Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

21 marca 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Streszczenie

Kluczowe jest określenie statusu mutacji w raku przed podaniem i leczeniem specyficznych leków molekularnych dla pacjentów z rakiem. W warunkach klinicznych tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie są szeroko stosowane do badań genetycznych. Jednak DNA FFPE jest na ogół uszkadzane i fragmentowane podczas procesu utrwalania formaliną. Dlatego DNA FFPE czasami nie nadaje się do badań genetycznych ze względu na niską jakość i ilość DNA. W artykule przedstawiamy metodę cytologii odcisku dotykowego (TIC) w celu uzyskania genomowego DNA z komórek nowotworowych, które można obserwować pod mikroskopem. Morfologię komórek i liczbę komórek nowotworowych można ocenić za pomocą próbek TIC. Co więcej, ekstrakcja genomowego DNA z próbek TIC może zostać zakończona w ciągu dwóch dni. Całkowita ilość i jakość DNA TIC uzyskanego tą metodą była wyższa niż DNA FFPE. Ta szybka i prosta metoda pozwala naukowcom uzyskać wysokiej jakości DNA do testów genetycznych (np. analizy sekwencjonowania nowej generacji, cyfrowego PCR i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym) oraz skrócić czas oczekiwania na raportowanie wyników.

Wprowadzenie

Technologia sekwencjonowania nowej generacji zapewniła badaczom znaczący postęp w analizie informacji o genomie w wariantach genetycznych, chorobie Mendla, dziedzicznych predyspozycjach i nowotworach 1,2,3. Atlas Genomu Raka (TCGA) i Międzynarodowe Konsorcjum Genomu Raka (ICGC) dążą do identyfikacji zmian genetycznych w kilku typach powszechnych nowotworów4. Udało się zidentyfikować setki kluczowych genów odpowiedzialnych za raka, a niektóre z tych cząsteczek są celem badań nad lekami1,5,6.

W warunkach klinicznych, próbki FFPE są powszechnie używane do diagnozy patologicznej i testów molekularnych na różne choroby, w tym raka. Jednak podczas procesu utrwalania formaliną dochodzi do sieciowania DNA-białka lub DNA-DNA i indukowana jest fragmentacja DNA. W związku z tym próbki DNA FFPE nie zawsze nadają się do analizy genetycznej ze względu na niską jakość i ilość DNA7,8,9. Dodatkowo przygotowanie próbek FFPE zajmuje kilka dni, a do dokładnego przygotowania przekrojów niezbędne są umiejętności techniczne. Dlatego pożądane jest opracowanie prostej i szybkiej metody uzyskiwania wysokiej jakości nienaruszonego DNA.

Cytologia jest alternatywną metodą diagnozy patologicznej. Przygotowanie próbki cytologicznej jest prostszym, tańszym i szybszym podejściem w porównaniu z przygotowaniem FFPE10. Technika TIC jest wykonywana na wartowniczych węzłach chłonnych i tkankach brzeżnych od pacjentek z rakiem piersi w celu śródoperacyjnej szybkiej diagnozy od kilku lat11,12. Istnieje jednak kilka doniesień, w których zbadano, czy wysokiej jakości genomowe DNA można wyekstrahować z próbek TIC i wykorzystać do późniejszej analizy genetycznej. Próbki cytologiczne są zwykle barwione barwieniem Papanicolaou (Pap) lub Giemsa, a wcześniej informowaliśmy, że ilość i jakość DNA wyekstrahowanego z próbek TIC (zwłaszcza próbek barwionych metodą Giemsa) jest lepsza niż próbki uzyskane z tkanek FFPE13. W porównaniu z barwieniem cytologicznym, barwienie Giemsa ma tę zaletę, że wymaga mniejszej liczby procedur barwienia. W barwieniu cytologicznym, po utrwaleniu i wybarwieniu próbek, należy je zamontować za pomocą podłoża montażowego (np. Malinolu) w celu rozróżnienia zawartości próbki, takiej jak komórki nowotworowe, normalne komórki i komórki zapalne pod mikroskopem. Jeśli próbka Pap jest przygotowywana bez etapu montażu, prawie niemożliwe jest obserwowanie komórek pod mikroskopem, ponieważ próbka jest suszona. Dla porównania, barwienie Giemsa można zaobserwować w stanie wysuszonym, dlatego etap montażu nie jest konieczny do szybkiej oceny komórkowej. W przypadku mikrodysekcji barwienie Giemsa jest bardziej odpowiednie, ponieważ wymaga suchych próbek.

