Artykuł metodologiczny

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56953

⸱

10 stycznia 2018

 ,  , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie pełnej długości struktury czynnika składania rybosomów Nsa1 z Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) jest trudne ze względu na nieuporządkowany i proteazowo labilny C-koniec białka. W tym manuskrypcie opisano metody oczyszczania rekombinowanego Nsa1 z S. cerevisiae do analizy strukturalnej zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS. Krystalografia rentgenowska została wykorzystana do rozwiązania struktury dobrze uporządkowanej N-końcowej domeny WD40 Nsa1, a następnie SAXS wykorzystano do rozdzielenia struktury C-końca Nsa1 w roztworze. Dane dotyczące rozpraszania roztworu zebrano z pełnej długości Nsa1 w roztworze. Teoretyczne amplitudy rozpraszania obliczono na podstawie struktury krystalicznej domeny WD40 o wysokiej rozdzielczości, a następnie połączenie modelowania ciała sztywnego i ab initio ujawniło C-koniec Nsa1. Dzięki temu hybrydowemu podejściu zrekonstruowano czwartorzędową strukturę całego białka. Przedstawione tutaj metody powinny być ogólnie stosowane do hybrydowego oznaczania strukturalnego innych białek złożonych z mieszaniny domen strukturalnych i niestrukturalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rybosomy to duże maszyny rybonukleoproteinowe, które pełnią zasadniczą rolę translacji mRNA na białka we wszystkich żywych komórkach. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, które są wytwarzane w złożonym procesie zwanym biogenezą rybosomów1,2,3,4. Składanie rybosomów eukariotycznych opiera się na pomocy setek podstawowych czynników składania rybosomów2,3,5. Nsa1 (Nop7 associated 1) jest eukariotycznym czynnikiem składania rybosomów, który jest szczególnie wymagany do produkcji dużej podjednostki rybosomalnej6 i jest znany jako WD-repeat zawierający 74 (WDR74) w organizmach wyższych7. Wykazano, że WDR74 jest niezbędny do tworzenia blastocyst u myszy8, a promotor WDR74 jest często mutowany w komórkach rakowych9. Jednak funkcja i dokładne mechanizmy Nsa1/WDR74 w składaniu rybosomów są nadal w dużej mierze nieznane. Aby rozpocząć odkrywanie roli Nsa1/WDR74 podczas dojrzewania rybosomów eukariotycznych, przeprowadzono wiele analiz strukturalnych, w tym krystalografię rentgenowską i rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)10.

Krystalografia rentgenowska, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), mikroskopia elektronowa i SAXS są ważnymi technikami do badania struktury makromolekularnej. Rozmiar, kształt, dostępność i stabilność makrocząsteczek wpływa na metodę biologii strukturalnej, do której dana makrocząsteczka będzie najlepiej dopasowana, jednak łączenie wielu technik za pomocą tak zwanego podejścia "hybrydowego" staje się coraz bardziej korzystnym narzędziem11. W szczególności krystalografia rentgenowska i SAXS są potężnymi i uzupełniającymi się metodami oznaczania strukturalnego makrocząsteczek12.

Krystalografia dostarcza struktur atomowych o wysokiej rozdzielczości, począwszy od małych cząsteczek, a skończywszy na dużych maszyneriach komórkowych, takich jak rybosom, i doprowadziła do licznych przełomów w zrozumieniu biologicznych funkcji białek i innych makrocząsteczek13. Co więcej, projektowanie leków w oparciu o strukturę wykorzystuje moc struktur krystalicznych do dokowania molekularnego za pomocą metod obliczeniowych, dodając krytyczny wymiar do odkrywania i opracowywania leków14. Pomimo szerokiego zastosowania, elastyczne i nieuporządkowane systemy są trudne do oceny za pomocą krystalografii, ponieważ upakowanie kryształów może być utrudnione lub mapy gęstości elektronów mogą być niekompletne lub niskiej jakości. Z drugiej strony, SAXS jest podejściem strukturalnym opartym na rozwiązaniach i niskiej rozdzielczości, zdolnym do opisywania elastycznych systemów, od nieuporządkowanych pętli i końców po wewnętrznie nieuporządkowane białka12,15,16. Biorąc pod uwagę, że jest kompatybilny z szerokim zakresem rozmiarów cząstek12, SAXS może działać synergistycznie z krystalografią, aby rozszerzyć zakres zagadnień biologicznych, na które można odpowiedzieć za pomocą badań strukturalnych.

