Artykuł metodologiczny

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

20.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56956

⸱

22 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Streszczenie

Kwantyfikacja małych cząsteczek w pojedynczych komórkach stwarza nowe możliwości dla lepszego zrozumienia podstawowych procesów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego. Aby umożliwić badania pojedynczych komórek bezpośrednio w żywych zarodkach, potrzebne są nowe podejścia analityczne, w szczególności te, które są czułe, selektywne, ilościowe, solidne i skalowalne do różnych rozmiarów komórek. W tym artykule przedstawiamy protokół, który umożliwia analizę in situ metabolizmu w pojedynczych komórkach w swobodnie rozwijających się zarodkach południowoafrykańskiej żaby szponiastej (Xenopus laevis), która jest potężnym modelem w biologii komórki i rozwoju. Podejście to wykorzystuje mikrosondę kapilarną do odsysania określonej części z pojedynczych zidentyfikowanych komórek w zarodku, pozostawiając sąsiednie komórki nienaruszone do późniejszej analizy. Zebrana zawartość komórek jest analizowana za pomocą interfejsu jonizacji elektrorozpylania elektroforezy kapilarnej w mikroskali (CE-ESI) sprzężonego z tandemowym spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości. Podejście to jest skalowalne do różnych rozmiarów komórek i kompatybilne ze złożoną trójwymiarową strukturą rozwijającego się zarodka. Jako przykład pokazujemy, że jednokomórkowa mikrosonda CE-ESI-MS umożliwia wyjaśnienie heterogeniczności metabolicznej komórek, która rozwija się, gdy komórka progenitorowa daje początek potomstwu podczas rozwoju zarodka. Oprócz biologii komórkowej i rozwojowej, opisane tutaj protokoły analizy pojedynczych komórek są podatne na inne rozmiary komórek, typy komórek lub modele zwierzęce.

Wprowadzenie

Kompleksowe zrozumienie rozwoju embrionalnego wymaga scharakteryzowania wszystkich zmian molekularnych, które zachodzą w każdej komórce rozwijającego się organizmu. Podczas gdy sekwencjonowanie nowej generacji z amplifikacją molekularną umożliwia dogłębny pomiar transkryptomów pojedynczych komórek1 w systemach rozwijających się2,3, znacznie mniej wiadomo o zestawie mniejszych cząsteczek wytwarzanych w pojedynczych komórkach embrionalnych, w tym białek, a zwłaszcza metabolitów (masa cząsteczkowa <~1,500 Da). Dzięki szybkiej i dynamicznej reakcji na zdarzenia wewnętrzne i zewnętrzne, metabolom służy jako potężny deskryptor stanu molekularnego komórki. Metabolom jednokomórkowy zwiększa zatem potencjał do śledzenia przestrzennego i czasowego rozwoju heterogeniczności komórek we wczesnym zarodku oraz do identyfikacji nowych cząsteczek do badań funkcjonalnych. Jednak bez dostępnej amplifikacji molekularnej dla tych cząsteczek, wykrywanie metabolomu wymaga wyjątkowej czułości przy użyciu spektrometrii mas (MS), która jest technologią z wyboru do analizy metabolitów.

Jednokomórkowy MS to zbiór technologii o wystarczającej czułości do pomiaru metabolitów w pojedynczych komórkach (zobacz recenzje 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15). Powtarzalne pobieranie próbek z komórek i skuteczna ekstrakcja metabolitów mają zasadnicze znaczenie dla skutecznego wykrywania metabolitów w pojedynczych komórkach. Analiza całokomórkowa zidentyfikowanych komórek z zarodków Xenopus umożliwiła scharakteryzowanie małych cząsteczek i peptydów16. Inne podejścia wykorzystują mikropipety do pobierania próbek z pojedynczych żywych komórek, a następnie detekcję za pomocą elektrorozpylania jonizacji (ESI) MS. Na przykład, metabolity mierzono w komórkach roślinnych lub ssaków za pomocą jednokomórkowego wideo MS17, pressure probe18, single probe19 i hydroic force microscopy20, między innymi21,22,23,24. Dodatkowo, włączenie separacji chemicznej przed jonizacją do przepływu pracy SM w pojedynczej komórce skutecznie upraszcza metabolom, łagodząc w ten sposób potencjalne zakłócenia podczas wytwarzania jonów przed wykryciem. Co ważne, separacja dostarcza również informacji specyficznych dla związku, które pomagają w identyfikacji molekularnej. Elektroforeza kapilarna (CE) została wykorzystana do wykrywania metabolitów w pojedynczych neuronach dissected25,26 lub microsampled27neuronów, rejestrując różnice między małymi cząsteczkami między fenotypami neuronów. Niedawno dostosowaliśmy CE do ESI tandem MS, aby umożliwić wykrywanie śladowych ilości setek metabolitów w pojedynczych komórkach, które zostały wypreparowane z wczesnych zarodków Xenopus laevis16,28. Badania te ujawniły zaskakujące różnice metaboliczne między komórkami embrionalnymi na wczesnym etapie rozwoju i doprowadziły do odkrycia metabolitów o nieznanym wcześniej wpływie na rozwój16.

