Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56924

⸱

21 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) to złożona sieć molekuł, które zarządzają kluczowymi procesami w tkankach i organach, jednocześnie znosząc fizjologiczną przebudowę przez całe życie. Standaryzowana decelularyzacja serc płodów i dorosłych pozwala na porównawcze badania eksperymentalne obu tkanek w kontekście 3D poprzez uchwycenie natywnej architektury i właściwości biomechanicznych.

Streszczenie

Obecna wiedza na temat komunikacji między komórkami w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przekłada się na duże dwuwymiarowe (2D) badania kultur in vitro, w których składniki ECM są prezentowane jako powłoka powierzchniowa. Te systemy hodowli stanowią uproszczenie złożonej natury tkanki ECM, która obejmuje skład biochemiczny, strukturę i właściwości mechaniczne. Aby lepiej naśladować komunikację między komórkami ECM kształtującą mikrośrodowisko serca, opracowaliśmy protokół, który pozwala na jednoczesną decelularyzację eksplantatów całego serca płodu i tkanki lewej komory dorosłego człowieka w celu przeprowadzenia badań porównawczych. Protokół łączy w sobie użycie buforu hipotonicznego, detergentu o właściwościach anionowych środków powierzchniowo czynnych oraz obróbkę DNazy bez konieczności posiadania specjalistycznych umiejętności lub sprzętu. Zastosowanie tej samej strategii decelularyzacji do próbek tkanek od osób w różnym wieku jest alternatywnym podejściem do przeprowadzania badań porównawczych. Niniejszy protokół pozwala na identyfikację unikalnych różnic strukturalnych między siatką ECM serca płodu i dorosłego oraz biologicznymi odpowiedziami komórkowymi. Co więcej, przedstawiona w niniejszym tekście metodologia pokazuje, że szersze zastosowanie jest z powodzeniem stosowane w innych tkankach i gatunkach z niewielkimi dostosowaniami, np. w biopsjach jelita ludzkiego i płucach myszy.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to dynamiczna sieć molekuł, które regulują ważne procesy komórkowe, a mianowicie decyzje o losie, proliferację i różnicowanie1,2. Badania interakcji komórka-ECM prowadzono głównie w dwuwymiarowych (2D) hodowlach in vitro pokrytych składnikami ECM, które stanowią uproszczenie natywnych właściwości ECM stwierdzonych in vivo. Decelularyzacja generuje bezkomórkowe biorusztowania ECM podobne do 3D, które w dużej mierze zachowują zewnątrzkomórkową architekturę i skład natywnych tkanek i narządów3,4. Oprócz tego, że służą jako bioaktywne rusztowania dla inżynierii tkankowej, bezkomórkowe biomateriały 3D ECM stają się nowymi platformami do oceny biologii komórki-ECM, które są równoległe do środowiska in vivo.

Ocena zróżnicowanej roli składników ECM w różnych tkankach, organach i wieku skorzysta na użyciu podobnych protokołów generowania natywnych biorusztowań. W przypadku serca opracowaliśmy wszechstronny protokół decelularyzacji próbek pochodzących od płodu i dorosłych, jako alternatywne podejście do wykonywania badań porównawczych mikrośrodowiska narządów. Korzystając z tej metodologii, uchwyciliśmy natywne mikrośrodowisko serca i wykazaliśmy, że ECM płodu sprzyja wyższej wydajności ponownego zasiedlania komórek serca5. Decelularyzacja pozwoliła ponadto na identyfikację rezydentnych różnic strukturalnych między ECM płodu i dorosłego na poziomie blaszki podstawnej i układu siatki macierzy okołokomórkowej oraz składu włókien5. Przed tą pracą bezpośrednie porównanie tkanek w różnych stadiach ontogennych przy użyciu tego samego podejścia do decelularyzacji zostało zgłoszone tylko dla nerek małp rezusów i serc gryzoni. Ponadto ograniczona liczba badań donosi o decelularyzacji tkanek płodowych/narządów per se5,6,7. Udało się to osiągnąć przy użyciu SDS jako unikalnego środka decelularyzacyjnego; jednak do decelularyzacji tkanki serca płodu i dorosłego zastosowano wyraźne stężenia SDS7,8. SDS jest jednym z najskuteczniejszych detergentów jonowych do usuwania materiału cytoplazmatycznego i jądrowego, szeroko stosowanym w decelularyzacji różnych tkanek i próbek9,10. Roztwory zawierające wysokie stężenia SDS i wydłużone okresy ekspozycji zostały skorelowane z denaturacją białek, utratą glikozaminoglikanu (GAG) i rozerwaniem włókien kolagenowych10,11, a zatem konieczna jest równowaga między zachowaniem ECM a usunięciem komórek. Aby zastosować tę samą procedurę do tkanki serca płodu i dorosłego człowieka, opisany w niniejszym dokumencie protokół jest podzielony na trzy sekwencyjne etapy: liza komórek przez wstrząs osmotyczny (bufor hipotoniczny); solubilizacja oddziaływań lipid-białko, DNA-białko i białko-białko (0,2% SDS); i usuwanie materiału jądrowego (obróbka DNaza).

