Artykuł metodologiczny

Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 maja 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednie wstrzykiwanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia rakowego (EV) prowadzi do przeprogramowania szpiku kostnego, co wspomaga postęp nowotworu; jednak nie jest jasne, które komórki pośredniczą w tym efekcie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji nowotworowo-mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pośrednictwem EV in vivo, ujawniając kluczową rolę MSC edukowanych przez EV w przerzutach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W mikrośrodowisku guza, rezydentne lub rekrutowane mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) przyczyniają się do złośliwej progresji w wielu typach raka. Pod wpływem określonych sygnałów środowiskowych te dorosłe komórki macierzyste mogą uwalniać mediatory parakrynne, co prowadzi do przyspieszonego wzrostu guza i przerzutów. Zdefiniowanie wzajemnych oddziaływań między nowotworem a MSCs ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw progresji raka i zidentyfikowania nowych celów interwencji terapeutycznej.

Komórki nowotworowe wytwarzają duże ilości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), które mogą głęboko wpływać na zachowanie komórek docelowych w mikrośrodowisku guza lub w odległych miejscach. Nowotworowe EV otaczają funkcjonalne biomolekuły, w tym zapalne RNA i (onko)białka, które mogą kształcić komórki zrębu w celu wzmocnienia przerzutowego zachowania komórek rakowych lub udziału w tworzeniu niszy przed przerzutami. W tym artykule opisujemy rozwój przedklinicznego mysiego modelu raka, który umożliwia specyficzną ocenę przesłuchu między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi za pośrednictwem EV. Po pierwsze, opisujemy oczyszczanie i charakterystykę EV wydzielanych przez nowotwór oraz ocenę internalizacji EV przez MSC. Następnie wykorzystujemy multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach, aby ocenić zmianę profilu ekspresji cytokin MSC indukowaną przez EV raka. Na koniec ilustrujemy generowanie bioluminescencyjnego ortotopowego mysiego modelu ksenoprzeszczepu kostniakomięsaka, który podsumowuje interakcję guza-MSC, i pokazujemy wkład MSC wykształconych w EV we wzroście guza i tworzeniu przerzutów.

Nasz model daje możliwość zdefiniowania, w jaki sposób EV nowotworowe kształtują środowisko wspierające nowotwór, oraz oceny, czy blokada komunikacji między guzem a MSCs za pośrednictwem EV zapobiega progresji raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza aktywnie uczestniczy w większości, jeśli nie we wszystkich, aspektach nowotworzenia i progresji raka, w tym w tworzeniu przerzutów i rozwoju oporności na środki terapeutyczne1. Podkreśla to potrzebę przedklinicznych ortotopowych modeli myszy raka, które umożliwiają analizę złożonych interakcji guz-zrąb zachodzących w niszy nowotworowej.

Wśród wielu składników komórkowych mikrośrodowiska guza, mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) silnie przyczyniają się do progresji raka w wielu typach nowotworów, takich jak rak piersi, rak prostaty, guzy mózgu, szpiczak mnogi i kostniakomięsak2,3,4,5,6,7. MSCs to multipotencjalne komórki macierzyste, które znajdują się w różnych tkankach dorosłych i płodowych, w tym w szpiku kostnym, tkance tłuszczowej, łożysku, krwi pępowinowej i innych8,9. W odpowiedzi na sygnały zapalne generowane przez raka, MSCs migrują w kierunku miejsc guza, włączają się w mikrośrodowisko guza i ostatecznie różnicują się w komórki wspierające raka10. Te związane z rakiem MSCs dostarczają niezbędnych czynników (tj. czynników wzrostu, chemokin, cytokin i mediatorów immunosupresyjnych) progresji nowotworu, działając zarówno na komórki nowotworowe, jak i na otaczający zrąb2,3,11,12,13. Podczas gdy sprzyjające nowotworom działanie MSCs związanych z rakiem zostało zbadane w wielu modelach raka, mechanizmy, za pomocą których komórki nowotworowe przeprogramowują MSC, aby ukształtować niszę sprzyjającą rakowi, są słabo poznane. W tym miejscu opisujemy generowanie ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu, który w szczególności umożliwia badanie pronowotworowej interakcji między komórkami raka kości a MSC za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

