość nie obejmuje somy, która pozostaje w komorze pośredniej o wysokości blisko 15 μm. Grubsze komory centralne (10 i 12 μm) są wystarczająco wysokie, aby śledzić wzrost całej komórki. Urządzenie zawiera również dwa zbiorniki umieszczone po obu stronach centralnej komory. W ten sposób realizowane są cztery otwory iniekcyjne (IH), które są oznaczone w następujący sposób: wlot i wylot służą do wprowadzania zawiesin komórkowych do chipa, podczas gdy dwa pozostałe zasilają zbiorniki.

Najpierw wyprodukowaliśmy szkiełka nakrywkowe do kalibracji do pomiarów wysokości przy użyciu struktur fotorezystu o znanej geometrii. Następnie zobrazowaliśmy swobodnie rosnące neurony, ale także morfologicznie ograniczone neurony do mikrowzorców adhezji.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych: 86/609/EEC. Cel badawczy i protokół są opisane w Aneksie Etycznym projektu ERCadg CellO, który został zatwierdzony i jest regularnie weryfikowany przez ERCEA. Zakład hodowli zwierząt Instytutu Curie otrzymał licencję #C75-05-18, 24/04/2012, podlegającą Comité d'Ethique en matière d'expérimentation animale Paris Centre et Sud (krajowy numer rejestracyjny: #59).

1. Wykonanie formy

UWAGA: Forma zawiera komory centralną i pośrednią połączone z wlotem i wylotem, a także dwa zbiorniki (i wloty) znajdujące się po obu stronach komory centralnej.

1. Za pomocą płaskiej pęsety manipuluj waflami krzemowymi o średnicy 51 mm i przenoś je z miejsca na miejsce.
2. Forma silikonowa z centralną komorą
   1. Napełnij plastikową pipetę o pojemności 2 ml dodatnim fotorezystem. Umieść pipetę na środku płytki krzemowej o średnicy 51 mm i dociśnij jej zbiornik, aż pokryje około 75% powierzchni płytki fotorezystem. Wirowanie z prędkością 3000 obr./min przez 30 s.
   2. Przenieść wafel z wirówki na płytę grzejną o temperaturze powierzchni 100 °C na 50 s.
   3. Przenieś wafel z płyty grzejnej do uchwytu podłoża (uchwytu) nakładki maski. Eksponuj za pomocą "maski DRIE" (patrz Pliki uzupełniające "masks_neuron_volume_chips.tiff" i "masks_neuron_volume_chips.dxf").
   4. Wyjmij wafel z uchwytu, a następnie zanurz go w szklanym naczyniu krystalizującym o pojemności 100 ml zawierającym wywoływacz (rozcieńczenie 1:4 w wodzie dejonizowanej). Uwolnij wafel i utrzymuj go przez 1 minutę, ciągle i delikatnie mieszając naczynie krystalizujące.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić odczynniki, napełnij naczynie krystalizujące maksymalnie do 1 cm wysokości.
   5. Weź wafel z wywoływacza i zanurz go w naczyniu krystalizującym o pojemności 100 ml wypełnionym wodą dejonizowaną na około 10 s. Następnie umieść wafel na bilecie chłonnym i wysusz go azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.
   6. Umieść wafel na 50 s na płycie grzejnej o temperaturze powierzchni 115 °C.
   7. Wykonaj głęboko reaktywne trawienie jonowe (DRIE) z następującymi parametrami (więcej informacji na temat techniki DRIE można znaleźć w piśmiennictwie ¹⁴ i ¹⁵); Etap pasywacji: 50 sccm C4F8, przepływ wsteczny He 10 sccm, CP 10 W, plazma sprzężona indukcyjnie (ICP) 1500 W, ciśnienie całkowite 24 mbar, temperatura 18 °C; Etap wytrawiania: 100 sccm SF6, przepływ He 10 sccm, CP 11 W, ICP 1500 W, ciśnienie całkowite 24 mbar, temperatura 18 °C; Czas pasywacji: 4 s; Czas trawienia: 7 s; Całkowity czas trwania procesu: zwykle 5 minut dla głębokości trawienia około 10 μm.
   8. Rozpuść fotorezyst, zanurzając podłoże w naczyniu krystalizującym wypełnionym acetonem.
   9. Zanurz wafel w roztworze piranii (2/3_H2O2(30%) i 1/3_H2SO4 (95%)) na 5 min.
      Ostrzeżenie: Zawsze najpierw dodawaj_H2O2, a następnie_H2SO4i po oczyszczeniu spłucz co najmniej 3 razy w wodzie dejonizowanej.
3. Wykonać formy odpowiadające komorom pośrednim, wykonując kroki od 1.2.1 do 1.2.11 zgodnie z parametrami wymienionymi w tabelach 1-3.
   UWAGA: Każdy stół odpowiada danemu urządzeniu charakteryzującemu się określoną wysokością centralnej komory obserwacyjnej.
   UWAGA: Wykonaj cały proces, zwiększając wysokości fotorezystorów (maski od 1 do 3 dla każdego urządzenia, patrz Pliki uzupełniające "masks_neuron_volume_chips.tiff" i "masks_neuron_volume_chips.dxf").
   1. Umieść wytrawioną płytkę krzemową na uchwycie podłoża do powlekania wirowego.
      1. Sprawdź, czy wirownik działa prawidłowo, sprawdzając, czy aspiracja podłoża jest skuteczna (podłoże powinno obracać się i pozostawać na miejscu podczas nominalnej prędkości obrotowej).
      2. Lepkość SU-8 wzrasta wraz z wysokością docelowego zakresu grubości. Zawsze używaj butelek o pojemności 20-30 ml do przechowywania fotorezystorów SU-8 i wylewaj je na wafel przed wirowaniem (SU-8 może być zbyt lepki, aby można było nim manipulować plastikową pipetą).
   2. Wlać ujemny fotorezyst epoksydowy SU-8 na środek podłoża, aż pokryje około 75% płytki krzemowej, a następnie pokryć wirowo przy użyciu parametrów wskazanych w wierszu "Powlekanie przędzalniczym" tabel.
   3. Umieść powlekany wafel na płycie grzejnej na czas i temperaturę wskazanych w wierszu "Miękkie pieczenie".
   4. Zamontuj wytrawioną płytkę i odpowiednią "maskę SU-8" na wyrównywaczu maski.
   5. Wyrównaj wytrawioną płytkę z maską za pomocą dedykowanych krzyżyków wyrównujących (typowy rozmiar tych krzyżyków: 50 μm × 150 μm) zaprojektowanych na każdej masce.
      UWAGA: Wystarczą dwa krzyżyki z każdej strony urządzenia (jeden w lewym dolnym rogu i jeden w prawym górnym rogu).
   6. Naświetlić za pomocą linii I nakładki maski (długość fali 365 nm) z odpowiednią dawką UV, jak wskazano w wierszu "Energia ekspozycji".
      UWAGA: Czas naświetlania oblicza się, dzieląc energię ekspozycji E właściwą dla każdego fotorezystu przez efektywną moc lampy UV, modulowaną przez absorpcję maski: x (1- _Maska absorpcyjna). Absorpcja wynosi około 20% w przypadku masek elastycznych i znikoma w przypadku masek chromowych.
   7. Umieść powlekaną wafel na płycie grzejnej na czas i temperaturę wskazanych w wierszu "Po upieczeniu".
   8. Przygotuj dwie szklane naczynia krystalizujące o pojemności 100 ml, z których jedno zawiera wywoływacz, a drugie jest puste. Zanurz wafel w wywoływaczu na czas wskazany w wierszu "Rozwój". Delikatnie mieszaj naczynie krystalizujące przez cały czas rozwoju
   9. Posyp wafel izopropanolem nad pustym naczyniem krystalizacyjnym przez około 5 sekund. Na koniec umieść wafel na chłonnym papierze i osusz go azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.
   10. Umieść powlekaną płytkę na płycie grzejnej na czas i temperaturę wskazywaną w wierszu "Twarde pieczenie" (opcjonalnie).
       UWAGA: Ten krok jest przydatny, aby uniknąć pęknięć w fotorezyście i zapewnić jednorodną płaską powierzchnię dla następnych kroków.
   11. Powtórz kroki 1.3.1 - 1.3.10, aby zakończyć procesy wymienione w tabeli 1-3.
   12. Po ostatnim etapie fotolitografii, ssilanizować końcową formę wzorcową składającą się z 3 warstw negatywowych fotorezystów, wysyłając dwie krople trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-oktylo)silanu po każdej stronie wzorca na 100-milimetrowej szalce Petriego. Uszczelnić krążek Petriego folią parafinową z tworzywa sztucznego i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
       UWAGA: Forma wzorcowa jest gotowa i może być używana kilka razy.

