Artykuł metodologiczny

Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

DOI:

10.3791/56936

⸱

21 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Associazione Annastaccatolisa Onlus, 3Nuclear Medicine Unit, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są związane ze słabym przeżywalnością w przypadku raka z przerzutami. Ich identyfikacja, fenotypowanie i genotypowanie mogą prowadzić do lepszego zrozumienia heterogeniczności guza, a tym samym ułatwić selekcję pacjentów do spersonalizowanego leczenia. Jest to jednak utrudnione ze względu na rzadkość występowania CTC. Przedstawiamy innowacyjne podejście do pobierania dużej objętości krwi pacjenta i uzyskiwania informacji o obecności, fenotypie i translokacji genów CTC. Metoda łączy barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację DNA na miejscu (DNA FISH) i opiera się na funkcjonalizowanym przewodzie medycznym. Drut ten jest innowacyjnym urządzeniem, które pozwala na izolację in vivo CTC z dużej objętości krwi obwodowej. Objętość krwi badana przez 30-minutowe podawanie drutu wynosi około 1,5-3 l. Aby zademonstrować wykonalność tego podejścia, określono ekspresję cząsteczki adhezji komórek nabłonka (EpCAM) i translokację chromosomalną genu ALK w liniach komórkowych niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) przechwyconych przez funkcjonalizowany drut i wybarwionych metodą immuno-DNA FISH. Naszym głównym wyzwaniem było przeprowadzenie testu na strukturze 3D, funkcjonalizowanym drucie, oraz określenie immunofenotypu i sygnałów FISH na tym podłożu za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Uzyskane wyniki wskazują, że wychwytywanie CTC i analizowanie ich fenotypu oraz rearanżacji chromosomów może potencjalnie stanowić nowe podejście do diagnostyki towarzyszącej i zapewnić innowacyjną strategię ulepszania spersonalizowanych metod leczenia raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTC stanowią kluczowy etap rozprzestrzeniania się komórek rakowych1. Ich obecność we krwi obwodowej pacjentów wiąże się z nawrotem choroby (z przerzutami) i progresją choroby2,3. Izolacja i charakterystyka CTC z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji. W ostatnich latach stało się coraz bardziej oczywiste, że monitorowanie progresji i odpowiedzi nowotworów na różne terapie za pomocą tego rodzaju analizy dostarcza ważnych informacji klinicznych4,5. Płynna biopsja jest jeszcze bardziej przydatna, gdy operacja nie jest możliwa lub gdy pierwotna tkanka nowotworowa nie jest dostępna, tj. w przypadku zmian niebiopsyjnych. W związku z tym podejście to jest obiecujące w określonych warunkach nowotworowych, takich jak przerzutowy NSCLC, gdzie wykazano, że obecność CTC ma negatywną rolę prognostyczną6. NSCLC jest nowotworem, który przynosi szczególne korzyści dzięki celowanym metodom terapeutycznym7,8,9 zaprojektowane do działania na określone cząsteczki (cele molekularne), o których wiadomo, że są zaangażowane we wzrost, progresję i rozprzestrzenianie się choroby. W związku z tym konieczne jest wykrywanie określonych celów podczas progresji choroby. Badanie CTC jest niezwykle interesującym podejściem diagnostycznym do wykrywania i monitorowania celów leków bez konieczności stosowania tkanek pierwotnych lub przerzutowych. Na przykład wykrycie translokacji genu ALK w komórkach NSCLC jest związane z wrażliwością na kryzotynib, specyficzną terapię celowaną10. Jednak obecnie wykrywanie translokacji ALK wykonuje się tylko w przypadku aspiracji cienkoigłowych lub małych biopsji; w rezultacie, bez tkanki nowotworowej analiza ALK nie jest możliwa. CTC są potencjalną alternatywą dla badań opartych na tkance nowotworowej i stanowią bardzo obiecujące podejście do diagnostyki towarzyszącej.

Pomimo ich potencjalnego znaczenia, CTC są nadal przedmiotem wielu dyskusji wśród badaczy, głównie ze względu na ich rzadkość (1-10 komórek/ml krwi obwodowej11). Obecne metody płynnej biopsji wykorzystują ograniczoną ilość krwi (tj. 1-30 ml)12,13, ale stwarza to sytuację nieoptymalnej czułości do wykrywania CTC. W związku z tym uzasadnione są badania mające na celu znalezienie podejść i opracowanie urządzeń do wykonywania płynnych biopsji ukierunkowanych na CTC na większej objętości krwi obwodowej.