EVs są kluczowymi mediatorami komunikacji międzykomórkowej między komórkami nowotworowymi i zrębowymi14. EV przenoszą funkcjonalne biomolekuły komórki, z której pochodzą, w tym białka, lipidy i regulatorowe RNA. Po uwolnieniu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej pęcherzyki te mogą być wchłaniane przez otaczające komórki lub przenoszone do odległych miejsc przez krew lub krążenie limfatyczne i mogą głęboko wpływać na zachowanie komórek docelowych. 15,16,17 Na przykład, wychwyt EVs raka przez fibroblasty zrębu może powodować różnicowanie miofibroblastów, wspierając angiogenezę i przyspieszając wzrost guza in vivo18,19, internalizacja przez komórki śródbłonka może stymulować angiogenezę guza i zwiększać przepuszczalność naczyń krwionośnych16,20, a interakcja z komórkami odpornościowymi może prowadzić do zahamowania przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej21.

Niedawno wykazaliśmy, używając bioluminescencyjnego ortotopowego modelu myszy ksenoprzeszczepu kostniakomięsaka, że komórki nowotworowe uwalniają duże ilości EVs, które skłaniają MSCs do uzyskania fenotypu pro-nowotworowego i pro-przerzutowego. Efekt ten wynika z dramatycznej zmiany w profilu ekspresji cytokin MSC (określanej jako "edukacja MSC") i można mu zapobiec poprzez podanie terapeutycznego przeciwciała przeciwko receptorowi interleukiny-6 (IL-6R)7. Nasza praca wykazała, że EV raka są kluczowymi modulatorami zachowania MSC, zapewniając w ten sposób uzasadnienie dla podejść ukierunkowanych na mikrośrodowisko w celu zatrzymania postępu kostniakomięsaka. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji guza-MSC za pośrednictwem EV in vivo. Model ten ma na celu: 1) szczegółowe zdefiniowanie wywołanych przez EV zmian w zachowaniu MSC w mikrośrodowisku guza, 2) ocenę, w jaki sposób ta interakcja przyczynia się do wzrostu guza kości i powstawania przerzutów oraz 3) zbadanie, czy zakłócenie przesłuchu za pośrednictwem EV in vivo zapobiega progresji raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie tkanki tłuszczowe do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych zostały uzyskane z Oddziału Chirurgii Plastycznej Szpitala Tergooi (Hilversum, Holandia) po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Etyki i pisemnej świadomej zgodzie. MgŁody tkanki tłuszczowej GFP-dodatnie uzyskano z Kliniki Nauk Medycznych i Chirurgicznych dla Dzieci i Dorosłych (Uniwersytet w Modenie i Reggio Emilia).

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z holenderskim prawem o doświadczeniach na zwierzętach, a protokół został zatwierdzony przez komitet ds. eksperymentów na zwierzętach centrum medycznego Uniwersytetu VU, Amsterdam, Holandia.

1. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez nowotwór.