2. Produkcja układu PDMS

1. Wlej 90 g polimeru organicznego na bazie krzemu (polidimetylosiloksan: PDMS) do plastikowego kubka o pojemności 100 ml. Dodaj 10 g utwardzacza (1:10 wagowo). Mieszaj mieszaninę za pomocą plastikowej pipety przez 2-3 min.
   UWAGA: Wymieszaj 90 g PDMS z 10 g utwardzacza w celu wytworzenia 6 wiórów.
2. Umieść mieszaninę w eksykatorze próżniowym i pompuj przez około 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w PDMS.
3. Umieść formę wzorcową na szalce Petriego P100 i wlej 15 ml mieszanki na formę za pomocą strzykawki.
   UWAGA: 15 ml prowadzi do całkowitej wysokości wióra 1,5 mm.
4. Umieść strukturę formy PDMS w eksykatorze próżniowym i pompuj, aż na powierzchni PDMS.
   nie będzie już pękających pęcherzyków powietrza. UWAGA: Ten krok zajmuje około 30 minut.
5. Wepchnij wafel na dno szalki Petriego za pomocą końcówki stożka, aby uniknąć martwej objętości PDMS poniżej płytki. Umieść urządzenie do formowania PDMS w piekarniku ustawionym na 70 °C na co najmniej 2 godziny.
6. Wyjmij blok PDMS pod okap chemiczny za pomocą płaskiej szpatułki ze stali nierdzewnej i wlewając izopropanol na chip. Umieść go na ławce ze stali nierdzewnej okapu.
7. Przeciąć wokół płytki silikonowej i rozformować replikę PDMS za pomocą skalpela.
8. Wytnij wiór (zostaw 2-milimetrowy margines) za pomocą skalpela lub żyletki.
9. Przebij wloty, mocno naciskając dziurkacz o średnicy 1.5 mm i uruchamiając go, aby wyciąć i wyciąć otwór wlotu. Zrób to samo w czterech dedykowanych strefach chipa, w których zostanie wstrzyknięta ciecz
.
10. Oczyść chip, przyklejając i odklejając taśmę klejącą po stronie mikrostrukturalnej. Posyp izopropanolem z obu stron. Następnie wysuszyć wiór azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.

3. Produkcja wzorzystych szkiełek nakrywkowych (24 × 24 mm²)

UWAGA: Manipuluj szkiełkami nakrywkowymi za pomocą zakrzywionej pęsety.