Nasz protokół wykazuje kilka zalet: i) możliwość równoważnej decelularyzacji tkanek serca specyficznych dla wieku poprzez zastosowanie tej samej strategii decelularyzacji; ii) brak wymagań dotyczących specjalistycznych metod lub sprzętu; iii) gotowa adaptacja do innych tkanek i gatunków, ponieważ została z powodzeniem zastosowana z niewielkimi zmianami w biopsjach jelita ludzkiego12 i mouse lung13; i, co ważne, iv) może zająć się właściwościami biomechanicznymi ECM, umożliwiając jednocześnie składanie kultur organotypowych podobnych do 3D, które bardziej naśladują cechy molekularne natywnego mikrośrodowiska tkankowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane metodologie zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt i3S oraz Direção Geral de Veterinária (DGAV) i są zgodne z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE.

1. Przygotowanie roztworów decelularyzacyjnych

UWAGA: Wszystkie roztwory decelularyzacyjne powinny być przefiltrowane przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowywane przez maksymalnie 3 miesiące, chyba że określono inaczej.

  1. Dla 1x PBS: Wymieszaj 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO4 200 mg KCl i 200 mg KH2PO4 z 900 ml wody dejonizowanej (woda DI). Doprowadzić pH roztworu do 7,5, a końcową objętość roztworu do 1 l. Przefiltrować, przelać w autoklawie i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Dla buforu hipotonicznego (10 mM Tris, 0,1% EDTA): Rozpuść 1,21 g TrisBASE i 1 g EDTA w 900 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić pH roztworu do 7,8 za pomocą NaOH/HCl, a końcową objętość roztworu do 1 l. Przefiltrować, wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Dla 0,2% roztworu SDS (0,2% SDS, 10 mM Tris): Dodać 0,6 g TrisBASE i 1 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) w 400 ml wody demineralizowanej i mieszać w temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia substancji rozpuszczonej. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Doprowadzić pH roztworu do 7,8, a końcową objętość roztworu do 500 ml. Sterylizuj roztwór przez filtrację.
    UWAGA: Roztwór SDS należy przygotować przed użyciem. Roztwór filtracyjny należy stosować dopiero po całkowitym rozpuszczeniu SDS, w przeciwnym razie nierozpuszczalne cząstki SDS nasycą filtr, zmieniając końcowe stężenie SDS, a w konsekwencji wpływając na skuteczność decelularyzacji tkanek.
  4. Dla hipotonicznego buforu do płukania (10 mM Tris): Wymieszaj 1,21 g TrisBASE w 900 ml wody DI. Doprowadzić pH roztworu do 7,8, a końcową objętość do 1 l. Przefiltrować, wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Do leczenia DNazą (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/ml DNazy): Rozpuść 2,42 g TrisBASE i 2 ml 1 M MgCl2 w 900 ml wody DI. Doprowadzić pH do 7,8, a końcową objętość roztworu do 1 l. Przefiltrować i wysterylizować roztwór w autoklawie. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodać DNazę I (50 U/ml).
  6. Dla roztworu podstawowego DNazy I: Przygotować bufor DNazy zawierający 50% glicerolu, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2 i dostosować do końcowej objętości roztworu 10 ml z wodą DI. W okapie z przepływem laminarnym dodać proszek DNazy I do buforu DNazy i delikatnie mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Wysterylizuj roztwór przez filtr 0,22 μm. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Pobieranie tkanek i kriokonserwacja

