Artykuł metodologiczny

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

16.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56960

⸱

18 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Streszczenie

Postępy w hodowli 3D tkanek jelitowych uzyskanych za pomocą biopsji lub wygenerowanych z pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez ukierunkowane różnicowanie, zaowocowały zaawansowanymi modelami in vitro błony śluzowej jelit. Wykorzystanie tych powstających systemów modelowych będzie wymagało adaptacji narzędzi i technik opracowanych dla systemów hodowli 2D i zwierząt. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez mikrowstrzyknięcie znakowanego fluorescencyjnie dekstranu i obrazowanie w mikroskopie odwróconym wyposażonym w filtry epifluorescencyjne. Pomiar przepuszczalności bariery w organoidach jelitowych w czasie rzeczywistym ułatwia generowanie danych czasowych o wysokiej rozdzielczości w tkance nabłonka jelitowego człowieka, chociaż technika ta może być również stosowana do obrazowania w ustalonym punkcie czasowym. Protokół ten można łatwo dostosować do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej po ekspozycji na czynniki farmakologiczne, produkty bakteryjne lub toksyny lub żywe mikroorganizmy. Przy niewielkich modyfikacjach protokół ten może również służyć jako ogólny wstęp do mikroiniekcji organoidów jelitowych, a użytkownicy mogą zdecydować się na uzupełnienie tego protokołu o dodatkowe lub alternatywne dalsze zastosowania po mikroiniekcji.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy tworzy selektywną barierę, która pośredniczy w kierunkowym transporcie składników odżywczych,H2O, jonów i produktów przemiany materii, jednocześnie minimalizując niespecyficzną wymianę innych cząstek za pośrednictwem dyfuzji między światłem a tkanką mezenchymalną lub dopływem krwi1,2. Niespecyficzna przepuszczalność bariery nabłonka jelitowego od dawna jest uważana za kluczowy parametr funkcjonalny zarówno w zdrowiu, jak i chorobie3,4,5,6, który odzwierciedla szybkość dyfuzji małych cząsteczek przez nabłonek przez przestrzeń parakomórkową. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej można przeprowadzić na modelach zwierzęcych7 oraz u ludzi8 poprzez spożycie laktulozy, która nie ma specyficznego transportera w przewodzie pokarmowym, a następnie pobranie i pomiar stężenia laktulozy we krwi obwodowej. Dostępne są również alternatywnie spożyte markery funkcji barierowej, takie jak fluorescencyjnie znakowane węglowodany9,10. Podejście to zostało zaadaptowane do hodowli komórek nabłonka jelitowego hodowanych na Transwell supports11, uproszczone podejście, które pozwala na większą kontrolę eksperymentalną, ale zostało również skrytykowane jako słaby predyktor przepuszczalności in vivo ze względu na brak zróżnicowanych podtypów nabłonka i struktury tkanki12. Wykorzystanie komór stanowi jeszcze inne podejście i pozwala na pomiar funkcji bariery nabłonkowej w całej błonie śluzowej jelita ex vivo13. Zastosowanie tej techniki jest często ograniczone dostępnością i stanem tkanek13,14. W związku z tym potrzebne są nowe metody, które równoważą odtwarzalność i przepustowość z znaczeniem fizjologicznym.

Ostatnie osiągnięcia w organogenezie in vitro doprowadziły do przyjęcia systemów modelowania 3D kultur tkankowych jako zaawansowanej platformy do rekapitulacji dynamiki złożonych tkanek15,16,17,18,19,20,21,22,23. W szczególności ludzkie pluripotencjalne organoidy jelitowe (HIO) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)19,24 pojawiły się jako powtarzalny i eksperymentalnie wykonalny system modelowy do badania interakcji gospodarz-mikroorganizmy i dynamiki bariery nabłonkowej25,26,27,28. Podobnie, organoidy pochodzące z tkanek ludzkich (znane również jako enteroidy) mogą pochodzić z prostej procedury biopsji i mogą być używane jako system do badania fizjologii i chorób człowieka15,29,30. Mikroiniekcja organoidów jelitowych człowieka pozwala na dostarczanie eksperymentalnych związków25 lub żywych mikroorganizmów25,31,32,33 do wierzchołkowej powierzchni nabłonka światła organoidu. Leslie i Huang i wsp.25 ostatnio zaadaptował tę technikę do pomiaru przepuszczalności bariery w mikroiniekcjach HIO z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) znakowanym dekstranem po ekspozycji na toksyny bakteryjne.

Ten protokół ma służyć jako przewodnik do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w HIO pochodzących z hPSC i HIO pochodzących z tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przy niewielkich modyfikacjach może również służyć jako ogólny podkład do mikroiniekcji HIO ze związkami eksperymentalnymi. Użytkownicy mogą uzupełnić ten protokół o dodatkowe lub alternatywne aplikacje końcowe po mikroiniekcji.

Protokół

Normalne, zanonimizowane tkanki jelita dorosłego człowieka pobrano od zmarłych dawców organów za pośrednictwem organizacji Gift of Life w Michigan. Ludzką linię komórek ES H9 (numer rejestru NIH #0062) pozyskano z WiCell Research Institute. Wszystkie ludzkie tkanki wykorzystane w tej pracy pochodziły od dawców zmarłych, zostały zanonimizowane, a badania przeprowadzono za zgodą Komisji Bioetycznej (IRB) Uniwersytetu w Michigan (protokoły nr HUM00093465 oraz HUM00105750).

