Method Article

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

DOI:

10.3791/56969

⸱

August 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka systemu CRISPR (ang. clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat) Streptococcus pyogenes umożliwiła rozwój konfigurowalnej platformy do szybkiego generowania modyfikacji genów w wielu różnych organizmach, w tym u danio pręgowanego. Edycja genomu oparta na CRISPR wykorzystuje pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA) do kierowania endonukleazy związanej z CRISPR (Cas) do celu genomowego DNA (gDNA) będącego przedmiotem zainteresowania, gdzie endonukleaza Cas generuje pęknięcie podwójnej nici (DSB). Naprawa DSB przez mechanizmy podatne na błędy prowadzi do wstawień i/lub delecji (indels). Może to powodować mutacje z przesunięciem ramki odczytu, które często wprowadzają przedwczesny kodon stop w sekwencji kodującej, tworząc w ten sposób allel zerowy białka. Inżynieria genomu oparta na CRISPR wymaga tylko kilku składników molekularnych i można ją łatwo wprowadzić do zarodków danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji. Protokół ten opisuje metody stosowane do generowania odczynników CRISPR do mikroiniekcji danio pręgowanego oraz do identyfikacji ryb wykazujących transmisję genów zmodyfikowanych CRISPR w linii zarodkowej. Metody te obejmują transkrypcję sgRNA in vitro, mikroiniekcję odczynników CRISPR, identyfikację indeli indukowanych w miejscu docelowym za pomocą metody opartej na PCR zwanej testem ruchliwości heterodupleksowej (HMA) oraz charakterystykę indeli przy użyciu zarówno niskiej przepustowości, jak i potężnego podejścia opartego na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS), które może analizować wiele produktów PCR zebranych od ryb heterozygotycznych. Protokół ten został uproszczony w celu zminimalizowania zarówno liczby wymaganych ryb, jak i rodzajów sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia analiz. Co więcej, protokół ten został zaprojektowany tak, aby mógł być używany przez pracowników laboratoriów na wszystkich poziomach doświadczenia, w tym studentów, co umożliwia ekonomiczne zastosowanie tego potężnego narzędzia przez każdą grupę badawczą zainteresowaną przeprowadzeniem modyfikacji genomu u danio pręgowanego opartej na CRISPR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie maszynerii molekularnej u eukariontów leży u podstaw możliwości wykorzystania organizmów modelowych do badań. Wiele z tych systemów modelowych ułatwia stosowanie podejść opartych na odwróconej genetyce, takich jak celowane nokauty genów, w celu scharakteryzowania wkładu produktu genetycznego w proces biologiczny lub chorobowy będący przedmiotem zainteresowania. Techniki zakłócania genów u organizmów takich jak danio pręgowany historycznie opierały się na ukierunkowanym wprowadzaniu mutacji przesunięcia ramki odczytu, które wynikają z nieprecyzyjnej naprawy DSBs1,2. Kiedy DSB jest wprowadzany do genomu, uszkodzenie DNA jest naprawiane przez jeden z dwóch szlaków, które są powszechnie obecne w prawie wszystkich typach komórek i organizmów: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR)3,4. Nieprecyzyjny charakter maszyn NHEJ często wytwarza indele o różnych długościach5,6,7,8,9. Wprowadzenie mutacji przesunięcia ramki odczytu w sekwencji kodującej gen może wytworzyć przedwczesny kodon stop, który często powoduje, że gen staje się niefunkcjonalny.

Wczesne strategie inżynierii genomu u danio pręgowanego mające na celu promowanie indeli obejmowały meganukleazy, nukleazy palców cynkowych i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, z których wszystkie wykorzystywały interakcje DNA-białko do kierowania nukleazy do określonego celu genomowego, gdzie wprowadzały DSB10,11,12,13,14,15. Jednak technologie te są często trudne do zastosowania ze względu na pracochłonną i złożoną inżynierię potrzebną do wygenerowania nukleazy, która celuje w sekwencję DNA, która jest przedmiotem zainteresowania. W przeciwieństwie do poprzednich strategii, edycja genów oparta na CRISPR nie opiera się na interakcjach białko-DNA w celu ukierunkowania. Zamiast tego endonukleaza związana z CRISPR (Cas) jest kierowana przez przewodnik RNA, który wykorzystuje interakcje parowania zasad nukleotydowych, aby celować w interesujące miejsce genomu16,17,18,19,20,21. Ze względu na prostotę projektowania przewodnika RNA z pożądanymi interakcjami parowania zasad do celowania, stosunkowo łatwo jest skierować endonukleazę Cas do pożądanego locus. W szczególności system CRISPR typu II został szeroko opracowany do zastosowań związanych z edycją genomu ze względu na kilka korzystnych cech, w tym zastosowanie pojedynczej wielodomenowej nukleazy Cas (Cas9), która wymaga interakcji z DNA w celu stymulacji aktywności endonukleazy oraz użycie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) w celu ukierunkowania go na pokrewną sekwencję DNA18. Wymagania dotyczące sekwencji niezbędne do celowania w pokrewne sgRNA są dobrze poznane19, a pożądany sgRNA można łatwo wygenerować przez transkrypcję in vitro. Prostota i solidność podejścia opartego na CRISPR/Cas9 znacznie ułatwia ukierunkowaną modyfikację genetyczną u danio pręgowanego i wielu innych organizmów.