Nsa1 nadaje się do hybrydowego podejścia strukturalnego, ponieważ zawiera dobrze ustrukturyzowaną domenę WD40, po której następuje funkcjonalny, ale elastyczny C-koniec, który nie jest podatny na metody krystalografii rentgenowskiej. Poniżej znajduje się protokół klonowania, ekspresji i oczyszczania S. cerevisiae Nsa1 do hybrydowego oznaczania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej i SAXS. Protokół ten można dostosować do badania struktur innych białek, które składają się z kombinacji uporządkowanych i nieuporządkowanych regionów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych białek Nsa 1

  1. Projektowanie i klonowanie plazmidu ekspresji Nsa1
    1. Uzyskanie lub zakup genomowego DNA S. cerevisiae.
    2. PCR amplifikuje docelowe sekwencje Nsa1 (Nsa1FL, reszty 1-463) i C-końcowy skrócony Nsa1 (Nsa1ΔC, reszty 1-434) odpowiednimi starterami przy użyciu genomowego DNA wyizolowanego z S. cerevisiae i temperaturze topnienia około 60 °C z czasem wydłużenia 1-2 min. Do amplifikacji Nsa1:
      użyto następujących starterów. SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTGCTTTTCTTACTGGTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1Δc Rv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTTTTTTTTTGCTTCCC
    3. Subklonuj Nsa1 do wektora ekspresji Escherichia coli (E. coli) pHMBP zawierającego N-końcowy znacznik 6X-histydyny, a następnie miejsce proteazy białka wiążącego maltozę (MBP) i wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) przy użyciu standardowych technik klonowania17.
    4. Użyj sekwencjonowania DNA, aby sprawdzić, czy Nsa1 został sklonowany w ramce z N-końcowym znacznikiem His-MBP.
  2. Ekspresja białka Nsa1
    1. Przekształć plazmid ekspresyjny (plazmidy) w odpowiedni szczep ekspresyjny E. coli z systemem opartym na promotorze T7. Utrzyj transformanty na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny i inkubuj płytkę odwróconą przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Zaszczepić 50 ml kultury LB 100 μg/ml ampicyliny z płytki transformacyjnej i hodować ją przez noc, wstrząsając przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
    3. Zaszczepić 3 x 1000 ml LB w kolbach Fernbacha ze 100 μg/ml ampicyliny z 15 ml nocnej kultury i hodować ją przez wytrząsanie z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W przypadku roztworu struktury białka, włączenie selenometionylu (SeMet) można osiągnąć poprzez hodowlę komórek w minimalnym pożywce M9, która jest uzupełniona SeMet i mieszaniną aminokwasów w celu zahamowania produkcji metioniny przed indukcją, w przeciwieństwie do LB media18.
    4. Indukować ekspresję Nsa1, gdy OD600 osiąga ~0,8 przez dodanie tiogalaktopiranozydu izopropylu β-D-1 (IPTG) w końcowym stężeniu 1 mM, a następnie inkubację w temperaturze 25 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    5. Zbierać komórki przez odwirowywanie w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 5 050 x g.
      UWAGA: Komórki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystane do oczyszczania białek.
  3. Oczyszczanie białka Nsa1
    1. Ponownie zawiesić komórki w 25 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10% glicerolu, 10 mM MgCl2) wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C zawierającego jedną tabletkę inhibitora proteazy wolną od EDTA.
    2. Lizować komórki metodą sonikacji w temperaturze 4 °C (czas 7 min, 2 s w cyklu, 2 s poza cyklem; amplituda: 70%).
    3. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 26 900 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Nałożyć oczyszczony lizat na grawitacyjną kolumnę przepływową załadowaną 10 ml unieruchomionej żywicy o powinowactwie do kobaltu, wstępnie zrównoważonej buforem do lizy.
    5. Pozwolić, aby supernatant przeszedł przez żywicę przez przepływ grawitacyjny w temperaturze 4 °C i przemyć żywicę dwukrotnie 100 ml buforu do lizy
      6. .
    6. Elute Nsa1 za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5% glicerolu i 200 mM imidazolu).
    7. Weź 15 μl eluatu i uruchom go na 4-15% żelu SDS-PAGE, aby sprawdzić, czy białko jest wymywane z żywicy powinowactwa (Rysunek 1A).
    8. Usuń znacznik MBP przez trawienie proteazy TEV. Dodać 1 ml proteazy TEV 19 (1 mg/ml zapasu) do elucji żywicy powinowactwa Nsa1 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Koncentrat MBP rozszczepiony Nsa1 do ~ 5 ml za pomocą filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej odciętej 10 kDa.
    10. Nałóż Nsa1 z rozszczepionym MBP do żelowej kolumny filtracyjnej, wstępnie zrównoważonej w buforze A (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% glicerolu i 1 mM β-merkaptoetanolu) (Rysunek 1B).
    11. Przeanalizuj frakcje kolumny z filtracji żelowej, aby sprawdzić, czy MBP jest rozszczepiony i oddzielony od Nsa1, przeprowadzając 15 μl próbek na 4-15% żelu SDS-PAGE (Rysunek 1B).
    12. Połączyć frakcje zawierające Nsa1 i stężyć do 8 mg/ml za pomocą filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej odciętej 10 kDa.
    13. Oznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm na spektrofotometrze przy użyciu współczynnika ekstynkcji 42530 M-1 cm-1. Białko należy natychmiast wykorzystać do badań przesiewowych proteolitycznych i prób krystalizacji.