W tym raporcie przedstawiamy prostą i szybką metodę przygotowania próbek TIC z barwieniem Giemsa i pokazujemy, że TIC jest lepszym źródłem DNA w porównaniu z próbkami FFPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie TIC do szybkiej oceny mikroskopowej przy użyciu zwykłych szkiełek

  1. Preparat TIC należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, po udostępnieniu klinicznych patologicznych materiałów tkankowych. Jeśli próbki TIC nie mogą być natychmiast przygotowane, należy przechowywać materiały tkankowe pokryte sterylną gazą zwilżoną solą fizjologiczną i przechowywać w lodówce, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
  2. Przygotuj materiał tkankowy o grubości 5mm3, taki jak guzy lite (np. tkanki wątroby, płuc i piersi) uzyskany klinicznie za pomocą zabiegu chirurgicznego lub endoskopii.
    1. Delikatnie przetrzyj tkankę sterylną gazą pokrytą solą fizjologiczną i usuń krew, jeśli na powierzchni tkanki jest dużo krwi.
    2. W przypadku próbek mikroskopowych, takich jak materiał biopsyjny, próbkę należy zwilżyć sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną.
  3. Wytnij i przytnij normalną tkankę nożem do przycinania i odsłoń powierzchnię zmiany nowotworowej, jeśli masy guza nie są rażąco widoczne.
  4. Dotknij powierzchni guza wyciętych próbek na normalnym szkiełku kilka razy rękami w rękawiczkach. Wizualnie potwierdź, że dotykany obszar stanowi ponad 80% normalnego szkiełka.
  5. Lekko dociśnij normalne szkiełko do szkiełka z membraną z naftalanu etylenu (PEN) i delikatnie przetrzyj 2-3 razy rękami w rękawiczkach. Potwierdź wzrokowo, że komórki są przenoszone z normalnego szkiełka do szkiełka membranowego PEN.
  6. Suszyć na powietrzu zarówno szkło, jak i szkiełka membranowe PEN przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Zabarwić normalne szkiełko szkiełkowe do bezpośredniego badania cytologicznego. Zanurz szkiełka w roztworze utrwalającym na 5 s, a następnie zabarwij roztworem barwiącym Giemsa na 15 s.
  8. Oceń i przeprowadź badania przesiewowe zawartości guza i komórek na normalnym szkiełku podstawowym całkowicie za pomocą mikroskopu w celu szybkiej oceny. Oceń komórki nowotworowe na podstawie kilku kryteriów; powiększenie jądra, nieprawidłowy kariotyp, obfita chromatyna, nierównomierne rozmieszczenie komórek, stosunek składnika jądrowego / składnika cytoplazmatycznego, wielkość komórki i polaryzacja komórki.

2. Przygotowanie folii do badań genetycznych z membraną PEN

  1. Jeśli próbka wykazuje komórkowość guza ponad 60% w wyniku szybkiej oceny mikroskopowej (krok 1.8), przeciąć dotkniętą guzem warstwę szkiełek błony PEN w celu ekstrakcji DNA za pomocą noża i rękawiczek. Przenieś wyciętą folię do sterylnej probówki mikrowirówkowej za pomocą pincette i dłoni w rękawiczkach.
  2. Jeśli komórkowość guza została określona jako niska (mniej niż 60% zawartości guza) za pomocą szybkiej oceny mikroskopowej (krok 1.8), należy zastosować mikrodysekcję laserową i uzyskać próbki guza.
    1. Wykonaj barwienie metodą Giemsa, aby ocenić komórki nowotworowe przy użyciu standardowych protokołów.
    2. Przeciąć folię szkiełka membranowego PEM za pomocą odpowiedniej mikrodysekcji wychwytu laserowego.
    3. Przenieś wyciętą folię do sterylnej probówki mikrowirówkowej za pomocą pincette i dłoni w rękawiczkach.
    4. Probówkę do mikrowirówki zawierającą film należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ekstrakcji DNA (w tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu).