Zwiększona zdolność do celowej edycji genomu u ryb pręgowanych w wyniku opracowania odczynników opartych na CRISPR znacznie zwiększyła możliwość badania procesów charakterystycznych dla organizmów kręgowców, takich jak rozwój ośrodkowego układu nerwowego. Genom danio pręgowanego zawiera ortologi 70% genów kodujących białka znajdujących się w ludzkim genomie, a także 84% genów związanych z chorobami u ludzi22. Rozwój danio pręgowanego wykazuje kilka kluczowych cech, które zwiększają jego zastosowanie w odwrotnych badaniach genetycznych: zarodki są składane w dużych lęgach, rozwijają się zewnętrznie od matki, co czyni je podatnymi na manipulację genetyczną przez mikroiniekcję, a dorosłe danio pręgowane osiągają dojrzałość płciową w wieku 3 miesięcy, co pozwala na szybkie rozmnażanie pożądanych linii23.

Dostępnych jest wiele protokołów, które opisują różne podejścia do generowania i identyfikacji indeli pochodzących z CRISPR u danio pręgowanego24,25,26,27,28,29,30,31. Jednak wiele z tych procedur jest czasochłonnych, wymaga dostępu do drogiego sprzętu i może stanowić wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonej wiedzy specjalistycznej. Kroki opisane w tym dokumencie zapewniają prostą, solidną i ekonomiczną strategię CRISPR/Cas9 do projektowania linii do wybijania danio pręgowanego. Protokół ten opisuje użycie wysoce wydajnego zestawu do syntezy sgRNA przy użyciu oligonukleotydów DNA (oligonukleotydów), podobnie jak w przypadku innych podejść, które zostały wcześniej opisane32. Opisany protokół obejmuje w szczególności dwa kroki, które znacznie upraszczają analizę linii zmutowanych przez CRISPR: krok po kroku użycie opartego na PCR HMA33 w celu łatwego określenia obecności modyfikacji genomu oraz analizę sekwencjonowania heterozygotycznego danio pręgowanego w celu szybkiego i łatwego określenia charakteru wielu indeli w ekonomiczny sposób. Ponadto dołączone są instrukcje krok po kroku dotyczące solidnej selekcji, niezawodnej produkcji i wstrzykiwania przewodników RNA. Przedstawione tutaj kroki są przykładem solidnego, stosunkowo niedrogiego protokołu, który umożliwia personelowi laboratoryjnemu posiadającemu szeroką wiedzę specjalistyczną przyczynienie się do identyfikacji nokautów genów u danio pręgowanego.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Purdue (numer PACUC 08-031-11).

1. Projektowanie specyficznych dla szablonów oligonukleotydów do produkcji przewodnika RNA

  1. Wybierz region docelowy, który ma zostać zmodyfikowany w regionie kodującym gen. Powinno to być blisko końca 5' genu, aby wygenerować skrócone białko, ale nie tak blisko, aby późniejszy kodon startowy w ramce umożliwiał produkcję białka o skromnym obcięciu N-końcowym.
    UWAGA: Jednym ze sposobów wykluczenia takiej możliwości jest przeskanowanie dalszego regionu kodującego genu w poszukiwaniu kodonu startowego w ramce. Ponadto użycie przewodnika RNA, który jest ukierunkowany na środek dużego eksonu, może pomóc w identyfikacji starterów PCR w celu późniejszej oceny powstałego indela.