  1. Przygotuj płodową surowicę bydlęcą zubożoną w EV (FBS), wirując FBS w temperaturze 70 000 x g przez noc (16 godzin), bez hamulca, w temperaturze 4 °C przy użyciu ultra-kołyszącego się wirnika kubełkowego (spodziewaj się 1 godziny na spowolnienie). Ostrożnie zebrać supernatant (FBS zubożony w EV), nie naruszając osadu. Przefiltruj FBS zubożony w EV za pomocą filtra 0,22 μm.
  2. Przygotuj pożywkę hodowlaną o zubożonej w EV, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco (IMDM) firmy Iscove o 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy (1x P/S/G) i 5% FBS o zubożonej w EV.
  3. Wysiewać 3 x 106 komórek 143B w kolbach o średnicy 175cm2 i hodować je na pożywce hodowlanej o zawartości EV w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Gdy komórki są zlewające się w 80 - 90% (zwykle po 36 godzinach do 48 godzin), należy pobrać supernatant z 8 kolb o długości 175 cm2 (28 ml / kolbę) w celu izolacji EV.
  4. Wstępnie oczyścić supernatant komórek w celu usunięcia komórek i resztek komórek poprzez wirowanie różnicowe (za każdym razem odwirowując supernatant z poprzedniego spinu) zgodnie z następującym protokołem:
    1. Odwirować supernatant dwukrotnie przy 500 x g przez 10 minut.
    2. Odwirować supernatant dwukrotnie przy 2000 x g przez 15 minut.
    3. Odwirować supernatant dwukrotnie przy stężeniu 10 000 x g przez 30 minut.
    4. Wszystkie wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C z maksymalnymi ustawieniami prędkości przyspieszania i zwalniania. Po każdym etapie ostrożnie zebrać supernatant zawierający EV, pozostawiając około 1 ml. Natychmiast przejść do kroku 1.5 lub przechowywać wstępnie oczyszczone, kondycjonowane podłoże w temperaturze -80 °C do momentu odizolowania EV.
  5. Izoluj EV poprzez odwirowanie wstępnie oczyszczonej, kondycjonowanej pożywki raz przy 70 000 x g przez 1 godzinę, z powolnym hamowaniem, w temperaturze 4 °C w probówkach ultrawirówkowych (końcowa objętość 38,5 ml / probówka) za pomocą ultra-kołyszącego się wirnika kubełkowego.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 1 ml, ponownie zawiesić granulki zawierające EV w pozostałej objętości, zebrać je wszystkie w jednej probówce ultrawirówki i dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) aż do całkowitego napełnienia probówki (końcowa objętość 38,5 ml).
  7. Ponownie odwirować przy 70 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, bez hamulca (oczekiwanie na 1 godzinę w przypadku zwalniania). Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu i pozostawić 100 - 200 μl.
  8. Ponownie zawiesić granulat EV i dostosować końcową objętość do 200 μl za pomocą PBS (znormalizowanego dla wszystkich izolacji EV). Preparat EV należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia22.
    UWAGA: Pojazdy elektryczne mogą być przechowywane do 6 miesięcy w temperaturze -80 °C.

2. Charakterystyka EV.

Oczyszczone pojazdy elektryczne mogą być wizualizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)23.

  1. Zmieszać preparaty EV z równą objętością 4 % paraformaldehydu w buforze fosforanowym.
  2. Siatki niklowe TEM powlekane węglem Formvar o oczkach 200 pokryć 5 μl zawieszenia EV przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Utrwalić próbki EV na siatkach TEM za pomocą 1 % aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,0), porównać ze szczawianem uranylu (pH 7,0) i zatopić w mieszaninie 4 % octanu uranylu i 2 % metylocelulozy w stosunku 1:9 na lodzie.
  4. Usuń kratki z pętlami ze stali nierdzewnej i osusz nadmiar płynu bibułą filtracyjną, aby zapewnić odpowiednią grubość filmu metylocelulozowego.
  5. Po wysuszeniu zbadaj siatki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego i uchwyć obrazy za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z odpowiednim oprogramowaniem do obrazowania.

3. Edukacja MSCs przez EV pochodzące z nowotworu.

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną MSC, uzupełniając pożywkę niezbędną o minimum alfa (alfa-MEM) ludzkim lizatem płytkowym o zawartości 4% EV (hPL)24, heparyna (10 U/mL) i 1x P/S/G.
    UWAGA: hPL zubożone w EV uzyskuje się zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 1.1.
  2. Wysiać 1,4 x 106 MSCs pochodzących z tłuszczu w kolbie o średnicy 75cm2 i wyhodować je w pożywce MSC o zawartości EV w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, dodaj 143B kostniakomięsaka lub kontroluj ludzkie fibroblasty (hf)-EVs, 10 μl preparatu EV /cm2 kolby hodowlanej. Inkubuj przez 24 godziny i dodawaj taką samą ilość EV przez dodatkowe 6 godzin. UWAGA: Ludzkie fibroblasty są hodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco 10% FBS, a EV izoluje się zgodnie z opisem w sekcji 1.
  4. Zebrać supernatant MSC, odwirować 1x przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (z ustawieniami maksymalnej prędkości przyspieszenia i opóźnienia), przenieść do nowej probówki i przechowywać oczyszczony supernatant w temperaturze -80 °C, aby umożliwić przyszłą analizę cytokin (sekcja 5).
  5. W przypadku doświadczeń in vivo (sekcja 6) należy wychować MSCs25, jak opisano w sekcjach 3.1 do 3.3, zebrać komórki i ponownie zawiesić je w PBS w końcowym stężeniu 10-6 komórek na 100 μl. Przechowywać komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia.

