Artykuł metodologiczny

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56935

⸱

24 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Graduate School of Science, Kyoto University, 2Graduate School of Science, Osaka City University, 3The Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University, 4Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.

Streszczenie

Zróżnicowane gatunki muszki owocowej (Drosophila) dają możliwość badania mechanizmów rozwoju i zmian genetycznych odpowiedzialnych za zmiany ewolucyjne. W szczególności stadium dorosłe jest bogatym źródłem cech morfologicznych do porównań międzygatunkowych, w tym porównania pigmentacji skrzydeł. Aby zbadać różnice rozwojowe między gatunkami, wymagana jest szczegółowa obserwacja i odpowiednia ocena stopnia zaawansowania w celu precyzyjnego porównania. W tym miejscu opisujemy protokoły oceny okresów poczwarki i ilościowego oznaczania pigmentacji skrzydeł u muszki owocowej w kropki, Drosophila guttifera. W pierwszej kolejności opisujemy metodę szczegółowej obserwacji morfologicznej i definiowania stadiów poczwarki na podstawie morfologii. Metoda ta obejmuje technikę usuwania poczwarki, która jest zewnętrznym chitynowym przypadkiem poczwarki, w celu umożliwienia szczegółowej obserwacji morfologii poczwarki. Po drugie, opisujemy metodę pomiaru czasu trwania określonych stadiów poczwarki. Na koniec opisano metodę kwantyfikacji pigmentacji skrzydeł w oparciu o analizę obrazu z wykorzystaniem obrazów cyfrowych i oprogramowania ImageJ. Dzięki tym metodom możemy stworzyć solidną podstawę do porównania procesów rozwojowych cech dorosłych osobników w stadiach poczwarkowych.

Wprowadzenie

Niektóre cechy morfologiczne Drosophila są zróżnicowane wśród gatunków1,2,3,4,5. Do pytania o to, w jaki sposób powstaje różnorodność morfologiczna, możemy podejść poprzez porównanie mechanizmów powstawania tych morfologii. Przykładami takich morfologii są trichomy larw, grzebienie płciowe dorosłych, zewnętrzne narządy płciowe, pigmentacja brzucha i pigmentacja skrzydeł6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Aby zbadać różnice morfologiczne między dorosłymi osobnikami, ważna jest obserwacja i analiza stadiów poczwarki, ponieważ los cech dorosłych osobników jest determinowany w późnych stadiach larwalnych, a późniejsza morfogeneza przebiega w okresie poczwarki.

W badaniach biologii rozwojowej Drosophila melanogaster, "godziny APF" (godziny po uformowaniu się poczwarki) to powszechna metoda oznaczania stadium poczwarki16. System ten wykorzystuje bezwzględny czas po uformowaniu się poczwarki i jest bardzo wygodny w rutynowych eksperymentach. Jednak szybkość rozwoju może się różnić między poczwarkami i mogą mieć na nią wpływ niewielkie różnice genetyczne, epigenetyczne lub mikrośrodowiskowe, a zatem ten sam bezwzględny czas po utworzeniu poczwarki nie gwarantuje, że poczwarki są na tym samym etapie rozwoju. W wielu przypadkach stadia zdefiniowane przez cechy morfologiczne są preferowane do porównywania wielu osobników. W szczególności porównanie między gatunkami wymaga precyzyjnego stopniowania i porównania między odpowiadającymi im (homologicznymi) stadiami.