2. Krystalizacja i proteolityczne badania przesiewowe Nsa 1

  1. Ekranowanie kryształów z rzadką matrycą Nsa1
    1. Odwirować 500 μl 8 mg/ml zapasu Nsa1 w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    2. Konfiguracja prób krystalizacji przy użyciu robota krystalizacyjnego i rzadkich ekranów kryształowych matrycy. Napełnij zbiornik 96 tacek dołkowych 30 μl poszczególnych odczynników do sit krystalicznych z rzadkich sit krystalizacyjnych. Ustaw krople do siedzenia z robotem, mieszając 250 nL roztworu studzienki z 250 nL roztworu białkowego.
    3. Uszczelnić płytki krystaliczne taśmą i inkubować je w temperaturze 25 °C.
    4. Sprawdzaj płytki co dwa dni przez pierwsze 2-3 tygodnie za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    5. Sprawdź, czy potencjalne uderzenia kryształów zawierają białko za pomocą mikroskopu UV.
      UWAGA: Dla Nsa1 dwie różne formy krystaliczne (sześcienna i rombowa, Rysunek 2A) uzyskano w ciągu 1 tygodnia z następujących badań przesiewowych: JCSG+ warunek B11 (1,6 M trizasadowy odwodniony cytrynian sodu, pH 6,5) i Wizard Precipitant Synergy Screen Block 2 warunek C11 (20,1% (v/v) PEG 1500, 13,4% (v/v) PEG 400, 0,1 M Tris HEPES/wodorotlenek sodu, pH 7,5).
  2. Proteolityczne badania przesiewowe
    UWAGA: Podczas optymalizacji krystalizacji odkryto, że rombowe kryształy Nsa1 powstały w wyniku rozszczepienia proteolitycznego i kryształów nie można powielić przy użyciu białka o pełnej długości. Wykorzystując kombinację ograniczonej proteolizy w połączeniu ze spektrometrią mas, ustalono, że C-koniec Nsa1 jest wrażliwy na proteolizę, a usunięcie C-końcowego ogona było wymagane do późniejszej reprodukcji rombowej formy kryształu (Nsa1ΔC).
    1. Przygotować 1 mg/ml roztworów podstawowych proteazy następujących proteaz α-chymotrypsyna, trypsyna, elastaza, papaina, subtylizyna i endoproteinaza Glu-C.
    2. Utworzyć rozcieńczenia 1:10, 1:100 i 1:1000 każdego 1 mg/ml proteazy za pomocą buforu rozcieńczającego (10 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM chlorku sodu).
    3. Odpipetować 1 μl proteazy (1:10, 1:100 i 1:1000) do 9 μl porcji białka (1 mg/ml) dla każdej proteazy, która ma być poddana badaniom przesiewowym.
    4. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    5. Zatrzymać reakcję przez dodanie 10 μl 2x buforu próbki SDS-PAGE i podgrzewać reakcję w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Przeanalizuj skróty, uruchamiając je na 4-15% żelu SDS-PAGE (Rysunek 2B).
    7. Zidentyfikuj domeny oporne na proteazy białka docelowego za pomocą analizy spektrometrii mas w żelu.
    8. Usuń regiony labilne proteazy z białka docelowego, tworząc skrócone konstrukcje ekspresji i postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem klonowania, ekspresji i oczyszczania.
  3. Optymalizacja krystalizacji
    1. Przygotować lub otrzymać roztwory podstawowe następujących odczynników do wstępnej krystalizacji: 1,6 M cytrynian sodu trizasadowy odwodnienie pH 6,5, 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) PEG 1500, 1 M HEPES/wodorotlenek sodu, pH 7,5.