1. Wzory z poliornityny (PLO)
   1. Nałóż plazmę czyszczącą_O2 na szklane szkiełka nakrywkowe. Parametry plazmy: ciśnienie odpompowywania: 0,25 mbar; Ø₂ czas dostawy: 3 min; przepływ gazu: 10 sccm; maksymalne odchylenie: ±5 sccm; Czas trwania plazmy: 3 min; ciśnienie nastawy: 0,36 mbar; maksymalne odchylenie: ±0,10 mbar; moc zestawu: 50 W; maksymalne odchylenie: 5%; Czas odpowietrzania: 45 s.
   2. Zmieszaj 484 μl kwasu octowego i 56 μl 3-metakryloksyloksypropylo-trimetoksysilanu, w komplecie z absolutnym etanolem, aby uzyskać całkowitą objętość 15 ml.
   3. Za pomocą stożka z końcówką o pojemności 1 ml nanieś kroplę 500 μl tego roztworu na każde szkiełko nakrywkowe, odczekaj 2-3 minuty. Wysuszyć za pomocą wycieraczki z mikrofibry do pomieszczeń czystych.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe ze szkła silanizowanego można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze pokojowej w plastikowych pudełkach zamkniętych plastikową folią parafinową.
   4. Umieść każde szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej znajdującej się w pomieszczeniu czystym. Umieść kroplę dodatniego fotorezystu pokrywającą około 75% szkiełka nakrywkowego (około 500 μl) i wiruj z prędkością 4000 obr./min przez 30 s, aby osiągnąć końcową grubość 0,45 μm.
   5. Umieść szkiełka nakrywkowe na 1 minutę na płycie grzejnej o temperaturze powierzchni 115 °C.
   6. Za pomocą nakładki na maskę naświetlić każde szkiełko nakrywkowe na długości fali 435 nm (G-line) przez dedykowaną maskę zgodnie z parametrami producenta (dawka UV około 50-60 ^mJ.cm-1)
   7. Przygotuj 2 szklane naczynia krystalizujące, jedno zawierające wywoływacz (bez rozcieńczania), drugie zawierające wodę dejonizowaną.
   8. Zanurzaj kolejno każde szkiełko nakrywkowe w wywoływaczu przez 1 minutę, ciągle i delikatnie mieszając naczynie krystalizujące. Następnie zanurz wafel w wodzie dejonizowanej na około 5 sekund. Umieść wafel na chłonnym papierze i osusz go azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.
   9. Zastosować aktywację plazmy_O2 o takich samych parametrach jak w ppkt 3.1.1.
   10. Pod maską umieść cztery krople 170 μl roztworu PLO o stężeniu 100 μg/ml na szalkę Petriego P100. Umieść wzorzystą powierzchnię szkiełek nakrywkowych na każdej z tych kropli. Uszczelnij szalkę Petriego plastikową folią parafinową, aby uniknąć wysuszenia. Inkubować przez noc w temperaturze RT.
       UWAGA: Roztwór PLO powinien pozostać połączony z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą kapilarności.
   11. Przygotuj cztery pojemniki (zazwyczaj szalki Petriego P60), napełnij trzy z nich PBS, a czwarty wodą dejonizowaną. Przygotuj dwie szklane naczynia krystalizujące z czystego etanolu.
   12. Wyjąć każde szkiełko nakrywkowe z szalek Petriego, zanurzyć je w pierwszej kąpieli PBS na 10-15 s, usunąć płyn na chłonną tkankę, kładąc szkiełko nakrywkowe pionowo na boku, włożyć je np. wzorzystą stroną do góry do kąpieli etanolowej.
       UWAGA: Po zakończeniu rozpuszczania fotorezystu trudno jest zlokalizować wzorzystą stronę szkiełka nakrywkowego. Dlatego ważne jest, aby na tym etapie prześledzić jego lokalizację.
   13. Umieść naczynie krystalizujące etanolu w sonikatorze do kąpieli ultradźwiękowej (120 W / 35 kHz) i pozwól fotorezystorowi rozpuścić się przez 3 minuty
       UWAGA: Zmieniaj kąpiel etanolową co 4 szkiełka nakrywkowe, aby ograniczyć rozcieńczanie przez PBS, które może pogorszyć rozpuszczanie fotorezystu.
   14. Wyjąć szkiełko nakrywkowe z kąpieli etanolowej, a następnie zanurzyć je kilkakrotnie w drugiej kąpieli PBS. Kilkakrotnie sprawdzaj wygląd powierzchni, aż zniknie tłusta powierzchnia, która powstaje z pozostałej ciekłej warstwy etanolu.
   15. Zanurz szkiełko nakrywkowe na 5-10 s w trzeciej kąpieli PBS. Następnie natychmiast przenieś go do łaźni wodnej dejonizowanej. Umieść szkiełko nakrywkowe na chłonnym papierze i osusz je azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.
       UWAGA: Ostatnie płukanie w wodzie dejonizowanej służy do uniknięcia tworzenia się kryształów PBS na etapie suszenia.
2. Konstrukcje fotorezystowe do kalibracji wysokości
   1. Wykonaj tylko kroki od 3.1.4. do 3.1.8. za pomocą dedykowanej maski (maska "Paski fotorezystu", patrz Plik uzupełniający "Mask_Photoresist-paski.dxf").

4. Montaż chipów i końcowa implementacja

1. Montaż wiórów na naczyniach ze szklanym dnem
   1. Umieść zarówno chip PDMS, jak i szklane naczynie, na którym zostanie połączony, w komorze plazmowej w celu aktywacji powierzchniowej. Parametry: ciśnienie pompowania: 0,25 mbar; Ø₂ czas dostawy: 3 min; przepływ gazu: 10 sccm; maksymalne odchylenie: ±5 sccm; Czas działania plazmy: 30 s; ciśnienie nastawy: 0,40 mbar; maksymalne odchylenie: ±0,10 mbar; moc zestawu: 50 W; maksymalne odchylenie: 5%; Czas odpowietrzania: 45 s.
   2. Delikatnie umieść aktywowany chip PDMS w kontakcie ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij krawędzie chipa, aby przymocować chip do szkiełka nakrywkowego. Aby zwiększyć siłę wiązania, umieść urządzenie w piekarniku w temperaturze 70 °C na 5 do 10 minut.
      UWAGA: Nie naciskaj na części zawierające filary, mogą się zapaść pod zbyt dużym naciskiem.
   3. Pod maską (tj. w temperaturze pokojowej) i w ciągu 30 minut po klejeniu umieść 10-μl stożek końcówki wypełniony roztworem PLO o stężeniu 100 μg/ml w IHs, a następnie wstrzyknij płyn. Dostosuj głośność tak, aby utworzyła kroplę na górze każdego IHs. Następnie, używając stożka końcówki o pojemności 1 ml, dodaj PBS na szalce Petriego dookoła chipa.
   4. Pozwól chipowi na RT z co najmniej 2 godzinnym czasem inkubacji. Do inkubacji przez noc uszczelnić szalkę Petriego plastikową folią parafinową, aby uniknąć wysuszenia.
      UWAGA: Płyn nie powinien wyciekać na zewnątrz chipa, w przeciwnym razie chip należy wyrzucić.
   5. Lekko wciśnij stożek końcówki o pojemności 10 μl w każdy IH i zassaj nadmiar płynu. Następnie całkowicie wbij stożek końcówki do wylotu i wciągnij pozostały płyn.
   6. Zastąp PLO lamininą, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w krokach 4.1.5 (opróżnianie) i 4.1.3 (napełnianie). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   7. Zastąp lamininę pożywką hodowlaną, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w krokach 4.1.5 (opróżnianie) i 4.1.3 (napełnianie). Skład pożywki: MEM 81,8%; pirogronian sodu 100 mM 1%; Glutamax 200 mM 1%; surowica końska 5%; Suplement B27 2%, suplement N2 1%, gentamycyna 0,2%; Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 220 nm. Używając stożka końcówki o pojemności 1 ml, zastąp również PBS otaczający chip tym medium.
   8. Umieścić chip w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na co najmniej 5 godzin (lub przez noc) przed wysiewem neuronów.
2. Składanie wiórów za pomocą wzorzystych szkiełek nakrywkowych
   UWAGA: Jeśli wzorzyste szkiełka nakrywkowe zawierają dodatnie obiekty odniesienia fotorezystu, wykonaj kroki od 4.2.1 do 4.2.9. W przeciwnym razie wykonaj tylko krok 4.2.3, przyklej urządzenie PDMS do szkiełka nakrywkowego z wzorem PLO, jak wskazano w 4.1.2, umieść pożywkę hodowlaną wewnątrz i wokół chipa, a następnie przejdź do kroku 4.2.10.
   1. Umieść kroplę wody na prostokątnym szkiełku mikroskopowym o grubej grubości i przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka kapilarnego (stroną bez wzoru skierowaną w stronę szkiełka podstawowego). Pod mikroskopem zaznacz położenie pasków fotorezystu z tyłu szkiełka za pomocą pisaka.
   2. Umieść wzorzyste szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie maski nakładki do maski. Polegaj na znaku wykonanym pisakiem, aby wyśrodkować obiekty referencyjne fotorezystu.
   3. Wykonaj krok plazmy zgodnie z opisem w 4.1.1 na chipie PDMS.
   4. Umieść chip PDMS na ruchomym uchwycie podłoża (uchwycie) nakładki do maski.
      UWAGA: Aby zwiększyć kontrast optyczny, umieść płytkę krzemową pod chipem PDMS. Płytka silikonowa powinna pozostać mocno przymocowana do uchwytu podczas procesu wyrównywania (użyj przezroczystej taśmy, aby przykleić ją do uchwytu).
   5. Podnieś uchwyt na granicy kontaktu mechanicznego, aby wyrównać chip z układem pasków fotorezystu znajdujących się na szkiełku nakrywkowym.
   6. Osiągnij kontakt mechaniczny między wiórem a szkiełkiem nakrywkowym, kończąc podnoszenie uchwytu, aż powierzchnia słupków PDMS dotknie szklanego szkiełka nakrywkowego.
   7. Opuść uchwyt. Usuń szkiełko nakrywkowe, które jest teraz połączone z chipem, z uchwytu maski. Następnie umieść urządzenie na szalce Petriego o średnicy 35 mm i przenieś wszystko do piekarnika (temperatura: 70 °C) na 5 do 10 minut, aby zwiększyć siłę wiązania.
   8. Wykonaj jak w kroku 4.1.3.
      UWAGA: jeśli używasz szkiełek nakrywkowych z wzorem PLO, przejdź bezpośrednio z kroku 4.2.7 do kroku 4.2.9.
   9. Zastąpić PLO medium galwanicznym, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4.1.5 (opróżnianie) i 4.1.3 (napełnianie). Używając stożka końcówki o pojemności 1 ml, zastąp również PBS otaczający chip tym medium.
   10. Umieścić chip w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do momentu wysiewu neuronów, z minimalnym czasem inkubacji wynoszącym 5 godzin.