Bainbridge and Bownes17 rozpoznał 20 stadiów poczwarki (od P1 do P15(ii)) na podstawie cech morfologicznych poczwarek Drosophila melanogaster. Ta klasyfikacja jest najczęściej używanym systemem morfologicznej oceny stopnia rozwoju18. W poprzednim badaniu przeprowadziliśmy ocenę stopnia zaawansowania poczwarki Drosophila guttifera, aby stworzyć podstawę do badań nad pigmentacją skrzydeł19. D. guttifera ma wzór w kropki na skrzydłach i jest jednym z gatunków modelowych do tworzenia pigmentacji skrzydeł20. Chociaż odnieśliśmy się do kryteriów morfologicznych opisanych w badaniach Bainbridge'a i Bownesa17, bezpośrednio mierzyliśmy czas trwania etapu za pomocą obserwacji seryjnych19, zamiast używać oszacowania czasu trwania etapu Bainbridge'a i Bownesa na podstawie obserwowanej częstotliwości. W tym miejscu opisujemy metodę oceny stanu poczwarki i pomiaru czasu trwania stadiów poczwarki Drosophila zastosowaną w Fukutomi et al19.

Aby zbadać mechanizm rozwoju pigmentacji skrzydeł, musimy wiedzieć, kiedy w stadium poczwarkowym lub dorosłym występuje pigmentacja. Fukutomi i wsp. 19 ilościowe określenie gęstości optycznej (OD) pigmentacji w stadium poczwarki i dorosłego osobnika poprzez analizę obrazów skrzydeł. Uważa się, że pigmentacja skrzydeł Drosophila jest spowodowana nagromadzeniem czarnej melaniny21. Do kwantyfikacji OD użyto obrazów w skali szarości i oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)22. Aby rozpoznać i określić ilościowo pigmentację specyficzną dla plamki (ΔOD), odejmujemy OD na zewnątrz plamki od OD wewnątrz plamki. Aby metoda ta była powtarzalna i obiektywna, miejsca pomiaru OD powinny być wyznaczane za pomocą żył skrzydłowych jako punktów orientacyjnych. W tym artykule szczegółowo opisujemy tę metodę ilościowego oznaczania pigmentacji skrzydeł u Drosophila guttifera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mucha

  1. Użyj Drosophila guttifera dla wszystkich poniższych protokołów.
  2. Do konserwacji zapasów należy używać plastikowych fiolek (średnica 25 mm x wysokość 96 mm) i zatyczek celulozowych (średnica 23 mm x wysokość 26 mm). Użyj standardowego pokarmu z mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru i postępuj zgodnie z publikacją opisaną w trzech innych alternatywnych przepisach dla tego gatunku2.
    UWAGA: D. guttifera (numer stada 15130-1971.10) jest dostarczany przez Drosophila Species Stock Center na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego. Chociaż D. guttifera należy do promieniowania imigrans-tripunctata, które jest daleko spokrewnione z D. melanogaster w obrębie rodzaju23, ma wiele właściwości biologicznych wspólnych z D. melanogaster. W związku z tym protokół ten może być stosowany do wielu gatunków Drosophila, chociaż niektóre gatunki wymagają specjalnego pożywienia i/lub wskazówek technicznych, aby je utrzymać2.

2. Obserwacja poczwarki i definicja stadiów poczwarki

UWAGA: Poczwarka do obserwacji jest pobierana z stada much utrzymywanego w cyklu 12:12 h światło/ciemność w temperaturze 25 °C. Bainbridge i Bownes17 opisali niskie ryzyko przeniesienia poczwarek D. melanogaster z pierwotnego miejsca przepoczwarzenia na kawałek zwilżonej bibuły (97% przeżycia z 946 przeniesionych poczwarek). Poczwarki D. guttifera można przygotować zasadniczo tą samą metodą.