Alternatywne urządzenie, funkcjonalizowany drut medyczny (patrz Tabela Materiałów), został opracowany w celu przezwyciężenia ograniczeń pobierania próbek krwi i uzyskania bardziej reprezentatywnej analizy CTC. Ten funkcjonalizowany przewód jest zatwierdzonym przez CE urządzeniem medycznym, które wychwytuje CTC bezpośrednio z krwiobiegu pacjentów z rakiem1. Składa się z drutu ze stali nierdzewnej o długości 16 cm (rysunek 1a) z funkcjonalną końcówką o długości 2 cm pokrytą warstwą złota o grubości 0,2 μm. Warstwa jest z kolei pokryta warstwą hydrożelu polikarboksylowego o grubości od 1 do 5 μm, kowalencyjnie sprzężoną z przeciwciałami skierowanymi przeciwko EpCAM, jednemu z najbardziej rozpowszechnionych antygenów na powierzchni CTCs14. Funkcjonalizowana końcówka drutu jest wprowadzana do żyły ramienia pacjenta i pozostaje na miejscu przez co najmniej 30 minut. Takie podejście pozwala na izolację CTC in vivo, bezpośrednio we krwi obwodowej i badanie przesiewowe około 1,5-3,0 l krwi (około 300-krotnie więcej niż objętość stosowana w alternatywnych metodach)1.

Pantel et al. wykazali skuteczność tego podejścia w izolowaniu CTC bezpośrednio do żył ramion pacjentów z rakiem płuc15. Przeprowadzili barwienie immunofluorescencyjne drutem w celu identyfikacji CTC przy użyciu konwencjonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko EpCAM i pan-cytokeratynie oraz CD45 do wykrywania leukocytów. Drut został zbadany pod optycznym mikroskopem fluorescencyjnym15. Autorzy wykazali, że urządzenie jest w stanie wyizolować CTC, ale nie badali żadnych celów związanych z terapią, takich jak translokacje ALK.

Przedstawiona metoda ma na celu zidentyfikowanie przypuszczalnych CTC w liniach komórkowych NSCLC na podstawie parametrów fenotypowych, np. pozytywności EpCAM i obecności biomarkerów molekularnych, na przykład statusu ALK (Rysunek 1b). Ta trwająca 3 dni procedura łączy funkcjonalizowane barwienie drutem i immunofluorescencyjną z hybrydyzacją fluorescencji DNA na miejscu (DNA FISH), o nazwie Immuno-DNA-FISH. Biorąc pod uwagę, że CTC są rzadkimi jednostkami, zaletą tego protokołu jest to, że CTC można scharakteryzować na tym samym przewodzie zarówno pod względem cech immunofenotypowych, jak i rearanżacji DNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ryba immuno-DNA na szkiełku nakrywkowym 2D

