Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56957

⸱

11 stycznia 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ta technika opisuje zautomatyzowany procesor obrazu wsadowego przeznaczony do pomiaru promieni kapsułki polisacharydowej i ciała. Chociaż początkowo został zaprojektowany do pomiarów kapsułek Cryptococcus neoformans, zautomatyzowany procesor obrazu może być również stosowany do innych opartych na kontraście detekcji okrągłych obiektów.

Streszczenie

Celem tej techniki jest zapewnienie spójnego, dokładnego i łatwego do opanowania procesu dla dużej liczby pomiarów kapsułek polisacharydowych.

Po pierwsze, obraz progowy jest generowany na podstawie wartości intensywności obliczanych dla każdego obrazu. Następnie okręgi są wykrywane na podstawie kontrastu między obiektem a tłem przy użyciu dobrze znanego algorytmu transformacji okręgu Hougha (CHT). Na koniec wykryte kapsułki i ciała komórek są dopasowywane zgodnie ze współrzędnymi środka i rozmiarem promienia, a dane są eksportowane do użytkownika w łatwym w zarządzaniu arkuszu kalkulacyjnym.

Zalety tej techniki są proste, ale znaczące. Po pierwsze, ponieważ obliczenia te są wykonywane przez algorytm, a nie przez człowieka, zwiększa się zarówno dokładność, jak i niezawodność. Nie ma spadku dokładności ani wiarygodności niezależnie od liczby analizowanych próbek. Po drugie, podejście to ustanawia potencjalną standardową procedurę operacyjną dla pola Cryptococcus zamiast obecnej sytuacji, w której pomiar kapsułek różni się w zależności od laboratorium. Po trzecie, biorąc pod uwagę, że ręczne pomiary kapsułek są powolne i monotonne, automatyzacja umożliwia szybkie pomiary na dużej liczbie komórek drożdży, co z kolei ułatwia analizę danych o wysokiej przepustowości i coraz bardziej zaawansowane statystyki.

Główne ograniczenia tej techniki wynikają z działania algorytmu. Po pierwsze, algorytm będzie generował tylko okręgi. Podczas gdy komórki Cryptococcus i ich kapsułki przyjmują morfologię kołową, trudno byłoby zastosować tę technikę do wykrywania obiektów niekołowych. Po drugie, ze względu na sposób, w jaki wykrywane są okręgi, algorytm CHT może wykrywać ogromne pseudo-okręgi na podstawie zewnętrznych krawędzi kilku zgrupowanych okręgów. Jednak wszelkie błędnie przedstawione ciała komórek złapane w pseudo-okręgu mogą być łatwo wykryte i usunięte z wynikowych zestawów danych.

Ta technika jest przeznaczona do pomiaru okrągłych kapsułek polisacharydowych gatunków Cryptococcus na podstawie mikroskopii jasnego pola India Ink; chociaż może być zastosowana do innych pomiarów okrągłych obiektów opartych na kontraście.

Wprowadzenie

Cryptococcus neoformans to chorobotwórcze drożdże występujące wszędzie na całym świecie, które są związane z chorobami ludzkimi, głównie w populacjach z obniżoną odpornością. C. neoformans jest w szczególności istotną przyczyną całkowitej rocznej liczby zgonów w Afryce Subsaharyjskiej z powodu chorób zakaźnych1. Głównym objawem klinicznym zakażenia kryptokokiem jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, które następuje po inwazji ośrodkowego układu nerwowego poprzez transport w zakażonych makrofagach (sposób konia trojańskiego) lub bezpośrednie przekroczenie bariery krew-mózg. C. neoformans wyraża kilka czynników wirulencji, w tym zdolność do replikacji w temperaturze ciała ludzkiego, aktywność ureazy, melanizację i tworzenie kapsułki polisacharydowej2. Kapsułka polisacharydowa składa się z powtarzających się polimerów glukuronoksylomannanu i glukoronoksylomannangalaaktu i działa jako bariera ochronna przed czynnikami takimi jak stres środowiskowy i odpowiedzi immunologiczne gospodarza2.

Chociaż rozmiar kapsułki z polisacharydem kryptokokowym nie był konsekwentnie kojarzony ze zjadliwością, istnieją dowody na to, że jest to czynnik patogenezy2,3,4,5,6,7. Rozmiar kapsułki jest związany z patologią zapalenia opon mózgowych6, może wpływać na zdolność makrofagów do kontrolowania infekcji Cryptococcus5 i może powodować utratę zjadliwości, jeśli jest nieobecny8. W związku z tym pomiary wielkości kapsuły są powszechne w badaniach kryptokokowych, ale nie ma ogólnopolowego standardu dla metody pomiaru kapsułki.