4. Test internalizacji EV.

Aby zobrazować wykorzystanie EV przez MSC, oznacz EV zielonym barwnikiem fluorescencyjnym (GFLD) (dostępnym na rynku) zgodnie z protokołem producenta:

  1. Na krótko dodać 180 μl rozcieńczalnika do preparatu 200 μl EV. Rozcieńczyć 1 μl barwnika GFLD w 50 μl rozcieńczalnika i dodać 20 μl rozcieńczonego barwnika do rozcieńczonego preparatu EV.
  2. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Dodać 5 ml 0,1% BSA do PBS, przenieść do probówek ultrawirówek i napełnić probówkę PBS (końcowa objętość 38,5 ml/probówkę).
  4. Wirować 1x przy 70 000 x g przez 1 h w temperaturze 4 °C, bez hamulca (oczekiwanie na 1 godzinę w przypadku zwalniania). Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić oznakowany granulat EV w końcowej objętości 200 μl (dostosować objętość za pomocą PBS).
  5. Dodaj oznakowane EV do kultury MSC lub przechowuj je w temperaturze -80 °C. Po całonocnej inkubacji ocenić internalizację pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej7.

5. Ocena profilu ekspresji cytokin MSC.

  1. Do wielopoziomowego oznaczania ilościowego poziomów białka interleukiny-8 (IL-8), interleukiny-1β (IL-1β), interleukiny-6 (IL-6), interleukiny-10 (IL-10), czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interleukiny-12p70 (IL-12p70) w pożywce kondycjonowanej MSC (patrz krok 3.4), należy użyć dostępnej na rynku cytometrycznej matrycy kulek (CBA) dla ludzkich cytokin zapalnych zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Krótko wymieszaj kulki wychwytujące sprzężone z przeciwciałami i dodaj je do wszystkich probówek. Dodać do probówek roztwory wzorcowe cytokin lub kondycjonowane próbki pożywki.
  3. Dodać odczynnik do wykrywania i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj koraliki dostarczonym roztworem myjącym. Zmierz próbki za pomocą cytometru przepływowego i przeanalizuj dane zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Generacja ortotopowego modelu kostniakomięsaka u myszy ksenoprzeszczepowej.