3. Ekstrakcja DNA

  1. Wykonaj ekstrakcję DNA z próbek tkanek TIC lub FFPE za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA FFPE zgodnie z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami. Dostępny jest równoważny zestaw do etapu ekstrakcji DNA FFPE.
  2. Dodać 180 μl buforu do lizy tkanek (pH = 8,3) do probówki mikrowirówkowej zawierającej film za pomocą ręcznej pipety o pojemności 200 μl. Dodać 20 μl proteinazy K za pomocą ręcznej pipety 20 μl i mieszać przez wirowanie mieszalnikiem wirowym z maksymalną prędkością (około 2 500 obr./min) przez 5 s.
  3. Próbki należy inkubować w temperaturze 56 °C przez noc w inkubatorze powietrznym.
  4. Próbki FFPE i TIC inkubować w temperaturze 90 °C w bloku grzewczym odpowiednio przez 1 godzinę i 10 minut. Krótko odwirować probówkę mikrowirówki o stężeniu 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej za pomocą miniwirówki.
  5. Dodać 200 μl buforu do lizy do próbki za pomocą pipety o pojemności 200 μl i dokładnie wymieszać, wirując z maksymalną prędkością przez 5 s.
  6. Dodać 200 μl etanolu (96 - 100%) za pomocą pipety o pojemności 200 μl i dokładnie wymieszać, wirując z maksymalną prędkością przez 5 s. Krótko odwirować probówkę do mikrowirówki o sile 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej za pomocą miniwirówki.
  7. Ostrożnie przenieść cały lizat do kolumny wirowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C.
  8. Umieść kolumnę wirującą w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml rękami w rękawiczkach i wyrzuć probówkę zawierającą przepływ, do plastikowego pojemnika na odpady.
  9. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny wirowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C.
  10. Umieść kolumnę wirującą w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml rękami w rękawiczkach i wyrzuć probówkę zawierającą przepływ, do plastikowego pojemnika na odpady.
  11. Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny wirowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C.
  12. Wyrzuć probówkę zbiorczą zawierającą przepływ, do plastikowego pojemnika na odpady. Umieść kolumnę wirową w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml rękami w rękawiczkach i odwiruj przy 20 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C, aby wysuszyć membranę.
  13. Umieść kolumnę wirującą w probówce wiążącej o niskiej zawartości DNA rękami w rękawiczkach.
    1. Dodać 40 - 50 μl buforu elucyjnego do środka membrany za pomocą pipety o pojemności 100 μl.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C.
    3. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu (w tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu).

4. Ocena jakości DNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

  1. Przygotuj mieszankę wzorcową w sterylnej probówce mikrowirówkowej z pipetą, w następujący sposób: 10 μl 2x Real-Time PCR Master Mix, 1 μL 20x RNase P Primer-Probe Mix (wielkość amplikonu: 87 pz) i 8 μl sterylnej wody wolnej od nukleaz.
  2. Przygotuj drugą mieszankę wzorcową w jednej sterylnej probówce mikrowirówki w następujący sposób: 10 μl 2x Real-Time PCR Master Mix, 1 μL 20x RNase P Primer-Probe Mix (wielkość amplikonu: 268 pz) i 8 μl sterylnej wody wolnej od nukleaz.
  3. Wykonaj seryjne rozcieńczenia ludzkiego kontrolnego genomowego DNA (dostarczonego w zestawie) 4 razy dla pięciopunktowej krzywej wzorcowej i określ bezwzględne stężenia DNA13.
  4. Dodać 19 μl dwóch przygotowanych mieszanek wzorcowych (przygotowanych w krokach 4.1 i 4.2) do oddzielnych studzienek optycznej 96-dołkowej płytki reakcyjnej za pomocą pipety 20 μl.
  5. Dodać 1 μl FFPE DNA lub TIC DNA do oddzielnych studzienek zawierających mieszaninę reakcyjną za pomocą pipety 2 μl. Dodać 1 μl wody wolnej od nukleaz do oddzielnego dołka zawierającego mieszaninę reakcyjną do kontroli bez matrycy.
  6. Przytrzymaj nieprzylepną stronę optycznej folii samoprzylepnej i odklej podkład ochronny od środka folii. Delikatnie przeciągnij aplikator po folii i uszczelnij folię na płytce 96-dołkowej.
  7. Delikatnie mieszaj 96-dołkową płytkę za pomocą 96-dołkowego miksera płytkowego przez 10 s w temperaturze pokojowej przy 2,000 obr./min. Krótko odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Włącz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym i włóż 96-dołkową płytkę. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu następującego protokołu: 95 °C przez 20 s, a następnie 45 cykli 95 °C przez 1 s i 60 °C przez 20 s. Użyj "krzywej standardowej" i "trybu szybkiego".
  9. Ocena fragmentacji DNA ze stosunkiem DNA (względna kwantyfikacja; RQ) uzyskany dla długiego amplikonu (268 pz) do krótkiego amplikonu (87 pz). RQ jest średnią wartością długiego amplikonu/średnią wartością krótkiego ampliconu13.