  1. Poddaj eutanazji dorosłe kobiety w ciąży w 18 dniu ciąży (płody E18) poprzez uduszenie CO2 . Wykonaj cesarskie cięcie u samic nożyczkami chirurgicznymi i zbierz rogi macicy z płodami myszy na szalkę Petriego z lodowatym 1x PBS za pomocą dwóch ząbkowanych pęset z zakrzywionymi końcówkami (po jednej pęsetie na każdym końcu rogu).
    1. Otwórz rogi macicy i worek owodniowy, aby odizolować płody. Przenieś płody na nową szalkę Petriego z lodowatym 1x PBS, aby je znieczulić i odciąć głowę nożyczkami.
    2. Eutanazja 7-8 tygodniowego samca myszy C57BL/6 za pomocą uduszenia CO2 . Wykonaj nacięcie na każdej klatce piersiowej myszy i zbierz serce.
    3. Krótko opłucz serca płodu i dorosłych lodowatym zimem 1x PBS.
  2. Usuń przedsionki dorosłego serca za pomocą skalpela. Wykonaj nacięcie na prawej komorze i usuń je za pomocą prostych małych nożyczek. Odsłoń wewnętrzną ścianę lewej komory, usuwając przegrodę. Na nowej szalce Petriego podziel wolną ścianę lewej komory na podłużne paski o grubości 2 mm i usuń mięsień brodawkowaty za pomocą skalpela i ząbkowanej pęsety z zakrzywionymi końcówkami.
    1. Wytnij małe eksplantaty tkanek za pomocą skalpela za pomocą siatki 2 mm x 2 mm (szczegółowy opis w uzupełnieniu Rysunek 15). Krótko spłucz eksplantaty tkanek 1x PBS.
  3. Dodaj ~250 μL związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do autoklawowanych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przenieść całe serca płodów i eksplantaty serca dorosłego osobnika do probówek z 250 μl OCT i zamrozić je za pomocą izopentanu chłodzonego suchym lodem i przechowywać w temperaturze -80 °C (maksymalnie do 6 miesięcy).
    UWAGA: Stosowanie kriokonserwowanych eksplantatów tkanek serca przez ponad 6 miesięcy znacznie zmniejszy skuteczność decelularyzacji, szczególnie w przypadku eksplantatów tkanek serca dla dorosłych.

3. Decelularyzacja tkanek

UWAGA: Decelularyzacja tkanki serca jest wykonywana na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z jedną próbką na dołek. 1 ml każdego roztworu decelularyzacyjnego dodaje się do każdej pojedynczej studzienki. Wszystkie etapy decelularyzacji powinny być wykonywane z mieszaniem przy 165 obr./min (wytrząsarka inkubatora o średnicy orbitalnej 20 mm) i w temperaturze 25 °C, chyba że określono inaczej. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się ze schematem na Rysunek 1A. Amfoterycyna B (np. fungizon) i gentamycyna są świeżo dodawane do wszystkich roztworów decelularyzacyjnych przed użyciem do końcowego stężenia odpowiednio 2,5 μg/ml i 0,01 μg/ml. Aby określić ilościowo ilość DNA zatrzymanego w tkankach pozbawionych komórek , masę próbki należy określić przed rozpoczęciem protokołu decelularyzacji. Protokół oznaczania ilościowego DNA jest bardziej szczegółowo opisany w sekcji 5.1.