5. Hodowla neuronów

1. Przygotować 100 ml pożywki rozwarstwiającej (pożywki HH), mieszając 10 ml HBSS 10x, 2 ml Hepes 1 M i 88 ml sterylnej wody w plastikowej kolbie o pojemności 200 ml.
   UWAGA: Pożywkę HH można przygotować dzień przed hodowlą.
2. Wypreparuj hipokamp z zarodka myszy E18 pobranego od matki uśpionej przez zwichnięcie szyjki macicy (myszy C57BL / 6J z Charles Rivers). Etapy sekcji są np. szczegółowo opisane w ¹⁶.
3. Umieścić hipokamp w plastikowej probówce zawierającej trypsynę (0,3 ml trypsyny 2,5%, bez EDTA w 2,7 ml pożywki HH) na 10 minut w temperaturze 37 °C w celu zainicjowania dysocjacji chemicznej.
4. Wyrzuć prawie cały płyn i zastąp go 5 do 10 ml HH za pomocą jednorazowych plastikowych pipet. Zrób to 3 razy. Do ostatniego napełnienia użyj 1 ml podłoża galwanicznego zamiast HH.
5. Mechanicznie rozdziel tkanki za pomocą stożka końcówki o pojemności 1 ml, kilkakrotnie zasysając i wyrzucając pełną objętość, unikając tworzenia pęcherzyków i używając nie więcej niż 15-20 pasaży.
6. W oddzielnym zbiorniku o pojemności 500 μl przygotować roztwór, używając 5 μl zawiesiny komórek rozcieńczonej w 45 μl PBS. Pobrać 1 μl tego roztworu za pomocą pipety o pojemności 10 μl i umieścić rozcieńczoną zawiesinę w liczniku komórek Malasseza. Użyj wskazówek podanych w ¹⁷, aby oszacować liczbę komórek.
   UWAGA: Pojedynczy hipokamp zwykle dostarcza około 0,5 miliona neuronów.
7. Wirować przy 100 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej.
8. Odrzucić supernatant i zastąpić go objętością podłoża galwanicznego wymaganą do osiągnięcia stężenia 10 milionów komórek/ml. Ponownie zawiesić komórki, kolejno aspirując i wyrzucając zawiesinę komórek za pomocą stożka końcówki o pojemności 1 ml.
9. Pobrać podłoże galwaniczne znajdujące się w wiórze (patrz krok 4.1.5). Zebrać 2-3 μl świeżo zawieszonego roztworu za pomocą pipety 10 μl i wstrzyknąć go na wlocie (patrz procedura wstrzykiwania opisana w kroku 4.1.3). Natychmiast powtórz tę samą operację na wylocie.
10. Wstrzyknąć mniej więcej taką samą objętość podłoża galwanicznego do każdego zbiornika (patrz krok 4.1.3).
    UWAGA: Szybko obserwuj chip pod mikroskopem, aby sprawdzić gęstość komórek. Rząd wielkości optymalnej gęstości komórek odpowiada około 5-10 komórkom w kwadratowej powierzchni ograniczonej 4 filarami (około 0,3 mm², czyli około 15-20 komórek na mm²).
11. Na koniec powtórz krok 5.10, używając zamiast tego 0,5-1 μl zawiesiny komórek, aby osiągnąć docelową gęstość komórek.
12. Umieścić wysiane wióry w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO_{2 .}