  1. Umieść zdrowe dorosłe osobniki Drosophila na świeżym pokarmie (standardowa mąka kukurydziana/cukier/drożdże/pokarm agarowy) w plastikowej fiolce (średnica 25 mm x wysokość 96 mm) i pozwól im złożyć jaja. Poczekaj 7 dni, aby uzyskać późne 3 gwiazdki.
  2. Umieść 1 ml standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru w każdej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Wykonaj 3 otwory w odstępach 2 mm w pokrywkach mikroprobówek, penetrując je pinezką, aby umożliwić oddychanie.
  3. Wirować mikroprobówki z pokarmem przez 7 s w mini mikrowirówce (860 x g).
  4. Odwrócić i postukać w fiolki, aby usunąć z niej wszystkie dorosłe osobniki.
  5. Wlać 5 - 10 ml ddH2O (lub wody z odwróconej osmozy) do fiolki.
  6. Wlej larwy z wodą do plastikowej szalki Petriego (średnica 90 mm x wysokość 15 mm). Późne trzecie stadium rozwojowe można rozpoznać po dużych rozmiarach ciała (3 - 4 mm długości).
  7. Delikatnie przenieś późne larwy 3 stadium za pomocą kleszczy do mikroprobówek z pokarmem (10 larw / mikroprobówka). Inkubować je przez noc w temperaturze 25 °C.
  8. Przenieść nowo powstałe poczwarki na kawałek bibuły, który został zwilżony ddH2O i umieszczony na plastikowej szalce Petriego (średnica 35 mm x wysokość 10 mm).
  9. Umieścić szalkę Petriego w wilgotnej komorze (zawierającej 10 mlddH2O na dnie) i poczekać, aż poczwarki rozwiną się do pożądanego etapu.
  10. Przenieść poczwarki na zwilżony kawałek bibuły na plastikowej szalce Petriego (średnica 60 mm x wysokość 15 mm).
    UWAGA: Definicję etapów można w większości uzyskać na podstawie stadiów D. melanogaster17. Zazwyczaj okres poczwarki Drosophila można podzielić na P1 - P15(ii), chociaż w zależności od użytego gatunku wymagane byłyby pewne modyfikacje definicji stadium. Jeśli to możliwe, usunięcie poczwarki umożliwia precyzyjną i szczegółową obserwację. Zobacz szczegóły poniżej (Krok 3).
  11. Obserwuj poczwarki pod mikroskopem stereoskopowym. Rób zdjęcia za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu stereoskopowego.

3. Usuwanie poczwarki

UWAGA: Poczwarki Drosophila są pokryte strukturą zwaną puparium. Owad Muscomorpha (muchy) nie zrzuca naskórka larwalnego w momencie przepoczwarzenia; Zamiast tego utwardza naskórek po apolizie i używa go jako osłony ochronnej poczwarki, Puparium24. Poczwarka znajdująca się w poczwarce ma prawdziwy naskórek poczwarki, który jest bardzo miękki i delikatny. Zanim dojdzie do apolizy wokół P4(ii), nabłonek i poczwarka są ze sobą zrośnięte, dlatego usunięcie poczwarki bez uszkodzenia jest bardzo trudne. Po P5 usunięcie poczwarki jest pracochłonne, ale przydatne do obserwacji morfologicznej i określenia stadiów poczwarki. Proces odbywa się w następujący sposób.

  1. Przyklej kawałek dwustronnej taśmy na ręczniku papierowym.
  2. Umieść poczwarkę na dwustronnej taśmie brzusznie do góry (Rysunek 1A).
  3. Zlokalizuj przestrzeń między przednią stroną poczwarki a poczwarką wewnętrzną. Chwyć i usuń poczwarkę wokół tej szczeliny za pomocą kleszczy i odsłoń przednią stronę głowy poczwarki.
  4. Włóż końcówkę kleszczy, przesuwając ją równolegle do osi przednio-tylnej. Podnieś końcówkę kleszczy, aby miejscowo złamać poczwarkę. Powtarzaj tę czynność, aż pęknięcie dotrze do tylnej części poczwarki. Upewnij się, że między poczwarką a nogami poczwarki jest również utworzona szczelina, a następnie przełam brzuszną stronę poczwarki i zminimalizuj uszkodzenie wewnętrznej poczwarki (Rysunek 1B).
  5. Po rozbiciu poczwarki tak bardzo, jak to możliwe, wyjmij poczwarkę za pomocą cienkiego pędzla (#5/0) (Rysunek 1C).
  6. Umieścić poczwarkę na kawałku bibuły, który został zwilżony ddH2O i umieszczony na plastikowej szalce Petriego (średnica 60 mm x wysokość 15 mm). Rób zdjęcia tak szybko, jak to możliwe, ponieważ odsłonięta poczwarka jest wrażliwa i łatwo wysycha.
    UWAGA: Poczwarki bez poczwarki nie nadają się do pomiaru czasu trwania okresów poczwarki (Krok 4), ponieważ stres (taki jak wysuszenie) i uszkodzenia fizyczne mogą zakłócać normalny rozwój.