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i wysiewanie komórek adhezyjnych
    UWAGA: Wszystkie poniższe czynności należy wykonać pod okapem z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
    1. Zanurz szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu, aby je zdezynfekować.
      UWAGA: Używamy kwadratowych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm ×12 mm na podłożu silikonowym (wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów).
    2. Umieścić szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego (o średnicy 100 mm). Suszyć przy wymuszonym przepływie powietrza przez 5 minut.
    3. Umyć szalkę Petriego 15 ml sterylnego 1× soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) firmy Dulbecco.
    4. Przemyć szalkę Petriego 10 ml kompletnego podłoża (patrz Tabela 1).
    5. Nasiona przylegających komórek (około 1 650 000 komórek w 10 ml pożywki, liczone za pomocą analizy FACS) poprzez delikatne upuszczenie zawiesiny komórkowej na szalkę Petriego w celu uzyskania jednolitego posiewu komórek (około 30 000 komórek/cm2).
      Uwaga: Aby uzyskać ~ 70% konfluencji, przylegające komórki należy hodować na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 48 godzin.
  2. Utrwalanie i przepuszczalność
    UWAGA: Aceton jest substancją łatwopalną i drażniącą. Używaj wyłącznie tworzyw sztucznych lub szklanych pojemników odpornych na aceton (bez PVC lub PVDF).
    UWAGA: Wykonaj te czynności pod wyciągiem chemicznym.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą jednorazowej pipety zasysającej.
    2. Umyć szalkę Petriego za pomocą 1× PBS.
    3. Za pomocą pęsety umyj szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w szklanej zlewce zawierającej 5 ml 1× PBS.
    4. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe na bibułce.
    5. Utrwal komórki na szkiełku nakrywkowym, zanurzając je w 100% roztworze acetonu na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą. Suche szkiełko nakrywkowe przy użyciu wymuszonego przepływu powietrza przez 5 min.
      Uwaga: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Szkiełko nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Immunofluorescencja Dzień 1
    UWAGA: Ten etap obejmuje inkubację przez noc (O/N) (~ 16 h).
    1. Umyj szkiełka nakrywkowe w 1× PBS dwukrotnie.
    2. Wrzucić 100 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (szczegóły patrz tabela 1) na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Objętość roztworu należy dostosować w zależności od powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe i uniknąć ryzyka przelania.
    3. Przygotować mieszaninę przeciwciał (Tabela 1) stosując rozcieńczenie 1:20 pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem i buforem do rozcieńczania przeciwciał, jak określono w karcie katalogowej dostarczonej przez producenta.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z termostabilnym fluorochromem. Jeśli używany jest nietermostabilny fluorochrom, temperatura stosowana podczas etapów DNA-FISH protokołu może uszkodzić fluorochrom i wygasić emisje fluorescencyjne. W tym protokole zdecydowaliśmy się na przeciwciało EpCAM-FITC (rozcieńczenie 1:20), które nie wykazało istotnych problemów z zastosowaną temperaturą.
    4. Szkiełka nakrywkowe opłukać dwukrotnie w 1× PBS.
    5. Umieść szkiełka nakrywkowe komórką do góry w wilgotnej komorze i upuść 100 μl mieszanki przeciwciał na szkiełko nakrywkowe.
      Uwaga: Objętość roztworu należy dostosować w zależności od powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe i zmniejszyć ryzyko przelania.
    6. Inkubować O/N (~ 16 h) w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. Immunofluorescencja Dzień 2
    1. Zablokować inkubację przeciwciał, przemłukując szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 1× PBS.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać zanurzone w 100 μl 1× PBS w temperaturze 4 °C w komorze o stałym wilgotnym środowisku w ciemności do czasu przeprowadzenia testu FISH.
  5. 2D DNA-FISH Dzień 2
    UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na wysoką temperaturę instrumentów i wilgotną komorę.
    1. Ustaw piec do hybrydyzacji i suchy piec grzewczy (~ 3 godziny przed uruchomieniem protokołu DNA-FISH). Ustawić piec do hybrydyzacji na 75 °C, ustawić suchy piec grzewczy na 37 °C i schłodzić roztwór 0,4× SSC (pH = 7,0 ± 0,1) (dla receptury SSC, patrz tabela 1) do 4 °C.
      UWAGA: Stan pH FISH jest krytyczny: pH = 7,0 ± 0,1.
    2. Umyj szkiełko nakrywkowe trzykrotnie w lodowatym roztworze 0,4× SSC.
    3. Suszyć szkiełko nakrywkowe pod wyciągiem chemicznym przez 10 minut w ciemności.
    4. Wiruj przez 10 s i wykonaj szybkie wirowanie w dół (z maksymalną prędkością) sondy od ścianki rurki sondy.
    5. Umieścić szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na kropli 5 μl sondy FISH na szkiełku podstawowym i uszczelnić wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym.
      UWAGA: Kolejne dwa kroki wiążą się z wysokimi temperaturami. Nosić rękawice ochronne.
    6. Umieścić szkiełko w ciemnej, wilgotnej komorze w piecu do hybrydyzacji na 8 minut w temperaturze 75 °C w celu całkowitej denaturacji DNA.
    7. Przenieść wilgotną komorę do suchego pieca grzewczego o temperaturze 37 °C O/N.
  6. 2D DNA-RYBA Dzień 3
    1. Ustawić łaźnię wodną na temperaturę 72 °C i umieścić w niej słoik do barwienia szkiełka z buforem 0,4× SSC (Tabela 1). Po 30 minutach sprawdzić temperaturę bufora 0,4× SSC, który musi wynosić 72 ± 1 °C.
    2. Przygotować dwie szklane zlewki: jedną z buforem 2× SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) (Tabela 1) i drugą z wodą destylowaną.
    3. Wyjmij wilgotną komorę z piekarnika, ostrożnie usuń cement gumowy ze szkiełka i odczep szkiełko nakrywkowe pęsetą.
    4. Szkiełko nakrywkowe umyć zanurzając w 0,4× SSC na 2 minuty w temperaturze 72 °C.
    5. Umyj szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w buforze 2× SSC + 0,05% Tween na 30 s.
    6. Opłucz szkiełko nakrywkowe w wodzie destylowanej.
    7. Suszyć szkiełka nakrywkowe pod wyciągiem chemicznym przez 10 minut w ciemności.
    8. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w płynnym podłożu montażowym z 1,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI), aby przeciwdziałać barwieniu całkowitego DNA. Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na kropli 5 μl podłoża montażowego na szkiełku podstawowym, naciśnij pęsetę na szkiełku nakrywkowym, aby usunąć powietrze i uszczelnij lakierem do paznokci.
      Uwaga: Objętość medium montażowego należy dostosować w zależności od wielkości powierzchni szkiełka nakrywkowego.
  7. Obserwacja i analiza mikroskopowa 2D
    UWAGA: Obrazy można uzyskiwać za pomocą różnych systemów mikroskopowych. Użyliśmy konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w standardowe komercyjne oprogramowanie do akwizycji obrazu (Tabela Materiałów).
    1. Rejestruj obrazy za pomocą 12-bitowej kamery cyfrowej oraz obiektywu 20×/0,50 NA i 40×/0,65 NA z odpowiednimi filtrami dla sondy czerwonej (wzbudzenie: 599 nm, emisja: 588 nm), zielonej (wzbudzenie: 509, emisja: 524) i niebieskiej (wzbudzenie: 367 nm, emisja: 452 nm).
    2. Analizuj obrazy za pomocą wybranego narzędzia programowego.
      UWAGA: Aby ocenić barwienie immunofluorescencyjne i lokalizację sondy ALK, użyliśmy ImageJ. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności przez maksymalnie 3 tygodnie. W przypadku długotrwałego przechowywania sugerujemy użycie specjalnego medium montażowego do długotrwałego przechowywania.