  1. DZIEŃ 1
    1. Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Pozostaw probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej, aż OCT częściowo się stopi. Przenieść blok tkanki serca nadal zamrożonego OCT na szalkę Petriego z 1x PBS.
    2. Po stopieniu się OCT przenieś tkankę serca na nową szalkę Petriego z 1x PBS. Próbki myć w 1x PBS i przy 60 obr./min za pomocą wytrząsarki przez 10-15 min. Powtórz co najmniej dwa razy.
    3. Dodać 1 ml działającego buforu hipotonicznego na studzienkę sterylnej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Przenieś jedną próbkę do studzienki za pomocą kleszczy.
    4. Przenieść 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z próbkami do wytrząsarki inkubatora w temperaturze 25 °C i rozpocząć 18-godzinną inkubację z hipotonicznym buforem.
  2. DZIEŃ 2
    1. Przygotować 0,2% roztwór SDS zgodnie z opisem w punkcie 1.3.
    2. Odessać bufor hipotoniczny i przemyć próbki 1x PBS przez 1 godzinę. Powtórzyć 3 razy.
      UWAGA: PUNKT PAUZY: Tkanka poddana decelularyzacji może być przechowywana w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez 18 godzin w warunkach statycznych.
    3. Usunąć 1x PBS, dodać 1 ml świeżo przygotowanego roztworu SDS (krok 1.3) do dołka i inkubować próbki przez 24 godziny
      UWAGA: (PUNKT KONTROLNY) Po inkubacji SDS upewnij się, że próbki mają biały lub półprzezroczysty wygląd. Na tym etapie próbki poddane działaniu SDS są nasączane DNA, wykazując konsystencję podobną do żelatyny. Roztwór SDS należy usuwać powoli, aby uniknąć przywierania próbki do końcówki pipety.
  3. DZIEŃ 3
    1. Przemywać próbki hipotonicznym buforem do płukania (1 ml na studzienkę) przez 20 minut. Powtórzyć 3 razy.
      UWAGA: Na tym etapie normalne jest obserwowanie zmniejszenia wielkości próbki z powodu usunięcia resztek komórek. PUNKT PAUZY: Tkanka poddana decelularyzacji może być przechowywana w hipotonicznym buforze do płukania w temperaturze 4 °C przez 18 godzin w warunkach statycznych.
    2. Dodać 1 ml roztworu do uzdatniania DNazy do studzienki i inkubować próbki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Odessać roztwór do leczenia DNazą i przemyć próbki 1x PBS (1 ml na studzienkę) przez 20 minut. Powtórzyć 3 razy. Wykonaj końcowe płukanie 1x PBS (1 ml na studzienkę) przez noc w temperaturze pokojowej i wstrząsając przy 60 obr./min.
    4. (Punkt kontrolny) Po obróbce DNazy upewnij się, że próbki pozbawione komórek utraciły konsystencję podobną do żelatyny.
      UWAGA: Po poddaniu działaniu DNazy należy delikatnie usunąć i dodać 1x PBS, ponieważ próbki można łatwo uwięzić i przymocować do końcówki pipety.

4. Ocena usuwania bezkomórkowych komórek tkankowych

  1. Umieścić próbki na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, po 1 próbce na studzienkę, dodając 1 ml świeżo przygotowanego 10% neutralnego buforu formaliny z 0,03% wodnym roztworem eozyny przez 2,5-3 godziny w temperaturze RT.
    UWAGA: Eozyna jest dodawana do utrwalacza w celu wybarwienia tkanki pozbawionej komórek i ułatwienia wizualizacji próbki podczas cięcia i barwienia histologicznego. Dodanie eozyny nie zakłóca barwienia histologicznego ani technik immunofluorescencji. Alternatywnie utrwalenie można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć roztwór utrwalający i dodać 1 ml 1x PBS w celu przemycia próbki.
  3. Zamknięte biorusztowania w żelu do przetwarzania histologicznego należy zakapsułkować za pomocą jednorazowej formy do próbek winylowych zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Usuń żel histologiczny z próbką osadzoną w formie i przenieś do kaset do przetwarzania biopsji/zatapiania z pokrywką.
    UWAGA: Alternatywą dla zatapiania tkanek w żelu histologicznym i procesowym jest przetwarzanie każdej próbki w dwóch gąbkach biopsyjnych z małymi porami. Próbki powinny być zlokalizowane w środku gąbek biopsyjnych, aby umożliwić wykrycie. Warto zauważyć, że niektóre próbki mogą być trudne do zlokalizowania przy użyciu tego podejścia.
  5. Próbki do zatapiania w parafinie należy przetworzyć poprzez kolejne inkubacje (30 minut na roztwór) w stężeniach alkoholu (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100%), izoparafinowego roztworu węglowodorów alifatycznych (2 stacje inkubacji) i parafiny (2 stacje inkubacji) w temperaturze 56 °C.
  6. Zamontuj próbki w bloku parafinowym.
  7. Wytnij skrawki parafiny o grubości 3 μm na mikrotomie i zbierz skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych.
  8. Suszyć skrawki parafiny przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) Skrawki parafiny są przechowywane w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
  9. Aby sprawdzić skuteczność protokołu, należy wykonać barwienie hematoksyną i eozyną (H&E) oraz trichromem Massona (MT) na skrawkach próbki bez komórek oraz na skrawkach tkanki niepoddanej manipulacji zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Barwienie H&E barwi jądra komórkowe na niebiesko / fioletowo, cytoplazma ciemnoróżowa / czerwona i kolagen bladoróżowy, a MT plami jądra na czarno, cytoplazmę na czerwono oraz kolagen i mucynę na niebiesko. Efektywną decelularyzację uzyskuje się, gdy obserwuje się porowatą jasnoróżową (H&E, MT) i niebieską (MT) sieć, przy braku zabarwienia jądrowego.