  1. Pozwól sześciotygodniowym, samicom myszy Athymic Nude-Foxn1nu zaaklimatyzować się przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.
  2. Dzień przed zabiegiem chirurgicznym i w ramach znieczulenia okołooperacyjnego należy dodać paracetamol do wody pitnej. Rozcieńczyć "roztwór paracetamolu dla dzieci" (patrz tabela materiałów) wodą, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml. W oparciu o średnie spożycie wody 150 ml/kg/dzień i średnią masę ciała 20 g, dawka ta jest wystarczająca do osiągnięcia dawki 6 mg/mysz/dzień (300 mg/kg/dobę
    3. ).
  3. Leczenie przeciwbólowe należy kontynuować do 24 godzin po operacji lub dłużej, jeśli zwierzęta wykazują oznaki bólu.
  4. W dniu zabiegu chirurgicznego należy pobrać wyhodowane komórki 143B lucyferazy-dodatnie (Fluc) (wcześniej wygenerowane przez transdukcję lentiwirusa) przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2 x 105 komórek/μL w PBS. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie do 6 godzin.
  5. Sprzęt chirurgiczny w autoklawie. Przygotuj i oczyść obszar roboczy i umieść wysterylizowane nożyczki i pęsetę na sterylnych arkuszach. Dwadzieścia minut przed zabiegiem chirurgicznym (krok 6.8) wstrzyknąć zwierzętom podskórnie buprenorfinę (0,05 mg/kg, rozcieńczoną w 0,9% soli fizjologicznej) jako środek przeciwbólowy za pomocą strzykawek insulinowych o pojemności 0,5 ml (igła o rozmiarze 29).
  6. Tuż przed znieczuleniem każdego zwierzęcia należy napełnić strzykawkę o pojemności 10 μl co najmniej 1 μl skoncentrowanej zawiesiny komórkowej (Fluc) 143B (patrz krok 6.4).
  7. Znieczulić zwierzę znieczuleniem wziewnym izofluranem (2 - 3% w tlenie). Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc zwierzę palcami u stóp. Gdy zwierzę nie reaguje na szczypanie, czyli jest głęboko znieczulone, należy nałożyć maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  8. Ułóż zwierzę na plecach z głową w masce anestezjologicznej i nogami skierowanymi w stronę operatora. Zegnij lewe kolano. Przetrzyj skórę 70% etanolem i nałóż lidokainę (2%) bawełnianą końcówką 3 razy jako miejscowy środek przeciwbólowy.
  9. Użyj sterylnego noża chirurgicznego, aby wykonać małe nacięcie (około 5 mm) na skórze tuż pod kolanem, aby odsłonić kość piszczelową. Wywierć otwór w kości piszczelowej, około 2 mm poniżej kolana, za pomocą wiertła krętego 0,8 mm. Uważaj, aby nie przewiercić się przez obie korowe kości piszczelowe.
  10. Wstrzyknąć 1 μl zawiesiny komórek (około 2 x 105 komórek) powoli (w ciągu około 5 sekund) do otworu za pomocą igły o rozmiarze 26G. Zamknij otwór kroplą kleju tkankowego, aby zapobiec cofaniu się zawiesiny.
  11. Zamknij skórę szwami monofilamentowymi i jedną kroplą kleju tkankowego. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie w dobrze nagrzanym środowisku (użyj lampy grzewczej). Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Dopiero gdy zwierzęta w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia, należy je umieścić w ich własnych klatkach.
  12. Dwa dni po zaszczepieniu guza należy wstrzyknąć e-mailowo lub wcześniej wykształcone lub wcześniej zakażone GFP MSC (106 komórek w 100 μl PBS, patrz krok 3.5) dożylnie za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml w żyłę ogonową myszy.
  13. Śledź wzrost guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego26 dwa razy w tygodniu. W tym celu wstrzyknij myszom i.p. 150 μl D-lucyferyny (30 mg / ml) za pomocą strzykawki insulinowej. Dziesięć minut po wstrzyknięciu umieść zwierzęta w systemie obrazowania bioluminescencyjnego i zmierz strumień fotonów generowany przez komórki nowotworowe.
  14. Ponadto zmierz średnicę pierwotnego guza kości za pomocą suwmiarki. Objętość guza (w mm3) szacuje się na podstawie szerokości x długości2 x 0,5.
  15. UWAGA: Humanitarne punkty końcowe definiuje się jako średnicę guza >15 mm lub utratę masy ciała >15%.

7. Ocena liczby guzków płucnych

  1. Gdy jedno ze zwierząt osiągnie humanitarny punkt końcowy określony w kroku 6.14 (w ciągu około 3-4 tygodni), należy zakończyć doświadczenie oraz pobrać i przeanalizować wszystkie istotne tkanki.
  2. Dziesięć minut przed eutanazją wstrzyknij 150 μl D-lucyferyny (30 mg/ml) za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.
  3. Znieczulić zwierzęta znieczuleniem wziewnym izofluranem (patrz krok 6.7). Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji myszy na szczypanie palców u stóp. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy27.
  4. Zbierz płuca, wątrobę, śledzionę i nerki za pomocą wysterylizowanych nożyczek i pęsety. Umyj narządy w PBS, aby usunąć ślady krwi i umieść je na szalce Petriego.
  5. Umieść szalkę Petriego wraz z narządami w systemie obrazowania bioluminescencyjnego. Zmierz sygnał bioluminescencji po obu stronach narządów. Natychmiast po pomiarze zanurz narządy w 4% formalinie, aby je utrwalić (24 - 72 godziny, w RT) do przyszłej analizy histologicznej.
  6. Uzyskane obrazy należy przetworzyć za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania poprzez ręczne progowanie. Policz liczbę guzków płuc na każdym obrazku. Policz całkowitą liczbę guzków płuc po obu stronach płuc.