6. Obserwacja wykluczenia fluorescencji

1. Zastąpienie pożywki hodowlanej pożywką do obrazowania.
   1. Przygotować pożywkę do obrazowania jak w ppkt 4.1.7, ale zamiast niej użyć MEM pozbawionego czerwieni fenolowej i dodać dekstran fluorescencyjny. W tym celu należy rozcieńczyć dekstran (masa cząsteczkowa 10 000 g/mol, roztwór podstawowy stężony w stężeniu 10 mg/ml w PBS) w celu uzyskania końcowego stężenia 0,5-1 mg/ml w pożywce do obrazowania.
      UWAGA: Należy stosować koniugaty Dekstranu z maksimami absorpcji/emisji 496/524 lub 650/668. Preferuj pierwszy do obrazowania dodatnich struktur fotorezystu o wysokiej wielkości 0,45 μm (aby pozbyć się ich autofluorescencji w czerwonym paśmie), a drugi do obrazowania neuronów (mniej toksyczny).
   2. Opróżnij wszystkie wloty za pomocą pipety o pojemności 10 μl i ponownie napełnij je całkowicie pożywką do obrazowania (patrz kroki 4.1.3 i 4.1.5, aby zapoznać się z dokładną metodologią wymiany pożywki).
2. Obrazowania
   1. Umieść chip pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w komorę środowiskową o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Użyj 40-krotnego obiektywu z przysłoną numeryczną (NA) 0,8 suchego, 30% pełnej mocy (pełna moc: 3 W) i 30 ms czasu naświetlania. Pozyskiwanie obrazów komórek w pozycji ostrej (od jednego do wielu kolejnych obrazów w przypadku eksperymentów poklatkowych).
3. Analiza obrazu
   1. Normalizuj obrazy za pomocą procedury redukcji tła zaimplementowanej w dedykowanym oprogramowaniu, aby uzyskać jednorodne tło. Zobacz ¹³, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat etapów przetwarzania obrazu zawartych w tym oprogramowaniu. Obraz wyjściowy ma rozszerzenie . w formacie MAT.
   2. nawrócić. MAT do pliku . TIFF 8-bitowe obrazy za pomocą procedury umieszczonej w materiale uzupełniającym (conversion_mattotiff.m, która wywołuje plik importfilevol.m).
   3. Wykonaj polecenie Importuj sekwencję obrazów > na ImageJ, aby zbudować wideo z pliku . Obrazy TIFF.
   4. Obliczyć średnie natężenie P kwadratowego obszaru zlokalizowanego w środku filaru (obiektu odniesienia) oraz średnie natężenie B kwadratowego obszaru komory pozbawionego komórek (tło, tj. wysokość zero). Zobacz ¹⁸, aby zapoznać się z przykładem szczegółowej metodologii przetwarzania obrazów.
      UWAGA: Wymiar boczny kwadratowych obszarów używanych jako odniesienia intensywności musi wynosić około połowy średnicy słupka, aby uzyskać wystarczającą liczbę pikseli, unikając jednocześnie zanieczyszczenia światłem od krawędzi słupków.
   5. Użyj wartości P i B, aby ustalić prawo konwersji liniowej od intensywności i do wysokości h:
      
      z h_c znaną wysokością komory, i
      UWAGA: PDMS nie wyświetla wykrywalnej autofluorescencji.
   6. Wybierz obszar wokół strefy zainteresowania, zintegruj intensywność za pomocą ImageJ (zobacz ¹⁹, aby uzyskać więcej informacji) i zastosuj prawo konwersji uzyskane w 6.3.5 do pomiaru objętości komory komórkowej.
      UWAGA: Strefa zainteresowania może być wybrana na podstawie fluorescencji elementów subkomórkowych, takich jak aktyna, np. w celu wyboru stożków wzrostu w neuronach GFP-LifeAct, wybierz strefę zainteresowania w kanale emisyjnym GFP, zapisz kontur tej strefy za pomocą narzędzia do zarządzania zwrotem z inwestycji, a następnie zmierz objętość komórki zamkniętej w tej samej strefie w kanale emisyjnym dekstranu (na czerwono).

Wyniki

Wynik procesu produkcji opisanego w sekcjach 1 i 2 jest zilustrowany obrazami Rysunek 1A-1B i krzywą Rysunek 1C. Tabela Rysunek 1D przedstawia wartości chropowatości dwóch różnych reprezentatywnych obszarów układu PDMS, tj. w centralnej i następnej komorze pośredniej o wysokości 20 μm. Zmniejszenie chropowatości około 7-krotnie uzyskano dzięki zastosowaniu wytrawionej płytki Si zamiast fotorezystu SU-8. Następnie FXm został najpierw nałożony na pasek fotorezystu o znanej geometrii (Rysunek 2A) w komorze o wysokości 10 μm. Po przetworzeniu obrazu i przeliczeniu intensywności na wysokość (patrz wykres Rysunek 2B), profile FXm wykonane na przekrojach wzdłuż tego pasa (Rysunek 2C) zapewniają pożądane profile wysokości (Rysunek 2D). Rysunek 2D przedstawia porównanie profili uzyskanych za pomocą profilometrii mechanicznej i metod FXm. Profile te, w tym wartość krawędzi i płaskowyżu, są bardzo podobne, co potwierdza słuszność metody. Należy zauważyć, że rozproszenie danych FXm nie jest reprezentatywne dla ostatecznej rozdzielczości metody, jak dalej oceniano w Rysunek 3 i Rysunek 4, ale wynika z niskiej intensywności zastosowanej w celu uniknięcia możliwego efektu bardzo słabej autofluorescencji fotorezystu w kanale GFP.

Następnie obserwowaliśmy neuryty w wysokich komorach 3 μm i 10 μm (Rysunek 3). Odchylenie standardowe szumu tła wynosi około 18 nm po przeliczeniu intensywności na wysokość i korekcji tła. Wartość ta jest nieco wyższa niż chropowatość fizyczna powierzchni PDMS odlanych na powierzchniach krzemowych (12 nm, patrz tabela Rysunek 1D), ale znacznie niższa niż chropowatość zmierzona na PDMS uzyskana z form SU-8. Wyniki te podkreślają wartość dodaną wiercenia studni w płytkach krzemowych, a nie otwierania otworów w fotorezyście SU-8 w celu odlewania filarów. Tak niska wartość pozwala na uzyskanie wysokiego stosunku sygnału do szumu i bardzo wyraźnych obrazów w objętości, takich jak ten wyświetlany w Rysunek 3A. Jako przykład danych, które można uzyskać z takich obrazów, obliczyliśmy objętość wycinka neurytu o szerokości 1,6 μm (tj. 10 pikseli) (patrz wykres Rysunek 3B). Użycie w pierwszym przybliżeniu liniowego dopasowania tych danych daje średnią wartość wysokości neurytu wynoszącą około 400 nm, którą można porównać np. ze średnicą aksonalną 500 nm stwierdzoną u 10-dniowych szczeniąt w obrębie ciała modzelowatego ⁵. Połączyliśmy również FXm z mikrowzorami adhezji składającymi się z szeregowo przylegających pasów o szerokości 2 μm i 6 μm o długości 30 μm. Naszym celem było zbadanie wpływu szerokości neurytu na jego kształt 3D. Rysunek 3C pokazuje reprezentację 3D w fałszywych kolorach całego obrazu neuronu uzyskanego w komorze o wysokości 10 μm. Neuryty rozprzestrzeniają się na paskach o szerokości 2 μm i 6 μm, podczas gdy soma znajduje się na końcu największego paska. Profile wysokości zostały narysowane w trzech różnych przekrojach. Zgodnie z wykresem wyświetlanym na Rysunek 3A, powierzchnia całkowana przez przekroje zwiększa się wraz z szerokością neurytu (Rysunek 3D).