2. Immuno-DNA RYBA na drucie

  1. Impuls linii komórkowej na przewodzie (obsługa 3D)
    UWAGA: Wstępna konfiguracja obejmuje dokładny wybór przylegających linii komórek w oparciu o pozytywność EpCAM. Drut jest funkcjonalizowany przeciwciałami anty-EpCAM, dzięki czemu barwione są tylko komórki EpCAM-dodatnie.
    UWAGA: Nie dotykaj funkcjonalnej części przewodu, aby uniknąć uszkodzeń.
    UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
    1. Ponownie zawiesić całą zawartość kolby T75 (80% konfluencji) w fiolce o pojemności 5 ml, używając 4 ml kompletnego podłoża; dla pojedynczego impulsu zaleca się około 2 000 000 komórek, aby zmaksymalizować przyczepność komórek do drutu.
    2. Wyjmij drut ze szklanego opakowania.
    3. Zanurzyć funkcjonalizowaną złotą część drutu w fiolce, upewniając się, że korek druciany jest wodoszczelnie dopasowany do fiolki. Uszczelnić folią laboratoryjną.
      UWAGA: Zaleca się użycie probówki o pojemności 5 ml, aby umożliwić prawidłowe dopasowanie korka drucianego do fiolki.
    4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze probówki (kąt 0-120).
    5. Przepłukać drut trzy razy w roztworze 1× PBS, używając 3 różnych czystych fiolek.
  2. Utrwalanie i przepuszczalność
    UWAGA: Aceton jest substancją łatwopalną, która może podrażniać drogi oddechowe. Używaj wyłącznie tworzyw sztucznych lub szklanych pojemników odpornych na aceton (bez PVC lub PVDF).
    UWAGA: Wykonaj te czynności pod wyciągiem chemicznym.
    1. Wysuszyć drut na powietrzu.
    2. Napraw ogniwa, zanurzając drut w 100% roztworze acetonu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj probówki o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Zatyczka drutu nie może stykać się z utrwalaczem.
    3. Suszyć drut na powietrzu przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Drut należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Podczas pakowania drutu do długotrwałego przechowywania, umieść korek drutu obok funkcjonalnej końcówki i ostrożnie włóż drut do szklanej rurki do przechowywania, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki. Zamknąć szklankę do przechowywania i przechowywać (pionowo lub poziomo) w temperaturze -20 °C.
  3. Immunofluorescencja Dzień 1
    UWAGA: Ten etap obejmuje inkubację O/N (~ 16 h).
    1. Umyć dwukrotnie w roztworze 1× PBS za pomocą probówki o pojemności 5 ml.
    2. Inkubować drut w buforze do rozcieńczania przeciwciał przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu probówki o pojemności 5 ml.
    3. Przygotować 150 μl mieszaniny przeciwciał z rozcieńczeniem pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem w buforze do rozcieńczania przeciwciał, jak określono w karcie katalogowej. Na przykład przeciwciało EpCAM-FITC zastosowano w rozcieńczeniu 1:20.
    4. Użyj końcówki p200 do przeprowadzenia inkubacji w następujący sposób: Wyjmij drut z korka drutu i delikatnie włóż drut przez większy otwór końcówki. Najpierw włóż niefunkcjonalny koniec i powoli przeciągnij drut przez mniejszy otwór, aż złota część znajdzie się tuż za większym otworem.
    5. Delikatnie wrzuć 150 μl mieszanki przeciwciał (na przykład przeciwciała anty EpCAM_FITC rozcieńczone w stosunku 1:20) do końcówki. Aby uniknąć ryzyka tworzenia się pęcherzyków, delikatnie obracaj drut, aż funkcjonalizowana część zostanie całkowicie zanurzona.
    6. Uszczelnij otwór końcówki. Pomocne może być owinięcie folii laboratoryjnej wokół otworu.
    7. Inkubować pionowo O/N (~ 16 h) w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. Immunofluorescencja dzień 2
    1. Zablokuj inkubację przeciwciał, przemywając drut dwukrotnie w 1× PBS.
    2. Włóż drut ponownie do korka drutu.
      UWAGA: Przechowywać w 1X PBS w temperaturze 4 °C w fiolce o pojemności 5 ml do czasu przeprowadzenia testu FISH.
  5. 3D DNA-FISH Dzień 2
    UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na wysoką temperaturę instrumentów i wilgotną komorę.
    1. Ustaw piec do hybrydyzacji i suchy piec grzewczy (~ 3 godziny przed uruchomieniem protokołu DNA-FISH). Ustawić piec do hybrydyzacji na 75 °C, ustawić suchy piec grzewczy na 37 °C i schłodzić roztwór 0,4× SSC (pH = 7,0 ± 0,1) do 4 °C.
      UWAGA: Stan pH FISH jest krytyczny i musi wynosić 7,0 ± 0,1.