Tutaj udostępniamy protokół, który umożliwił wykrywanie metabolitów w pojedynczych komórkach bezpośrednio w żywym zarodku kręgowców za pomocą mikrosondy jednokomórkowej CE-ESI-MS29,30. Wybrany organizm modelowy to zarodek X. laevis składający się z 8 do 32 komórek, chociaż podejście to ma również zastosowanie do późniejszych etapów rozwoju i innych typów organizmów modelowych. Protokół ten wykorzystuje zaostrzone naczynia włosowate z wieloosiową kontrolą translacyjną pod kierunkiem systemu obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu odessania ~10 nL części zidentyfikowanych komórek in situ w morfologicznie rozwijającym się zarodku. Ta mikrosonda jest skalowalna do mniejszych komórek i działa w ciągu kilku sekund, co jest wystarczająco szybkie, aby śledzić linie komórkowe w zarodku. Po wyekstrahowaniu polarnych lub apolarnych małych cząsteczek, takich jak metabolity i peptydy, z pobranej próbki w ~4-5 μL roztworu ekstrakcyjnego, ~10 nL otrzymanego ekstraktu jest analizowane na specjalnie zbudowanej platformie CE z łącznikiem do spektrometru mas ESI. Budowa i eksploatacja platformy CE-ESI-MS opiera się na protokołach opisanych w innym miejscu. 31,32 Współosiowy interfejs CE-ESI jest skonstruowany tak, jak opisano w innym miejscu. 31 Ta platforma jest utrzymywana w reżimie natryskiwania stożkowym, aby osiągnąć czułość na poziomie śladowym z możliwością kwantyfikacji w zakresie dynamiki 4-5 log-order (relative28,29,30 lub absolute16). Platforma CE-ESI-MS oferuje dolną granicę wykrywalności 60-amolową z 8% względnym odchyleniem standardowym (RSD) w ocenie ilościowej w badanym zakresie od 10 nM do 1 μM dla małych cząsteczek16, które są wystarczające do scharakteryzowania endogennych metabolitów w komórkach X. laevis. Mikrosondowane komórki kontynuują podział w miarę postępu zarodka w procesie rozwoju30, co pozwala na czasową i przestrzenną analizę metabolizmu komórkowego. Rzeczywiście, jednokomórkowy CE-ESI-MS może być używany do znajdowania różnic metabolicznych między komórkami, które zajmują grzbietowo-brzuszne16,29, animal-vegetal16, and left-right28 osi rozwojowych, a także komórek, które tworzą linię grzbietową przeznaczoną na tkankę nerwową od wspólnej komórki progenitorowej w X. laevis30. Oprócz badania różnic metabolicznych między poszczególnymi komórkami embrionalnymi na różnych etapach rozwoju X. laevis embryo30, przewidujemy, że opisane tutaj protokoły mają zastosowanie do szerokiej gamy biomolekuł i pojedynczych komórek mikropróbkowanych z różnych etapów rozwoju embrionalnego, a także innych typów komórek i organizmów modelowych. Ponadto mikrosonda może być wykorzystana do mikropróbkowania, podczas gdy inna platforma kompatybilna z małymi próbkami może być wykorzystana do separacji i/lub charakterystyki biomolekuł.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące utrzymania i obchodzenia się z Xenopus laevis zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na George Washington University (IACUC nr A311).