4. Pomiar czasu trwania stadiów poczwarki

  1. Przygotuj poczwarki do pomiaru czasu trwania stadiów poczwarki, jak opisano w kroku 2. Zbierz poczwarki 1-2, 2-3 i 3-4 dni po utworzeniu poczwarki (po 20 poczwarek każda). Nadaj indywidualne numery identyfikacyjne (1 - 60) poczwarkom w celu identyfikacji. Kontynuuj zbieranie nowo powstałych poczwarek w poniższych krokach, aby uzyskać 20 kolejnych młodych poczwarek. Nadaj indywidualne numery identyfikacyjne (61 - 80) nowo powstałym poczwarkom. Umieścić poczwarkę na kawałku bibuły zwilżonej ddH2O, w studzience (3,9cm2) 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (1 poczwarka/dołek, 12 poczwarek/płytka). Wypełnij przestrzeń międzystudzienkową płytek ddH2O, aby utrzymać wilgotność, załóż pokrywki i umieść płytki w temperaturze 25 °C, przy stałym świetle (24:0 h światła/ciemności).
    UWAGA: Poczwarki bez poczwarki nie nadają się do pomiaru czasu trwania okresów poczwarki. Proszę nie usuwać poczwarki.
  2. Obserwuj cechy morfologiczne, w tym kolor ciała, szczecinę, kanaliki Malpighiego i żółte ciało wszystkich poczwarek raz na 30 minut, a następnie zapisuj obserwowane etapy (P1 - P15(ii), na podstawie referencji17,19) w arkuszu zliczania.
  3. Kontynuuj nagrywanie przez cztery dni z rzędu (96 godzin) na zmianę składającą się z trzech (lub więcej) osób.
  4. Policz liczbę rekordów każdego konkretnego etapu i uśrednij je (średnia liczba obserwacji / poczwarek). Następnie pomnóż je przez 0.5 (h), co otrzyma szacunkowe długości etapów (h).

5. Pomiar intensywności czarnych plam na skrzydle

UWAGA: Intensywność czarnych plam na poczwarce lub skrzydle dorosłego osobnika może być określona ilościowo poprzez pomiar gęstości optycznej (OD). Szklany filtr ze znanymi OD (filtr o stopniowanej gęstości) jest używany do kalibracji25, dzięki czemu można obliczyć OD określonego obszaru na podstawie cyfrowego obrazu skrzydła. Mierzy się OD w miejscu i OD na zewnątrz punktu, a ten ostatni jest odejmowany od pierwszego w celu uzyskania intensywności plamki (ΔOD). Tutaj opisujemy metodę preparacji, pomiaru i obliczania ΔOD. Tę procedurę można wykonać po kroku 2, niezależnie od kroku 3 i kroku 4. Po wykonaniu Kroku 2 i zrozumieniu wszystkich etapów poczwarki, można bezpośrednio rozpocząć lub powtórzyć Krok 5.