Obecnie, pomiar kapsułek polisacharydowych C. neoformans opiera się na ręcznych pomiarach obrazów mikroskopowych, a dokładne metody pozyskiwania obrazów i pomiarów różnią się w zależności od laboratorium9,10,11. Bezpośrednim problemem związanym z tą metodą jest to, że niektóre badania wymagają uzyskania tysięcy indywidualnych pomiarów, co utrudnia utrzymanie dokładności i wiarygodności. Co więcej, nawet gdy wyniki są publikowane, często brakuje odpowiedniego opisu metody pomiaru. Wiele publikacji nie wyjaśnia, w jaki sposób uzyskano ich pomiary, jaka płaszczyzna ogniskowa została użyta, w jaki sposób wyznaczono próg identyfikacji kapsuły, czy użyto promienia czy średnicy, czy użyto jednego pomiaru, czy uśredniono kilka, ani innych szczegółów. Niektóre publikacje podają tylko swoją metodę jako program, który został użyty, np. "Adobe Photoshop CS3 został użyty do pomiaru komórek"11. Ten brak standaryzacji i szczegółowości raportowania może utrudnić lub uniemożliwić odtwarzalność. Różnice w ludzkim wzroku, jasności komputera, ustawieniach mikroskopu, oświetleniu szkiełek i innych czynnikach mogą różnić się nie tylko między osobami, ale także między próbkami, podczas gdy obliczenia oparte na proporcjach wartości intensywności pikseli pozostaną stałe i będą miały zastosowanie między próbkami. Technika ta została opracowana w kontekście zapewnienia ustandaryzowanej, dokładnej, szybkiej i prostej techniki pomiaru rozmiarów kapsułek dla pola, w którym wcześniej ich nie było.

Jak wcześniej wspomniano, algorytm CHT jest już dawno sprawdzony, a skrypty do automatycznego wykrywania okręgów zostały już wcześniej napisane. Ta metoda poprawia się w dwóch obszarach, w których inne skrypty byłyby niewystarczające. Po pierwsze, samo wykrycie okręgów nie wystarczy, ponieważ w przypadku komórek kryptokokowych muszą zostać wykryte dwa odrębne okręgi względem siebie. Metoda ta w szczególności wykrywa ciała komórkowe w kapsułkach, rozróżnia je i wykonuje obliczenia tylko na odpowiednich parach ciało-kapsułka. Po drugie, nawet jeśli postępują zgodnie z tym samym protokołem, różni badacze uzyskają różne uzyskane obrazy. Umożliwiając badaczowi kontrolę nad każdym parametrem algorytmu, narzędzie to można dostosować tak, aby pasowało do szerokiego zakresu metod akwizycji. Nie ma potrzeby stosowania ustandaryzowanego zakresu, obiektywu, filtra i tak dalej.

Ta technika może być łatwo zastosowana w każdej sytuacji, w której badacz musi wykryć okręgi na obrazie, które kontrastują z ich tłem. Oba okręgi jaśniejsze i ciemniejsze niż ich tło można wykryć, policzyć i zmierzyć za pomocą tej techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie indyjskiego preparatu atramentowego

  1. Pobrać pipetę 10 μl próbki kryptokokowej na szkiełko podstawowe wody. Każdy okrągły szczep drożdży będzie działał, ale w tym eksperymencie H99 był jedynym użytym szczepem.
    UWAGA: Jeśli próbka pochodzi bezpośrednio z pożywki hodowlanej, rozcieńczenie w stosunku 1:2 PBS lub wodą może zapobiec zbrylaniu się atramentu indyjskiego.
  2. Odpipetuj 2 μl barwnika India Ink na próbkę i wymieszaj, fizycznie dociskając końcówkę pipety do próbki i poruszając ruchem okrężnym, aż atrament India Ink będzie wyglądał na równomiernie rozłożony.
  3. Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce, przytrzymując lewą krawędź szkiełka nakrywkowego przy powierzchni szkiełka, a następnie delikatnie i równomiernie opuszczając przeciwną stronę szkiełka nakrywkowego na próbkę.
  4. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
  5. Delikatnie nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci na brzeg szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć uszczelnienie i zachować plamę z atramentu indyjskiego.