  2. Zidentyfikuj potencjalne miejsca przewodnika w interesującym Cię regionie genomowym za pomocą programu selekcji RNA przewodnika (patrz Tabela materiałów)34,35,36. Ustaw dane przeglądarki na Danio rerio i sekwencję sąsiadującego z motywem protospacer (PAM) na 5'- NGG -3'.
    UWAGA: Idealne sekwencje gRNA zawierają 5′-G w pierwszej pozycji gRNA dla efektywnej transkrypcji T7 in vitro. Jeśli nie zostanie znaleziona akceptowalna prowadnica z G w pozycji 5′, podstawa 5′ innej prowadnicy może zostać zmieniona na G lub G może zostać dodana na końcu 5′ RNA prowadnicy, ale może to zmniejszyć wydajność cięcia37. Aby zmaksymalizować wydajność cięcia, optymalna sekwencja prowadząca ma 40-80% zawartości GC (im wyższa, tym lepiej) i zawiera G na 20. pozycji, w sąsiedztwie PAM, ale nie jest wymagana38. Przykład idealnej sekwencji celowania: 5′- G (N)18 G -3′ -NGG (NGG to PAM). Oprócz zbadania wyników programu selekcji przewodnikowego RNA w celu zidentyfikowania optymalnych przewodnikowych RNA, jak opisano powyżej, należy zachować ostrożność, aby unikać przewodnikowych RNA z przewidywanymi silnymi efektami off-target, które znacznie komplikują dalszą analizę. W szczególności należy wykluczyć przewodnikowe RNA z przewidywanymi efektami off-target, które mieszczą się w regionach kodujących, a całkowita przewidywana liczba przewidywanych miejsc poza celem powinna zostać zminimalizowana.
  3. Z danych wyjściowych narzędzia do projektowania przewodnika RNA należy wykluczyć sekwencję PAM (5′- NGG -3′); nie jest ona używana do celowania, ale zawiera sekwencję rozpoznawania dla rozszczepienia Cas9.
  4. Do pozostałych 20 nukleotydów (nt) dodać sekwencję promotora T7 i sekwencję nakładającą się (region komplementarny do oligonuligoligologii rusztowania używanego do syntezy pełnej długości sgRNA dostarczanych w zalecanym zestawie do transkrypcji in vitro) w kolejności wskazanej poniżej, aby otrzymać 54 nt oligo: sekwencja promotora T7: 5′- TTCTAATACGACTCACTATA -3′; Prowadząca sekwencja RNA 5′- G (N)18 G -3′; Sekwencja nakładania się: 5′- GTTTTAGAGCTAGA -3′
  5. Zidentyfikuj startery PCR, które otaczają przewidywane miejsce cięcia (Cas9 rozszczepia 3 nt przed sekwencją PAM) w odległości 50–150 par zasad (bp) każda od cięcia za pomocą oprogramowania internetowego (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zostaną one wykorzystane w późniejszym kroku do pomiaru wydajności cięcia. Jeśli przy użyciu tych ograniczeń nie zostaną zidentyfikowane odpowiednie startery, może być konieczne rozważenie innego przewodnika RNA.
  6. Zamów 54 nt oligonukleotydów do wytworzenia przewodnika RNA i starterów PCR do analizy miejsc docelowych (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Jako opcjonalna kontrola pozytywna, pomocne może być wyprodukowanie sgRNA ukierunkowanego na gen niezbędny do produkcji pigmentu w celu zweryfikowania działania tego protokołu przy użyciu łatwego do oceny wizualnego fenotypu (patrz Rysunek 1 dla reprezentatywnych wyników). Częstym celem jest gen tyrozynazy, wykorzystujący oligo (podkreślona jest sekwencja przewodnika RNA)39: 5′- TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA -3′