5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji

  1. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania do sekwencjonowania nowej generacji zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotować wzorcową mieszaninę multipleksową PCR w sterylnej probówce mikrowirówkowej na próbkę w następujący sposób: 4 μl 5 x roztworu reakcyjnego Multiplex PCR, 4 μl 5 x puli starterów, ≤6 μl DNA TIC lub FFPE (1 - 100 ng) i dodać wodę wolną od nukleaz do 20 μl.
    1. Dodaj multipleksową mieszankę wzorcową PCR do probówki PCR i delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę.
    2. Krótko odwirować probówkę mikrowirówki o stężeniu 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej za pomocą miniwirówki.
  3. Przeprowadzić reakcje PCR zgodnie z następującym protokołem: 99 °C przez 2 minuty, następnie 20 cykli 99 °C przez 15 s i 60 °C przez 4 minuty, przytrzymując krok 10 °C. Krótko odwirować probówkę PCR za pomocą mini wirówki o temperaturze 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Określ liczbę cykli na podstawie liczby par starterów.
  4. Otwórz pokrywę probówki do PCR i dodaj 2 μl enzymu restrykcyjnego za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Zamknij pokrywę probówki do PCR i delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę do PCR. Krótko odwirować probówkę do PCR za pomocą mini wirówki o sile 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej.
  5. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu następującego protokołu: 50 °C przez 10 minut, 55 °C przez 10 minut, 60 °C przez 20 minut i przytrzymując krok 10 °C. Krótko odwirować probówkę PCR za pomocą mini wirówki o sile 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać główną mieszankę ligacji adaptora do każdej studzienki zawierającej strawione amplikony PCR za pomocą pipety w następujący sposób: 4 μl roztworu do ligacji adaptora, 0,5 μl kodu kreskowego, 0,5 μl adaptora, 2 μl wody wolnej od nukleaz i 2 μl ligazy DNA. Zamknij pokrywę probówki do PCR i delikatnie wymieszaj, stukając. Krótko odwirować probówkę do PCR za pomocą mini wirówki o sile 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej.
  7. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu następującego protokołu: 22 °C przez 30 min, 68 °C przez 5 min, 72 °C przez 5 min i przytrzymując krok 10 °C.
  8. Oczyść bibliotekę sekwencjonowania za pomocą kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Przenieś roztwór biblioteczny ligowany adaptorem do 1,5 ml probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Dodaj 45 μl kulek magnetycznych do probówki o niskim poziomie wiązania DNA wcelu 1. oczyszczenia. Delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Umieść probówkę wiążącą o niskiej zawartości DNA w stojaku magnetycznym, a następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aż roztwór będzie klarowny. Ostrożnie wyrzuć supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając kulek magnetycznych.
  11. Dodaj 150 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu za pomocą pipety o pojemności 200 μl, a następnie przesuń rurkę na bok magnesu, aby umyć kulki. Ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.
  12. Powtórz krok 5.11 dla drugiego prania.
  13. Krótko odwirować probówkę za pomocą mini wirówki o stężeniu 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę o niskim poziomie wiązania DNA w stojaku magnetycznym i ostrożnie wyrzuć kropelki etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
  14. Dodaj 50 μl Low TE do probówki o niskim poziomie wiązania DNA zawierającej osad kulek magnetycznych, aby rozproszyć kulki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  15. Umieść probówkę o niskim poziomie wiązania DNA w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
  16. Przenieś 50 μl supernatantu do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA i dodaj 75 μl kulek magnetycznych za pomocą pipety 100 μl w celu 2. oczyszczenia. Delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Umieść probówkę o niskim poziomie wiązania DNA w stojaku magnetycznym, a następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aż roztwór będzie klarowny. Ostrożnie wyrzuć supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając kulek magnetycznych.
  18. Dodaj 150 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu za pomocą pipety o pojemności 200 μl, a następnie przesuń rurkę na bok magnesu, aby umyć kulki. Ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.
  19. Powtórz krok 5.18 dla drugiego prania.
  20. Krótko odwirować probówkę za pomocą mini wirówki o sile 1 500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę o niskim poziomie wiązania DNA w stojaku magnetycznym i ostrożnie wyrzuć kropelki etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
  21. Dodaj 50 μl niskiego poziomu TE do probówki o niskim poziomie wiązania DNA zawierającej osad kulek magnetycznych, aby rozproszyć kulki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  22. Umieść probówkę o niskim poziomie wiązania DNA w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
  23. Przenieść 45 μl supernatantu zawierającego oczyszczoną bibliotekę do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA za pomocą pipety o pojemności 100 μl.