Skupiliśmy się również na strukturach 3D stożka wzrostu (GC). Rysunek 4A-B przedstawia dwa różne profile GC uzyskane w komorze o wysokości 3 μm, które podkreślają ich rozgałęzioną strukturę nośną. Ponadto przeprowadziliśmy eksperymenty poklatkowe w celu prześledzenia dynamiki objętości GC w komorze o wysokości 12 μm. Rysunek 4C przedstawia cykl kurczenia się i reaktywacji danego GC w skali czasowej kilkudziesięciu minut. Dzięki zastosowaniu myszy GFP-lifeact, stożki wzrostu zostały zlokalizowane w długości fali emisji GFP (510 nm) z powodu ich wysokiego stężenia aktyny. Powierzchnia zidentyfikowana na długości fali została wykorzystana do całkowania przez długość fali emisji dekstranu przy długości fali 647 nm w celu obliczenia objętości GC. Rysunek 4D pokazuje na końcu rozkład objętości GC w różnych punktach czasowych i miejscach na trzech różnych neuronach, wyśrodkowanych na wartości około 6^μm3.

Rysunek 1: Komory FXm PDMS. (A) Schematy czterech różnych głównych etapów mikrofabrykacji prowadzących do ostatecznej formy. Wskazana jest lokalizacja wlotu, wylotu i zbiorników. Podziałka: 1 mm. (B) Obraz komory PDMS FXm uzyskany za pomocą profilometru optycznego. Zdjęcie przedstawia centralną komorę zawierającą 3 rzędy słupów o wysokości 10 μm oraz komory pośrednie o wysokości 20, 50 i 90 μm. Podziałka liniowa: 500 μm. (C) Przekrój poprzeczny wióra wzdłuż dwóch linii przerywanych narysowanych w (B). Żółty/złoty: przekrój poprzeczny wzdłuż filarów, niebieski: przekrój poprzeczny między filarami. (D) Średnie wartości chropowatości PDMS mierzone na obszarach o wielkości 50 × 50^μm2 uformowanych na krzemie oraz na komorze pośredniej SU-8 o wysokości 20 μm (położenie tych obszarów jest zaznaczone strzałkami). Średnie wartości uzyskano z pomiarów trzech różnych obszarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kalibracja metody FXm z wykorzystaniem paska fotorezystu jako obiektu zainteresowania. (A) Obraz fluorescencji GFP wykonany w komorze o wysokości 10 μm wypełnionej dekstranem o mocy 10 000 MW absorbującym przy 488 nm przy 1 mg/ml. (B: tło, P: filar). Obserwacja suchym obiektywem 40X NA 0.8. Podziałka skali: 50 μm. (B) Liniowe prawo kalibracji uzyskane ze średniej intensywności dwóch kolorowych prostokątów pokazanych w A. (C) Profil intensywności fluorescencji uzyskany na poziomie niebieskiej linii przerywanej wyświetlanej w (A), przecinającej pasek fotorezystu (wysoki dodatni fotorezyst 0,45 μm). (D) Porównanie profili uzyskanych z profilometru mechanicznego (czarne kropki) i FXm po przeliczeniu intensywności na wysokość danych z (B) (niebieskie kropki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obrazowanie objętości neurytu. (A) Neuryt rozciągający się do centralnej komory o wysokości 3 μm z somy znajdującej się w następnej komorze pośredniej o wysokości 15 μm. Obrazowanie wykonano przy użyciu dekstranu o mocy 10 000 MW absorpującego przy długości fali 488 nm i obiektywu 40X, NA 0,8 suchego. Wstawka uzyskana po użyciu procedury redukcji tła podkreśla dwa neuryty i wybiera je do wykreślenia wykresu po prawej stronie. Podziałka skali: 30 μm. (B) Objętość wycinka neurytu w funkcji szerokości neurytu otrzymanej z 22 profili (średnio dla 10 pikseli, tj. dla "wycinka neurytu" o grubości 1,6 μm) pokazanego w (A). Linia ciągła reprezentuje liniowe pasowanie nachylenia 0,4 μm przechodzące przez początek układu współrzędnych. (C) Obraz w fałszywym kolorze wzorzystego neuronu na samoprzylepnym pasku złożonym z kolejnych kikutów o szerokości 2 μm i 6 μm (reprezentowanych na biało). Pomiary wykonano w komorze o wysokości 10 μm wypełnionej dekstranem o mocy 10 000 MW absorbującym przy długości fali 647 nm i przy użyciu suchego obiektywu 40x NA 0,8. (D) Profile wysokości odpowiadające kolorowym liniom przerywanym pokazanym w (C), zachowując ten sam kod koloru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Statyczne i dynamiczne obrazowanie stożków wzrostu. Punkty A-B) Profile wysokości stożka wzrostu uzyskane w komorze o wysokości 3 μm po przeliczeniu intensywności na wysokość wzdłuż żółtych linii wyświetlanych na powiązanych obrazach. Obserwacja wykonana przy użyciu wypełnienia dekstranem o mocy 10 000 MW pochłaniającym przy długości fali 488 nm i suchej obiektywie 40X, NA 0,8. (C) Obrazowanie całych neuronów w komorze o wysokości 12 μm wypełnionej dekstranem o mocy 10 000 MW absorbującym przy długości fali 647 nm. Obserwacje przeprowadzono w dwóch kanałach fluorescencyjnych: GFP dla lokalizacji stożka wzrostu (przerywane żółte linie) i CY5 w celu obliczenia objętości GC na podstawie wykluczenia fluorescencji. Powierzchnia oznaczona przerywanymi żółtymi liniami została użyta do obliczenia objętości GC. Wykres przedstawia zmienność objętości GC w czasie i związane z nią morfologie zarówno w kanałach GFP, jak i CY5 w dwóch reprezentatywnych różnych punktach czasowych. Wszystkie dane zostały zebrane przy użyciu 40-krotnego suchego obiektywu NA 0,8 co 3 minuty. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