1. Przygotowanie narzędzi do pobierania próbek, pożywek, rozpuszczalników i naczyń do pobierania próbek

  1. Przygotuj 1x roztwór Steinberga (SS), rozpuszczając następujące sole w wodzie ultrapurej (~18,2 MΩ.cm przy 25 °C) w poniższej kolejności i w określonych stężeniach zgodnie ze standardowym protokołem33: chlorek sodu (58,2 mM), chlorek potasu (0,67 mM), azotan wapnia (0,34 mM), siarczan magnezu (0,83 mM), Tris-hydrochlorowodorek (4,19 mM) oraz Tris-zasada (0,66 mM). Przygotuj 0,5x SS poprzez dwukrotne rozcieńczenie, a 0,1x SS poprzez dziesięciokrotne rozcieńczenie 1x SS wodą ultrapurej.
  2. Przygotuj płytki do pobierania próbek, sporządzając najpierw 2% agarozę w 1x SS. Autoklawuj w temperaturze 120 °C przez 20 min w celu rozpuszczenia. Gdy roztwór jest jeszcze w stanie ciekłym, pokryj nim dno płytek Petriego o średnicy 60 mm. Po ostygnięciu i zestaleniu żelu agarowego, wypal koniec sześciocalowej pipety Pasteura, aż utworzy się kuleczka, a następnie delikatnie dotykaj rozgrzanym końcem żelu, aby odcisnąć od 5 do 10 otworów o głębokości ~1 mm w agarozie.
    UWAGA: Otwory te służą do unieruchamiania zarodków podczas pobierania próbek.
  3. Przygotuj rozpuszczalnik do ekstrakcji metabolitów. Dostosuj właściwości fizykochemiczne rozpuszczalnika (np. polarność i pH) do klas cząsteczek, które są przedmiotem badania.
    UWAGA: Na przykład stosujemy 40% metanol i 40% acetonitryl w wodzie klasy LC-MS w podejściu odkrywczym, aby targetować głównie metabolity polarne oraz nieliczne metabolity apolarne i peptydy28.
  4. Wykonaj pętelki z czystego włosa i pipety Pasteura, jak opisano w innej publikacji33, aby delikatnie przesuwać zarodki w płytkach Petriego przy minimalnych zakłóceniach.
  5. Wykonaj mikropipety zدقzwężonym końcem, jak pokazano na Rysunku 1a.
    1. Najpierw wyciągnij kapilary borokrzemianowe (średnica zewnętrzna/wewnętrzna 1 000/500 µm) w wyciągarce kapilar typu Flaming-Brown z następującymi ustawieniami: heat = 355; pull = 65, velocity = 80; time = 150.
    2. Następnie odłam koniec wyciągniętej mikropipety za pomocą precyzyjnej ostrej pęsety, aby uzyskać zewnętrzną średnicę końcówki kapilary wynoszącą ~20 µm. Wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym, aby zwiększyć precyzję i powtarzalność.
      UWAGA: Kapilary z bardzo cienkim końcem są podatne na zatykanie podczas aspiracji lepkim cytoplazmy. Choć kapilary z większym końcem z pewnością pomagają uniknąć zapychania i pozwalają na aspirację większej ilości zawartości komórkowej, kapilary o dużym przekroju mogą sprawiać trudności podczas pobierania próbek z mniejszych komórek i potencjalnie uszkodzić komórkę przed kolejnymi etapami pobierania. Ostrożna regulacja ciśnienia i czasu aspiracji może częściowo złagodzić te problemy. W pracy przedstawionej w niniejszym protokole uznaliśmy mikropipety o średnicy zewnętrznej ~20 µm za idealne.