6. Ilościowe określenie stężenia w bibliotece za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

  1. Określ stężenie każdej biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta13.
    1. Przygotować 20-krotny roztwór rozcieńczający w następujący sposób: zmieszać 2 μl oczyszczonej biblioteki i 38 μl wody wolnej od nukleaz w probówce o niskim poziomie wiązania DNA za pomocą pipety o pojemności 2 μl i 100 μl.
    2. Nierozcieńczone biblioteki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do kroku 7.3.
  2. Przygotować 200-krotny roztwór rozcieńczający w następujący sposób: zmieszać 5 μl 20-krotnie rozcieńczonej oczyszczonej biblioteki (przygotowanej w kroku 6.1) i 45 μl wody wolnej od nukleaz w probówce o niskim poziomie wiązania DNA.
  3. Przygotować roztwór do 2000-krotnego rozcieńczenia w następujący sposób: zmieszać 5 μl 200-krotnie rozcieńczonej oczyszczonej biblioteki (przygotowanej w kroku 6.2) i 45 μl wody wolnej od nukleaz w probówce o niskim poziomie wiązania DNA.
  4. Przygotować główną mieszaninę reakcji w następujący sposób: zmieszać 10 μl 2x roztworu wzorcowego i 1 μl 20 x roztworu testowego starter-sonda w sterylnej probówce mikrowirówkowej za pomocą pipety, a następnie wymieszać, stukając w probówkę. Dodać 11 μl wzorcowej mieszaniny reakcyjnej do studzienek 96-dołkowej reakcji optycznej.
  5. Dodaj 9 μl 2,000-krotnie rozcieńczonej biblioteki, 9 μl każdej wzorcowej kontroli lub 9 μl wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki za pomocą pipety 10 μl.
  6. Przytrzymaj nieprzylepną stronę optycznej folii samoprzylepnej i odklej podkład ochronny od środka folii.
    1. Delikatnie przeciągnij aplikator po folii i uszczelnij folię na płytce 96-dołkowej.
    2. Delikatnie mieszaj 96-dołkową płytkę za pomocą 96-dołkowego miksera płytkowego przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.
    3. Krótko odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Włącz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym i włóż 96-dołkową płytkę. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu następującego protokołu: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 1 s i 60 °C przez 20 s. Użyj "krzywej standardowej" i "trybu szybkiego".
  8. Oblicz stężenie biblioteki nierozcieńczonej, mnożąc stężenie oznaczone za pomocą qPCR przez 2,000.