1. Konfiguracja mikroinjektora

  1. Należy przygotować materiały wymienione w Tabeli materiałów.
  2. Umieścić mikromanipulator, stereomikroskop oraz źródło światła w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przed użyciem eksperymentalnym należy oczyścić zestaw do mikroiniekcji 70% etanolem lub innym środkiem dezynfekującym. Należy unikać długotrwałego narażenia na środki dezynfekcyjne zawierające wybielacz, które mogą korodować sprzęt do mikroiniekcji.
    UWAGA: Przykład kompletnego zestawu mikroinjektora przedstawiono na Rysunku 1.
  3. Ustawić stereomikroskop tak, aby okular można było wykorzystać poprzez otwór dostępowy w osłonie komory z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Alternatywnie można użyć stołu z laminarnym przepływem powietrza zamiast komory z laminarnym przepływem powietrza z punktami dostępu dla mikroskopu.
  4. Zmontować mikromanipulator po prawej stronie mikroskopu zgodnie z instrukcjami producenta i wyregulować go tak, aby elementy sterujące były łatwo dostępne i regulowane. Mikromanipulator powinien być zamontowany na płycie żeliwnej lub w inny sposób ustabilizowany.
    UWAGA: Osoby leworęczne mogą chcieć umieścić mikromanipulator po lewej stronie stereomikroskopu.
  5. Zamontować uchwyt mikropipety na ramieniu mikromanipulatora i podłączyć przewód analogowy, wkładając go do uchwytu mikropipety.
  6. Napełnić szklaną strzykawkę 10 mL około 5 - 7 mL sterylnego oleju mineralnego.
  7. Połączyć szklaną strzykawkę 10 mL wypełnioną olejem mineralnym z otwartym końcem przewodu analogowego za pomocą mechanizmu Luer lock. Umieścić szklaną strzykawkę po lewej stronie stereomikroskopu, po przeciwnej stronie niż mikromanipulator.
  8. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki, przepychając olej mineralny przez przewód. Przepłukać około 10 kropli oleju mineralnego z końcówki uchwytu mikropipety, zebrać je do szalki Petriego lub podobnego naczynia, a następnie zutylizować.
    UWAGA: Ten krok usuwa całe powietrze z przewodu i powinien być wykonywany przed każdą sesją mikroiniekcji.

2. Przygotowanie do mikroiniekcji

  1. 24 h przed mikroiniekcją:
    1. Przygotować roztwór dekstranu FITC poprzez zawieszenie dekstranu FITC w stężeniu 2 mg/mL w sterylnym PBS lub soli fizjologicznej. Przygotować objętość całkowitą >250 µL.
      UWAGA: Można stosować wyższe lub niższe stężenia dekstranu FITC, w zakresie od około 0,1 do 10 mg/mL. Dostosować stężenie dekstranu FITC do wymagań późniejszej aplikacji obrazowania.
    2. Przygotować hodowle organoidów na szkiełkach z komorami 4- lub 8-dołkowymi lub w innym naczyniu hodowlanym odpowiednim do mikroskopii żywych komórek, umieszczając do 4–6 HIO na dołek, osadzonych w 50 µL roztworu macierzy komórkowej i hodowanych w pożywce z czynnikami wzrostu EGF, Noggin i R-Spondin (ENR) 19,24. Należy zadbać o równomierne rozmieszczenie organoidów (w odstępach około 5 mm), aby uniknąć uchwycenia wielu HIO w jednym polu widzenia mikroskopu podczas analizy obrazowania w czasie rzeczywistym. Pełny przewodnik po hodowli i utrzymaniu HIO znajduje się w pracy McCraken et al.24.
      UWAGA: Protokół ten opracowano przy użyciu HIO pochodzących z komórek macierzystych, a reprezentatywne wyniki (patrz poniżej) demonstrują zastosowanie tego modelu hodowli tkankowej. Jednak ten sam protokół można łatwo zaadaptować do organoidów nabłonka jelitowego pochodzenia tkankowego15,29. HIO pochodzenia tkankowego są zazwyczaj mniejsze niż HIO pochodzące z hPSC i nie posiadają wspierającej mezenchymalnej struktury komórek bazolateralnych15,29,30. Mikroiniekcja w HIO pochodzenia tkankowego może wymagać większych umiejętności technicznych i doświadczenia. Nie wiadomo, w jakim stopniu dane dotyczące przepuszczalności bariery nabłonkowej uzyskane przy użyciu HIO pochodzenia tkankowego korelują z danymi z HIO pochodzących z hPSC.
    3. Przed mikroiniekcją inkubować HIO w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 42 °C i 5% CO2.
  2. Na 30 minut przed mikroiniekcją włączyć komorę z laminarnym przepływem powietrza i podnieść osłonę szklaną do optymalnej wysokości roboczej.
  3. Usunąć z komory wszystkie zbędne przedmioty. Nadmiar przedmiotów zwiększa ryzyko rozlania substancji lub innych wypadków podczas pracy w ograniczonej przestrzeni.
  4. Spryskać i dokładnie oczyścić powierzchnię roboczą 70% etanolem lub innym środkiem dezynfekującym. Wytrzeć do sucha papierowym ręcznikiem.
  5. Sprawdzić poziom oleju mineralnego w szklanej strzykawce przymocowanej do mikroinjektora. Jeśli pozostało mniej niż 3 mL oleju mineralnego, odkręcić strzykawkę i napełnić ją ponownie wewnątrz komory, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Nie napełniać powyżej 7 mL.