2. Mikropobieranie pojedynczych komórek i ekstrakcja metabolitów

  1. Pozyskać zarodki (zapłodnione jaja) poprzez naturalne kojarzenie dorosłych osobników Xenopus laevis indukowane gonadotropiną lub poprzez zapłodnienie in vitro, zgodnie z opisami w innych protokołach33,34.
    UWAGA: Naturalne kojarzenie zapewnia zróżnicowanie stadiów rozwoju embrionalnego, podczas gdy zarodki uzyskane drogą zapłodnienia in vitro gwarantują bardziej niezawodną dostępność. Jednak zapłodnienie in vitro wymaga uśmiercenia dorosłego samca żaby.
  2. Przygotować na świeżo 2% roztwór cysteiny do usuwania otoczek galaretowatych, rozpuszczając 4 g cysteiny w 200 mL wody ultrapure i dostosowując kropelkowo pH roztworu do wartości 8 za pomocą 10 N roztworu wodorotlenku sodu.
  3. Usunąć otoczki galaretowate otaczające zarodki w momencie, gdy zaczynają one dzielić się do stadium 2 komórek, w następujący sposób: pozostawić zarodki w roztworze do usuwania otoczek na 2 min, a następnie delikatnie nimi zamieszać przez kolejne 2 min, aby zapobiec przyleganiu zarodków do powierzchni naczynia zbiorczego.
  4. Delikatnie przelać zawartość naczynia do czystego zlewki i szybko odlać roztwór do usuwania otoczek ze zlewki. Natychmiast zalać jaja roztworem 0,1x SS, aby wypłukać pozostałości roztworu do usuwania otoczek, delikatnie zamieszać, a następnie odlać roztwór. Powtórzyć ten krok czterokrotnie, aby dokładnie wypłukać zarodki.
    UWAGA: Ograniczyć ekspozycję zarodków na roztwór do usuwania otoczek do 4 min, aby zapewnić ich żywotność. Kompleksowe protokoły usuwania otoczek galaretowatych są dostępne w innym opracowaniu33.
  5. Przenieść zarodki po usunięciu otoczek do roztworu 1x SS w szalce Petriego. Aby zminimalizować zagęszczenie na płytkach, umieścić ~100 zarodków na szalce 100 mm33.
    UWAGA: Szalki zawierające zarodki można przechowywać w temperaturze 14-18 °C, aby spowolnić rozwój i uzyskać zarodki na różnych stadiach rozwojowych od tych samych rodziców. Dalsze wytyczne dotyczące zależności wzrostu i rozwoju od temperatury są opublikowane w bazie Xenbase oraz w innych źródłach33,35,36,37.
  6. Posegregować dzielące się zarodki w stadium 2 komórek do oddzielnej szalki, w której stereotypowa pigmentacja pozwala pewnie określić oś grzbietowo-brzuszną, w odniesieniu do ustalonych map losów komórek38,39,40.
    1. Zidentyfikować prawidłowo dzielące się zarodki, upewniając się, że pierwsza bruzda podziałowa, wyznaczająca płaszczyznę pośrodkową, przecina ciemno (brzusznie) i jasno (grzbietnie) pigmentowany biegun zwierzęcy w taki sposób, że obie połowy są swoimi odbiciami lustrzanymi41.
  7. Zamontować wykonaną mikropipetę na wieloosiowym mikromanipulatorze (ręcznym lub zdalnie sterowanym). Podłączyć mikropipetę do mikroinjektora.
  8. Używając plastikowej pipety transferowej, pobrać ~5 zarodków w stadium 8 komórek i przenieść je do szalki probierczej zawierającej 0,5x SS. Za pomocą pętelki z włosa umieścić pobierany zarodek w oddzielnej studzience i upewnić się, że prawidłowo zidentyfikowana komórka docelowa jest skierowana w stronę mikrosondy pod kątem ~90°.
    UWAGA: Identyfikować komórki na podstawie pigmentacji i położenia w zarodku, w odniesieniu do map losów komórek38,39,40.
  9. Pracując pod stereomikroskopem (powiększenie 20-30X), wprowadzić końcówkę mikropipety do zidentyfikowanej pojedynczej komórki w żywym zarodku, jak pokazano na Rysunku 1 (patrz: punkty poboru z komórek na panelu B oraz aparat na panelu C).
  10. Pobrać pożądaną część zawartości komórki, przykładając impulsy podciśnienia do mikrokapilary za pomocą mikroinjektora („tryb napełniania” - fill mode).
    UWAGA: Na przykład rutynowo aspirujemy objętość ~10-15 nL z komórki, przykładając do kapilary ~3 impulsy o wartości -30 psi. Cały ten etap aspiracji trwa ~5 s30.
  11. Delikatnie wycofać mikrosondę z komórki i przenieść jej końcówkę do 4 µL schłodzonego (4 °C) rozpuszczalnika do ekstrakcji metabolitów w mikroprobówce. Następnie, za pomocą mikroinjektora, przyłożyć do kapilary impuls ciśnienia +80 psi przez 1 s („tryb czyszczenia” - clear mode), aby wyrzucić aspirat do rozpuszczalnika.
    1. Szczelnie zamknąć probówkę, aby zapobiec parowaniu, i umieścić ją z powrotem w pojemniku z lodem (4 °C) aż do zakończenia pobierania próbek. Zużytą mikropipetę wyrzucić do pojemnika na odpady ostre, aby uniknąć ryzyka zakłucia.
      UWAGA: Aby określić objętość aspirowanej zawartości komórki, wstrzyknąć aspirat do oleju mineralnego, w którym przybierze on kształt sferyczny. Średnicę tej sfery można zmierzyć pod mikroskopem. Obliczyć objętość aspiratu: V = 4/3 π r3, gdzie V to objętość, a r to promień sfery.
  12. Aby ponownie pobrać próbkę z tej samej komórki lub z innych komórek zarodka, powtórzyć kroki 2.7-2.11 (Rysunek 1c). Aby uniknąć potencjalnej kontaminacji krzyżowej między kolejnymi pobraniami, należy używać nowej mikropipety do analizy każdej innej komórki.
  13. Po zakończeniu pobierania próbek, zmieszać probówki mikrocentryfugowe zawierające próbki za pomocą vortexa przez ~1 min, aby przyspieszyć ekstrakcję metabolitów, a następnie wirować przy 8,000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby osadzić szczątki komórkowe i inne cząstki stałe.
  14. Przechowywać ekstrakty komórkowe wraz ze szczątkami komórkowymi i materiałami wytrąconymi w temperaturze -20 °C przez jeden dzień lub w -80 °C do 1 miesiąca do czasu pomiaru metodą CE-ESI-MS.