2. Slajd obrazowania

  1. Umieść szkiełka w mikroskopie jasnego pola z nasadką do kamery i znaną konwersją pikseli na mikrony. Dostosuj filtry, obiektywy i kontrast tak, aby kapsułki komórkowe były czyste, a ciała komórek skupione, ciemne pasma.
    UWAGA: Różne filtry, obiektywy i ustawienia kontrastu będą działać, ale zalecany jest obiektyw 20x, filtr Ph1 i binning 2x2.
  2. Upewnij się, że pole widzenia jest gęste, ale nie przeludnione komórkami kryptokokowymi, z wyraźnym kontrastem między torebką komórkową a tłem i odpowiednio ostre, z ciałem komórki zwizualizowanym jako ciemne pasmo.
    UWAGA: Dokładna liczba komórek zapewniająca optymalny obraz będzie się różnić w zależności od użytej próbki i obiektywu. Ważne aspekty to upewnienie się, że komórki nie są zgrupowane ani nie nakładają się na siebie, że płaszczyzny ogniskowe komórek nie różnią się znacząco oraz że w tle jest wyraźnie widoczna znaczna plama atramentu indyjskiego (co najmniej 25% pola).
  3. Zapisuj obrazy w jednym katalogu z wyraźnymi tytułami, ponieważ algorytm pomiarowy zostanie uruchomiony na obrazach w jednym katalogu, a dane wyjściowe zostaną zorganizowane zgodnie z nazwami plików obrazów.

3. Konfiguracja algorytmu

  1. Zainstaluj język Python w wersji 2.7 z
  2. Zainstaluj dodatkowe biblioteki Pythona, uruchamiając polecenia "install pillow" i "install openpyxl".
  3. Zainstaluj program MATLAB, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie
  4. Skompiluj bibliotekę języka Python MATLAB, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Pobierz trzy wymagane pliki zawarte w materiałach uzupełniających tego manuskryptu ("QCA.py", "Analysis2.m" i "TestRun.m").
    Uwaga: Te pliki można rozpakować do dowolnej lokalizacji, ale wszystkie trzy muszą znajdować się w tym samym katalogu.