5. Ocena usuwania materiału jądrowego z tkanek pozbawionych komórek

UWAGA: Kwantyfikacja zawartości DNA na tkance pozbawionej komórek musi być przeprowadzona w porównaniu z odpowiednią tkanką, która nie została poddana manipulacji.

  1. Przed decelularyzacją zważ probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na precyzyjnej wadze cyfrowej. Przenieś tkankę serca do probówki, usuń dodatkową ilość 1x PBS i zważ probówkę z próbkami. Obliczyć mokrą masę próbek:
    Próbkao mokrej masie = waga probówki z próbkami – waga pustej probówki
  2. Zdecelularyzacja próbek zgodnie z opisem w kroku 3.
  3. Po decelularyzacji zbierz pozbawione komórek tkanki do probówki mikrowirówkowej.
    1. Ze względu na małe wymiary i masę poszczególnych próbek serca oraz specyfikacje zestawu, pula zdecelularnych tkanek każdego stanu próbki (serce płodu: 5 całych serc; eksplantaty LV dla dorosłych: 15 eksplantatów). Wykonaj tę samą procedurę z niemanipulowaną tkanką.
      UWAGA: (PUNKT PAUZY) Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji DNA i kwantyfikacji.
  4. Pokrój niemanipulowane i pozbawione komórek tkanki w małych eksplantatach za pomocą skalpela na czystej szalce Petriego.
    UWAGA: Do każdej próbki należy użyć indywidualnego skalpela i szalki Petriego. Mechaniczne rozdrobnienie próbek za pomocą skalpela ułatwia ich tylne trawienie enzymatyczne, a następnie ekstrakcję DNA.
  5. Do ekstrakcji DNA należy użyć metody ekstrakcji DNA opartej na kolumnie wirowej zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Zebrać mechanicznie zdysocjowane próbki z płytki Petriego za pomocą głównego buforu wytrawiającego (bufor wytrawiający i proteinaza K) zgodnie z instrukcjami producenta, używając końcówki pipety z szeroką kryzą.
      UWAGA: Liza tkanek z trawieniem proteinazy K jest szybsza w próbkach pozbawionych komórek. Aby przetwarzać różne próbki w tym samym czasie, należy przechowywać próbki zlizowane na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zlizowane w celu zminimalizowania degradacji. Pełna liza próbek uzyskuje się w ciągu 4-6 godzin.
    2. Postępuj zgodnie z protokołem zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Aby zwiększyć wydajność wyekstrahowanego DNA z bezkomórkowych i niepozbawionych komórek próbek tkanek, należy wymyć DNA odpowiednio na 25-50 μl i 100 μl buforu elucyjnego. Zebrać wymyte DNA i załadować kolumnę wirową. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Próbki odwirować zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: (PUNKT PAUZY) DNA WYEKSTRAHOWANE Z PRÓBEK MOŻE BYĆ PRZECHOWYWANE W TEMPERATURZE -20 °C do czasu dalszego wykorzystania.
  6. Określ ilościowo wyekstrahowane DNA z próbek za pomocą fluorescencyjnego zestawu do wykrywania dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Znormalizować zawartość DNA jako nanogramy DNA na miligram początkowej mokrej masy próbki (przed decelularyzacją).