3. Pomiar CE-ESI-MS

  1. Przygotowanie standardów i roztworów do CE-ESI-MS
    1. Przygotuj elektrolit tła (BGE) składający się z 1% kwasu mrówkowego w wodzie klasy LC-MS.
    2. Przygotować roztwór osłonkowy zawierający 50% metanolu w wodzie klasy LC-MS oraz 0,1% kwasu mrowego.
    3. Przygotować 50 nM roztwór acetylocholiny w roztworze osłonowym do codziennej oceny wydajności systemu CE-ESI-MS.
    4. Przygotuj 150 mM roztwór chlorku sodu jako standard do kalibracji masy dla niskiego m/z zakres w trybie jonów dodatnich. Masa (m/zdokładność <Zaleca się stężenie 10 ppm. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta spektrometru masowego podczas wykonywania tego kroku.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne standardy o znanej m/z Wartości te mogą zostać wykorzystane do kalibracji masowej spektrometru masowego.
  2. Budowa platformy CE-ESI
    1. Zbuduj platformę wtryskową do elektroforezy kapilarnej (CE), umożliwiającą szybkie przesunięcie w pionie podestu utrzymującego fiolkę z buforem tła (BGE) oraz mikrofiolkę do ładowania próbki. W celu konstrukcji i eksploatacji platformy należy zapoznać się ze szczegółami zawartymi w Literaturze.31.
    2. Zmontuj interfejs CE-ESI (Rycina 1c) w następujący sposób. Zamontuj metalowy emiter do elektrorysu (130/260 µm (średnica wewnętrzna/zewnętrzna i długość ok. 35 mm) do 3-portowego złącza T. Wprowadź kapilarę CE do rozdziału (40/105 µm średnica wewnętrzna/zewnętrzna i długość ~100 cm) przez emiter do elektrorosysku, tak aby wystawał on na około 40-100 µm poza końcówkę emitera. Pracę należy prowadzić pod stereomikroskopem w celu zwiększenia dokładności.
      1. Podłącz kapilarę z roztworem osłonowym (75/360 µm (średnica wewnętrzna/zewnętrzna i długość ~100 cm) do pozostałego portu, aby doprowadzić roztwór do elektrosprayu. Należy użyć odpowiednich tulejek i dokręcić połączenia palcami, aby zapewnić szczelność interfejsu CE-ESI. W kwestii szczegółów należy odnieść się do poprzednich protokołów.31,32 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat montażu i rozwiązywania problemów z tym interfejsem.
        UWAGA: Wymiary kapilary wpływają na stosunek sygnału do szumu (S/N) oraz czas trwania rozdziału. Na przykład kapilary o wąskiej średnicy i krótkiej długości umożliwiają szybki rozdział przy zastosowaniu wyższych napięć rozdziałczych.42,43Ponadto, w zależności od typów cząsteczek będących przedmiotem badania, kapilary rozdzielcze mogą być powlekane w celu zminimalizowania lub uniknięcia niepożądanych oddziaływań między cząsteczkami a ściankami kapilary.44.
    3. Za pomocą uchwytu do płytek zamocuj interfejs CE-ESI na trójosiowej platformie translacyjnej i ustaw końcówkę emitera elektrospray w odległości ok. 2 mm od otworu spektrometru mas (Rycina 1c).
    4. Aby wyczyścić elementy interfejsu, należy przepłukać go, podając roztwór osłonowy do elektrosprayu poprzez emiter elektrosprayu w prędkości 1 µL/min oraz BGE przez kapilarę rozdzielczą CE. Do podawania rozpuszczalników ze stałą prędkością należy użyć pomp strzykawkowych.
    5. Przed każdym pomiarem należy przepłukać kapilarę do rozdziału CE, podłączając strzykawkę do wlotu kapilary. Należy używać strzykawek o odpowiednio dużej objętości, aby zminimalizować konieczność ponownego napełniania i odpowietrzania linii doprowadzających rozpuszczalnik.
      UWAGA: W doświadczeniach zazwyczaj stosuje się strzykawki gazoszczelne o pojemności 1 ml do podawania rozpuszczalnika osłonowego do elektrorsyku oraz 500 µL strzykawka do płukania kapilary rozdziałczej.
  3. Walidacja platformy CE-ESI-MS i pomiar metabolitów
    UWAGA: Celem tego etapu jest codzienna weryfikacja czułości analitycznej instrumentu CE-ESI-MS przed przystąpieniem do analizy ekstraktów z pojedynczych komórek. Wykorzystując opisaną tutaj platformę CE-ESI, jesteśmy w stanie osiągnąć górną granicę wykrywalności na poziomie 60 amol przy użyciu kwadrupolowego spektrometru mas z ortogonalnym przyspieszeniem i pomiarem czasu przelotu (TOF).16.
    1. Po płukaniu kapilary rozdzielczej przez około 5 min, przenieść jej wlot do roztworu BGE znajdującego się w fiolce ze stali nierdzewnej.
    2. Ustaw końcówkę emitera do elektrosprayu w odległości około 2 mm od wlotu spektrometru mas i precyzyjnie dostosuj ten dystans za pomocą stołu translacyjnego, aby uzyskać elektrospray w stabilnym reżimie stożka-struga (cone-jet), monitorując strumień za pomocą stereomikroskopu (patrz referencje)31,45Monitoruj stabilność całkowitego prądu jonowego (TIC) przez około 30–45 min, aby upewnić się, że urządzenie pracuje stabilnie.
    3. Przyłożyć napięcie ~20 kV do fiolki z buforem BGE, stopniowo zwiększając potencjał w czasie ~15 s, co zazwyczaj generuje ~7.5 µA prąd w kapilarze rozdziałowej, stosując 1% kwas mrówkowy jako BGE. Przed każdym pomiarem należy upewnić się, że system jest stabilny, monitorując profil TIC przez około 5–10 min, a następnie stopniowo obniżyć potencjał rozdziału (CE) do 0 V (masa).