    2. Przygotować roztwór podstawowy Nsa1FL i Nsa1ΔC o stężeniu 8 mg/ml, jak opisano powyżej.
    3. Zoptymalizuj kryształy sześcienne Nsa1 (Nsa1FL).
      1. Przygotować 24-dołkowe sito siatkowe z dołkami zawierającymi 500 μl o nachyleniu 1-1,6 M cytrynianu sodu o pH 6,5 z roztworu podstawowego 1,6 M cytrynianu sodu trizasadowego o pH 6,5.
      2. Wymieszaj 1 μl białka z 1 μl roztworu studzienki i umieść mieszaninę na silikonowanym szkiełku podstawowym. Ostrożnie odwróć prowadnicę pokrywy na górze wstępnie nasmarowanej studzienki i upewnij się, że jest dobrze uszczelniona, ale uważaj, aby nie zakłócić upadku ani nie złamać suwaka pokrywy. Powtarzaj ten proces, aż taca zostanie napełniona, a następnie przechowuj w temperaturze 25 °C.
        UWAGA: Małe sześcienne kryształy powinny pojawić się w ciągu 2-7 dni.
      3. Przygotuj wywar z mikronasion kryształów sześciennych. Użyj zamontowanej nylonowej pętli, aby przenieść ~10 małych sześciennych kryształów do 1,5 ml probówki mikrowirówki zawierającej mały koralik i 50 μl 1,6 M trizasadowego cytrynianu sodu o pH 6,5.
      4. Wirować probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z dużą prędkością (~ 3000 obr./min) przez 1 min.
      5. Wykonać serię 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń materiału siewnego 1,6 M trizasadowym roztworem cytrynianu sodu i dokładnie mieszać mieszaninę przez 5 s.
      6. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej siatki, przesiewającą 500 μl 1,6 M cytrynianu sodu o trójzasadowym pH 6,5.
      7. Zoptymalizuj warunki mikrosiewu, ustawiając krople o różnych proporcjach białka z roztworami podstawowymi nasion (Rysunek 3A). Większe kryształy sześcienne o wysokiej jakości dyfrakcyjnej powinny pojawić się w ciągu 2-5 dni (Rysunek 3C).
    4. Zoptymalizuj kryształy rombowe (Nsa1ΔC)
      1. Przygotuj siatkę z 500 μl w każdym dołku w 24 różnych warunkach (Rysunek 3B) z roztworów podstawowych 50%(v/v) PEG 1500 i 100%(v/v) PEG 400. Oprócz gradientów PEG 1500 i PEG 400, każda studzienka powinna również zawierać 0,1 M HEPES/wodorotlenek sodu o pH 7,5.
      2. Wymieszać 1 μl roztworu białkowego z 1 μl roztworu studzienki na silikonowanym szkiełku podstawowym. Ostrożnie odwróć suwak pokrywy na górze wstępnie nasmarowanej studzienki i upewnij się, że jest dobrze uszczelniony. Powtarzaj ten proces, aż cała taca zostanie wypełniona. Przechowuj tace w temperaturze 25 °C.
        UWAGA: Kryształy rombowe Nsa1 powinny pojawić się w ciągu 2-7 dni.
      3. Dalej optymalizuj kryształy rombowe przez mikrowysiewanie, jak opisano dla kryształów sześciennych (kroki 2.3.3.3 do 2.3.3.7) przy użyciu 500 μl 20,1% (v/v) PEG 1500, 13,4%(v/v) PEG 400 i 0,1 M HEPES/wodorotlenek sodu o pH 7,5 jako roztwór studzienki.
        UWAGA: Kryształy Nsa1 SeMet powinny być zoptymalizowane analogicznie do kryształów natywnych.