2. Przygotowanie odczynników CRISPR do mikroiniekcji zarodków

  1. Zamów dostępne w handlu białko Cas9 (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Wstrzyknięcie mRNA Cas9 może być również wykorzystane do generowania indeli w danio pręgowanym40,41, jednak wykazano, że mikroiniekcja zarodka danio pręgowanego białkiem Cas9 jest bardziej wydajna32,42.
    1. Zawiesić białko Cas9 w dostarczonym buforze, aby wytworzyć roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać roztwór w podwielokrotnościach gotowych do wstrzyknięcia w probówkach do PCR w temperaturze -80 °C, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania. Aby wytworzyć 5 μl roztworu do wstrzykiwań, stosuje się 2 μl 1 mg/ml roztworu Cas9, dlatego Cas9 można podzielić na 2 μl podwielokrotności za pomocą probówek paskowych do PCR.
  2. Zsyntetyzuj sgRNA za pomocą zestawu do transkrypcji sgRNA in vitro (patrz tabela materiałów). Wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Utrzymuj technikę wolną od RNaz podczas wszystkich etapów syntezy, oczyszczania i przygotowywania roztworu do wstrzykiwań. Na przykład używaj rękawiczek jednorazowych i często je zmieniaj, używaj probówek i końcówek, które są certyfikowane jako wolne od RNaz oraz czyść powierzchnie i pipety dostępnymi na rynku roztworami do odkażania sprzętu laboratoryjnego (patrz Tabela materiałów).
  3. Oczyść zsyntetyzowane sgRNA za pomocą wytrącania amonu/octanu przy użyciu techniki wolnej od RNazy.
    UWAGA: Alternatywnie, sgRNA można oczyścić za pomocą różnych dostępnych na rynku zestawów do czyszczenia RNA opartych na kolumnach za stosunkowo niewielką cenę.
    1. Dodać 25 μl 5 M octanu amonu i dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Roztwór octanu amonu jest dostępny w handlu (patrz Tabela materiałów) lub 5 M roztwór można przygotować we własnym zakresie, dodając 385,4 mg octanu amonu o czystości cząsteczkowej do 1 ml wody wolnej od RNaz i przechowując w temperaturze -20 °C.
    2. Do każdej próbki dodać 150 μl etanolu wolnego od nukleaz o 200 procentach. Umieścić reakcję w zamrażarce o temperaturze -80 °C na minimum 20 minut
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze -80 °C, ale nie zwiększy to znacząco całkowitej wydajności RNA.
    3. Odwirować próbki z maksymalną prędkością (>16 000 x g) w mikrowirówce o temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant, powoli odpipetowując płyn, upewniając się, że osad RNA nie został naruszony.
    5. Dodaj 1 ml 70% etanolu (powstałego przez rozcieńczenie etanolu bez nukleaz w wodzie wolnej od RNaz) i delikatnie wymieszaj probówkę, kilkakrotnie ją odwracając, aby zmyć resztki soli z probówki.
    6. Powtarzaj etap wirowania przez 7 minut.
    7. Usunąć supernatant, najpierw pipetując większość roztworu za pomocą pipety P1000, a następnie użyć pipety P200, aby usunąć jak najwięcej roztworu bez naruszania osadu. Wysuszyć granulkę RNA w czystej przestrzeni, takiej jak okap z przepływem laminarnym lub blat stołu, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą, przez 15 minut lub do momentu, gdy w probówce nie będą już widoczne krople cieczy.
    8. Zawiesić osad w 30 μl wody wolnej od RNaz, oznaczyć ilościowo produkt (na przykład za pomocą spektrofotometru) i podwielokrotnić roztwór do długotrwałego przechowywania w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Typowe stężenia wahają się od 800 do 2 500 ng/μl.
  4. (OPCJONALNIE) Sprawdź, czy pełnowymiarowy RNA został wygenerowany przy użyciu mocznika/PAGE. Alternatywnie użyj żelu agarozowego, aby sprawdzić, czy RNA jest nienaruszone.
    UWAGA: Jednak w przypadku stosowania żelu agarozowego należy uruchomić większą ilość gRNA, aby uwidocznić RNA, a długości nie można dokładnie określić. Analizując skuteczność cięcia docelowego po wstrzyknięciu odczynników do ryby, jeśli nie ma cięcia lub występuje je w niewielkim stopniu, należy sprawdzić sgRNA pod kątem degradacji.
    1. Odlewać 8% żel poliakryloamidowy w KZM z 40% poliakryloamidem (19:1) i 8 M mocznikiem przy użyciu techniki wolnej od RNAzy dla roztworów i sprzętu43.
      UWAGA: Do czyszczenia sprzętu można używać dostępnych w handlu materiałów (patrz Tabela materiałów).
    2. Po całkowitym zestaleniu się żelu (około 30 min) należy go zrównoważyć, umieszczając go w buforze do pracy TBE i wykonując elektroforezę przez 30 minut przy napięciu 5 V/cm.
    3. Wymieszać 300–500 ng sgRNA z równą objętością 2x barwnika ładującego żel RNA (patrz Tabela materiałów). Za pomocą P1000 oczyść studzienki z wszelkich zanieczyszczeń, kilkakrotnie pipetując bufor do każdej studzienki. Załaduj roztwór (roztwory) i uruchom żel pod napięciem 10 V/cm przez 2,5 godziny < / > UWAGA: Pas znacznikowy w tym miejscu jest przydatny do wizualizacji długości RNA, ale nie jest wymagany; generalnie łatwo zauważyć, czy zsyntetyzowano RNA o pełnej długości (Ryc. 2).
    4. Wizualizację pasm za pomocą barwienia kwasem nukleinowym (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: prążki sgRNA powinny pojawiać się jako pojedyncze prążki, podczas gdy rozmazywanie wskazuje na degradację RNA (Rysunek 2).