krok	Maska 1:8 μm warstwa	Maska 2:30 μm warstwa	Maska 3:40 μm warstwa
Typ SU-8	Rok 2007	Rok 2025	Rok 2050
Powlekanie przędzalnicze	30 s @ 2000 obr./min	30 s @ 3050 obr./min	30 s @ 3250 obr./min
Miękki wypiek	3 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C	3 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
Energia ekspozycji	110 mJ/cm2	155 mJ/cm2	170 mJ/cm2
Wypieki poekspozycyjne	4 min @ 95 °C	1 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
rozwój	2 min 30 s	Czas trwania: 5 min	Czas trwania: 6 min
Pieczenie na twardo (opcjonalnie)	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C

Tabela 1: Etapy fotolitografii wykonane w celu zbudowania urządzenia zawierającego centralną komorę o wysokości 12 μm. Wysokości komór pośrednich: 20, 50 i 90 μm.

krok	Maska 1:10 μm warstwa	Maska 2:30 μm warstwa	Maska 3:40 μm warstwa
Typ SU-8	Rok 2007	Rok 2025	Rok 2050
Powlekanie przędzalnicze	30 s @ 1500 obr./min	30 s @ 3050 obr./min	30 s @ 3250 obr./min
Miękki wypiek	3 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C	3 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
Energia ekspozycji	125 mJ/cm2	155 mJ/cm2	170 mJ/cm2
Wypieki poekspozycyjne	4 min @ 95 °C	1 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
rozwój	2 min 30 s	Czas trwania: 5 min	Czas trwania: 6 min
Pieczenie na twardo (opcjonalnie)	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C

Tabela 2: Etapy fotolitografii wykonane w celu zbudowania urządzenia zawierającego centralną komorę o wysokości 10 μm. Wysokości komór pośrednich: 20, 50 i 90 μm.

krok	Maska 1:12 μm warstwa	Maska 2:32 μm warstwa	Maska 3:40 μm warstwa
Typ SU-8	2015	Rok 2025	Rok 2050
Powlekanie przędzalnicze	30 s @ 3250 obr./min	30 s @ 2500 obr./min	30 s @ 3250 obr./min
Miękki wypiek	3 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 5 min @ 95 °C	3 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
Czas naświetlania	140 mJ/cm2	157 mJ/cm2	170 mJ/cm2
Wypieki poekspozycyjne	4 min @ 95 °C	1 min @ 65 °C + 5 min @ 95 °C	2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C
rozwój	Czas trwania: 3 min	Czas trwania: 5 min	Czas trwania: 6 min
Pieczenie na twardo (opcjonalnie)	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C	3-5 min @ 200 °C

Tabela 3: Etapy fotolitografii wykonane w celu zbudowania urządzenia zawierającego centralną komorę o wysokości 3 μm. Wysokości komór pośrednich: 18, 50 i 90 μm.

Dane uzupełniające 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schemat masek użytych do produkcji urządzenia PDMS (maska DRIE i maski 1-3). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dane uzupełniające 2: plik "masks_neuron_volume_chips.dxf". Pliki elektroniczne pozwalające na wykonanie maski DRIE i masek 1-3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dane uzupełniające 3: "Mask_Photoresist-paski.dxf". Pliki elektroniczne pozwalające na wytworzenie maski wykorzystywanej do fotolitografii pasów fotorezystu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dane uzupełniające 4: plik conversion_mattotiff.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dane uzupełniające 5: plik importfilevol.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obrazowanie objętościowe neuronów stanowi wyzwanie dla techniki FXm ze względu na długie i cienkie przedłużenia tych komórek. Protokół ten opisuje warianty tego samego typu urządzenia mikroprzepływowego dedykowanego do obrazowania neuronów.

Oprócz aspektów konstrukcji mikroprzepływowej, wybór obiektywu ma fundamentalne znaczenie dla obrazowania z wykluczeniem fluorescencji i implikuje kompromis między rozdzielczością poprzeczną a wyrazistością obrazu. W ^{badaniu 13} wykazano, że wysoki NA prowadzący do głębokości ostrości mniejszej niż wysokość komory nie był szkodliwy dla precyzji pomiaru objętości, jeśli obrazowanie było wykonywane w ognisku i jeśli pozostawiono wystarczający margines między konturem obiektu zainteresowania a granicami powierzchni całkowania. Jednak zastosowanie komory znacznie wyższej niż głębia ostrości pogarsza klarowność obrazu ze względu na dyfuzję fotonów, która wygładza krawędzie interesujących obiektów. Wykonanie komory o wysokości 3 μm zmniejszyło to boczne rozmycie i zapewniło wyjątkowo dobrze zdefiniowane obrazy wykluczające fluorescencyjne, nawet przy użyciu obiektywów o wysokim NA (0,8) 40X do wizualizacji gałęzi neuronalnych z wysoką rozdzielczością boczną.

Montaż wiórów jest krytycznym etapem, w szczególności w przypadku komór o wysokości 3 μm, ale ostrożna manipulacja, jak opisano w 4.1.2, pozwala uniknąć zawalenia się dachu. Wysoki stosunek powierzchni do objętości związany z tymi cienkimi komorami zrodził również kwestię stabilności stężenia dekstranu w czasie. Sprawdziliśmy, że absorpcja powierzchniowa dekstranu po jednej nocy inkubacji była znikoma: po zastąpieniu dekstranu przez PBS różnica intensywności między filarem a tłem wynosiła około 1 na 1000 początkowego kontrastu intensywności między tymi dwoma regionami w obecności dekstranu. Należy zauważyć, że neurony mogą przylegać zarówno do dolnego szkiełka nakrywkowego, jak i do dachu PDMS. Efekt ten znika w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych (tj. gdy nie inkubujemy cząsteczek kleju w komorze PDMS), ponieważ powłoka jest więc ściśle zlokalizowana na dnie komory.