  1. Przygotowanie obrazu
    1. Przygotuj nową poczwarkę w stadium ogniskowym, jak opisano w kroku 2. Usuń przednią część poczwarki za pomocą kleszczy. Wyjąć poczwarkę za pomocą kleszczy i umieścić ją w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, tabela 2) na plastikowej szalce Petriego (średnica 35 mm x wysokość 10 mm).
    2. Wytnij staw podstawowy skrzydła (staw podstawowy to wąska proksymalna część skrzydła). Po złożeniu skrzydła umieść je na plastikowej szalce Petriego (średnica 35 mm x wysokość 10 mm) wypełnionej ddH2O, aby wysunąć je pod ciśnieniem osmotycznym (skrzydło rozkłada się samoczynnie).
    3. Nowo zamknięte dorosłe osobniki należy zbierać raz na 10 minut z fiolki z zapasem. Znieczulić muchę CO2 za pomocą podkładki znieczulającej CO2, potwierdzić znieczulenie przez unieruchomienie i przeciąć staw podstawowy skrzydła.
    4. Umieścić 10 μl PBS na szkiełku podstawowym, umieścić tam skrzydełko i przykryć szkiełkiem nakrywkowym (18 mm x 18 mm).
    5. Włącz światło mikroskopu stereoskopowego. Ustaw światło na maksymalny poziom. Ustaw soczewkę obiektywu 11.5x. Ustaw przysłonę w stanie najbardziej otwartym. Włącz aparat. Ustaw aparat na (ISO: 100, tryb SHQ 3136 x 2352 pikseli, czas otwarcia migawki: 1/20 s). Ustaw ostrość na próbce, przesuwając pokrętło ostrości mikroskopu.
    6. Naciśnij spust migawki na pilocie zdalnego sterowania, aby zrobić zdjęcie. Zrób 3 zdjęcia na każde skrzydło, z których każde musi być wyśrodkowane na czubku dzwonkowatym, podłużnej żyle lub tylnej żyle poprzecznej, umieszczając dystalną część skrzydła po lewej stronie, a przednią część skrzydła po górnej stronie.
  2. wzorcowanie
    1. Wykonaj zdjęcia 9 części filtra o stopniowanej gęstości, korzystając z tych samych ustawień kamery, które zostały użyte do uzyskania obrazu skrzydła.
    2. Uruchom oprogramowanie ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
    3. Kliknij pozycję Plik | Otwórz | i wybierz jeden z obrazów filtra gęstości schodkowej.
    4. Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
    5. Kliknij Edytuj | Selekcja | Określ | i zaznacz opcję Owalna i Wyśrodkowana kolumna. Wpisz 100 (pikseli) w kolumnie szerokości, 100 (pikseli) w kolumnie wysokości, 1568 w kolumnie współrzędnych X i 1176 w kolumnie współrzędnych Y. Kliknij przycisk OK.
    6. Kliknij pozycję Analizuj | Środek|. Mierzona jest "średnia wartość szarości" wybranych obszarów.
    7. Powtórz te czynności od 5.2.3. do 5.2.6. dla pozostałych 8 obrazów.
    8. Kliknij pozycję Analizuj | Skalibruj i wybierz Rodbard25 w kolumnie Funkcja i wpisz następującą liczbę w prawej kolumnie pośrodku (0.04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; liczby te zależą od gęstości stopniowanego filtra gęstości).
    9. Zaznacz kolumnę Kalibracja globalna i kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Wykonując tę procedurę, "średnia wartość szarości" jest konwertowana na "gęstość optyczną (OD)" za pomocą funkcji Rodbarda. Po tym kroku można obliczyć gęstość optyczną dla konkretnego, wybranego obszaru w oprogramowaniu ImageJ.
  3. Wybór obszaru pomiarów
    UWAGA: Plamy są zwykle kojarzone z punktami orientacyjnymi, takimi jak czułka dzwonkowata, podłużne końcówki żył i żyły poprzeczne. Te i inne punkty orientacyjne na skrzydle można wykorzystać do wyboru obszaru pomiarów. Tutaj opisano przykład u D. guttifera (Rysunek 2).
    1. Definicja punktu A, plamka czułkowata dzwonkowata.
      1. Otwórz obraz, na którym w środku obrazu znajduje się plamka czułkowata dzwonkowata. Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