  6. Włączyć lampę oświetlającą stereomikroskop. Dostosować okulary dla własnej wygody.
  7. Ustawić mikromanipulator po prawej stronie stereomikroskopu. Przymocować mikromanipulator do stalowej płyty za pomocą podstawy magnetycznej. Przełączyć podstawę magnetyczną w pozycję OFF, aby dostosować położenie mikromanipulatora, a następnie przymocować podstawę do płyty, ustawiając pozycję ON.
  8. Instalacja mikrokapilary
    1. Wyjąć jeden szklany filament o średnicy 1 mm z pojemnika dostarczonego przez producenta.
    2. Wsunąć szklany filament przez środek miedzianej cewki grzejnej wyciągarki do mikropipet.
      UWAGA: Sposób przygotowania wyciągarki do mikropipet przedstawiono na Rysunku 2.
    3. Ustawić filament tak, aby miedziana cewka grzejna znajdowała się mniej więcej w połowie szklanego filamentu. Zapewni to wytworzenie przez wyciągarkę dwóch użytecznych igieł do mikroiniekcji z każdego filamentu.
    4. Zabezpieczyć szklany filament za pomocą zacisków, dokręcając najpierw górny zacisk i upewniając się, że filament jest osadzony w nacięciu, aby zapobiec jego pęknięciu.
    5. Wysunąć ramię wyciągarki do maksymalnej pozycji pionowej przed dokręceniem dolnego zacisku.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny. Niepełne wysunięcie ramienia wyciągarki spowoduje nierówny podział dwóch sekcji szklanego filamentu.
    6. Sprawdzić ustawienia mechanizmu grzejnego i wyciągającego. Wybrać Heat #1 za pomocą przełącznika (990) i ustawić parametr PULL na 059 (Rysunek 2).
    7. Włączyć urządzenie za pomocą przełącznika On/Off.
    8. Zamknąć ochronną osłonę z pleksiglasu i nacisnąć przycisk PULL znajdujący się na dolnej prawej ściance wyciągarki. Cewka miedziana zacznie się nagrzewać i zaświeci na jasnopomarańczowo. Wraz ze wzrostem temperatury szklany filament zacznie się rozciągać, aż w końcu pęknie. Po rozdzieleniu obu końców szklanego filamentu urządzenie wyłączy się.
      UWAGA: Cewka miedziana pozostaje ekstremalnie gorąca przez kilka minut. Wyciągnięty szklany filament będzie w dalszej części protokołu określany jako „mikrokapilara”.
    9. Uważając, aby nie dotknąć miedzianej cewki, wyjąć jedną z szklanych mikrokapilar. Mikrokapilara powinna mieć bardzo ostry koniec. Operować mikrokapilarą ostrożnie, używając rękawiczek lateksowych lub nitrylowych, i natychmiast przejść do komory z zestawem do mikroiniekcji.
      UWAGA: Szklana mikrokapilara jest niezwykle ostra i bardzo krucha. Należy z nią obchodzić się ostrożnie.
    10. Poluzować nakrętkę na końcu ramienia mikromanipulatora. Wsunąć tępy koniec wyciągniętej mikrokapilary do otwartego końca uchwytu mikropipety i pchać do wewnątrz, aż napotka opór.
    11. Zabezpieczyć tępy koniec mikrokapilary na ramieniu mikromanipulatora, ponownie dokręcając nakrętkę.
      UWAGA: Podczas montażu mikrokapilary w systemie do mikroiniekcji należy uważać, aby nie dotknąć zaostrzonego końca. Zmniejszy to ryzyko kontaminacji i zachowa ostrość końcówki niezbędną do mikroiniekcji. Nieprawidłowe zabezpieczenie mikrokapilary może prowadzić do niestabilności lub pęknięcia szklanego filamentu podczas mikroiniekcji.
    12. Otworzyć końcówkę szklanej mikrokapilary. Podczas wyciągania szklanej mikrokapilary wierzchołek może stopić się w taki sposób, że zatyka ostry koniec. Aby usunąć tę blokadę:
      1. Ustawić mikromanipulator tak, aby mikrokapilara była skierowana w dół, w stronę szklanego stolika stereomikroskopu, nie dotykając jego powierzchni.
      2. Znaleźć sterylną plastikową powierzchnię (doskonale sprawdzi się spód pokrywki płytki hodowlanej) i umieścić ją na stoliku mikroskopu bezpośrednio pod igłą mikrokapilary.
      3. Wycentrować końcówkę mikrokapilary w polu widzenia i upewnić się, że jest ona widoczna przez okular mikroskopu przy powiększeniu 1,5X.
      4. Używając sterowników mikromanipulatora, powoli przesunąć ramię i mikrokapilarę w stronę sterylnej plastikowej pokrywki, aż końcówka lekko dotknie powierzchni plastiku i zostanie udrożniona.
        UWAGA: Należy dążyć do wykonania jak najmniejszego przełamania, które umożliwi przepływ cieczy z szklanego filamentu, aby zminimalizować uszkodzenia HIO podczas mikroiniekcji.
      5. Odsunąć mikrokapilarę od sterylnej powierzchni, aby zminimalizować ryzyko przypadkowego pęknięcia przed kontynuacją.
      6. Sprawdzić drożność mikrokapilary, naciskając szklaną strzykawkę i przepychając olej mineralny przez dren. Jeśli koniec mikrokapilary został otwarty, po kilku sekundach z końcówki pojawi się mała kropla oleju mineralnego. Jeśli tak się nie stanie, powtórzyć poprzedni krok i sprawdzić ponownie.