6. Rusztowania bezkomórkowe zasiewanie komórek

UWAGA: Wszystkie roztwory/odczynniki muszą być sterylne, a cała procedura musi być wykonywana w sterylnych warunkach.

  1. Przygotować 1x DPBS z 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 1% P/S (penicylina, 100 j.m.; streptomycyna 100 μg/ml).
  2. Usunąć 1x roztwór PBS z ostatniego etapu płukania decelularyzacji (krok 3.3.3) i dodać 500 μl na studzienkę świeżo przygotowanego 1x DPBS/2,5 μg/ml roztworu amfoterycyny B/1% P/S. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-7 dni.
    UWAGA: Przechowywanie próbek w temperaturze 4 °C jest ważne dla utrzymania sterylności.
  3. Dodaj P/S do podłoża podstawowego komórek (bez FBS i suplementów) do końcowego stężenia 1%.
  4. Odessać 1x DPBS/2,5 μg/ml roztworu amfoterycyny B/1% P/S z próbek pozbawionych celulonu. Dodać 500 μl na studzienkę pożywki komórkowej/1% P/S i pozostawić próbki do równowagi przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub w temperaturze 4 °C przez ponad 1 godzinę.
  5. Podziel interesujące Cię komórki i przygotuj małe porcje komórek o pożądanej gęstości komórek.
    UWAGA: Wysiew tkanek pozbawionych komórek musi być przeprowadzony pod mikroskopem stereoskopowym i w sterylnych warunkach. Pożywki do hodowli komórkowych powinny zawierać 1% P/S.
  6. Odpipetować 3-4 μl DPBS do środka dołka na 96-dołkowej płytce. Za pomocą cienkiej i prostej pęsety przenieś rusztowania bezkomórkowe do kropli DPBS, usuń dodatkowy DPBS przez aspirację i upewnij się, że próbka nie jest pofałdowana ani pomarszczona. Pozostaw do wyschnięcia na krawędziach, aby przylegał do powierzchni studni.
    UWAGA: Rusztowania wolnostojące mają niższą wydajność wysiewu.
  7. Dodaj komórki do rusztowania, odpipetowując powoli roztwór jednokomórkowy do krawędzi studzienki.
    UWAGA: Na przykład kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów są obsiewane o gęstości 7,500 komórek/mm2 i unieśmiertelnionymi mysimi komórkami progenitorowymi serca Lin− Sca-1+ (iCPCSca-1) o gęstości 60-1,500 komórek/mm2. Dostosuj gęstość komórek zgodnie z uzasadnieniem eksperymentalnym.
  8. Dodaj DPBS do sąsiednich studzienek, aby uniknąć szybkiego parowania mediów.
  9. 24 godziny po wysiewie komórek, jeśli użyty typ komórki przylegał do płytek polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS), przenieś biorusztowania do nowej studzienki. W przeciwnym razie wymień pożywkę, aby usunąć nieprzylegające komórki.
  10. Ostrożnie zmieniaj nośnik zgodnie z określonymi wymaganiami typu ogniwa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Efektywność decelularyzacji powinna zostać oceniona za pomocą trzech głównych technik: obserwacji makroskopowej, histologii oraz ilościowego oznaczania DNA. Wygląd makroskopowy próbek po obróbce SDS pośrednio wpływa na skuteczność usuwania komórek. Po inkubacji w SDS próbki powinny mieć wygląd od półprzezroczystego do białego (Rysunek 1C). Decelularyzowane tkanki płodowe (E18) charakteryzują się wysoce półprzezroczystą strukturą, podczas gdy eksplanty dorosłe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest wysoce dynamiczną i złożoną siatką włóknistych i adhezyjnych glikoprotein, składającą się z rezerwuaru licznych bioaktywnych peptydów i uwięzionych czynników wzrostu. Jako główny modulator adhezji komórek, dynamiki cytoszkieletu, ruchliwości/migracji, proliferacji, różnicowania i apoptozy, ECM aktywnie reguluje funkcje i zachowanie komórek. Wiedząc, że zachowanie komórek różni się w kulturach 