      2. Kliknij pozycję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt. Ustaw lewy górny wierzchołek prostokąta tak, aby był przymocowany do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej i bardziej dystalny od plamki czubkowej dzwonkowatej. Ustaw prawą stronę prostokąta tak, aby znajdowała się na prawo od plamki czułości dzwonka.
      3. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |. Zaznacz kolumnę Pokaż wszystko.
      4. Kliknij narzędzie Kąt w Narzędziach do zaznaczania linii. Narysuj pierwszą linię na tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Ustaw lewe punkty końcowe linii na wierzchołku prostokąta narysowanego w kroku 1. Narysuj drugą linię w górnej części prostokąta. Naciśnij "m", aby zmierzyć kąt między dwiema liniami narysowanymi w tym kroku. Kliknij okno obrazu na ekranie komputera.
      5. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |.
      6. Kliknij opcję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu. Kliknij Edytuj | Selekcja | Obróć |. Wpisz minus stopnie kąta mierzonego w kroku 5.3.1.4. w kolumnie Kąt i kliknij przycisk OK, aby obrócić prostokąt narysowany w tym kroku.
      7. Przesuń prostokąt narysowany w kroku 5.3.1.6. za pomocą strzałek. Ustaw punkt końcowy tylnej linii drugiej żyły podłużnej po lewej stronie prostokąta, a dolną stronę prostokąta dołączoną do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Upewnij się, że w tej procedurze narysowana jest prostopadła linia od punktu końcowego drugiej żyły podłużnej do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Zdefiniuj stopę prostopadłej linii jako punkt A (Rysunek 2A).
      8. Zapisz współrzędną x i współrzędną y punktu A, wskazanymi poniżej narzędzi wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie A.
    2. Definicja punktu B, podłużna plamka końcówki żyły
      1. Otwórz obraz, na którym podłużna końcówka żyły znajduje się w środku obrazu. Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
      2. Powtórz tę samą procedurę opisaną w kroku 5.3.1. (Definicja punktu A, plamka czułkowata dzwonkowata), aby znaleźć punkt A na obrazie.
      3. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |.
      4. Kliknij pozycję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt. Ustaw lewy górny wierzchołek prostokąta w punkcie końcowym tylnej linii trzeciej żyły podłużnej.
      5. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |.
      6. Kliknij narzędzie Kąt w Narzędziach do zaznaczania linii. Narysuj pierwszą linię, aby połączyć punkt A z punktem końcowym tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Zdefiniuj tę linię jako linię A. Narysuj drugą linię w górnej części prostokąta narysowanego w kroku 5.3.2.4. Naciśnij "m", aby zmierzyć kąt między dwiema liniami.
      7. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |.
      8. Kliknij opcję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu. Kliknij Edytuj | Selekcja | Obróć |. Wpisz minus stopnie kąta zmierzonego w kroku 5.3.2.6. w kolumnie Kąt i kliknij przycisk OK, aby obrócić prostokąt narysowany w tym kroku. Przesuń prostokąt za pomocą strzałek. Ustaw górną stronę prostokąta tak, aby była dołączona do linii A, a punkt końcowy przedniej linii czwartej żyły podłużnej tak, aby znajdował się po lewej stronie prostokąta.
      9. Kliknij Edytuj | Selekcja | Dodaj do Menedżera |.