3. Mikroiniekcja składników CRISPR do zarodków danio pręgowanego

  1. Ustaw zbiorniki hodowlane na noc przed wstrzyknięciem, umieszczając liczbę pożądanych samców i samic (zazwyczaj 2 samice i 1 lub 2 samce) w zbiorniku hodowlanym z przegrodą na miejscu44.
  2. Przygotować płytkę do mikroiniekcji z 1,5% agarozą w 1x pożywce E3 (patrz tabela materiałów) z 0,01% błękitem metylenowym (fungicydem), wlewając 35 ml stopionej agarozy na 10-centymetrową szalkę Petriego i delikatnie połóż plastikową formę, aby utworzyć w roztworze koryta w kształcie klina, stukając w formę w celu wyeliminowania pęcherzyków powietrza.
  3. Pozostawić agarozę do zastygnięcia i przechowywać naczynie z niewielką ilością podłoża i zawinąć w folię parafinową, aby zapobiec wysychaniu talerza w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Płytki wtryskowe są wielokrotnego użytku przez kilka tygodni, aż dołki ulegną deformacji lub wyschną lub płyta zacznie pleśnieć.
  4. Rano w dniu wstrzyknięcia rozmrozić oczyszczone białko sgRNA i Cas9 na lodzie. Pamiętaj, aby obchodzić się ze wszystkimi materiałami w rękawicach, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą i używać końcówek i probówek wolnych od RNaz.
  5. Wygeneruj 5 μl roztworu do wstrzykiwań, łącząc białko Cas9 i sgRNA w stosunku 2:1 Cas9:sgRNA, aby uzyskać końcowe stężenia 400 pg/nL białka Cas9 i 200 pg/nL sgRNA. Inkubować roztwór Cas9/sgRNA w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić Cas9 i sgRNA utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego. Dodać 0,5 μl 2,5% wag./obj. roztworu czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów) i wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 5 μl.
    UWAGA: Wykazano, że siła jonowa roztworu wpływa na rozpuszczalność kompleksu Cas9/sgRNA, dlatego dodanie KCl może zwiększyć wydajność cięcia sgRNA, które wykazują niskie tworzenie indel28.
  6. Wykonać igłę do wstrzykiwań, pociągając szklaną kapilarnę o średnicy 1,0 mm za pomocą ściągacza do mikropipet. Odetnij końcówkę świeżo przygotowanej igły za pomocą nowej żyletki lub kleszczy, aby uzyskać kątowy otwór, który z łatwością przebije kosmówkę i woreczek żółtkowy.
  7. Umieścić igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza przy włączonym źródle powietrza. Pod mikroskopem świetlnym przy użyciu powiększenia odpowiedniego do kalibracji określonej dla danego aparatu, wyreguluj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła konsekwentnie wyrzuci roztwór o stężeniu 1 nL na szalkę Petriego wypełnioną olejem mineralnym.
    UWAGA: Jakość igły ma kluczowe znaczenie. Ćwicz wytwarzanie igły i wstrzykiwanie do woreczka żółtkowego zarodków, dopóki ta umiejętność nie zostanie opanowana przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów45.
  8. Zdejmij przegrodę i pozwól rybom rozmnażać się przez około 15 minut.
    UWAGA: Dłuższy czas rozmnażania spowoduje wyprodukowanie większej liczby zarodków, jednak wstrzyknięcie powinno zostać zakończone, gdy zarodki są na etapie 1-komórkowym, aby zmaksymalizować szansę na wczesne cięcie Cas9, a tym samym zmniejszyć mozaikowość genetyczną. Zarodki mogą być wstrzykiwane w późniejszych stadiach (2-4 stadia komórkowe), ale może to zmniejszyć szybkość transmisji w linii zarodkowej zmodyfikowanego allelu.
  9. Zbierz jajka za pomocą sitka i opłucz je na 10 cm szalce Petriego za pomocą 1x pożywki E3 z 0,0001% błękitu metylenowego. Zbadaj stan zdrowia jaj pod mikroskopem świetlnym, usuwając wszelkie niezapłodnione jaja i zanieczyszczenia.
  10. Odłóż 10-15 zarodków jako niewstrzykniętą kontrolę na oddzielnej, oznakowanej szalce Petriego.
  11. Za pomocą pipety transferowej delikatnie ułożyć jaja na płytce iniekcyjnej podgrzanej do temperatury pokojowej.
  12. Pod mikroskopem preparacyjnym przy 2,5-krotnym powiększeniu wstrzyknąć 1 nl roztworu do woreczka żółtkowego każdego zarodka, aby wstrzyknąć łącznie 400 pg białka Cas9 i 200 pg sgRNA.
    UWAGA: Aby zwiększyć cięcie, jeśli jest to pożądane lub konieczne, należy zwiększyć końcowe stężenie białka Cas9 do 800 pg/nL i sgRNA do 400 pg/nL w roztworze do wstrzykiwań; Może to jednak również zwiększyć cięcie poza celem i/lub pogorszyć zdrowie zarodków. Wydajność cięcia można również zwiększyć poprzez wstrzykiwanie bezpośrednio do komórki46. Jednak wstrzyknięcie do worka z żółtkiem jest technicznie mniej wymagające i zapewnia wystarczające cięcie, aby uzyskać ryby o wysokiej transmisji w linii zarodkowej (>70% potomstwa zawierającego zmodyfikowany allel).
  13. Umieścić wstrzyknięte zarodki z powrotem na odpowiednio oznakowanej szalce Petriego, przykryć je 1x pożywką E3 z błękitem metylenowym i umieścić w inkubatorze zarodków ustawionym na 28 °C.
  14. Po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy sprawdzić stan zdrowia wstrzykniętych zarodków, usuwając martwe lub nieprawidłowo rozwijające się osobniki i zmień pożywkę (patrz Rysunek 3). Sprawdzić wskaźnik przeżycia w porównaniu z kontrolą bez wstrzyknięcia.
    UWAGA: W przypadku celowania w nieistotny gen oczekuje się mniej niż 10% śmiertelności w stosunku do niewstrzykniętej kontroli. Jeśli w populacjach, którym wstrzyknięto wstrzyknięte przewodniki, obserwuje się podwyższony poziom śmiertelności w porównaniu z kontrolą, której nie wstrzyknięto, może to oznaczać, że docelowy gen jest niezbędny do rozwoju lub efekty niezamierzone prowadzą do nieudanego rozwoju. Konieczne może być zmniejszenie ilości wstrzykiwanych odczynników CRISPR lub może być wymagane wytworzenie nowego sgRNA o zmniejszonych efektach poza celem.
  15. Zwróć zarodki do inkubatora i kontynuuj wzrost zarodków do 72 hpf, codziennie zmieniając pożywkę, aby utrzymać zdrowie zarodka.