      UWAGA: Aby częściowo zautomatyzować ten proces, wykorzystujemy specjalistyczne oprogramowanie do zdalnego sterowania zasilaczem wysokiego napięcia w układzie CE31Jeśli platforma CE-ESI-MS jest niestabilna, należy dokładnie ocenić źródło niestabilności, testując platformę CE-ESI-MS najpierw w trybie samego ESI, a następnie w trybie pracy CE-ESI, zgodnie z zaleceniami opisanymi w innym miejscu.31Krótko mówiąc, aby przetestować platformę w trybie wyłącznie ESI, należy wyłączyć wysokie napięcie CE i monitorować TIC przez około 30 min w reżimie rozpylania typu cone-jet. W razie potrzeby, w celu wyeliminowania błędów, należy postąpić w następujący sposób: (i) sprawdzić szczelność połączeń; (ii) oczyścić emiter do elektrorspylania wodą, izopropanolem, wodą i metanolem; (iii) odgazować rozpuszczalniki; (iv) przepłukać emiter przez około 25 min przed ponownym przetestowaniem. Jeśli platforma CE-ESI wykazuje stabilność w trybie wyłącznie ESI, lecz staje się niestabilna podczas rozdziału CE, należy sprawdzić system pod kątem efektu Joule’a i/lub elektrolizy: (i) przepłukać kapilarę rozdzielczą BGE przez około 25 min i powtórzyć eksperyment; (ii) zastosować niższe potencjały rozdzielcze, aby utrzymać liniową odpowiedź ohmiczną (t. j., liniowa krzywa zależności prądu CE od napięcia rozdziału); (iii) sprawdzić kapilarę CE pod kątem potencjalnych uszkodzeń, takich jak pęknięcia, i w razie potrzeby wymienić kapilarę.
    4. Przeanalizuj ok. 6 nL próbki w następujący sposób:
      1. Pipeta 1 µL roztworu wzorcowego acetylocholiny do fiolki do wstrzykiwania.
      2. Przenieś kapilarę rozdziałczą z fiolki z BGE do fiolki do wtrysku.
      3. Podnieś zespół wtryskowy CE o 15 cm w czasie 1 s.
      4. Utrzymaj stoлик w pozycji podniesionej przez 60 s, aby wstrzyknąć hydrodynamicznie ok. 6 nL próbki do kapilary rozdzielczej.
      5. Następnie należy cofnąć stolik do poziomu początkowego (do linii wylotu kapilary).
      6. Ostrożnie wprowadź koniec wlotowy kapilary do BGE.
      7. Następnie niezwłocznie zwiększcie napięcie CE, aby rozpocząć rozdział elektroforetyczny.
      8. Rozpocznij akwizycję danych MS.
        UWAGA: Wydajność systemu można charakteryzować, używając dowolnego standardu chemicznego. Metoda CE-ESI-MS dla pojedynczych komórek zapewnia niższe granice wykrywalności na poziomie ~10 nM (~60 amol) dla acetylocholiny, metioniny i histydyny.16Wstrzyknięta objętość (Vwstrzyknięcie), do kapilary w nL, zależy od różnicy wysokości (H, cm) podczas wtryskiwania, gęstości (ρ, g cm-3) oraz lepkość (η, kg m-1s-1) BGE, długość (L, m) i promień (r, µm) kapilary CE oraz czasu wstrzykiwania (twstrzykiwanie, s). Zależność tę wyraża następujący wzór, w którym g (m s-2) jest przyspieszeniem grawitacyjnym:
        figure-protocol-1
    5. Po wykryciu standardu należy przerwać akwizycję danych, stopniowo obniżyć napięcie separacyjne do 0 V (masa), a następnie cofnąć emitera na odległość 2 cm od otworu (orifice). Przed analizą ekstraktu komórkowego należy płukać kapilarę separacyjną przez 5 min.
    6. Odmierz 10 nL ekstraktu z pojedynczej komórki, powtarzając kroki 3.3.1–3.3.5, wykorzystując 90 s na hydrodynamiczną iniekcję próbki.
  4. Przetwarzanie danych
    UWAGA: Celem przetwarzania danych jest identyfikacja i ilościowe oznaczenie związków w pojedynczych komórkach. Protokół CE-ESI-MS dla pojedynczych komórek generuje wąskie piki elektroforegramu o typowej szerokości podstawy wynoszącej kilka sekund. Dzięki przeprowadzaniu analizy danych w sposób półautomatyczny możliwe jest zidentyfikowanie cech molekularnych (unikalnych m/z wartości o unikalnych czasach migracji) zgodnie z poniższymi krokami. Reprezentatywny rozdział przedstawiono dla wybranych zidentyfikowanych metabolitów w Rysunek 2a.
    1. Przeprowadź masową kalibrację surowych plików danych po akwizycji danych.
      UWAGA: Wykorzystujemy sygnały z klastrów mręczanu sodu, które powstają podczas oddzielania obfitych jonów sodu z próbki; jony te występują naturalnie w komórkach lub są ekstrahowane z pożywek do hodowli embrionów. Celem tego etapu jest ułatwienie identyfikacji metabolitów w późniejszych krokach poprzez zapewnienie wysokiej masy (m/z) dokładność, najlepiej <5 mDa lub <10 ppm, pomiędzy m/z 50–1000. W tym przypadku kalibracja po akwizycji danych pozwala na rutynowe uzyskiwanie dokładności masy <1 mDa, lub <2 ppm dla m/z 50-500.
    2. Za pomocą skryptu przetwarzającego należy wyszukać cechy molekularne w całym wykrytym zakresie mas. Należy uśrednić widma masowe dla każdego piku w celu wyznaczenia dokładnej masy oraz odnotować odpowiadające im czasy migracji. W celu identyfikacji metabolitów o niskiej masie w... m/z zakres 50–500, należy zastosować okno krokowe 500 mDa w celu monitorowania cech cząsteczkowych z odpowiednim stosunkiem sygnału do szumu (S/N) > 3.
    3. Zintegruj pole powierzchni pod krzywą dla każdego piku cechy molekularnej ręcznie lub automatycznie. Wynikowe wartości pola powierzchni służą jako miara obfitości metabolitów.
    4. Zidentyfikuj interesujące cechy molekularne z wysoką pewnością w następujący sposób (patrz ryc. 2b).
      1. Najpierw należy porównać dokładną masę cech molekularnych z bazą danych metabolitów (np., Metlina46 oraz HMDB47) z dokładnością do 10 ppm, aby uzyskać listę potencjalnych dopasowań mas.