      10. Kliknij opcję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu. Kliknij Edytuj | Selekcja | Obróć |. Wpisz minus stopnie kąta zmierzonego w kroku 6 w kolumnie Kąt i kliknij przycisk OK, aby obrócić prostokąt narysowany w tym kroku. Przesuń prostokąt za pomocą strzałek. Ustaw lewy dolny wierzchołek prostokąta tak, aby znajdował się w lewym górnym wierzchołku prostokąta narysowanego w kroku 5.3.2.8., co spowoduje uzyskanie prostopadłej linii od punktu końcowego przedniej linii czwartej żyły podłużnej do linii A. Zdefiniuj punkt przecięcia linii prostopadłej i tylnej linii trzeciej żyły podłużnej jako punkt B (Rysunek 2B).
      11. Zapisz współrzędną x i współrzędną y punktu B, wskazanymi poniżej Narzędzia wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie B.
    3. Definicja punktu C, tylna plamka żył poprzecznych
      1. Otwórz obraz, na którym w środku obrazu znajduje się tylna plamka żył poprzecznych. Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
      2. Zdefiniuj punkt C jako najbardziej wysunięty do tyłu punkt przedniej linii czwartej żyły podłużnej w obszarze przecięcia tylnej żyły poprzecznej i czwartej żyły podłużnej (Rysunek 2C).
      3. Zapisz współrzędną x i współrzędną y punktu C, wskazanymi poniżej Narzędzia wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie C.
    4. Definicja punktu D, obszar kontrolny
      1. Otwórz obraz, na którym w środku obrazu znajduje się plamka czułkowata dzwonkowata. Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
      2. Kliknij Narzędzia wyboru linii prostej i narysuj linię łączącą punkt końcowy przedniej linii drugiej żyły podłużnej z punktem końcowym tylnej linii czwartej żyły podłużnej. Zdefiniuj punkt D jako punkt przecięcia tej linii i tylnej linii trzeciej żyły podłużnej (Rysunek 2D).
      3. Zapisz współrzędną x i współrzędną y punktu D, wskazanym poniżej narzędzi wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie D.
  4. Pomiary
    1. Otwórz jeden z obrazów plamek na skrzydłach (aby zmierzyć punkt A, otwórz obraz z punktem A pośrodku). Kliknij Obraz | Rodzaj | 8-bitowy | , aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy.
    2. Kliknij opcję Prostokąt w obszarze Narzędzia do zaznaczania i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu.
    3. Kliknij Edytuj | Selekcja | Określ wartość |. Zaznacz opcję Kolumna owalna i wyśrodkowana. Wpisz 100 (pikseli) w kolumnach Szerokość i Wysokość, wpisz współrzędne x punktu A (lub punktu B lub punktu C) i D w kolumnie współrzędnych X i napisz współrzędne y punktu A (lub punktu B lub punktu C) i D w kolumnie współrzędnych Y. Kliknij przycisk OK.
    4. Kliknij pozycję Analizuj | Działanie |. Jeżeli kalibracja opisana w ppkt 5.2 została już zakończona, OD są wskazane w kolumnie Średnia.
    5. Obliczyć ΔOD, odejmując OD punktu D od OD punktów A, B i C.
      UWAGA: Punkt D znajduje się w przezroczystej części skrzydła i nie zawiera pigmentacji, dlatego nadaje się do kontroli tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Okres poczwarki D. guttifera podzielono na 17 stadiów (P1 – P15(ii); obrazy trzech reprezentatywnych stadiów (P1, P5 – 6, P10) przedstawiono na Rysunku 3, a wszystkie 17 stadiów zilustrowano na Rysunku 4). Chociaż Bainbridge i Bownes17 wyróżnili 20 stadiów u D. melanogaster, niektóre z nich nie mogły zostać zastosowane do D. guttifera. Kolejność dwóch zdarzeń rozwojowych – pojawi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy tutaj protokoły definiowania stadiów poczwarki, usuwania poczwarki w celu szczegółowej obserwacji, pomiaru czasu trwania stadiów poczwarki oraz pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle u D. guttifera. Protokoły te można zastosować do wielu Drosophila i pokrewnych gatunków much, zwłaszcza gatunków z pigmentacją skrzydeł.