3. Gromadzenie danych dyfrakcji rentgenowskiej i rozwiązanie struktury Nsa 1

  1. Krioochrona kryształów i gromadzenie danych dyfrakcji rentgenowskiej
    1. Dla kryształów rombowych (Nsa1ΔC) należy przygotować 1 ml roztworu krioprotektantu zawierającego 22,5% (v/v) PEG 1500, 15% (v/v) PEG 400 i 0,1 M HEPES/wodorotlenek sodu o pH 7,5.
    2. Napełnij piankę Dewara ciekłym azotem i wstępnie ostudź kryształowy krążek. Zachowaj ostrożność podczas pracy z ciekłym azotem i noś rękawice i okulary ochronne.
    3. Ostrożnie odwrócić szkiełko pokrywowe studzienki krystalizacyjnej zawierającej kryształy na stolik mikroskopu stereoskopowego.
    4. Odpipetować 2 μl roztworu krioprotektantu na nowe szkiełko podstawowe.
    5. Przymocuj zamontowaną nylonową pętlę o rozmiarze odpowiednim dla kryształu do magnetycznej różdżki kriogenicznej.
    6. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego szybko przenieś kryształ do roztworu krioprotektantu za pomocą zamontowanej pętli kriograficznej.
    7. Pozwól kryształowi zrównoważyć się przez 5 minut w roztworze krioprotektantu.
    8. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego szybko zapętlić kryształ z roztworu krioprotektantu i zanurzyć go w ciekłym azocie.
    9. Poczekaj, aż ciekły azot wokół pętli przestanie wrzeć, a następnie zwolnij pętlę z różdżki w określone miejsce w kryształowym krążku.
    10. Sześcienne kryształy Nsa1FL nie muszą być zabezpieczone kriogenicznie i mogą być bezpośrednio zamrażane (zgodnie z krokami 3.1.8-3.1.9 powyżej).
    11. Zapieczętuj kryształowy krążek za pomocą narzędzi kriogenicznych i przenieś do trzciny transportowej we wstępnie schłodzonym dewarze. Przechowuj kryształy w krążkach/dewarach do czasu zebrania danych.
    12. Jeśli zbierasz dane w synchrotronie, wyślij kryształy do synchrotronu za pomocą suchego transportera.
    13. Zbieraj dane dyfrakcji rentgenowskiej zgodnie ze standardowymi technikami20.
      UWAGA: Dla natywnych Nsa1 i SAD (dyspersja anomalna o pojedynczej długości fali) zestawy danych zostały zebrane w temperaturze 100 K na liniach wiązki SER-CAT 22-ID i 22-BM Advanced Photon Source w Argonne National Laboratory (Chicago, IL). Zestaw danych SAD Nsa1 został zebrany przy λ= 0,97911 A. Dane zostały zarejestrowane przy użyciu czasu naświetlania 1 s i oscylacji 0,5°. Mozaikowość tych kryształów wynosiła typowo około 0.3°.
    14. Przetwarzaj i skaluj obrazy dyfrakcji rentgenowskiej, aby wygenerować pliki odbicia dla każdego zestawu danych w odpowiedniej grupie przestrzennej.
      UWAGA: Zestawy danych dyfrakcyjnych Nsa1 zostały przetworzone za pomocą HKL200021. Kryształy sześcienne Nsa1 przetworzono w grupie przestrzennej P213, a kryształy rombowe przetworzono w grupie przestrzennej P212121.
  2. Roztwór strukturalny Nsa1.
    UWAGA: Istnieje kilka pakietów oprogramowania krystalograficznego, które można wykorzystać do rozwiązywania i uszlachetniania struktur krystalicznych, w tym Phenix i CCP422,23. Poniżej znajduje się protokół rozwiązania struktury Nsa1 przy użyciu pakietu oprogramowania Phenix22.
    1. Analizuj natywne i skalowane zestawy danych SAD za pomocą phenix.xtriage22.
    2. Rozwiąż strukturę Nsa1 za pomocą Phenix.autosol za pomocą pliku odbicia piku SAD22,24. Aby uruchomić program AutoSol, wprowadź liczbę miejsc selenometioniny (miejsca = 9), plik sekwencji fasta Nsa1ΔC oraz długość fali używaną do zbierania danych SAD (λ= 0,97911 A).
      UWAGA: Na podstawie zestawu danych Nsa1 SAD phenix.autosol powinien być w stanie określić fazy eksperymentalne i zbudować większość modelu.
    3. Dokonaj ręcznych korekt modelu za pomocą Coot25, a następnie uściślij w phenix.refine22,26.
    4. Rozwiąż strukturę natywnego kryształu rombowego o wysokiej rozdzielczości i kryształu sześciennego przez zastąpienie molekularne za pomocą Phaser27,28.
    5. Po pomyślnym rozwiązaniu struktury sprawdź model i mapę gęstości elektronów w Coot25.
    6. Buduj i udoskonalaj struktury, uruchamiając iteracyjne rundy udoskonalania w phenix.refine22,26 i budowaniu modelu w Coot25.