      2. Następnie należy ocenić te dopasowania mas, porównując uzyskane z ekstraktów komórkowych widma mas tandemowych z danymi dostępnymi w bazach danych metabolitów lub z widmem mas tandemowych zmierzonym dla odpowiadającego im wzorca chemicznego.
      3. Na koniec należy zweryfikować te przypisania, porównując czas migracji cech molekularnych zarejestrowanych w ekstraktach komórkowych z czasami migracji odpowiednich wzorców chemicznych analizowanych za pomocą tego samego instrumentu CE-ESI-MS.
        UWAGA: Aby zwiększyć wydajność eksperymentalną, zazwyczaj identyfikujemy jedynie cechy molekularne, które wykazują statystycznie istotne różnice między warunkami eksperymentalnymi lub typami komórek. Reprezentatywne identyfikacje przedstawiono w Rycina 2Aby zidentyfikować metabolity z wysoką dokładnością masy, zalecamy codzienną kalibrację zewnętrzną spektrometru mas, przeprowadzanie rekalibracji w czasie rzeczywistym podczas każdego pomiaru przy użyciu standardu wewnętrznego i/lub zewnętrzną kalibrację masy każdego pliku pomiarowego po akwizycji danych (np.zalecane są (w tym przypadku dla klastrów mrachlanu sodu).
    5. Aby porównać produkcję małych cząsteczek między pojedynczymi komórkami, należy wykorzystać pole powierzchni pod krzywą w wybranych elektroforeogramach jonowych (z kroku 3.4.3) jako wzglomne miary zawartości związku.
      UWAGA: W naszych eksperymentach platformy programistyczne online47 zastosowano do wykonania wszystkich etapów późniejszej analizy danych, w tym następujących kroków: i) filtrowania cech molekularnych występujących w co najmniej 50% każdego zestawu próbek (np., typ komórki); ii) normalizacja danych; iii) statystyczna (np., t-test) oraz wielowymiarową analizę danych, taką jak analiza głównych składowych (PCA) i hierarchiczna analiza skupień (HCA). Wykorzystujemy p < 0,05 (test t Studenta) t-test) w celu oznaczenia istotności statystycznej oraz krotność zmiany (fold-change) ≥ 1,5 w celu wskazania istotności biologicznej.
    6. Aby wyznaczyć bezwzględne stężenie małej cząsteczki w pojedynczej komórce, należy zastosować klasyczne metody kalibracji (np., kalibracji zewnętrznej lub metody dodatku standardu) z wykorzystaniem pola powierzchni pod krzywą piku dla analizowanego związku16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niedawno zastosowaliśmy mikroprobową analizę pojedynczych komórek metodą CE-ESI-MS w celu charakterystyki metabolitów w poszczególnych zidentyfikowanych komórkach swobodnie rozwijających się embrionów Xenopus laevis29,30. Mikroproba umożliwia szybką (~5 s/komórkę), in situ aspirację ~10 nL z pojedynczej komórki, wielokrotne aspiracje z tej samej komórki lub z kilku różnych komórek w tym samym lub późniejszych sta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikrosonda CE-ESI-MS umożliwia bezpośrednią charakterystykę metabolitów w pojedynczych komórkach żywych, swobodnie rozwijających się zarodków. U podstaw tego podejścia leżą dwa podkomponenty techniczne, a mianowicie mikropróbkowanie kapilarne in situ oraz CE-ESI-MS o wysokiej czułości. W porównaniu z rozwarstwianiem całych komórek, mikropróbkowanie kapilarne ma tę zaletę, że działa szybko (kilka sekund w porównaniu z 5 minutami/komórkę podczas sekcji), kompatybilnością ze złożoną trójwymiarową morfologią zarodkó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants GM114854 (dla P.N.) i CA211635 (dla P.N.), grant Fundacji Arnolda i Mabel Beckman dla Beckmana dla Młodego Badacza (dla P.N.), nagrodę DuPont Young Professor (dla P.N.), Nagrodę Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Spektrometrią Mas (dla P.N.) oraz stypendia Fundacji COSMOS Club (dla R.M.O. i E.P.P.). Opinie i wnioski wyrażone w niniejszej publikacji są wyłącznie opiniami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy źródeł finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli zarodków Podłoża
Chlorek potasuFisher ScientificBP 366-1
Siarczan magnezuFisher ScientificM 65-3
Azotan wapniaSigma AldrichC1396
CysteinaMP Biomedicals101444
Trizma chlorowodorekSigma AldrichT3253
Baza TrizmaSigma AldrichT1503
Chlorek soduFisher Scientific5641-212
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Metabolit Rozpuszczalniki ekstrakcyjne
Acetonitryl (klasa LC-MS)Metanol Fisher ScientificA955
(klasa LC-MS)Fisher ScientificA456
Woda (klasa LC-MS)Fisher ScientificW6
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozpuszczalniki i normy dla CE-ESI-MS
Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)Fisher ScientificA11710X1-AMP
Metanol (klasa LC-MS)Fisher ScientificA456-4
Woda (klasa LC-MS)Fisher ScientificW6
Chlorek soduFisher Scientific5641-212
Chlorek acetylocholinyAcros Organics159170050
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Konfiguracja produkcji mikrosondy
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-1000
Kapilary borokrzemianoweSutter Instrument Co.B100-50-10
Cienkie, ostre kleszcze: Dumont #5, Biologie/DumoxelFine Science Tools (USA) Inc11252-30Odporny na korozję i autoklawowalny
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Microprobe Sampling Setup
MicromanipulatorEppendorf, Hauppauge, NYTransferMan 4r
StereoskopNikonSMZ18Powinien być izolowany wibracyjnie.