3. Sterylna mikroiniekcja

UWAGA: Po przygotowaniu, zamontowaniu i przetestowaniu mikrokapilary należy rozpocząć mikroiniekcję HIO. Rysunek 3 przedstawia pochodzącą z tkanki HIO, do której pomyślnie wstrzyknięto FITC-dekstran.

  1. Napełnij mikrokapilarę materiałem do iniekcji. Zanurz końcówkę szklanej mikrokapilary w zawiesinie iniekcyjnej FITC dextran, uważając, aby nie złamać końcówki mikrokapilary o ścianki lub dno probówki. Po zanurzeniu końcówki mikrokapilary w roztworze, odciągnij tłok strzykawki z olejem mineralnym, aby zaciągnąć do mikrokapilary około 10 µL zawiesiny FITC dextran.
    UWAGA: Do roztworów iniekcyjnych/hodowli zaleca się stosowanie probówek o pojemności 1,5 mL lub 0,5 mL, ponieważ są one najłatwiej dostępne dla zainstalowanej mikrokapilary. Alternatywnie roztwory iniekcyjne można pobierać ze sterylnej szalki Petriego lub sterylnego parafilmu, co może zmniejszyć ryzyko zranienia narzędziami ostrymi poprzez ograniczenie konieczności trzymania probówki w bliskim sąsiedztwie mikrokapilary. Jeśli zawiesina jest bardzo lepka lub otwór mikrokapilary jest wyjątkowo mały, napełnienie mikrokapilary może zająć kilka sekund. Nie zaciągaj zawiesin do mikroiniekcji do plastikowych przewodów mikroiniekcyjnych, ponieważ może to zanieczyścić cały system mikroiniekcyjny.
  2. Przerwij napełnianie mikrokapilary, gdy zawiesina do mikroiniekcji wypełni 90% długości szklanej mikrokapilary. Przed wyjęciem mikrokapilary z roztworu do mikroiniekcji lekko naciśnij strzykawkę, aby upewnić się, że w końcówce mikrokapilary nie ma pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Jeśli podczas badania mikrokapilary zostaną stwierdzone pęcherzyki powietrza, należy ją opróżnić i napełnić ponownie.
  3. Wyjmij płytkę(i) z hodowlą HIO z inkubatora do hodowli komórek i przenieś do komory z laminarnym przepływem powietrza wraz z mikroiniektorem.
  4. Zdejmij pokrywkę z płytki z hodowlą HIO w komorze z laminarnym przepływem powietrza i ustaw pierwszy dołek na stoliku mikroskopu tak, aby był wyraźnie widoczny przez okular mikroskopu przy najniższym powiększeniu.
  5. Obróć ramię mikromanipulatora tak, aby mikrokapilara była skierowana w dół, do dołka z hodowlą HIO, pod kątem >45° względem stolika mikroskopu. Najłatwiej zrobić to, obracając ręcznie zespół ramienia mikromanipulatora na jego osi poziomej w miejscu, w którym poziome wspornik ramienia mikromanipulatora łączy się z pionowym statywem, ponieważ pokrętła precyzyjne (czarne tarcze) mają ograniczony zakres ruchu. Ustaw końcówkę mikrokapilary nad pierwszym dołkiem z hodowlą, w odległości około 1 cm nad powierzchnią medium (Rycina 3A). Reprezentatywny obraz przedstawiający mikroiniekcję organoidów nabłonka jelitowego pochodzenia tkankowego pokazano na Rycini 3B.
  6. Sprawdź, czy zarówno końcówka szklanego włókna, jak i HIO są widoczne przez okular. W razie potrzeby zmień położenie.
  7. Powoli posuwaj mikrokapilarę, obracając pokrętło regulacji osi Z zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
    UWAGA: Ocena położenia końcówki mikrokapilary, a w szczególności głębokości, wymaga wprawy. W momencie przebicia powierzchni medium zauważalne będzie lekkie zniekształcenie wizualne końcówki mikrokapilary. Od tego momentu postępuj ostrożnie, aby uniknąć złamania mikrokapilary o dno płytki hodowlanej lub uszkodzenia HIO.
  8. Przebij HIO końcówką mikrokapilary. Zewnętrzna powierzchnia HIO lekko się zapadnie, gdy mikrokapilara zacznie wywierać nacisk, a następnie powróci do pierwotnego kształtu w momencie penetracji światła przez końcówkę. Identyfikacja końcówki mikrokapilary w świetle HIO może być trudna. Jeśli mikrokapilara jest słabo widoczna, dostosuj oświetlenie lub ustawienia powiększenia mikroskopu stereoskopowego.
  9. Zdejmij ręce z elementów sterujących mikromanipulatora, gdy mikrokapilara zostanie prawidłowo ustawiona, a jej końcówka znajdzie się w pobliżu centrum HIO.
  10. Lekko naciśnij strzykawkę z olejem mineralnym, aby wypchnąć roztwór do mikroiniekcji z mikrokapilary do światła HIO. HIO może lekko zwiększyć swoją objętość, aby pomieścić wstrzykniętą dawkę.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przepełnić HIO, ponieważ może to spowodować pęknięcie organoidu. Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że każde widoczne zwiększenie objętości HIO oznacza moment przerwania iniekcji. Średnia objętość światła dojrzałego HIO wynosi około 1 µL, ale może się ona znacznie różnić. Zamiast strzykawki manualnej można zastosować automatyczne pompy strzykawkowe, aby zapewnić precyzyjną kontrolę wstrzykiwanej objętości.
  11. Wycofaj mikrokapilarę z HIO za pomocą regulacji osi Z i ustaw ją nad powierzchnią medium.
  12. Przejdź do kolejnego celu HIO z mikrokapilarą ustawioną nad medium, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia HIO podczas manewrowania, i wykonaj iniekcję w podobny sposób (patrz kroki 3.6 – 3.11).
    1. Napełnij ponownie mikrokapilarę, stosując opisaną powyżej metodę.
      UWAGA: Jeśli końcówka pęknie w dowolnym momencie podczas mikroiniekcji, nie próbuj kontynuować iniekcji. Wymień końcówkę zgodnie z poniższymi instrukcjami.
  13. Wymień mikrokapilarę pomiędzy zabiegami lub w przypadku pęknięcia. Poluzuj zacisk na końcu ramienia mikromanipulatora i wyjmij mikrokapilarę z uchwytu mikropipety.
    Ostrzeżenie: Nie dotykaj mikrokapilary w pobliżu ostrego końca. Cienka końcówka mikrokapilary jest niezwykle ostra i może łatwo przebić rękawiczki oraz skórę. Zachowaj ostrożność i kontroluj wszystkie ruchy, posługując się mikrokapilarą wyłącznie za pomocą manipulatora i nigdy nie umieszczając dłoni między końcówką mikrokapilary a hodowlami HIO. W przypadku zakłucia igłą mikrokapilary zawierającej czynniki zakaźne lub toksyny należy niezwłocznie zgłosić się po pomoc medyczną.
    UWAGA: W niektórych przypadkach wizualne potwierdzenie udanej mikroiniekcji HIO może być trudne. Widoczność przejrzystych zawiesin do mikroiniekcji można poprawić poprzez zastosowanie wyższych stężeń FITC-dextran.

4. Leczenie farmakologiczne HIO

  1. Aby przetestować związki dostarczane do nabłonka apikalnego, zawiesić je ponownie w sterylnym PBS zawierającym 2 mg/mL FITC-dextranu i wstrzyknąć mikrostrzykawką do światła HIO zgodnie z opisem powyżej (Sekcja 3). W eksperymencie reprezentatywnym toksynę TcdA Clostridium difficile zawieszono ponownie w stężeniu 12,8 ng/µL w PBS zawierającym FITC-dextran.
  2. Aby przetestować związki dostarczane do przedziału bazolateralnego, po mikroiniekcji FITC-dextranu wymienić zewnętrzne medium hodowlane na nowe medium zawierające 2 mM glikol etylenowy-bis(β-aminoetylu eteru)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA) (kontrola pozytywna), sam nośnik PBS (kontrola negatywna) lub inny badany związek.
    UWAGA: Dawkowanie i czas aplikacji związków farmakologicznych, toksyn lub innych czynników mogą się różnić w zależności od postawionego pytania badawczego.