    2. Umyj drut 3 razy w lodowatym roztworze 0,4× SSC.
      UWAGA: Trzymaj drut w ciemności, aby uniknąć fotowybielania fluorochromowego podczas poniższych procedur.
    3. Suszyć przez 10 minut w ciemności pod dygestoriami.
    4. Wiruj i obracaj sondę przez 5 s.
    5. Wrzuć 10 μl sondy do szklanych mikroprobówek. Przykryj folią laboratoryjną.
    6. Obracaj mikroprobówki w następujący sposób: zawiń mikroprobówkę w suchy absorbent, papier włóż do probówki o pojemności 50 ml i krótko wiruj.
    7. Ostrożnie umieść wysuszony drut w mikroprobówce i włóż korek do drutu. Uszczelnić cementem gumowym.
      UWAGA: Kolejne dwa kroki wiążą się z wysokimi temperaturami. Nosić rękawice ochronne.
    8. Umieścić drut w ciemnej, wilgotnej komorze w piecu do hybrydyzacji na 8 minut w temperaturze 75 °C, aby uzyskać całkowitą denaturację DNA.
    9. Przenieść wilgotną komorę do suchego pieca grzewczego o temperaturze 37 °C O/N.
  6. 3D DNA-RYBA Dzień 3
    1. Umieścić słoik do barwienia szkiełka z roztworem 0,4× SSC do łaźni wodnej i ustawić w temperaturze 72 °C.
    2. Sprawdzić temperaturę roztworu 0,4× SSC, aż osiągnie 72 ± 1 °C.
    3. Przygotować dwie szklane zlewki, jedną z roztworem 2× SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1), a drugą z wodą destylowaną.
    4. Wyjmij wilgotną komorę z suchego piekarnika, ostrożnie usuń cement gumowy z korka drutu za pomocą pęsety i wyjmij drut.
      Uwaga: Ostrożnie przeciągnij niepowlekany koniec drutu przez IN-Stopper, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki.
    5. Zanurz drut w roztworze 0,4× SSC na 2 minuty w temperaturze 72 °C.
    6. Umyj drut w roztworze 2× SSC + 0,05% Tween przez 30 s w temperaturze pokojowej.
    7. Umyj drut w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej.
    8. Suszyć drut pod wyciągiem przez 10 minut w ciemności.
    9. Przygotować roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 1,43 μM w 2 ml 1× PBS.
    10. Inkubować funkcjonalizowaną końcówkę drutu z roztworem DAPI w fiolce o pojemności 2 ml przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
    11. Opłucz drut dwukrotnie w 1× PBS i wysusz na powietrzu.
  7. Obserwacja i analiza mikroskopowa 3D
    1. Umieść przewód w uchwycie przewodu. Ostrożnie włóż funkcjonalną końcówkę przez punkt wejścia specjalnego uchwytu, aż końcówka dopasuje się do punktu złączenia. Uważaj, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki (Rysunek 1a).
    2. Umieść specjalny uchwyt na stoliku mikroskopu. Wyreguluj ostrość mikroskopu za pomocą obiektywu 20×. Najpierw z grubsza skoncentruj się na specjalnym podparciu, a następnie dokładnie dostosuj komórki, które wydają się jasne w kanale DAPI.
    3. Ostrość należy ustawić tylko na komórkach znajdujących się centralnie w obiektywie.
      Uwaga: Obrazy można uzyskiwać za pomocą różnych systemów mikroskopowych. W tym ustawieniu używamy konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w standardowe komercyjne oprogramowanie do akwizycji obrazu.
    4. Rejestruj obrazy za pomocą 12-bitowego aparatu cyfrowego i obiektywu 20×/0,50 NA i 40×/0,65 NA z odpowiednimi filtr> Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Drut należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Podczas pakowania drutu do długotrwałego przechowywania, umieść korek drutu obok funkcjonalnej końcówki i ostrożnie włóż drut do szklanej rurki do przechowywania, uważając, aby nie uszkodzić funkcjonalnej końcówki. Zamknąć szklankę do przechowywania i przechowywać (pionowo lub poziomo) w temperaturze -20 °C.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z procedury opisanej powyżej, możliwe jest przeprowadzenie testu Immuno-DNA FISH na CTC (lub innych równoważnych komórkach) wzbogaconych o funkcjonalizowany przewód. Przed ustanowieniem tego protokołu określono kompatybilność obu technik (immunofluorescencja z FISH) na standardowych nośnikach 2D. Wybrano dwie różne linie komórkowe NSCLC wykazujące ekspresję EpCAM (wymaganą do przylegania do drutu sprzężonego z przeciwciałami przeciwko EpCAM). Mają one różny stan ALK, co jest przydatne do testowania różnych warunków początkowych. Pierwszy, NCI-H1975, ma geny ALK typu dzikiego (WT), podczas gdy drugi, NCI-H3122, charakteryzuje się translokacjami ALK.