Oświetlacz, np. Gęsia szyjaNikonC-FLED2
MikrowtryskiwaczWarner Instrument, Handem, CTPLI-100A
Pipety transferowe (plastikowe, jednorazowe)Fisher Scientific13-711-7M
szalka Petriego 60 mm i 80 mmFisher ScientificS08184
Szklane pipety Pasteura (borokrzemianowe, jednorazowe)Fisher Scientific13-678-20A
WirówkaThermo ScientificSorvall Legend X1R
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CE-ESI-MS Konfiguracja
Zasilacz wysokiego napięciaSpellmanCZE1000RHVPS może być sterowany zdalnie za pomocą niskonapięciowego programu generowanego przez komputer osobisty. Ostrzeżenie: Wysokie napięcie stwarza ryzyko porażenia prądem; Wszystkie części łączące muszą być uziemione lub starannie ekranowane, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu użytkowników.
Pompy strzykawkowe (2)Aparatura Harvarda704506
Mikroskop stereoskopowyAmscopeSM-3BZZMikroskop stereoskopowy o powiększeniu 4,5 raza, wyposażony w oświetlacz do monitorowania trybu natryskiwania interfejsu CE-ESI.
Etap translacji XYZThorlabsPT3
Etap translacji XYZZbudowanyna zamówienie Ta platforma jest w stanie załadować nanolitrowe ilości próbki do kapilary separacyjnej poprzez wtrysk hydrodynamiczny i dostarczyć BGE do CE. Oba interfejsy opisane w tej pracy były w stanie wstrzyknąć 6– 10 nL próbki w ciągu 1 minuty do kapilary separacyjnej o długości 1 m
Fiolki na próbki ze stali nierdzewnejWykonana
na zamówienie fiolka BGE ze stali nierdzewnejWykonana
kapilara z topionej krzemionki (40 &mikro; M/105 &MIKRO; m ID/OD; 100 cm)Technologie PolymicroTSP040105
Kapilara ze stopionej krzemionki (75 &mikro; M/360 i mikro; m ID/OD; 100 cm)Technologie PolymicroTSP075375
Emiter ze stali nierdzewnej z końcówkami (130/260 i mikro; m ID/OD)Hamilton Co.21031AAby uzyskać lepszą wydajność, rozetnij laserowo i dokładnie wypoleruj końcówkę emitera.
Strzykawki (gazoszczelne): 500 - 1000 i mikro; LHamilton Co.Multimetr cyfrowy 1750TTL
FlukeFluke 117
BrukerDaltonicsMaxis Impact HDTandemowy spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości wyposażony w interfejs atmosferyczno-ciśnieniowy skonfigurowany do ESI
Mieszanka tuningowa do kalibracji spektrometru masAgilent technologiesESI-L G1969-85000
Analiza danych wersja 4.3 oprogramowanieBruker Daltonics
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Wyposażenie pomocnicze
Koncentrator podciśnienia zdolny do pracy na 4– 10&stopni; CMikrowaga
(XSE105DU)Fisher Scientific01911005
Zamrażarka (-20 ° C)Zamrażarka Fisher Scientific97-926-1
(-80 ° C)Inkubator88300ASP
Fisher Scientific11475126
Vortex-mixerBenchmarkBS-VM-1000
.na zamówienie Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości analityczna Labconco 7310022 z chłodzeniem Fisher Scientific

Bibliografia

  1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
  2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
  3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
  4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
  6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
  8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
  10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259(2013).
  11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003(2012).
  12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
  13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012(2017).
  14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
  15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
  17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
  19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
  21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
  22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
  23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
  24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
  26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
  28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
  29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
  30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
  31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
  32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
  35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
  36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
  37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
  38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
  42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
  43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
  44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
  45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
  46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
  47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
  48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
  49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
  50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
  51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikropr bkowanie in siturozpuszczalnik do ekstrakcji metabolit winterfejs jonizacji rozpylnejtandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczo cianaliza g wnych sk adowychmetaboliczna heterogenno kom rkowa

Powiązane artykuły