5. Obrazowanie na żywo mikroiniekcyjnych organoidów

  1. Rozpocznij obrazowanie na żywo natychmiast po mikroiniekcji. Przenieś płytki hodowlane do mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę inkubacyjną utrzymującą temperaturę 37 °C oraz stężenia 21% O2 i 5% CO2 z automatycznym systemem obrazowania żywych komórek. Zamknij komorę środowiskową i uruchom proces obrazowania.
  2. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazów (np. softWoRx) z pulpitu. Kliknij „File” i wybierz „Acquire (Resolve 3D)”, aby zainicjować oprogramowanie do obrazowania i sterowania mikroskopem.
  3. Ustaw wzbudzenie/emisję na FITC (wzbudzenie 475 nm/emisja 523 nm), moc transmisji na 5%, a obiektyw na 4X. Ustaw czas ekspozycji na 0,025 ms (Rycina 4A).
    UWAGA: Czas ekspozycji należy dostosować do natężenia sygnału fluorescencyjnego. Zazwyczaj sygnał fluorescencji FITC będzie jedynie maleć. Dlatego, aby zapewnić maksymalną czułość, początkowe czasy ekspozycji powinny być dostosowane tak, aby zarejestrowany sygnał fluorescencyjny znajdował się tuż poniżej punktu nasycenia kamery i oprogramowania do obrazowania.
  4. Zlokalizuj HIO przy powiększeniu 4X, korzystając z cyfrowego sterownika przymocowanego do mikroskopu. Wycentruj HIO w polu widzenia (Rycina 4A).
  5. Kliknij „View” na pasku narzędzi i wybierz „Point list”, aby wyświetlić nowe okno. Kliknij „Mark point”, aby zapisać aktualną pozycję stolika na liście punktów (Rycina 4A).
  6. Powtarzaj kroki 5.4 i 5.5, aż zostaną zarejestrowane pozycje wszystkich HIO. W notatniku lub rekordzie cyfrowym zapisz unikalny numer ID przypisany do każdej zaprogramowanej pozycji mikroskopowej oraz obrazy uchwycone w tej pozycji. Pliki obrazów zostaną oznaczone tym numerem ID, co będzie istotne przy przypisywaniu numerów ID obrazów do konkretnych HIO i traktowań po zakończeniu zbierania danych.
  7. Aby skonfigurować automatyczne zbieranie obrazów, kliknij „File”, a następnie „Experiment” na pasku narzędzi. Nazwij eksperyment datą lub inną unikalną nazwą.
  8. Ustaw parametry zbierania obrazów, przechodząc przez każdą z kart opcji, jak pokazano na Rycynie 4B.
    1. Odznacz „Z Sectioning” w karcie „Sectioning”.
    2. W karcie „Channels” wprowadź parametry z górnego lewego okna „Resolve 3D”. Aby zaoszczędzić czas, pierwszy wiersz zostanie wypełniony automatycznie po zaznaczeniu pola po lewej stronie.
    3. W karcie „Time-lapse” zaznacz pole „Time lapse” i wprowadź odstęp czasu między obrazami w wierszu „Time-lapse” oraz całkowity czas trwania eksperymentu w wierszu „Total Time”. Oprogramowanie automatycznie obliczy liczbę punktów czasowych.
    4. W karcie „Points” zaznacz pole „Visit Point list”. Można również ręcznie wprowadzić konkretne numery punktów do uwzględnienia w eksperymencie, wpisując je w polu tekstowym.
    5. Nie zmieniaj domyślnych opcji w kartach „Panels” lub „Actions”.
  9. Kliknij kartę „Run”. Wprowadź datę eksperymentu w polu „image file name” i ustaw lokalizację zapisu danych w sekcji „Settings”.
  10. Kliknij zieloną strzałkę, aby uruchomić makro eksperymentalne. Licznik time-lapse będzie śledzić postęp eksperymentu.
  11. Po zakończeniu zaplanowanego przebiegu czasowego wyeksportuj i zapisz wszystkie pliki obrazów jako 24-bitowe obrazy RGB TIFF (Rycina 4C).
    1. Na pasku narzędzi wybierz „Process”, a następnie „Task builder”.
    2. W menu Task builder dodaj pliki, przechodząc do folderu z danymi określonego w punkcie 5.9. Podświetl wszystkie pliki kończące się rozszerzeniem „.dv”, wpisując „*.dv” w polu wyszukiwania. Zaznacz wszystko (Ctrl+A) i kliknij „Add”.
    3. Kliknij znak + w sekcji „Task”. Wybierz „Export as...” i kliknij kartę „Options”.
    4. Ustaw „Export Format” na „TIFF Images” i zaznacz pole poniżej, aby dodać „Custom Output Folder”. Jest to lokalizacja, do której zostaną wyeksportowane obrazy TIFF. Wybierz „24-bit RGB” w sekcji „TIFF output type” i kliknij „Done”.
    5. Kliknij „Submit to Queue”, aby uruchomić makro eksportu.
  12. Skopiuj obrazy TIFF wyeksportowane w punkcie 5.11 na zewnętrzny dysk lub serwer, jeśli analiza po obrazowaniu (Sekcja 6) będzie przeprowadzana na innym komputerze.
    UWAGA: Tkankę HIO i pożywkę można przechowywać do badań histologicznych34, PCR35, Western blot36 lub innych analiz następczych.