Pogłębiona obserwacja i opisanie bardziej szczegółowych zdarzeń rozwojowych umożliwiłoby dalszy podział etapów. W wielu przypadkach zdarzenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Seanowi B. Carrollowi i Thomasowi Wernerowi za dostarczenie materiałów na muchy, Naoyuki Fuse za sprzęt, Byung Seok Jin za pomoc w filmowaniu, Kiyokazu Agata za mentoring i Elizabeth Nakajima za montaż w języku angielskim. Prace te były wspierane przez KAKENHI 17K19427 i Fundację Naukową Takeda.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drosophila guttiferaThe Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego15130-1971.10Drosophila guttifera, gatunek muszki owocowej używany w tym artykule
Fiolka plastikowaHightechMKC-30Fiolka plastikowa, do konserwacji stada much
Zatyczki brzęczące do fiolek i zamknięć butelek do szklanych fiolekFisher ScientificAS-271Korek celulozowy, do konserwacji stada muchowego
Cukier miękki białyMitsui CukierJ-500gCukier miękki biały, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
Mąka kukurydzianaNippon MłynkiFMąka kukurydziana, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
Grys kukurydziany - CMłyny do mąki NipponGCKasza kukurydziana - C, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
Agar w proszkuMatsuki Kanten SangyoNo.602Proszek agarowy, do standardowej mąki kukurydzianej / cukru / drożdży / agaru
Suche drożdże piwneAsahi Food & Opieka zdrowotnaY2ASuche drożdże piwne, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
P-hydroksybenzoesan butyluNacalai Tesque06327-02P-hydroksybenzoesan butylu, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
EtanolWako057-00456Etanol, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru
Mikroprobówka z płaskim dnemIna OpticaCF-01501,5 ml mikroprobówka, do zbieranie poczwarek
CAPSULEFUGETomyPMC-060Mini mikrowirówka, do zbierania poczwarek
Sterylizowany Schale NBSansei Medical01-013Plastikowa szalka Petriego (średnica 90 mm x wysokość 15 mm)
Stojak na probówki z surowicąIwaki9796-050Używany jako komora wilgotna, do obserwacji poczwarek
Naczynie do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-GripCorning353001Plastikowa szalka Petriego (średnica 35 mm x wysokość 10 mm)
Standardowa szalka do hodowli tkankowychFalcon Corning353002Plastikowa szalka Petriego (średnica 60 mm x wysokość 15 mm)
PinezkaKokuyo51233709Pinezka, do robienia otworów na pokrywie mikroprobówki
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16do obserwacji morfologicznej
Aparat cyfrowyOlympusDSE-330-A Aparatcyfrowy, do obrazowania
Taśma dwustronna NICETACKNichibanNW-15SFTaśma dwustronna, do usuwania poczwarek
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11252-20Kleszcze, do usuwania poczwarki
Van Gogh VISUAL Pędzel malarskiTalens JapanGWVR-#5/0Pędzel do usuwania puparium
Greiner CELLSTAR 12-dołkowa płytka do hodowli komórkowychMerck665-18012-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, do pomiaru czasu trwania okresów poczwarki
NaClWako191-01665NaCl, dla PBS
KClNacalai Tesque285-14KCl, dla PBS
Na2HPO4· 12H2OWako196-02835Na2HPO4· 12H2O, dla PBS
KH2PO4Nacalai Tesque28721-55KH2PO4, dla filtra PBS
stopniowanej neutralnej gęstości (ND) 0,04 - 3,0Edmund Optics64-384Stopniowy filtr gęstości, do kalibracji pomiaru pigmentacji
Oprogramowanie ImageJNIH1.8.0-101Oprogramowanie ImageJ, do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle (https://imagej.nih.gov)
Szkiełko szkiełkowe FINE FROSTMatsunami Glass IndFF-001Szkiełko podstawowe, do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle
Kwadratowa szklana osłona mikroskopu 18 x 18Matsunami Glass IndC018181Szkiełko wystawowe do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle
, o

Bibliografia

  1. Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
  2. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
  3. Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
  4. Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
  5. Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
  6. Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
  7. Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136(2015).
  8. Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
  9. Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
  10. Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
  11. Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
  12. McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
  13. Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
  14. Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
  15. Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  16. Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  18. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  19. Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
  20. Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
  21. True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051(2016).
  24. Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
  25. DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
  26. Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
  27. McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
  28. Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
  29. Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Okre lanie stadium poczwarkiusuwanie pupariumanaliza obrazuoprogramowanie ImageJobserwacja morfologicznaczas rozwojuewolucyjna biologia rozwojustereomikroskopia

Powiązane artykuły