Oprócz trudnej morfologii, neurony są raczej przystosowane do FXm ze względu na fakt, że jedno z głównych ograniczeń metody, tj. endocytoza dekstranu, jest w tych komórkach bardzo ograniczona. Wybieramy preparat o stężeniu 10 kDa, aby w długim zakresie (godzinach) stłumić wszelkie widoczne zjawiska endocytozy.

Podsumowując, koncepcyjna prostota FXm jest równoważona przez zestaw problemów eksperymentalnych, które zostały rozwiązane przez niniejszy protokół, takich jak nanometryczna chropowatość PDMS i mikrometryczna wysokość komory, czy korekta tła w celu skorygowania nierówności sufitu PDMS między filarami. Jednak zastosowanie zamkniętej komory mikroprzepływowej do ograniczenia ośrodka fluorescencyjnego powoduje kilka konkretnych ograniczeń, takich jak potrzeba filarów wsporczych, które obniżają efektywną powierzchnię dostępną do adhezji komórek, lub konieczność wykluczenia somy z komory centralnej, aby obserwować rozszerzenia neuronów z najwyższą przejrzystością, co ogranicza obszary komórki dostępne do obserwacji w wysokiej rozdzielczości. Jedną z możliwych ewolucji tej metody byłoby pozbycie się tego fizycznego ograniczenia i zastąpienie go optymalnym. Nowe osiągnięcie w dziedzinie mikroskopii arkuszowej może być w przyszłości korzystnie połączone z FXm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipments
Plasmalab System 100	Oxford Instruments		Do wykonania nakładki maski DRIE
MJB4	SUSS MicroTec		SU-8 fotolitografia
NXQ 4006 Nakładka maski	Neutronix Quintel		Fotolitografia związana z DRIE
Oczyszczacz plazmowy	Diener Electronic	Okap do hodowli komórkowych Pico PCCE
	ADS Wirówka Laminaire	Optimale 12
	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Multifuge X1R
Inkubator 37 & deg; C 5% CO2	Panasonic	MCO-170AICUVH-PE IncuSafe Inkubator
Mikroskop epifluorescencyjny	Piekarnik Leica	DMi8
PDMS między 65 a 80 stopni; C	Memmert
Profilometr mechaniczny	Veeco	Dektak 6M Stylus Profiler
Profilometr optyczny	Veeco	Wyko NT9100
Eksykator próżniowy	Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)	230KAR	Średnica 200 mm
Sonikator do kąpieli ultradźwiękowej	Labo Moderne	SHE1000	Objętość wanny: 0,8 litra
Płyta grzejna	Stuart SD162	SD162
Masks
DRIE			Dane uzupełniające
Su8 Maska 1			Dane uzupełniające
Su8 Maska 2	Dane uzupełniające
			Dane uzupełniające
Kalibracja S1805 Paski			Dane uzupełniające
Mały sprzęt laboratoryjny
Dziurkacz 1,5 mm	Sigma-Aldrich	29002519 (odniesienie amerykańskie)
Skalpel lub żyletka
9-calowa płaska szpatułka ze stali nierdzewnej z łyżką	VWR International	82027-532	Do wyjmowania z formy PDMS
Obsługa wafli górnej wargi	VWR International	63042-096
Pęseta zakrzywiona	FST	Dumont #7 Kleszcze - Standard / Dumoxel	Do manipulowania szkiełkami nakrywkowymi
Podłoża
Krzemowy wafel	Prolog Semicor Ltd
Szkiełka nakrywkowe szklane 24x24 mm	VWR	631-0127
Photoresists i wywoływacze
AZ 1518 positive photoresist	Microchemicals GmbH		Przed procesem DRIE grubości 1,8 i mikro; m
AZ 351B deweloper	Microchemicals GmbH		Aby opracować dodatni fotorezystor AZ 1518
SU-8 2007	MicroChem
SU-8 2025	MicroChem
SU-8 2050	MicroChem
PGMA deweloper	Technic		Aby opracować negatywny fotorezystor SU-8
Microposit S1805 odporny	Chimie Usługi		Dodatni fotorezystor używany do uzyskania 0,5&mikro; m wysokie konstrukcje
MF 26A deweloper	Chimie Tech Services		Aby opracować dodatni fotorezystor S1805
Laboratoryjne materiały eksploatacyjne
Jednorazowa plastikowa pipeta 3 ml	LifeTechnologies - ThermoFisher
P100 Szalki Petriego	TPP	93100
Strzykawka 20 ml	Terumo	SS+20ES1
Przezroczysta taśma
Chusteczki kwadratowe	VWR	115-2148
Parafilm	DUTSCHER	90260	Folia parafinowa z tworzywa sztucznego
Chemikalia
(3-metakrylooksypropylo)trichlorosilan	abcr	AB 109004
PDMS i utwardzacz Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761036
izopropanol		W292907
poliornityna	Sigma-Aldrich	P4957 - 50 ml
Etanol absolut	Sigma-aldrich	02865	99,8%
3-metakryloksyloksypropylo-trimetoksysilan	Sigma-aldrich	M6514-25ML(	C4H5O2)-(CH2)3-Si(OCH3)3
kwas	octowySigma-aldrich	71251-5ML-F Dekstran
10kW sprzężony z Alexa488	LifeTechnologies - ThermoFisher	D22910	Absorpcja przy 488 nm
Dekstran 10kW sprzężony z Alexa647	LifeTechnologies - ThermoFisher	D22914	Absorpcja przy 647 nm
Culture medium
MEM	LifeTechnologies - ThermoFisher	21090-022
Surowica dla koni	LifeTechnologies - ThermoFisher	26050088
B27	LifeTechnologies - ThermoFisher	12587-010
Glutamax 200	mM LifeTechnologies - ThermoFisher	35050-061
Pirogronian sodu GIBCO 100 mM	LifeTechnologies - ThermoFisher	11360-070
Gentamycyna	LifeTechnologies - ThermoFisher	15710-049
PBS	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
HBSS 10x	LifeTechnologies - ThermoFisher	14180-046
Hepes 1M	LifeTechnologies - ThermoFisher	15630-056
trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich	59418C-100ML
Neurobasal	LifeTechnologies - ThermoFisher	21103-049
Neurobasal bez czerwieni fenolowej	LifeTechnologies - ThermoFisher	12348-017
Softwares
Routine w Matlabie do normalizacji tła	Quantacell	Skontaktuj się z Victorem Racine: victor.racine@quantacell.com
ImageJ			Aby wybrać konkretny zwrot z inwestycji dla analiza obrazu
Rutynowa	ImageJ		Dane uzupełniające
Rutynowa	Matlab		Dane uzupełniające