6. Analiza po obrazowaniu

  1. Upewnij się, że program ImageJ37 jest zainstalowany i działa poprawnie na komputerze używanym do analizy.
    UWAGA: Fiji37 jest alternatywną dystrybucją rdzenia programu ImageJ, która będzie równie skuteczna w tej analizie.
  2. Uruchom analizę wsadową, wybierając z menu ImageJ kolejno „Process”, następnie „Batch” i na koniec „Macro”.
  3. W polu Input ustaw katalog zawierający obrazy TIFF zebrane podczas eksperymentalnego przebiegu czasowego. Otwórz plik makra ImageJ „thesholdmeasure.ijm” lub bezpośrednio skopiuj/wklej kod makra do okna. Kliknij „Process”, aby rozpocząć przetwarzanie plików.
    UWAGA: Minimalną wartość progu x (setThreshold(x,255);) można ustawić na dowolną liczbę od 0 do 255; należy ją dostosować tak, aby wyeliminować fluorescencję tła. Zalecane są wartości <100. Aby empirycznie określić odpowiednią wartość progu, uruchom makro obrazowania na pojedynczym obrazie reprezentującym organoid bez sygnału fluorescencyjnego. Średnia intensywność tego obrazu może służyć jako wskazówka do odpowiedniego ustawienia progu. W przedstawionej poniżej reprezentatywnej analizie próg ustawiono na „42”.
  4. Program ImageJ wygeneruje dużą tabelę zawierającą powierzchnię wszystkich pikseli w zakresie intensywności progu oraz średnią, medianę, minimalną i maksymalną (limit) wartość intensywności dla obszaru w granicach intensywności progu. Zapisz te dane w formacie CSV lub XLS.
  5. Zmianę intensywności w czasie można obliczyć w arkuszu kalkulacyjnym39, przetwarzając tabelę danych w celu wykonania poniższego obliczenia, lub można to zautomatyzować za pomocą odpowiedniego języka programowania. Do niniejszego manuskryptu dołączono przykładowy skrypt analizy napisany w języku R 40.
    UWAGA: Dla każdego HIO względną intensywność fluorescencji można określić jako Wzór na współczynnik równowagi statycznej; FIT Ct=n/FIT Ct=0; schemat edukacyjny do badań.. Czas eliminacji 41 (t1/2) FITC-dekstranu w świetle HIO obliczono w następujący sposób:
    1. Najpierw oblicz „pole pod krzywą” (AUC) z krzywej opisującej względną intensywność fluorescencji w czasie (t) jako:
      Wzór na obliczenie AUC, równanie całkowe, analiza farmakokinetyczna, stosunek stężeń FITC.
    2. Następnie oblicz szybkość „klirensu” (Równanie potencjału chemicznego, ΔG=μCL-μCR, w termodynamice, schemat, proces energii swobodnej.) przy objętości dystrybucji (Vd) zdefiniowanej jako 1 dla znormalizowanej fluorescencji w t = 0:
      Równanie farmakokinetyczne, CL = Vd/AUC, schemat dawkowania, klirens leku, analiza objętości dystrybucji.
    3. Następnie zdefiniuj „stałą szybkości eliminacji” (Równanie stałej Coulomba: \(k_e = \frac{1}{4\pi\varepsilon_0}\); schemat wzoru fizycznego.) jako:
      Wzór farmakokinetyczny, stała szybkości eliminacji k_e, równanie k_e=CL/V_d, schemat koncepcyjny.
    4. I na koniec oblicz „czas eliminacji” (t1/2) jako:
      Równanie okresu półtrwania t1/2=ln(2)/ke, proces kinetyczny, wzór kinetyki chemicznej dla szybkości reakcji.
      Zredukowane równanie przyjmuje zatem postać:
      Równanie okresu półtrwania, ln(2)/całka(0 do ∞) zaniku FITC, wzór do analizy zaniku fluorescencji.

Wyniki

HIO zostały zróżnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i hodowane w roztworze macierzy komórkowej, zgodnie z wcześniejszymi opisami19,24. Po 4 tygodniach hodowli HIO uległy wystarczającemu powiększeniu, aby umożliwić mikroiniekcję. Do HIO wstrzyknięto za pomocą mikroiniekcji dekstran sprzężony z FITC o masie 4 kDa zawieszony w PBS lub w PBS zawierającym toksynę TcdA Clostridium difficile. C. difficile jest oportunistycznym patogenem przewodu pokarmowego, który wykazuje toksynowo indukowaną toksyczność nabłonkową w HIO25. Jako kontrolę pozytywną do pożywek hodowlanych w podgrupie HIO wstrzykniętych PBS i dekstranem-FITC dodano EGTA. EGTA jest chelatorem wapnia, który powoduje szybką depolimeryzację cytoszkieletu aktynowego42. Fluorescencję FITC monitorowano w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopu do obrazowania żywych komórek w kontrolowanej komorze środowiskowej, a obrazy rejestrowano w odstępach 10-minutowych.

Analiza post-hoc danych obrazowych wykazała istotne różnice w retencji fluorescencji FITC (Rysunek 5). HIO wstrzyknięte z PBS zachowały niemal cały sygnał fluorescencyjny obecny w czasie t = 0, natomiast HIO wstrzyknięte również z TcdA lub traktowane EGTA wykazały znaczny spadek intensywności fluorescencji do 8 godzin po mikrowstrzyknięciu (Rysunek 5A). Dane obrazowe dla wszystkich HIO we wszystkich punktach czasowych zostały poddane kwantyfikacji w celu stworzenia wysokorozdzielczego zestawu danych reprezentującego względną zmianę intensywności fluorescencji w czasie dla każdego warunku eksperymentalnego (Rysunek 5B). Różnice w przepuszczalności nabłonka oceniano poprzez obliczenie średniego czasu eliminacji (t1/2 ) FITC dla każdej grupy traktowanej (Tabela 1) i porównanie różnic w t t1/2 między grupami za pomocą testu t Studenta. HIO z grupy kontrolnej zachowały większość sygnału fluorescencyjnego FITC przez ponad 16 godzin (t1/2 = 17 ± 0.3 h). Traktowanie EGTA znacząco skróciło czas eliminacji FITC-dekstranu w stosunku do kontrolnych HIO (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h; P = 1.3 x 10-8). Zgodnie z wcześniej opublikowanymi wynikami25, mikrowstrzyknięcie TcdA znacząco zwiększyło przepuszczalność bariery nabłonkowej w stosunku do traktowania kontrolnego (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). Zatem zarówno związki podane zewnętrznie (EGTA), jak i wstrzyknięte (TcdA) są w stanie wywołać istotne zmiany w przepuszczalności bariery nabłonkowej w HIO. Wyniki te sugerują, że za pomocą tego podejścia można oceniać wpływ szerokiej gamy czynników farmakologicznych, metabolitów, produktów bakteryjnych, cytokin, czynników wzrostu i innych związków na funkcję bariery nabłonkowej.