Zastosowano system wykrywania rozpadu genu ALK do testu FISH. System składa się z dwóch sond, jednej (pomarańczowej) hybrydyzującej do obszaru proksymalnego w obrębie ALK na 2p23 i jednej (zielonej) hybrydyzującej dystalnie do ALK. Na nośnikach 2D Immuno-DNA FISH dostarczyło dobrze zdefiniowanych sygnałów zarówno dla przeciwciała, jak i sondy (Rysunek 2). W szczególności obie linie komórkowe wykazywały dobrze zdefiniowaną lokalizację błony EpCAM. Co więcej, sygnały sondy wydawały się jasne i ostre: komórki NCI-H1975 pokazywały nakładające się na siebie pomarańczowe i zielone sondy, potwierdzając status dzikiego genu ALK (Figura 2a, b). I odwrotnie, komórki NCI-H3122 wykazywały nakładające się sygnały i pojedyncze zielone kropki, odzwierciedlające delecję genu ALK (Figura 2c, d). Gdy test Immuno-DNA FISH przeprowadzono na funkcjonalizowanym przewodzie 3D, sygnały przeciwciał i sondy były na ogół mniej zdefiniowane niż na podporze 2D. Widoczne było barwienie EpCAM. Sygnały sondy ALK były mniej zdefiniowane, ale nadal odzwierciedlały oczekiwany stan ALK (Rysunek 3). Wyniki wykazały, że barwienie immunofluorescencyjne nie zakłócało sygnałów DNA FISH. Sondy hybrydyzowały się specjalnie ze swoimi celami. Linia komórkowa NCI-H3122 wykazała nieprawidłowy status genu ALK (Figura 3b), w przeciwieństwie do NCI-H1975, z genem ALK typu dzikiego (Figura 3a).