8. Analiza histologiczna

  1. Do analizy histologicznej tkanek płucnych:
    1. Zanurz narządy utrwalone w formalinie w parafinie i przygotuj szkiełka tkankowe o grubości 6 μm.
    2. Odparafinować szkiełka tkanki płucnej i przeprowadzić pobieranie antygenu, gotując je przez 15 minut w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 6).
    3. Inkubować szkiełka poziomo w temperaturze pokojowej z przeciwciałem przeciwko ludzkiej wimentynie (200 μg/ml) rozcieńczonym w stosunku 1:150 w rozcieńczalniku przeciwciał (dostępnym w handlu), a następnie z drugorzędowym przeciwciałem znakowanym HRP (0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:500). Wybarwić tkanki 3'-diaminobenzydyną (DAB) i hematoksyliną przeciw barwieniu.
    4. Obserwuj wybarwione szkiełka tkankowe za pomocą mikroskopu optycznego sprzężonego z odpowiednią kamerą i oprogramowaniem do obrazowania.
  2. Aby ocenić obecność MSCs GFP-dodatnich w piszczelach myszy:
    1. Odwapnić kości piszczelowe w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) 0,24 M, pH 7,2 - 7,4. Odświeżaj bufor EDTA co drugi dzień, aż kości staną się elastyczne (około 1 tydzień).
    2. Odwodnić piszczele i naciekać je parafiną. Osadź piszczele (w tym tkankę kostniakomięsaka) w blokach parafinowych.
    3. Za pomocą mikrotomu przygotuj skrawki parafiny o wielkości 6 μm. Umieść skrawki parafiny na szkiełkach podstawowych. Po wyschnięciu przechowuj szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej.
    4. Przeprowadzić pobieranie antygenu za pośrednictwem ciepła za pomocą buforu cytrynianowego (patrz ppkt 8.1.2) i wybarwić tkanki przeciwciałem anty-GFP (całą surowicą anty-GFP) w rozcieńczalniku 1:900 w rozcieńczalniku przeciwciała. Przeciwbarwić tkanki 4',6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI).
    5. Obserwuj szkiełka tkankowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z odpowiednim oprogramowaniem do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu badaliśmy zdolność EV wydzielanych przez kostniakomięsaka do edukacji MSC w kierunku fenotypu pronowotworowego i proprzerzutowego. Pokazujemy, że komórki kostniakomięsaka uwalniają egzosomy podobne do EV, które są internalizowane przez MSC. Zmierzyliśmy zmianę profilu ekspresji cytokin MSC indukowaną przez EV raka i oceniliśmy wpływ MSCs edukowanych przez EV na wzrost guza i tworzenie przerzutów. Ogólna reprezentacja projektu badania jest zilustrowana na rysunku