LeczenieOkres półtrwania (h)SEM (h)Dolna granica 95% CI (h)Górna granica 95% CI (h)n
Kontrola17.110.316.4517.7811
EGTA2.580.191.783.383
TcdA7.560.635.939.186

Tabela 1: Średni czas eliminacji (t1/2) dla FITC-dekstranu w HIO traktowanych EGTA lub TcdA. Jednostki to godziny po mikroiniekcji.

Układ do mikromanipulacji z mikroskopem, mikroinjektorem i strzykawką z olejem mineralnym; badanie wstrzykiwania do komórek.
Rycina 1: Podstawowy układ mikroinjektora i mikromanipulatora do mikroiniekcji HIO.Ten obraz przedstawia pełny zestaw sprzętu wykorzystywanego do przeprowadzania mikroiniekcji w HIO. Kluczowe komponenty są opisane, a informacje o zamawianiu znajdują się w tabeli Materiały. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat zestawu wyciągacza elektrod do precyzyjnego wytwarzania mikropipet, obejmujący regulacje mechaniczne.
Rysunek 2: Wyciągacz mikropipet. Strzałkami wskazano miedzianą cewkę grzejną hc, górny zacisk c1, dolny zacisk (c2), ramię wyciągacza (pa) oraz przełącznik wyboru grzania (ht). Prawidłowe ustawienia dla HEAT 1 oraz PULL są zaznaczone czerwonym tekstem. Wstawka przedstawia prawidłowo zamocowany szklany włókno gotowe do podgrzania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Formowanie ciał embrioidalnych, transfer mikropipetą (A) i obraz mikroskopowy (B), pasek skali 100 μm.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy pochodzącego z tkanki HIO po wstrzyknięciu FITC-dekstranu. (A) Obraz demonstrujący pozycjonowanie szklanej mikrokapiilary bezpośrednio przed wprowadzeniem do HIO i mikroiniekcją. (B) Obraz w polu jasnym pochodzących z tkanki ludzkich organoidów jelitowych po mikroiniekcji FITC-dekstranu. Należy zauważyć, że sygnał fluorescencyjny jest widoczny nawet bez użycia specyficznego zestawu filtrów. Zabarwienie to ułatwia precyzję mikroiniekcji. Powiększenie 3X Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat przepływu pracy konfiguracji mikroskopowej; wzbudzenie/emisja, przechwytywanie obrazów, proces eksportu do formatu TIFF.
Rycina 4: Przepływ pracy obrazowania na żywo. (A) Zrzut ekranu ilustrujący kroki niezbędne do ustawienia parametrów mikroskopu, zlokalizowania HIO na szkiełku oraz zapisania pozycji stolika dla każdego HIO przeznaczonego do obrazowania. (B) Ustawienia przed obrazowaniem w celu przechwytywania kanału FITC w regularnych odstępach czasu w każdej z pozycji określonych w punkcie A. (C) Eksport plików danych w formacie DV po obrazowaniu do postaci obrazów TIFF, z jednym obrazem TIFF na HIO w każdym punkcie czasowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki testu przepuszczalności FITC-dekstranu; obrazy mikroskopowe i wykres intensywności w czasie; EGTA, TcdA.
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki. (A) Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) pochodzące z komórek macierzystych, do których wstrzyknięto mikrostrzykawką 2 mg/mL FITC-dekstranu (4 kDa), obrazowane przez 20 godzin. Do HIO wstrzyknięto również PBS (kontrola), toksynę TcdA z Clostridium difficile (12,8 ng/µL) lub potraktowano je 2 mM EGTA dodanym do zewnętrznej pożywki hodowlanej. Powiększenie 4X. (B) Wykres średniej znormalizowanej intensywności FITC w czasie w HIO traktowanych PBS (kontrola), TcdA lub EGTA. Słupki błędu reprezentują S.E.M. i n = 11 HIO (kontrola), 3 HIO (EGTA), 6 HIO (TcdA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten ustanawia metodę ogólnego przeznaczenia do mikroiniekcji HIO pochodzących z hPSC i organoidów jelitowych pochodzenia tkankowego oraz pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym. Zademonstrowaliśmy również nasze podejście do analizy i interpretacji danych generowanych tymi metodami. Biorąc pod uwagę rosnące zastosowanie systemów modelowych organoidów jelitowych 16,20,21,28 oraz długotrwałe zainteresowanie przepuszczalnością bariery jelitowej jako fizjologicznie istotnym wynikiem funkcjonalnym 3,4,5,6, przewidujemy, że inni pracujący w tej dziedzinie będą w stanie zastosować i rozwijać te metody.

Istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla zastosowania tej techniki. Dostęp do wysokiej jakości hPSC lub tkankowej tkanki HIO powinien być zapewniony przed szeroko zakrojonymi eksperymentami z mikroiniekcją. Makrostruktura HIO może być niejednorodna, z różnicami zarówno pod względem wielkości, jak i kształtu, chociaż tożsamość tkanki i morfologia komórkowa są wysoce powtarzalne przy użyciu ustalonej metodologii do generowania HIO24. Sferyczne HIO składające się z pojedynczego półprzezroczystego strumienia świetlnego o średnicy około 1 mm są idealne do mikroiniekcji i pomiaru fluorescencji światła w czasie rzeczywistym. W niektórych przypadkach mikroiniekcja zakończy się niepowodzeniem, co spowoduje zapadnięcie się HIO lub oczywisty wyciek wstrzykniętego materiału. Uszkodzone HIO można usunąć z hodowli według uznania użytkownika za pomocą standardowej mikropipety. Przy wyborze soczewek obiektywowych do mikroiniekcji i obrazowania należy wziąć pod uwagę soczewki obiektywowe dostępne na platformie obrazowania. Ogólnie rzecz biorąc, soczewki obiektywowe 2-4X są idealne do przechwytywania pełnego sygnału fluorescencyjnego HIO, chociaż obiektyw 10X może być używany, jeśli soczewki o małej mocy nie są dostępne lub jeśli dostępne HIO mają średnicę <1 mm. Oprogramowanie do obrazowania musi umożliwiać automatyczne rejestrowanie obrazów fluorescencyjnych w określonych punktach w czasie.