2D i 3D, podjęto wysiłki w celu opracowania nowych modeli organotypowych, które mogą dokładni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Pinto-do-Ó za odpowiednią krytyczną dyskusję. Prace te były wspierane przez Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) w ramach projektu "CARDIOSTEM-Engineered cardiac tissues and stem cell-based therapies for cardiovascular applications" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. jest stypendystą FCT [SFRH/BD/88780/2012], a M.J.O. jest członkiem FCT (FCT-Investigator 2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< silny>Sprzęt< / silny>
inkubowany wytrząsarka stołowaWytrząsarki orbitalneIKA: 3510001Zalecany
fluorymetr-dostępny sprzęt
Cyfrowa waga-dostępny sprzęt
Mikroskop odwrócony-dostępny sprzęt
Inkubator do hodowli komórkowych-dostępne wyposażenie
Lodówka (4º C)-Dostępny sprzęt
Zamrażarka (-80 i ordm; C)-Dostępny sprzęt
Mikrotom-Dostępny sprzęt
< silny> Instrumenty Cirurgical < / strong>
Vannas Spring Scissors - 2,5 mm Cutting EdgeFine Science Tools5000-08Zalecane
Dumont 5 Fine Science Tools - Biologie/InoxFine Science Tools11254-20Zalecane
Kleszcze Dumont 7Narzędzia do nauki o naprawach11272-30Zalecane
Nożyczki preparacyjne, proste-Dostępne narzędzie
Kleszcze, ząbkowane, zakrzywione-Dostępne narzędzie
Materiały< / mocne>
płytki 24-dołkowe, pakowane pojedynczoVWR29442-044-
Płytki 96-dołkowe, pakowane pojedynczoVWR71000-078-Steriflip-GV
, 0,22&mikro; m, PVDF, Radio-SterylizowanyMilliporeSE1M179M6-Eppendorff
-Dostępny materiał
15 ml probówek FalconFisher Scientific430791-50
ml FalconFisher Scientific
430829-Czterokomorowa biopsja Przetwarzanie/Osadzanie Kasety z pokrywkąMikroskopia elektronowa Science70075-B-
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusThermo Fisher Scientific22-037-246-
Kriokonserwacja tkanek
Shandon Żywica do zatapiania CryomatrixThermo Scientific
6769006-2-METYLOBUTAN BEZWODNY 99+% (izopentan)Sigma-Aldrich277258-1L-Suchy
lód- --
Decellularization
NaClBDH Prolabo27810.364-Na
2HPO4Sigma-AldrichS-31264-KH
sub>2PO4Sigma-AldrichP5379-100g-KCl
Sigma-AldrichP8041-1KG-TrisBASE
Sigma-AldrichT6066-500G-Dodecylosiarczan
soduSigma-AldrichL-4390-MgCl
2MERCK1.05833.1000-DNAse
IAplliChemA3778,0050-Gentamycyna
Gibco15710-049-
FungizoneGibco BRL15290-026-Woda
dejonizowana (woda DI)---
Histologia
10 % bufor neutralny formalinaProlabo361387P-Eozyna
Y WODNISTASurgipath01592EMoże być zastąpiony alkoholową eozyną
Richard-Allan Scientific HistoGel Żel do przetwarzania próbekThermo Fisher ScientificHG-4000-012-Alkohol
etylowy 99,5% anydrousAga4,006,02,02,00-Woda
dejonizowana (woda DI)---
Clear Rite 3Richard-Allan Scientific6915-Shandon
HistoplastThermo Fisher ScientificRAS.6774006-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher Scientific
K182001-Quant-iT PicoGreen  Zestaw dsDNAInvitrogenP11496-
Cell culture
DPBSVWR45000-434-Penicylina-Streptomycyna
Roztwór 100XLabclinicsL0022-100-Fungizone
Gibco BRL15290-026-Pożywka
do hodowli komórkowych komórki będącej przedmiotem zainteresowania---
<

Bibliografia

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 4/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Tagi

Decelularyzacja tkanki sercatkanka p odowego sercadoros a lewa komoratraktowanie buforem hipotonicznymmetoda decelularyzacji SDSprotok traktowania DNazprzygotowanie fragment w tkankiproces zatapiania w parafinieanaliza przekroj w histologicznychzasiewanie rusztowania kom rkowego
Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.