4. Analiza efektywności formacji indel za pomocą HMA

  1. Zebrać dwa zestawy po pięć zarodków z wstrzykniętych płytek wyhodowanych do 72 hpf do probówek do mikrowirówek i zebrać jeden zestaw pięciu zarodków z niewstrzykniętej kontroli.
  2. Znieczulić zarodki, dodając 0,004% MS-222 (trikainy) i odczekać 2 minuty.
  3. Aby wyekstrahować gDNA, delikatnie odpipetuj pożywkę z każdego zestawu zarodków i dodaj 45 μl 50 mM NaOH. Inkubować zarodki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  4. Usuń zarodki ze źródła ciepła i ostudź do temperatury pokojowej. Dodać 5 μl 1 M Tris-HCl pH = 8 i energicznie wirować próbki (5–10 s). Odwirować roztwór z maksymalną prędkością (>16 000 x g) w mikrowirówce o temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Przenieść supernatant do czystej, znakowanej probówki i przechowywać gDNA w temperaturze -20 °C DNA przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Fragmenty DNA o wielkości około 900 pz i mniejsze zostaną wygenerowane przy użyciu tego protokołu.
  5. Przygotuj reakcję PCR o objętości 50 μl, używając 2 μl przygotowanego gDNA z każdej próbki (w tym niewstrzykniętej kontroli) zgodnie z instrukcjami dołączonymi do polimerazy, używając wcześniej zaprojektowanych starterów flankujących przewidywane miejsce cięcia.
  6. Oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR (patrz tabela materiałów), eluować próbki w 30 μl wody lub buforu elucyjnego i określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru.
  7. Ponownie zakwasić wszystkie 30 μl każdego oczyszczonego produktu PCR, umieszczając probówki w pływającym stojaku we wrzącej łaźni wodnej (około 150 ml w zlewce o pojemności 500 ml). Po 3 minutach wyłącz źródło ciepła i pozwól roztworom ostygnąć do temperatury pokojowej, około 1 h.
    UWAGA: Ten krok najpierw denaturuje DNA, a następnie pozwala niciom na losowe ponowne wygrzebanie się w celu wygenerowania możliwych prążków heterodupleksowych lub niedopasowanych dwuniciowych DNA, które zawierają polimorfizmy utworzone przez mutagenezę CRISPR, a zatem mają zmienioną ruchliwość elektroforetyczną w porównaniu z homodupleksami. Ostatni cykl PCR lub program ramp-down w termocyklerze może być również wykorzystany do ponownego wyżarzania produktów47,48, ale użycie wrzącej kąpieli może dać lepszą rozdzielczość produktów heterodupleksowych.
  8. Dodać 5 μl 6-krotnego barwnika ładującego (patrz tabela materiałów) do ponownie wyżarzonych roztworów PCR.
  9. Odlewać 15% poliakrylamid/żel TBE przy użyciu 30% poliakrylamidu (29:1). Po stwardnieniu żelu należy umieścić go w aparacie do elektroforezy z buforem do pracy TBE. Za pomocą P1000 oczyść studzienki z wszelkich zanieczyszczeń, takich jak resztki soli lub fragmenty żelu, które mogą zatkać studzienki, delikatnie kilkakrotnie pipetując bufor w górę iw dół do studzienek.
  10. Załaduj 500 ng ponownie wyżarzonych produktów PCR i załaduj kontrolę (próbkę z niewstrzykniętych ryb) obok każdego zestawu próbek sgRNA. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 2,5 godziny lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dnie żelu.
  11. Wizualizację pasm za pomocą barwienia kwasem nukleinowym (np. bromkiem etydyny lub zielonym SYBR (patrz tabela materiałów)).
  12. Zbadaj wzór pasma dla każdej puli zarodków kontrolnych i wstrzykiwanych metodą CRISPR.
    UWAGA: Pojawienie się wielu pasm, które przebiegają wolniej na torach wstrzykiwanych i niewstrzykiwanych, wskazuje na powstawanie nowych produktów heterodupleksowych (Rysunek 4). Obecność nowego heterodupleksowego DNA wskazuje, że indele zostały wygenerowane przez wstrzyknięcie CRISPR. Zmniejszenie intensywności pasma homodupleksu we wstrzykniętych roztworach o około 50% lub więcej jest na ogół wystarczające, aby doprowadzić do wystarczającej transmisji w linii zarodkowej. Dodatkowo, dodatkowe prążki są czasami identyfikowane u ryb, którym nie wstrzyknięto i nie powinny być uważane za pasma heterodupleksowe, gdy obserwuje się je u wstrzykniętych ryb.
  13. Dla każdego celu należy wybrać zastrzyki o najwyższej wydajności cięcia w stosunku do niewstrzykniętej kontroli; zarodki z tych wstrzyknięć można wykorzystać do wyhodowania ryb w poszukiwaniu indeli powodujących przedwczesne kodony stop.
    UWAGA: W przypadku wysoce wydajnego cięcia (zmniejszenie pasma homodupleksu o >około 50% intensywności), badanie przesiewowe 20–30 dorosłych ryb powinno być wystarczające do uzyskania transmisji linii zarodkowej.
    W przypadku sgRNA, które generują mniej cięcia, może być potrzebna większa liczba dorosłych ryb, aby zwiększyć prawdopodobieństwo identyfikacji ryb, które wykazują transmisję linii zarodkowej zmodyfikowanych alleli zawierających przedwczesny kodon stop. Jeśli nie zaobserwuje się tworzenia indel, może być konieczne przeprojektowanie sgRNA do innego regionu genu. Jeśli nie obserwuje się tworzenia pasma heterodupleksowego, sgRNA mogło ulec degradacji, a jakość sgRNA należy zweryfikować za pomocą żelu mocznikowego/PAGE.