Możliwe jest kilka modyfikacji tego protokołu w celu dostosowania go do wymagań eksperymentalnych. Na przykład wyniki badań funkcji bariery mogą zależeć od wielkości cząsteczkowej stosowanych związków43 i właściwe może być badanie preparatów dekstranu o różnej masie cząsteczkowej. Ponadto obrazowanie w jasnym polu może być wykonywane jako dodatek do obrazowania fluorescencyjnego jako wskaźnik ogólnej integralności strukturalnej tkanki25. Podczas wykonywania mikroiniekcji żywych bakterii 25,28,31,32,33,44 może być konieczne dodanie penicyliny i streptomycyny lub gentamycyny do pożywki hodowlanej HIO przed lub po mikroiniekcji. Zewnętrzna strona mikrokapilary zostanie zanieczyszczona podczas napełniania zawiesiną kultur bakteryjnych, która może zostać przeniesiona do pożywki HIO. Alternatywnie, mikroiniekcję można wykonać na HIO zawieszonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Matrigel) bez pożywki, dodając pożywkę po zakończeniu mikroiniekcji. Może to ograniczyć zanieczyszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej i zewnętrznej powierzchni HIO. Planując testy wzrostu drobnoustrojów, może być konieczne usunięcie antybiotyków z pożywki po 1 - 2 godzinach, aby uniknąć spowolnienia lub zapobieżenia wzrostowi mikroiniekcji organizmów.

Wreszcie, uznając, że nie wszyscy badacze będą mieli dostęp do sprzętu mikroskopowego przystosowanego do obrazowania in vitro , należy podkreślić, że opisane w niniejszym protokole procedury zbierania danych fluorescencyjnych mogą być stosowane do obrazów wykonanych w ustalonych punktach czasowych przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej bez automatycznego przechwytywania obrazów lub kontroli środowiska. Przykłady takiego podejścia można znaleźć w raportach Leslie i Huang i wsp.25, którzy badali aktywność toksyny C. difficile w organoidach jelitowych pochodzących z hPSC, oraz Karve i Pradan i wsp.44, którzy badali przepuszczalność bariery nabłonkowej w podobnych organoidach jelitowych pochodzących z hPSC, którym mikrowstrzyknięto żywą E. coli. Ręczna obsługa sprzętu do obrazowania może powodować większą zmienność i trudności w normalizacji sygnału fluorescencyjnego. Podczas wykonywania ręcznego obrazowania HIO z wstrzyknięciem FITC-dekstranu ważne jest utrzymanie stałego powiększenia, intensywności wzbudzenia fluorescencyjnego i czasów ekspozycji przez cały czas trwania eksperymentu, aby uniknąć zniekształcenia pomiarów intensywności fluorescencji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Stephanie Spohn i Basel Abuaita za wiele użytecznych dyskusji na temat mikroiniekcji organoidów. JRS jest wspierany przez Intestinal Stem Cell Consortium (U01DK103141), wspólny projekt badawczy finansowany przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) oraz National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). JRS i VBY są wspierane przez konsorcjum NIAID Novel, Alternative Model Systems for Enteric Diseases (NAMSED) (U19AI116482). DRH jest wspierany grantem szkoleniowym w zakresie mechanizmów patogenezy drobnoustrojów z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID, T32AI007528) oraz nagrodą Clinical and Translational Science dla Michigan Institute for Clinical and Health Research (UL1TR000433).

Pełne pliki danych i kod analizy danych użyte w tym manuskrypcie są dostępne na stronie https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EGTA 0,5 M sterylne (pH 8,0)Bioworld405200081
Roztwór do pomiaru matryc komórkowych (Matrigel)Corning354230
Deltavision RT29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
CameraGE Life Sciences29065728W zestawie z oprogramowaniem
do obrazowania softWoRxGE Life Sciences29065728W zestawie z systemem Deltavision
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
1X PBSLife Technologies10010-023
Zaawansowany DMEM-F12Life Technologie12634-010Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24
B27 suplement (50X)Life Technologies17504044Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24
L-glutamine (100X)Life Technologies25030-081Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24Bufor
HEPESLife Technologies15630080Składnik pożywek ENR; patrz McCraken et al. 24
ManipulatorNarshgeUM-3C
MikromanipulatorNarshgeUM-1PF
Uchwyt na pipetyNarshgeUP-1Alternatywa dla uchwytu na pipety Xenoworks
Stojak magnetycznyLuneta prosektoryjna NarshgeGJ-1
OlympusSX61Zalecana luneta, chociaż inne modele są prawdopodobnie kompatybilne
Mikroskop fluorescencyjny Olympus IX71W zestawie z systemem Deltavision
CoolSNAP HQ2Fotometria29065728W zestawie z systemem Deltavision
Rekombinowany C. difficile Toksyna A/TcdA BiałkoR& D Systems8619-GT-020
EGFR& D Systems236-EGKomponent podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24
R-spondin 1R& D Systems4645-RSKomponent nośników ENR; patrz McCraken et al. 24
NogginR& D Systems6057-NGSkładnik mediów ENR; patrz McCraken et al. 24
Olej mineralnySigma-AldrichM8410
FITC-dekstran (4 kDa)Sigma-Aldrich46944
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-30
Prowadnice komorowe Nunc Lab-Tek IIThermoFisher Scientific154526PK
Filamenty szklaneWPITW100F-4
Uchwyt do mikropipetXenoworksBR-MH2Preferowane urządzenie
Zestaw przewodów analogowychXenoworksBR-AT
1/16 w przezroczystej tulejceXenoworksV001104
1-1,2 mm O-ringXenoworksV300450
System obrazowania żywych komórek systemu Deltavision

Bibliografia

  1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
  3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
  4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
  5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).
  6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
  7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
  8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
  9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
  10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
  11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
  12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
  13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
  14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
  15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
  18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
  19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
  21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
  22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
  24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
  25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
  27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
  28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
  29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
  30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
  32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
  33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
  34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
  35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
  40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
  41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
  42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
  43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
  44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika mikrowstrzykiwaniaFITC dekstranobrazowanie w czasie rzeczywistymludzka tkanka jelitowapomiar przepuszczalno cifluorescencyjny dekstranekspozycja na toksynyobrazowanie ywych tkanek

Powiązane artykuły