7. Sekwencjonowanie nowej generacji

  1. Zaplanuj warunek uruchomienia i ustaw parametr uruchamiania w oprogramowaniu.
    1. Kliknij [Karta Plan] i [Szablon], a następnie wybierz odpowiednią metodę uruchamiania.
    2. Wybierz aplikację i typ techniki, a następnie kliknij przycisk [Next] (Dalej).
    3. Wybierz urządzenie, zestaw do przygotowania próbki (opcjonalnie), typ zestawu biblioteki, zestaw szablonów, zestaw do sekwencjonowania, podstawowy tryb kalibracji, typ chipa, sekwencję kontrolną (opcjonalnie) i zestaw kodów kreskowych, a następnie kliknij przycisk [Next] (Dalej).
    4. Wybierz wtyczki i kliknij [Dalej].
    5. Wybierz projekt i kliknij przycisk [Dalej].
    6. Wybierz domyślne pliki referencyjne i pliki BED regionu docelowego.
    7. Wpisz nazwę próbki, wybierz kod kreskowy i kliknij przycisk [Plan Run] (Planuj uruchomienie).
  2. Przygotowanie szablonu i załadunek wiórów należy wykonać w automatycznym urządzeniu zgodnie z instrukcjami producenta. Przed użyciem rozmrozić wkład z odczynnikiem w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  3. Rozcieńczyć nierozcieńczoną bibliotekę wodą wolną od nukleaz zgodnie ze stężeniem biblioteki obliczonym w kroku 6.8 i utworzyć biblioteki 20 pM.
    1. Przygotuj bibliotekę w puli do sekwencjonowania i przechowuj ją na lodzie.
    2. Dodać 25 μl zbiorczej biblioteki za pomocą pipety o pojemności 100 μl na dno probówki z próbką. Skorzystaj z biblioteki w puli w ciągu 48 godzin.
  4. Włącz i otwórz pokrywę automatycznego instrumentu.
    1. Umieść chip sekwencjonujący, adapter chipowy, wkład wzbogacający, wkład z końcówką, płytkę PCR, uszczelkę ramy PCR, probówkę odzyskiwania, kasetę z roztworem i kasetę z odczynnikiem w odpowiedniej pozycji automatycznego instrumentu.
    2. Dotknij przycisków [Skonfiguruj uruchom] i [Krok po kroku] na ekranie.
    3. Zamknij pokrywę i dotknij opcji [Rozpocznij sprawdzanie] na ekranie.
    4. Po zakończeniu procesu skanowania pokładu dotknij [Dalej] na ekranie.
    5. Sprawdź zawartość wyświetlacza (typ zestawu, typ chipa, identyfikator chipa, identyfikator próbki, plany), ustaw czas i dotknij [OK] na ekranie.
  5. Po zakończeniu ładowania wiórów:
    1. Dotknij [Dalej] na ekranie i otwórz pokrywę.
    2. Wyjmij chip sekwencjonujący z adaptera chipa rękami w rękawiczkach.
    3. Umieścić wiór w pojemniku na wióry, zraszać parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu reakcji sekwencjonowania.
    4. Wyjął wkład wzbogacający, płytkę do PCR, uszczelkę ramy PCR, probówkę odzyskiwania, kasetę z roztworem i wkład z odczynnikiem z odpowiedniej pozycji automatycznego instrumentu rękami w rękawiczkach.
    5. Przenieś wkład z pustą końcówką do pozycji końcówki odpadu automatycznego instrumentu rękami w rękawiczkach.
    6. Dotknij opcji [Next] (Dalej) i zamknij pokrywę.
    7. Dotknij [Start] i wyczyść automatyczny instrument promieniami ultrafioletowymi przez 4 minuty.
  6. Rozpuść tabletkę chlorynu sodu w 1 000 ml ultraczystej wody i przefiltruj roztwór za pomocą jednostki filtrującej o przepływie 0,22 μm.
    1. Włącz przyrząd do sekwencjonowania.
    2. Dotknij [Wyczyść] i [Dalej] na ekranie przyrządu do sekwencjonowania.
    3. Wyczyść przyrząd do sekwencjonowania 250 ml wysterylizowanego przez filtr roztworu chlorynu sodu, a następnie 250 ml ultraczystej wody.
  7. Dotknij opcji [Inicjalizuj] i wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania na ekranie.
    1. Zainstaluj szarego nadawcę w odpowiednim miejscu rękami w rękawiczkach.
    2. Zainicjuj przyrząd do sekwencjonowania roztworem do przemywania (dostarczonym w zestawie), roztworem do regulacji pH (zawierającym 350 μl 100 mM wodorotlenku sodu) i roztworem wzorcowym pH (dostarczonym w zestawie).
  8. Dodaj 20 μl nukleotydów dATP, dGTP, dCTP i dTTP (dostarczonych w zestawie) do probówek o pojemności 50 ml (dostarczonych w zestawie) za pomocą pipety 100 μl.
    1. Zainstaluj szarego nadawcę w odpowiednim miejscu rękami w rękawiczkach.
    2. Załaduj probówkę o pojemności 50 ml i przykręć do przyrządu do sekwencjonowania.
    3. Dotknij przycisku [Dalej] na ekranie, aby rozpocząć etap inicjalizacji, który trwa około 25 minut.
  9. Po wykonaniu kroku inicjalizacji:
    1. Dotknij opcji [Uruchom] na ekranie i wybierz odpowiedni instrument do przygotowywania biblioteki.
    2. Zeskanuj dwuwymiarowy kod kreskowy chipa.
    3. Włóż chip sekwencjonujący w odpowiedniej pozycji.
    4. Zamknij zacisk wióra i drzwiczki instrumentu.
