Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Streszczenie

Podczas gdy stres oksydacyjny jest często cytowanym mechanizmem toksykologicznym, konwencjonalne metody jego badania mają wiele niedociągnięć, w tym niszczenie próbki, wprowadzanie potencjalnych artefaktów i brak specyficzności dla zaangażowanych w nią reaktywnych gatunków. W związku z tym w dziedzinie toksykologii istnieje obecnie zapotrzebowanie na nieniszczące, czułe i specyficzne metody, które można wykorzystać do obserwacji i ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych zaburzeń redoks, częściej określanych jako stres oksydacyjny. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystania dwóch genetycznie kodowanych czujników fluorogenicznych, roGFP2 i HyPer, które mają być stosowane w badaniach obrazowania żywych komórek w celu obserwacji reakcji oksydacyjnych wywołanych ksenobiotykami. roGFP2 równoważy się z potencjałem redoks glutationu (E_GSH), podczas gdy HyPer bezpośrednio wykrywa nadtlenek wodoru (_H2O2). Oba czujniki mogą być poddawane ekspresji do różnych typów komórek poprzez transfekcję lub transdukcję i mogą być ukierunkowane na określone przedziały komórkowe. Co najważniejsze, mikroskopia żywych komórek z wykorzystaniem tych czujników oferuje wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową, która nie jest możliwa przy użyciu konwencjonalnych metod. Zmiany intensywności fluorescencji monitorowane przy 510 nm służą jako odczyt dla obu genetycznie kodowanych czujników fluorogenicznych, gdy są one sekwencyjnie wzbudzane światłem 404 nm i 488 nm. Ta właściwość sprawia, że oba czujniki są ratiometryczne, eliminując typowe artefakty mikroskopowe i korygując różnice w ekspresji czujnika między komórkami. Metodologia ta może być stosowana na różnych platformach fluorometrycznych zdolnych do wzbudzania i zbierania emisji na określonych długościach fal, dzięki czemu nadaje się do stosowania z systemami obrazowania konfokalnego, konwencjonalną mikroskopią szerokokątną i czytnikami płytek. Oba genetycznie kodowane czujniki fluorogenne były wykorzystywane w różnych typach komórek i badaniach toksykologicznych do monitorowania generacji komórkowych E_GSH i_H2O2 w czasie rzeczywistym. Przedstawiono tutaj znormalizowaną metodę, którą można szeroko dostosować do różnych typów komórek i platform fluorometrycznych w celu zastosowania roGFP2 i HyPer w toksykologicznych ocenach stresu oksydacyjnego na żywych komórkach.

Wprowadzenie

Termin "stres oksydacyjny" jest często cytowany jako mechanizm w toksykologii, jednak rzadko kiedy ten termin jest szczegółowo opisany. Stres oksydacyjny może odnosić się do kilku procesów wewnątrzkomórkowych, w tym wytwarzania reaktywnych form tlenu, uszkodzeń spowodowanych przez wolne rodniki, utleniania cząsteczek przeciwutleniaczy, a nawet aktywacji określonych kaskad sygnałowych. Udokumentowano, że szeroki zakres zanieczyszczeń środowiskowych ^1,2 i farmaceutyczny^3,4 zostały udokumentowane jako wywołujące stres oksydacyjny poprzez bezpośrednie dzia....

Protokół

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: Niniejsza procedura opisuje transdukcję lentiwirusową uniezśmiertelnionej linii komórkowej (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) w celu ekspresji wybranego reportera (roGFP2 lub HyPer). Można wykorzystać inne linie/typy komórek i/lub metody transferu genów, w tym transfekcję, pod warunkiem, że zapewnią one poziom ekspresji reportera wystarczający do wizualizacji odpowiedniej liczby komórek wykazujących ekspresję sensora w jednym polu widzenia (zazwyczaj 5 - 10 komórek). W przypadku stosowania metod transfekcji, procedurę należy przeprowadzić w naczyniu, które zostanie ostatecznie użyte do analizy (np. transfekcję komór....

Wyniki

Zastosowanie roGFP2 i HyPer w wykrywaniu zmian w E_GSH oraz wewnątrzkomórkowym H₂O₂ zostało wcześniej szczegółowo opisane^25,36,42,43 i jest tutaj zaprezentowane. Obrazy konfokalne komórek wykazujących ekspresję roGFP2 w stanie spoczynkowym oraz po dodaniu H₂O₂ i DTT przedstawiono na Rysun.......

Dyskusja

Zastosowanie roGFP2 i HyPer w wykrywaniu zmian odpowiednio w wewnątrzkomórkowych E_GSH i_{H2O2 2} zostało dobrze opisane w poprzednich badaniach fizjologicznych i toksykologicznych 25,35,36,39,40,41,42,43 . Przedstawiony tutaj p.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A Hojny	dar od S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Nadtlenek wodoru	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma	Aldrich 156507
Naczynia ścienne ze szklanym dnem	Ted Pella	14029-20
Linia komórkowa BEAS-2B	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	CRL-9609
Keratynocyty Podłoże podstawowe	Lonza	192151
Pożywka do wzrostu keratynocytów BulletKit	Lonza	192060
Excel	Pakiet Microsoft Office	Nie dotyczy
Oprogramowanie do obrazowania AR NIS-Elements	Nikon	N/A
obrazowania konfokalnego Nikon C1si	Nikon	Nie dotyczy

System