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez guz (EV) mogą zmieniać fizjologię lokalnych i odległych komórek mezenchymalnych w celu wytworzenia środowiska wspierającego nowotwór. W tym miejscu opisujemy generowanie przedklinicznego mysiego modelu kostniakomięsaka, który umożliwia analizę interakcji za pośrednictwem EV między komórkami nowotworowymi a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (MSC) in vivo. Pokazujemy, że ogólnoustrojowe wstrzykiwanie MSCs wykształconych przez ludzki guz EV myszom z ksenografami k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio był wspierany przez stypendium Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) współfinansowane przez Unię Europejską. Ponadto projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 660200 (dla S.R. Baglio) w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Ultra WirówkaBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650Określany w rękopisie jako ultra-wahadłowy wirnik kubełkowy
Transmisyjny mikroskop elektronowyZeissEM109Lub podobny TEM
Aparat cyfrowyNikonDMX 1200FLub podobny aparat
Oprogramowanie do obrazowania TEM NikonACT-1
Mikroskop fluorescencyjnyZeissImager.D2Lub podobny Mikroskop fluorescencyjny
Oprogramowanie do obrazowania FMZeissZEN Niebieski
inkubatorNuaire4750E
WirówkaHettickROTANTA 460R-80
ZamrażarkaThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburLub podobny cytometr przepływowy
WiertłoFermFCT-300Z wiertłem 0,8 mm Wiertła
kręte HSS mikro, 0,8 mmWiertło Proxxon28 8520,8 mm Kamera
IVISXenogenIvis LuminaOkreślany w manuskrypcie jako kamera bioluminescencyjna. Xenogen jest teraz częścią oprogramowania do obrazowania Perkin Elmer
Living2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen jest teraz częścią Perkin Elmer
10 i micro; L StrzykawkaHamiltonNeuros Model 1701 RN
Igła: Hamilton RN Igła do strzykawki, 26 Gauge, Pointstyle AS, niestandardowa długość 2 cmHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Heat
LampPhilipsn.a.
Culture media
Płodowa surowica bydlęcaHyklonRYG35912
Lizat płytkowyn.a.n.a.IMDM
mediumLonzaBE12-722F
alpha-MEM mediumLonzaBE02-002F
DMEM mediumLonzaBE12-614F
pen/strep/glutamineGIBCO10378-016
heparynaLEO012866-08
Trypsyna/EDTA (10x)GIBCO15400-054
komórki
tłuszczowe odrzeczone MSCs
MSCsn.a.n.a.ludzkie
fibroblastyn.a.n.a.
Komórki 143BATCCCRL-8303
Ogniwa FLUC-143BATCCCRL-8303Transdukowane
Jednorazowe
Kolby hodowlane 175 cm2CELLSTAR660175
probówki 50 mlGreiner bio-one210261
Probówki do zamrażaniaThermoscientific377224
Probówki Ultra-ClearBeckman344058Określane w manuskrypcie jako ultra-probówki wirówkowe
0,22 i mikro; Filtrm MillexSLGV033RS
200 mesh Siatki niklowe powlekane węglemFormvar EMS (Electron Microscopy Sciences)
Strzykawki insulinowe 0,5 ml z igłą 29GTerumoU-100 
Szalka PetriegoSigma - AldrichP7612
Bibuła filtracyjna Thermo fisher Scientific50363215
Odczynniki / zestawy
paraformaldehydAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
aldehyd glutarowyEMS (Nauki o Mikroskopii Elektronowej)16300
szczawian uranyluEMS (mikroskopia elektronowa Nauki)22510
octan uranuEMS (Nauki o mikroskopii elektronowej)22400
metylocelulozaEMS (Nauki o mikroskopii elektronowej)1560
PKH67Sigmamini67-1ktOkreślany w manuskrypcie jako GFLD
BSASigmaA8412
CBA - zestaw ludzkich cytokin zapalnychBD551811
Formaldehyd 37%VWR104003100
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowejSwann-Morton206Określany w manuskrypcie jako nóż chirurgiczny
przeciwciało anty-ludzka wimentynaSanta Cruzsc-6260Clone V9
Rozcieńczalnik przeciwciałDAKOS0809
Przeciwciało anty mysie IgG znakowane HRPLife Technologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoksyllinaSigmaGHS232
EDTA-buffern.a.n.a.Bufor
cytrynianowyn.a.n.a.rabbit
poliklonalne przeciwciało anty-GFPAbcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syropBayern.a.Sinaspril, roztwór paracetamolu dla dzieci
Izofluran 1000 mg/gVumc aptekachlorowodorek
, 0,3 mg/mlIndivior UK Limitedn.a.lidokaina-HCL
2%Vumc aptekan.d.70
% etanoluVWR93003.1006
Klej do tkanekDerma+Flex, opracowany medyczny cyjanoakrylanVygonLB604060
Krople do oczu: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lomb
, sól potasowaZłoto BiotechnologiaLUCK-1
Szkiełkaszklane Thermo scientific630-0954
Pętle ze stali nierdzewnej n.a.n.a.
Mice experiments
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  samica, 6 tygodni po przybyciu, status bakteryjny zgodny z FELASAENVIGOn.a.Inteligentny
dom z masy papierniczej (wzbogacanie klatek)Bio Servicesb.a.Materiał
ściółkowy Alpha-driShepperd Speciality Papersb.a.
Karma dla myszy: Teklad global 18% białkowa dieta dla gryzoniENVIGO2918-11416M
SzwyEthiconV926H
NożyczkiSigma-AldrichS3146-1EA(lub podobne)
PęsetySigma-AldrichF4142-1EA(lub podobne)
n.a.n.a.GFP-dodatnie buprenofiny n.a.D-lucyferyna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wydzielanie p cherzyk w zewn trzkom rkowychEV nowotworoweoczyszczanie EVksenoprzeszczep ortotopowyobrazowanie bioluminescencyjneekspresja cytokinhoming MSCprzerzuty do p ucpobieranie EV

Powiązane artykuły