    5. Dotknij [Chip check], [Next] i [OK] na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie.
  10. Po reakcji sekwencjonowania przenieś dane i wykonaj potok analizy danych na serwerze sekwencjonowania13,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia cały proces, od przygotowania preparatów TIC do ekstrakcji DNA. Co istotne, procedura uzyskania genomowego DNA z próbek TIC zajmuje tylko dwa dni. Oceniono wpływ przechowywania guza przed opracowaniem preparatów na szkiełkach. Stwierdzono, że komórki nowotworowe przylegały do szkiełka przedmiotowego, gdy preparaty tkankowe zostały natychmiast dotknięte do szkiełka oraz gdy tkanki były przechowywane w sterylnej gazie zwilżonej solą fizjol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono alternatywną metodę pozyskiwania DNA guza z klinicznych próbek patologicznych za pomocą TIC. Przygotowanie TIC jest bardzo proste i zajmuje mniej czasu w porównaniu z metodami FFPE, bez konieczności stosowania specjalnych instrumentów10. Wszystkie procedury, od przygotowania TIC do ekstrakcji DNA, można wykonać w ciągu dwóch dni (ryc. 1). Metoda ta skraca w ten sposób czas realizacji badań genetycznych. W szczególności zapewnia to znac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy całemu personelowi medycznemu i pomocniczemu szpitala oraz pacjentom za zgodę na udział. Dziękujemy dr Gabrielle White Wolf z Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) za zredagowanie projektu tego raportu. Badanie to było wspierane przez Grant-in-Aid for Genome Research Project z prefektury Yamanashi (Y.H. i M.O.) oraz grant z The YASUDA Medical Foundation (Y.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FINE FROST white20 mikro szkło ślizgoweMatsunami Glass ind, LtdSFF-011
Szkiełka szklane z membraną Arcturus PENThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A roztwórMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B roztwórMuto Pure Chemicals20581
Maj-Grunwald RoztwórMuto Pure Chemicals15053
Roztwór GiemsaMuto Pure Chemicals15002
Zestaw tkanek QIAamp DNA FFPEQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific 4444557
Zestaw odczynników do wykrywania RNase PThermo Fisher Scientific4316831
Test TaqMan od FFPE DNA QC Test v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna Thermo Fisher Scientific4346907
MicroAmp optyczna folia samoprzylepnaThermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
Biblioteka jonowa Zestaw ilościowy TaqManThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Zestaw 1-16 ThermoFisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Zestaw sekwencjonowania (200 podstaw)Thermo Fisher ScientificA30044
Ion Chef SystemThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-dołkowy termocyklerThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Zestaw butelekThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt&handel; AMPure&handel; Zestaw XP BeckmanCoulterA63881
16-pozycyjny stojak magnetycznyThermo Fisher Scientific4457858
Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofugowania, 1,5 ml (rurka o niskim poziomie wiązania)Thermo Fisher ScientificAM12450
Woda bez nukleazThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp™ Optyczne 96-dołkowe płytki reakcyjneThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ Przezroczysta folia samoprzylepnaThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt™ AMPure&handel; Zestaw XP BeckmanCoulterA63881
Etanol (99,5)Nacalai Tesque08948-25
Wodorotlenek sodu (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipeta Pipet-Lite LTS L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipeta Pipet-Lite LTS L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
petit-changeWAKENMODEL8864wirówkowy
małychWAKENWKN-2290Inkubator powietrzny
SensiCare Bezpudrowe rękawice nitryloweMEDLINESEM486802
Sterylna gazaOsaki11138
Lodówka MediCoolSANYO MPR-312DCN-PJ
PIÓRO DO PRZYCINANIA PIÓRNR 130
PIÓRO DO PRZYCINANIA PIÓRNR 260
PIÓRO SPIÓROFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Mieszalnik wirowy
PincetteNATSUMEA-5
1,5 ml mikroprobówkaBIOBIKRC-0150
Adaptery kodów kreskowych Mini inkubator do wirówek

Bibliografia

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNA z guzaporównanie DNA z FFPEszkiełko z membraną PENocena jakości DNAsekwencjonowanie następnej generacjicyfrowy PCRilościowy PCR w czasie rzeczywistymwykrywanie mutacji somatycznychzautomatyzowane sekwencjonowanie
Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.