5. Identyfikacja i propagacja linii nokautu

  1. Aby zidentyfikować potencjalną rybę rodzicielską założyciela, wykonaj klipsy na ogonie dorosłej ryby F0 (dorosłej do około 2,5–3 miesięcy), aby zidentyfikować obecność indeli. Znieczulij rybę w 0,62 mM trikainy (patrz tabela materiałów), a następnie użyj czystej, ostrej żyletki, aby usunąć około 1/2-3/4 płetwy ogonowej.
  2. Umieścić ogon w 45 μl 50 mM NaOH i umieścić rybę z powrotem w zbiorniku regeneracyjnym. Wykonaj ekstrakcję gDNA zgodnie z opisem (kroki 4.2–4.4). Gdy ryba powróci do normalnego zachowania podczas pływania, umieść rybę z powrotem w płynącej wodzie systemowej, aż zostanie zidentyfikowana natura indel.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że poszczególne ryby są identyfikowalne i mogą być odpowiednio dopasowane do wyników klipsów ogonowych.
  3. Zgodnie z opisem (kroki 4.5–4.9) wykonaj HMA na gDNA klipsa ogonowego, aby określić, czy ryba została zmodyfikowana przez wstrzyknięcie CRISPR (Rysunek 5). Aby zidentyfikować rybę założycielkę, rozmnażaj dorosłe osobniki, które wykazują heterodupleksowe prążki od gDNA ogona do ryb typu dzikiego. Zbierz zarodki i wyhoduj je do 72 hpf.
  4. Przy 72 hpf zbierz 10 zarodków i umieść każdy zarodek w osobnej probówce. Wykonaj ekstrakcję gDNA zgodnie z powyższym opisem (kroki 4.2–4.4) przy użyciu 11,25 μl 50 mM NaOH i 1,25 μl 1 M Tris pH = 8.
  5. Powtórz PCR i elektroforezę, aby zidentyfikować prążki heterodupleksowe, jak opisano powyżej (kroki 4.7–4.13), aby ustalić, czy allele indel zostały przekazane do tego pokolenia (Figura 6).
  6. Opierając się na procentowej transmisji obserwowanej w pojedynczych zarodkach przy użyciu HMA, wyhoduj średnio 20-30 zarodków uzyskanych przez krzyżówkę dla każdej linii CRISPR, która jest interesująca dla dorosłości.
    UWAGA: Liczba ta może być zwiększona lub zmniejszona w zależności od częstotliwości transmisji w linii zarodkowej.
  7. Wykonaj klipsy na ogony dorosłej ryby F1, aby zidentyfikować obecność indeli zgodnie z opisem (kroki 5.1–5.2). Zgodnie z opisem (kroki 4.5–4.11), wykonaj HMA na gDNA klipsa ogonowego, aby określić, czy ryba jest nosicielem indel (Rysunek 7).
  8. W przypadku ryb, które zawierają prążek heterodupleksowy, należy przygotować DNA do analizy sekwencjonowania.
    1. Wykonaj PCR przy użyciu nowych starterów, aby amplifikować produkt PCR o stężeniu 300–600 pz wyśrodkowany wokół miejsca cięcia.
    2. Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić DNA i wymyj w 30 μl. Zbadaj DNA na żelu agarozowym, aby upewnić się, że występuje pojedyncze prążkowie.
      UWAGA: Na żelu agarozowym mogą występować pewne prążki heterodupleksowe i pojawiają się jako mały rozmaz lub podwójne prążki tuż nad produktem PCR w oczekiwanym rozmiarze.
  9. Jeśli analizowany jest od jednego do trzech indeli, zsekwencjonuj produkty PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera i określ sekwencję indela za pomocą narzędzia bioinformatycznego49. W przeciwnym razie bardziej ekonomiczne jest określenie sekwencji wielu produktów PCR za pomocą analizy NGS (patrz tabela materiałów).
  10. Określ, czy uzyskano przedwczesny kodon stop, analizując sekwencję za pomocą narzędzia bioinformatycznego (patrz tabela materiałów).
  11. Umieść rybę zawierającą pożądany zmutowany allel w nowym zbiorniku z odpowiednimi etykietami.
  12. Zaprojektuj startery PCR dla określonych alleli indel na potrzeby przyszłego genotypowania. Te startery powinny obejmować zmutowaną sekwencję i nie wzmacniać sekwencji typu dzikiego.
  13. Heterozygotyczny danio pręgowany w krzyżówce w celu wygenerowania segregującej populacji, która będzie zawierała 25% linii nokautujących.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne podejścia opisane w tym protokole pozwalają na wydajną, opłacalną produkcję linii do wybijania danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Poniższe rysunki zostały zamieszczone w tym artykule, aby ułatwić interpretację i rozwiązywanie problemów z wynikami uzyskanymi przy użyciu tego protokołu. Po udanej produkcji i mikrowstrzyknięciu odczynników CRISPR, zarodki danio pręgowanego mogą być analizowane pod kątem jawnych fenotypów i tworzenia indeli za pomocą HMA. Pomocną kontrolą do wizualizacji sukcesu eksperymentu CRISPR jest użycie sgRNA opisanego w kroku 1.5 do celowania w gen wytwarzający pigment tyrozynazę. Indukowane przez Cas9 tworzenie indelu przez tyrozynazę powoduje utratę pigmentacji i jest łatwe do oceny przez 48 hpf (Ryc. 1). Inną pomocną kontrolą zapewniającą, że przygotowanie odczynników CRISPR do wstrzykiwań zakończyło się sukcesem, jest sprawdzenie, czy sgRNA o pełnej długości (120 nt) zostało zsyntetyzowane przy użyciu denaturującego żelu poliakrylamidowego (Rysunek 2, tor 1 i 2). Jeśli RNA zostało zdegradowane, może pojawić się jako rozmaz, na przykład Lane 3 (Rysunek 2) pokazuje zdegradowany RNA, który nie nadaje się do wstrzyknięcia.