figure-results-1
Rysunek 1: Funkcjonalizowany drut, schematyczny układ sond rozdzielających ALK, schemat oczekiwanych wzorców przegrupowania ALK i specjalny uchwyt. (a) Czerwone pola podkreślają trzy główne części drutu: funkcjonalizowaną końcówkę, zatyczkę drutu i niefunkcjonalizowaną końcówkę. Funkcjonalna końcówka jest najdelikatniejszą częścią drutu i nie wolno jej dotykać podczas przenoszenia, aby uniknąć oderwania lub uszkodzenia ogniwa. (b) Zielona i czerwona sonda wiążą się odpowiednio z sekwencjami przed i za loci genu ALK (po lewej). Po prawej stronie pokazane są przykładowe wzorce układów ALK. Czerwone i zielone sygnały kolokalizacji na normalnych komórkach; rozdzielone sygnały zielone i czerwone wskazują na pęknięcie chromosomu genu ALK (translokacja genu ALK) i jeden sygnał kolokalizacji zielono-pomarańczowej (nieprawidłowa komórka-1). Jeden sygnał czerwony i dwa sygnały zielone wskazują na utratę jednego sygnału czerwonego, co sugeruje translokację chromosomową i delecję (nieprawidłowa komórka-2). c) Uchwyt przewodu; Czerwone pola podświetlają obszary, w których należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z drutem podczas analizy mikroskopowej. Drut może zostać poddany analizie 360° poprzez obrócenie rotatora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test Immuno-DNA FISH na podłożu 2D (szkiełko nakrywkowe). (a, b) Komórki NCI-H1975 słabo dodatnie dla EpCAM. Sygnały EpCAM FITC były znaczące. Pomarańczowa i zielona sonda rozpadu ALK nałożyły się na siebie, potwierdzając status WT genu ALK w NCIH1975 linii komórkowej. Komórki wyświetlające więcej niż dwa sparowane sygnały były obecne ze względu na ich aneuploidię. lit. c), d) W linii komórkowej NCIH3122 o wysokiej ekspresji EpCAM sygnały immunofluorescencyjne były jasne, co było uwydatnione w połączeniach komórka-komórka. Analizy przeprowadzone w ramach projektu FISH potwierdziły delecje genu ALK, typowego dla tej linii komórkowej. Czerwone strzałki oznaczają pojedyncze zielone sondy (bez odpowiadających im pomarańczowych sond), odzwierciedlające delecję genu ALK. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Test immuno-DNA FISH z wykorzystaniem funkcjonalizowanego przewodu jako wsparcia 3D. (a) Reprezentatywny obraz ogniw NCI-H1975 na przewodzie. Chociaż kształt 3D komórek na przewodzie utrudnia uzyskanie w pełni ostrych obrazów, sygnał EpCAM jest dobrze widoczny we wszystkich komórkach. (b) Reprezentatywny obraz ogniw NCI-H3122 na przewodzie. Sondy ALK wykazały delecję genu (czerwone strzałki), jak wcześniej obserwowano na nośniku 2D. Widoczne sygnały tła były najprawdopodobniej spowodowane obecnością warstwy polimeru. Nie wpłynęło to jednak znacząco na identyfikację komórek ani analizę fluorescencyjną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

buforkompozycjanutaZapasów
Kompletna pożywka do hodowli komórkowychRPMI 1640 + 2 mM Glutamina + 5-10% Surowica Bydlęca Płodu (FBS).Prędkość obrotowa: 4 °C; Glutamina, FBS:-20 °C
Bufor rozcieńczający przeciwciała1% BSA, 0,3% Triton X-100 w 1x PBS RT. Uszczelnić folią laboratoryjną.
20x rozwiązanie SSC3 M chlorek sodu, 300 mM cytrynian trisodowy rozpuszczony w ddH20 Roztwór filtracyjny i pH = 7,0 +/- 0,1 z HClRT. Uszczelnić folią laboratoryjną.
0,4x Rozwiązanie SSCRozcieńczyć materiał 20x SSC w destylowanymH2O Roztwór filtracyjny i pH = 7,0 +/- 0,1 z HClRT. Uszczelnić folią laboratoryjną.
2x SSC + 0,05% Tween 20 RozwiązanieRozcieńczyć 20x SSC w destylowanym H2O + 0,05% Tween 20Roztwór filtracyjny i pH = 7,0 +/- 0,1 z HClRT. Uszczelnić folią laboratoryjną.
Rozwiązanie DAPI 30 nMRozcieńczyć zapas 1,43 μM w 1x PBS-20 °C w ciemności gotowy do użycia alikwot

Tabela 1: Przepisy na rozwiązania.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy po raz pierwszy zaproponowano metodę łączącą barwienie immunofluorescencyjne i DNA FISH, do stosowania z funkcjonalizowanym drutem. Metoda została nazwana Immuno-DNA FISH. Technika ta została opracowana, aby umożliwić jednoczesną identyfikację przypuszczalnych CTC na przewodzie 3D na podstawie parametrów fenotypowych, takich jak dodatni wynik wobec EpCAM (zdarzenie 1), oraz ułatwić wykrywanie zmian molekularnych, takich jak status genu ALK (zdarzenie 2). Jednoczesna identyfikacja dwóch zdarzeń pozwala na wykrycie ich kolokalizacji. W związku z tym podejście to można dostosować do identyfikacji i charakterystyki CTC pobranej z krwi pacjentów z rakiem. Potencjalny wpływ hemoskładników i leukocytów na procedurę barwienia zwykle nie zakłóca procedury. W szczególności dane przedstawione w piśmiennictwie wskazują, że hemokomponenty i leukocyty nie wpływają na barwienie immunofluorescencyjne komórek przyczepionych do drutu, co jest krytycznym krokiem do identyfikacji rzeczywistych CTC 1,15.