4. Użycie algorytmu

  1. Uruchom aplikację, klikając dwukrotnie QCA.py.
    UWAGA: Uruchomienie aplikacji może potrwać kilka minut. Plik "QCA.py" zawiera strukturę programu, która wywołuje pliki ".m" w celu uruchomienia rzeczywistego algorytmu.
  2. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w programie.
    1. Wprowadź typ rozszerzenia plików obrazów poprzedzonych kropką i oddzielonych średnikami (np. ". TIF; jpeg"), a następnie kliknij w przycisk Enter.
    2. Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki obrazów, klikając przycisk Wybierz katalog i wybierając folder zawierający obrazy.
    3. Wygeneruj listę plików graficznych w katalogu, klikając przycisk Generuj listę obrazów. Obrazy zostaną wyświetlone w polu tekstowym po prawej stronie. Przejrzyj i upewnij się, że lista jest dokładna i kompletna.
    4. Wybierz losowy obraz z listy, który ma zostać użyty jako podgląd, klikając przycisk Wybierz losowy obraz.
      UWAGA: Jeśli obrazu nie można otworzyć z powodu "błędu nieprawidłowego trybu obrazu", algorytm będzie nadal działał poprawnie, mimo że obraz nie zostanie wyświetlony. Po kroku 4.2.7 obraz testowy będzie nadal wyświetlany.
    5. Wprowadzanie ustawień obiektywu i kategoryzacji mikroskopu. Jeśli ustawienia domyślne nie pasują do używanego mikroskopu, wybierz opcję "Niestandardowa konwersja pikseli" i wprowadź konwersję pikseli na um dla plików obrazów. Po wybraniu kliknij przycisk Oblicz konwersję i upewnij się, że konwersja jest poprawna zgodnie z polem tekstowym po prawej stronie.
      UWAGA: Reprezentatywne obrazy pokazane w Rysunek 1 zostały obliczone z 40-krotnym powiększeniem i wybranym binningiem 2x2.
    6. Parametry algorytmu wejściowego do wykrywania okręgu.
      1. Wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania kapsuły zewnętrznej jako wpisy Min i Max Capsule Radius (Minimalny i Maksymalny promień kapsułki). Mniejszy zakres pozwoli na dokładniejsze wyniki.
      2. Wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania ciała komórki jako wpisy Min i Max Cell Body Radius (Minimalny i Maksymalny promień ciała komórki).
        UWAGA: Wszystkie cztery wpisy powinny być liczbami reprezentującymi odpowiednie wartości w pikselach, zgodnie z obrazami źródłowymi.
      3. Przesuń suwaki Czułość kapsułki i Czułość ciała komórki, aby dostosować próg czułości algorytmu. Niska czułość będzie ścisła i zmniejszy wykrywanie fałszywych alarmów w kręgach, ale może również wykryć mniej rzeczywistych kręgów. I odwrotnie, wysoka czułość zwiększy współczynnik wykrywalności, ale może również spowodować fałszywe alarmy.
        UWAGA: Reprezentatywne wyniki uzyskano przy minimalnym promieniu kapsułki wynoszącym 7, maksymalnym promieniu kapsułki wynoszącym 45, minimalnym promieniu ciała 4, maksymalnym promieniu ciała 30, czułości kapsułki 87 i wrażliwości ciała 87.
    7. Przetestuj parametry na losowo wybranym obrazie, klikając przycisk Uruchom test. Wyniki zostaną wyświetlone w górnej środkowej części programu, zastępując oryginalny obraz. Jeśli wyniki wyglądają na dokładne, zaleca się wybranie dodatkowego losowego obrazu, aby upewnić się, że wybrane parametry będą pasować do wszystkich wybranych obrazów.
      1. Zmaksymalizuj liczbę wykrytych ciał i kapsułek oraz sprawdź wzrokowo, czy okręgi wydają się pasować prawidłowo. Liczba wykrytych ciał w kapsułach zostanie wyświetlona w polu tekstowym po prawej stronie. W przeciwnym razie manipuluj parametrami algorytmu, aż wyniki będą dokładne.
        UWAGA: Grube kolorowe koła służą jedynie do pomocy w wizualizacji. Rzeczywiste okręgi generowane do pomiaru to krzywa matematyczna obliczona przez algorytm HCT.
    8. Uruchom algorytm wykrywania w całym katalogu plików obrazów, klikając przycisk Rozpocznij analizę. Każdy obraz zostanie przeanalizowany, a program wyświetli "gotowe" w polu tekstowym po prawej stronie, gdy wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane.
    9. Kliknij przycisk Dopasuj i oczyść. Spowoduje to dopasowanie wykrytych ciał komórek do wykrytych kapsułek, w których się znajdują, i obliczenie prawdziwego promienia kapsułki, odejmując ciało od kapsułki.
      UWAGA: Jeśli algorytm jest używany do wykrywania fluorescencji lub innej sytuacji, w której wykrywany jest tylko jeden okrąg, ten krok jest zbędny. Zamiast tego kliknij przycisk Tylko ciała ciągnące lub Tylko kapsułki ciągnące, aby zebrać dane odpowiednio tylko dla niebieskich lub tylko zielonych kółek. Ważne jest, aby pamiętać, że jeśli zostaną pobrane tylko dane z kapsułki, promień będzie odnosił się do całkowitego promienia komórki, ponieważ promienia ciała komórki nie można odjąć.
    10. Zlokalizuj uzupełnione dane w pliku "CleanedOuput.csv" w katalogu obrazu. Jeśli wybrano tylko jeden fragment danych, plik zostanie oznaczony jako "CleanedBodies.csv" lub "CleanedCapsules.csv".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy są najpierw pozyskiwane za pomocą mikroskopii preparatów z tuszem indyjskim przy użyciu mikroskopu w świetle przechodzącym sprzężonego z kamerą (Rysunek 1A). Ważne jest, aby komórki były odseparowane i występowały w dostatecznie niskiej gęstości, aby nie wypełniały nadmiernie pola widzenia, a także aby użyć odpowiedniej ilości barwnika w celu stworzenia kontrastu między komórkami a tłem. Jak określono w protokole, dokładna liczba komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowymi etapami tej techniki jest przygotowanie szkiełka atramentowego India Ink i uzyskanie obrazów mikroskopowych. Chociaż algorytm został pomyślnie przetestowany przy użyciu różnych technik slajdów i obrazów, zalecany protokół jest opisany w tym manuskrypcie. Kapsułka polisacharydowa jest wykrywana na podstawie wykluczenia cząstek atramentu indyjskiego z domeny kapsułki, ponieważ cząstki te są zbyt duże, aby przeniknąć przez sieć fibryli polisacharydowych. Wykluczenie atramentu India powoduje powstanie jasnego okrę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Anthony'emu Bowenowi, którego preparaty zostały użyte jako drugie ludzkie porównanie obok siebie, a także Sabrinie Nolan, której preparaty zostały użyte jako trzecie porównanie człowieka obok siebie i drugie porównanie mikroskopowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IndieAtrament Becton, Dickinson i spółka
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand SuperfrostFisher Scientific12-550-14325x75x1
Szkło osłonowe Fisherfinest PremiumFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Lakier do paznokciSally HansenN/A109 niewidoczny
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821szczep H99
Olympus AX70 MicroscopeOlympusAX70TRFwycofany z produkcji ; Mikroskop jasnego pola
Qimaging Retiga 1300QimagingN/A wycofany; Przystawka do mikroskopu fotograficznego
MATLABMathWorksN/AZalecana najnowsza wersja
Język programowania PythonNie dotyczywersja 2 wymagana; 2.7 zalecana
ExcelMicrosoftN/AZalecana najnowsza wersja
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP3813
261194Microsoft

Bibliografia

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar otoczki Cryptococcuszautomatyzowana analiza otoczkitransformacja Hougha dla okr g wbarwienie tuszem indyjskimdetekcja cia a kom rkianaliza polisacharydowej otoczkimikroskopia w polu jasnymprogowanie obrazudopasowanie cia a otoczkipomiar wysokoprzepustowy

Powiązane artykuły