4. Gromadzenie, przetwarzanie i modelowanie danych SAXS

  1. Gromadzenie danych SAXS
    UWAGA: Dane SAXS zostały zarejestrowane dla pełnowymiarowego S. cerevisiae Nsa1 w Advanced Light Source, na wysokoprzepustowej linii badawczej SIBYLS 12.3.1 w Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Oczyścić Nsa1FL zgodnie z protokołem opisanym powyżej. 24 godziny przed wysyłką Nsa1FL na linię badawczą, przepuścić białko przez żelową kolumnę filtracyjną wstępnie zrównoważoną w buforze A.
    2. Puluj frakcje zawierające Nsa1 i oznacz stężenie białka zgodnie z wcześniejszym opisem.
    3. Przygotować 30 μl podwielokrotności szeregu stężeń Nsa1 od 1 do 6,2 mg/ml przy użyciu buforu A.
    4. Przenieść 20 μl każdej serii stężeń Nsa1 na przezroczystą 96-dołkową mikropłytkę z pełną osłoną wraz z samym buforem A kontrolnym.
      UWAGA: Dane SAXS są zbierane na rozcieńczonych roztworach przy użyciu kilku stężeń oczyszczonej próbki, aby uniknąć agregacji, odpychania między cząstkami i skutków uszkodzenia przez promieniowanie.
    5. Uszczelnić mikropłytkę silikonową matą uszczelniającą i wysłać przez noc w temperaturze 4 °C do linii badawczej.
    6. Przechowywać mikropłytkę w temperaturze 4 °C do czasu zebrania danych.
    7. Bezpośrednio przed zebraniem danych należy obracać płytkę o gramaturze 3200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia potencjalnych agregatów i pęcherzyków powietrza.
    8. Nagrywanie danych SAXS.
      UWAGA: W przypadku Nsa1 dane SAXS zarejestrowano dla buforu przed i po każdej serii stężeń białka. Pobrano trzydzieści trzy kolejne skany 0,3 s dla Nsa1FL w serii stężeń (od 1 do 6,2 mg / ml) w temperaturze 10 °C.
    9. Wykonaj odejmowanie bufora dla danych SAXS.
      UWAGA: W przypadku Nsa1 odejmowanie bufora było wykonywane automatycznie na linii badawczej, ale odejmowanie bufora można również wykonać za pomocą oprogramowania do redukcji danych, takiego jak Scatter30 i ATSAS suite31. Odejmowanie buforu jest krytyczną częścią analizy danych SAXS i należy zadbać o to, aby bufor używany do odejmowania był identyczny z buforem próbki białka.
    10. Uśrednij 33 kolejne skany, aby utworzyć plik *ave.dat dla każdego stężenia.
      UWAGA: Nałóż na siebie 33 kolejne klatki, aby porównać krzywe. Zmiany krzywych rozpraszania w czasie często wskazują na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. Wyklucz te klatki ze średniego. Uśrednianie kolejnych skanów Nsa1 zostało wykonane automatycznie na linii badawczej SIBYLS.
  2. SAXS Przetwarzanie danych i porównanie stężeń serii
    UWAGA: Istnieje kilka pakietów oprogramowania, które można wykorzystać do analizy danych SAXS. Dla Nsa1 promień bezwładności i funkcje rozkładu odległości parami zostały określone za pomocą PRIMUS32 i Gnom33 z ATSAS 2.7.2 suite31 i porównane dla wszystkich stężeń białek, aby upewnić się, że nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem lub zależnych od stężenia interakcji międzycząsteczkowych10.
    1. Otwórz powłokę terminala i przejdź do katalogu zawierającego dane SAXS.
    2. Uruchom GUI PRIMUS32 z poziomu powłoki terminala.
    3. W graficznym interfejsie użytkownika PRIMUS załaduj krzywe rozpraszania (*ave.dat).
    4. Użyj AutoRg, aby określić promień bezwładności (Rg) i intensywność rozpraszania do przodu I(0) dla każdej krzywej rozpraszania (*ave.dat).
    5. Wygeneruj wykresy Kratky'ego dla każdej krzywej rozpraszania (*ave.dat), aby ocenić stopień zwartości.
    6. Użyj AutoGNOM33, aby obliczyć funkcję rozkładu parami (zwaną również P(r)) dla każdej krzywej rozpraszania (*ave.dat). Wprowadź początkową wartość Dmax ≈ 3*Rg i zoptymalizuj wartość Dmax, aby uzyskać gładką krzywą P(r). Podczas optymalizacji Dmax należy upewnić się, że obliczona funkcja P(r) jest zgodna z eksperymentalną krzywą rozpraszania, sprawdzając podaną wartość χ2 i wizualnie oceniając ogólne dopasowanie do krzywej rozpraszania.
    7. Oblicz masę cząsteczkową Nsa1 na podstawie krzywych rozpraszania, korzystając z objętości korelacji34.
    8. Porównaj parametry strukturalne dla każdego stężenia, aby upewnić się, że nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem lub skutków zależnych od stężenia.
      UWAGA: Efekty koncentracji mogą objawiać się wzrostem Rg i Dmax w stosunku do rosnącego stężenia białka. Rozpraszanie do przodu I(0) podzielone przez stężenie próbki powinno również pozostać stałe w całym szeregu stężeń białka.
  3. SAXS Modeling
    UWAGA: Aby określić położenie C-końca Nsa1FL, do przeprowadzenia kombinacji modelowania ciała sztywnego i ab initio wykorzystano strukturę krystaliczną Nsa1 class10 (PDB 5SUM) oraz krzywe rozpraszania SAXS w celu przeprowadzenia kombinacji modelowania ciała sztywnego i ab initio, przy użyciu programów BUNCH35 i Ensemble Optimization Method (EOM)36 z pakietu oprogramowania ATSAS31. Domena WD40 Nsa1 została potraktowana jako ciało sztywne, podczas gdy C-koniec Nsa1 wraz z kilkoma nieuporządkowanymi pętlami z domeny WD40 został zamodelowany tak, aby pasował do eksperymentalnych danych SAXS.