Jasność fluorescencji Immuno-DNA FISH jest nieco mniej wyraźna niż w tradycyjnym teście immunofototypowym i jest wynikiem wysokiej temperatury potrzebnej do testu FISH. Jednak barwienie immunofluorescencyjne jest nadal znaczące. Na przykład słaby sygnał jest nadal wykrywalny w linii komórkowej o niskiej ekspresji EpCAM, NCIH1975. Wysoka temperatura wymagana do testu FISH jest głównym czynnikiem ograniczającym wybór odpowiedniego fluorochromu związanego z przeciwciałem. W tym protokole przeciwciała muszą być połączone z termostabilnym fluorochromem, aby tolerować temperaturę denaturacji DNA. Na przykład fikoerytryna, termoczuły fluorochrom, nie jest zalecana w tym ustawieniu ze względu na degradację fluorochromu spowodowaną wysoką temperaturą. Izotiocyjanian fluoresceiny jest dobrym wyborem i często powszechnym fluorochromem stosowanym w sondach FISH. Sygnał autofluorescencji Immuno-DNA FISH jest bardzo słaby na standardowych nośnikach 2D. Na wsporniku drutu warstwa polimeru może indukować lekki sygnał autofluorescencji, szczególnie na kanale czerwonym. W przeciwieństwie do tła 2D, specyficzny sygnał tła jest dostrzegalny na przewodzie, ale nie wpływa znacząco na identyfikację jąder lub charakterystykę komórek.

Mikroskopowa ocena drutu jest znacznie bardziej męcząca niż na podłożu 2D ze względu na ograniczenia mikroskopu optycznego w odczytywaniu powierzchni cylindrycznej struktury 3D. Jednak tę trudność można pokonać, obracając uchwyt drutu i uzyskując obrazy, które są głównie zlokalizowane wzdłuż linii środkowej drutu. Uchwyt drutu umożliwia obrót drutu o 360 °. Po skupieniu się na jądrach, zmiana kanałów fluorescencyjnych niekoniecznie utrzymuje ostrość na obszarze docelowym. Z tego powodu ważne jest, aby skupić się na obszarze docelowym komórki wewnętrznej.

Technikę tę można dostosować do wykrywania i charakteryzowania komórek na różnych rodzajach podpór 3D. Możliwe jest również użycie różnych przeciwciał i sond FISH. Decydując się na użycie różnych przeciwciał, ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są termostabilność fluorochromu i poziom ekspresji docelowego antygenu na błonie komórkowej. Antygeny wewnątrzcytoplazmatyczne mogą być również barwione. W przypadku korzystania z różnych sond FISH ważne jest, aby sprawdzić specyfikacje karty katalogowej dotyczące procedury denaturacji i odpowiednio przygotować komórki do testu FISH.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EtanolCarlo Erba# 414605
Tween 20BIO RAD# 1706531
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) Medicago# 09-9400-100
AcetonSigma Aldrich# 534064-500ML
BSASigma Aldrich# A7906
Triton X-100 DetergentBIO RAD#1610407
RUBBERCEMENTRoyal Talens# 95306500
Vysis 20X SSC (66g)Abbott Molecular Inc. # 30-804850proszek do ponownego zawieszenia w destylowanym H2O, zgodnie z
zaleceniami RPMI 1640Gibco# 31870-025
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco# 10270-098
L-glutamina (200mM)Gibco# 25030-024
Penicylina-StreptomycynaGibco# 15140-122
H20Sondy MilliPore
XT ALK BAMetaSystems# D-6001-100-OG
DAPI, FluoroPure gradeInvitrogen# D21490
SlowFade Diamond Antifade Mountant z DAPILife Technologies# S36973
EpCAM-FITC (klon: HEA-125)Mitenyi# 130-080-301
Mikrorurki M-Tube18Gilupi Detektor Nanomedizin
CANCER01 EpCAMGilupi NanomedizinDrut funkcjonalizowany
STAR FROST Szkiełka mikroskopoweKnittel GLÄ SERVS1117# 076FKB
Szkło nakrywkowe SecureSlip na podkładzie silikonowymGRACE BIO-LABS# 104112
Mikroskop fluorescencyjny ZEISS Axioskop ZEISS
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64-bitowe oprogramowanieNikonBR 4.11.00
Nikon DS-QiMc 12-bitowy aparat cyfrowyNikonDS-QiMc

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
  2. Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
  3. Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424(2017).
  4. Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
  5. Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108(2014).
  6. Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070(2013).
  7. Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
  8. Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
  9. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  10. Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
  11. Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
  13. Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
  14. Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
  15. Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Circulating Tumor CellsImmunofluorescence StainingDNA FISHFunctionalized WireEpCAM ExpressionALK Gene TranslocationNon Small Cell Lung CancerWidefield Fluorescence Microscopy3D Support AnalysisCytogenetic Alterations

Powiązane artykuły