    1. Wygeneruj wejściowe pliki PDB. Plik PDB musi być dzielony za każdym razem, gdy w łańcuchu głównym brakuje reszt, a plik PDB nie może zawierać wielu konformacji, ligandów lub cząsteczek wody.
    2. Uruchom program Pre_BUNCH35, aby przygotować wejściowy plik PDB dla BUNCH (pre_bunch.pdb). Wprowadź sekwencję białka docelowego (*.seq), liczbę domen/PDB wygenerowanych w 4.3.1 oraz każdy z indywidualnych plików PDB wygenerowanych powyżej.
    3. Oblicz amplitudy rozproszenia dla każdego pojedynczego pliku PDB za pomocą programu CRYSOL37. Aby uruchomić CRYSOL, wprowadź pojedynczy plik PDB i eksperymentalną krzywą rozpraszania SAXS (*.dat). Spowoduje to wygenerowanie pliku amplitudy (*.alm).
    4. Uruchom program BUNCH35, aby zamodelować domenę WD40 Nsa1 względem danych SAXS przy użyciu połączonego podejścia sztywnego ciała i ab initio. Wprowadź plik PDB z Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), eksperymentalną krzywą rozpraszania SAXS (*.dat) oraz indywidualne pliki amplitudy (*.alm) dla każdego częściowego pliku PDB wygenerowanego przez CRYSOL.
    5. Porównaj wartość χ2 z początkowego PDB (5SUM) z wartością z modelu ab initio wygenerowanego przez BUNCH przy użyciu eksperymentalnych danych SAXS.
      UWAGA: Udany model BUNCH powinien mieć znacznie niższą wartość χ2 niż model początkowy. Teoretyczne rozproszenie modelu BUNCH powinno również dobrze opisywać dane eksperymentalne, oceniane przez wizualną inspekcję nakładki między teoretycznym rozpraszaniem modelu BUNCH na dane SAXS a jego wartością χ2 (Rysunek 4, środkowy rurociąg).
    6. Ręcznie sprawdź pliki wyjściowe z BUNCH w Pymol38, aby nałożyć strukturę krystaliczną na model wygenerowany przez BUNCH i obwiednię SAXS (Rysunek 4, środkowy potok).
    7. Uruchom ponownie BUNCH 10-20 razy, aby wygenerować niezależne modele i potwierdzić, że modele są podobne.
      UWAGA: Dla Nsa1 istniał zakres wartości χ2 od ~1 do 3 z 20 niezależnych przebiegów.
    8. Modelowanie zespołowe
      UWAGA: Jako opcjonalne podejście do BUNCH uruchom EOM36 lub Minimal Ensemble Search39 (MES). EOM i MES wykorzystują podejścia zespołowe, które dobrze nadają się do białek o elastycznych domenach/regionach, które są w wielu konformacjach.
      1. Uruchom program EOM36 korzystając z serwera online ATSAS. Aby uruchomić EOM, wprowadź pliki PDB z 4.3.1, sekwencję białka docelowego (*.seq) i eksperymentalne dane SAXS (*.dat).
      2. Porównaj wartości χ2 z początkowego PDB (5SUM) z wartościami z zestawu wygenerowanego przez EOM przy użyciu eksperymentalnych danych SAXS.
        UWAGA: Udany zespół EOM powinien mieć znacznie niższą wartość χ2 niż model początkowy. Teoretyczne rozproszenie zespołu powinno również dobrze opisywać dane eksperymentalne, oceniane na podstawie oględzin nakładki między teoretycznym rozproszeniem zespołu a danymi SAXS a jego wartością χ2 (Rysunek 4, prawy rurociąg). Należy również porównać wartości χ2 z BUNCH i EOM, aby określić, który model najlepiej opisuje eksperymentalne dane SAXS.
      3. Ręcznie sprawdź konformery EOM w Pymol38, aby nałożyć strukturę krystaliczną na konformery wygenerowane przez EOM (Rysunek 4). Zwróć uwagę na całkowitą liczbę konformerów i ułamek zajętości dla każdego konformera, który przyczynia się do krzywej rozpraszania. W przypadku bardziej sztywnych cząsteczek, takich jak Nsa1, liczba konformerów powinna być mała (1-5) (Rysunek 4, prawy rurociąg)36.
      4. Uruchom ponownie EOM kilka razy, aby zapewnić spójne wyniki.
        UWAGA: W przypadku Nsa1 liczba konformerów wynosiła zwykle od 3 do 4, przy czym wartości χ2 mieściły się w zakresie od 0,1 do 0,3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nsa1 został amplifikowany metodą PCR z genomowego DNA S. cerevisiae i poddany subklonowaniu do wektora zawierającego N-końcowy znacznik powinowactwa 6x-histydyny, po którym następuje MBP i miejsce proteazy TEV. Nsa1 został przekształcony w komórki E. coli BL21(DE3) i uzyskano wysokie wyniki ekspresji białka po indukcji za pomocą IPTG i wzroście w temperaturze 25 °C przez noc (Figura 1A). Nsa1 oczyszczono pod kątem powinowactwa na unieruchomionej żywic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, wygenerowano rekombinowany Nsa1 z S. cerevisiae do badań strukturalnych zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS. Nsa1 zachowywał się dobrze w roztworze i krystalizował w wielu formach krystalicznych. Podczas optymalizacji tych kryształów odkryto, że C-koniec Nsa1 jest wrażliwy na degradację proteazy. Rombowa forma kryształu o wysokiej rozdzielczości mogła być zduplikowana tylko z wariantami C-końca Nsa1, prawdopodobnie dlatego, że elastyczny C-koniec Nsa1 zapobie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane dyfrakcyjne zostały zebrane na liniach badawczych Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID i 22-BM w Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Dane z projektu SAXS zostały zebrane na linii badawczej SIBYLS w Advance Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Serdecznie dziękujemy pracownikom linii badawczej SIBYLS za pomoc w zdalnym gromadzeniu i przetwarzaniu danych. Jesteśmy wdzięczni Grupie Badawczej i Wsparcia Spektrometrii Mas Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) za pomoc w określeniu granic domen białkowych. Prace te były wspierane przez amerykański National Institute of Health Intramural Research Program; Amerykański Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) (ZIA ES103247 do R. E. S.) oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR, 146626 do MCP). Wykorzystanie APS było wspierane przez Departament Energii USA, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych w ramach kontraktu nr W-31-109-Eng-38. Wykorzystanie Zaawansowanego Źródła Światła (ALS) było wspierane przez Dyrektora Biura Nauki Biura Podstawowych Nauk o Energii Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w ramach umowy nr 1. DE-AC02-05CH11231. Dodatkowe wsparcie dla linii badawczej SIBYLS SAXS pochodzi z projektu MINOS (R01GM105404) realizowanego przez Narodowy Instytut Zdrowia oraz S10OD018483 grantu High-End Instrumentation Grant. Chcielibyśmy również podziękować Andrei Moon i dr Sarze Andres za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vectorSheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)Użyliśmy zmodyfikowanej wersji pMBP2, która zawierała N-końcowy znacznik Hisa (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNAATCC204508D-5
Primers do klonowania Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Rekombinowana produkcja białek i oczyszczanie Nsa1< / strong>
Escherichia coli BL21 (DE3) Komórki gwiazdoweInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 i różne skrótyLo i wsp., 2017
Wymiary molekularneselenometioninyMD12-503B
IPTG, Bez dioksanuPromegaV3953
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTASigma-Aldrich4693159001
Chlorek soduCaledon Chemikalia laboratoryjne7560-1-80
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM2670
Tris Buffer, 1 M pH 7,5KD MedicalRGF-3340
GlycerolInvitrogen15514-029
beta-merkaptoetanolSigmaM6250
1M Imidazol, pH 8,0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinClonetech635503
Amicon Ultra 15 ml (MWCO 10K)MiliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Żel klasy przygotowawczej Kolumna filtracyjnaGE-Healthcare28989335
proteaza TEVprzygotowana przez NIEHS Plazmid Protein Expression CoreExpression dostarczony przez NCI (Tropea i wsp. Metody Mol Biology, 2009)
4-15% Prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGXBioRad456-8056
Krystalizacja, przesiewowe badanie proteolityczne
Ekran kryształowyHampton ResearchHR2-110
Ekran kryształowy 2Hampton ResearchHR2-112
Sól RxHampton ResearchHR2-136
Ekran indeksuHampton ResearchHR2-144
Ekran PEG / jonowyHampton ResearchHR2-139
JCSG+wymiary molekularneMD1-37
Wizard Precipitant SynergyWymiary molekularneMD15-PS-T Swissci
96-dołkowe 3-kroplowe płytki opadowe UVPTTP Labtech4150-05823
3-calowa krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniającaHampton ResearchHR4-506
Zestaw Proti-AceHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Wymiary molekularneMD2-100-6
PEG 400Wymiary molekularneMD2-100-3
HEPES/wodorotlenek sodu pH 7,5Wymiary molekularneMD2-011-Cytrynian
sodu tribasicWymiary molekularneMD2-100-127
22 mm x 0,22 mm silikonowane szkiełka nakrywkoweHampton ResearchHR3-231
24-dołkowe płytki z uszczelniaczem (płyta VDX z Uszczelniacz)Hampton ResearchHR3-172
18 mM Nylonowe pętle montowane (0,05 mm do 0,5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Zestaw koralików nasiennychHampton ResearchHR2-320
Magnetyczne nasadki kryształkoweHampton ResearchHR4-779
Magnetyczna różdżka kriogenicznaHampton ResearchHR4-729
Pianka kriogeniczna DewarHampton ResearchHR4-673
Crystal Puck SystemMiTeGenM-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear PlateVWR10011-228
Mata uszczelniająca AxyMatVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Spektrofotometr Nanodrop LiteThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski i Minor, 1997
PhenixAdams i wsp., 2010
CootEmsley i wsp., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo i Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, wersja 1.8 Schrö dinger, Sp. z o.o.
BUNCHPetoukhov i Svergun, 2005
CRYSOLSvergun i wsp., 1995
PRIMUSKonarev i wsp., 2003
EOMTria i wsp., 2015
Filtr odśrodkowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516(2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431(2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ekanaliza danych SAXSczynnik monta u rybosom wbia ko Nsa1hybrydowe modelowanie strukturalnemodelowanie cia sztywnychmodelowanie ab initioscreening proteolityczny

Powiązane artykuły