Aby przeanalizować częstotliwość powstawania indel genów docelowych przez CRISPR-Cas9, które nie skutkują jawnymi fenotypami, takimi jak tyrozynaza, analiza HMA jest prostą i niezawodną metodą. Zarodki z wstrzykniętymi sgRNA/Cas9 analizowane za pomocą HMA powodują powstawanie prążków heterodupleksowych i zmniejszenie intensywności pasma homodupleksu (Rysunek 4). Obecność prążków heterodupleksowych jest dalej wykorzystywana w tym protokole do identyfikacji potencjalnych ryb założycielskich z mikrowstrzykniętych zarodków i jako dorosłych (Rysunek 4 i Rysunek 5), do analizy skuteczności transmisji linii zarodkowej założyciela (Rysunek 6) oraz do sprawdzenia obecności indela u heterozygotycznej ryby F1 (Rysunek 7). Heterozygotyczne ryby, które zawierają indel, są kandydatami do NGS w celu zidentyfikowania charakteru indela i określenia, czy w regionie kodującym docelowego genu występuje przedwczesny kodon stop.

figure-results-1
Rysunek 1: Zarodki danio pręgowanego wykazują defekt pigmentu po wstrzyknięciu sgRNA ukierunkowanego na tyrozynazę w stadium jednokomórkowym. (A) Zarodek typu dzikiego, któremu wstrzyknięto zarodek w dawce 48 hpf i (B) zarodek, któremu wstrzyknięto zarodek w dawce 48 hpf. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Transkrypcja in vitro sgRNA przy użyciu zestawu do syntezy. Oligonukleotydy zsyntetyzowano przy użyciu transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami zestawu do syntezy sgRNA. 500 ng RNA przeprowadzono na żelu mocznik/PAGE zgodnie z opisem. sgRNA załadowane na pasach 1 i 2 wykazuje prążek odpowiadający pełnej długości, nienaruszonemu 120 nt RNA. sgRNA na torze 3 pokazuje zdegradowaną próbkę RNA, która nie nadaje się do wstrzyknięcia.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie stanu zdrowia 24 zarodków, którym wstrzyknięto hpf. Żywy zarodek (A) rozwinięty do 24 hpf jest łatwy do odróżnienia od zarodka, który ma przerwany rozwój (B). Zarodki, które przypominają (B) lub mają drastycznie zmienione cechy (A), takie jak skrzywienie kręgosłupa lub zmieniony rozwój głowy i oczu, powinny zostać usunięte z naczynia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Test mobilności heterodupleksowej mikrowstrzykniętych zarodków danio pręgowanego sgRNA-Cas9. Pule po 5 zarodków na próbkę pobrano w temperaturze 72 hpf i wyekstrahowano gDNA. Analizę heterodupleksową przeprowadzono zgodnie z opisem, próbki załadowano równo 500 ng DNA. Pasy ruchu: M = znacznik 100 pz; 1 = kontrola bez wtrysku; 2 = próbka do wstrzykiwań 1; 3 = próbka do wstrzykiwań 2. Oczekiwany rozmiar pasma = 98 pz.

figure-results-5
Rysunek 5: Test mobilności heterodupleksowej gDNA wyekstrahowanego z ogona dorosłego danio pręgowanego, któremu wstrzyknięto CRISPR. Zarodki, którym wstrzyknięto sgRNA i białko Cas9, dorastano do dorosłości (3 miesiące). Ryby B i C wykazują prążki heterodupleksowe, a następnie zostały wyhodowane w celu identyfikacji indeli przenoszonych przez linię zarodkową; ryba A nie została wykorzystana w późniejszej analizie, ponieważ nie wykazuje dodatniego pasma heterodupleksowego. Pasy: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = Ryba A; 3 = Ryba B; 4 = Ryba C. Oczekiwany rozmiar pasma = 98 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Test mobilności heterodupleksowej pojedynczych zarodków wygenerowany przez hodowlę wetrzykniętego przez F0 CRISPR ryba pręgowanego z rybą typu dzikiego w celu identyfikacji indeli przenoszonych przez linię zarodkową. Danio pręgowanego kryto, a zarodki F1 hodowano przez 72 godziny. Pobrano pojedyncze zarodki i przeprowadzono analizę heterodupleksową zgodnie z opisem. Pasy: 1 = kontrola typu dzikiego; 2-10 = pojedynczy zarodek F1 na pas. Ten żel pokazuje, że 7 na 10 zarodków wykazuje dodatnie prążki heterodupleksowe, co wskazuje na szybkość transmisji linii zarodkowej wynoszącą 70% indela. Oczekiwany rozmiar pasma = 98 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Test mobilności heterodupleksowej klipsów ogonowych zebry F1. Dorosłe ryby F1 zostały ocenione przez HMA w celu identyfikacji indeli. Ryby, które wykazywały dodatnie prążki heterodupleksowe, amplifikowano metodą PCR i poddano analizie szerokiego sekwencjonowania w celu określenia charakteru mutacji. (A) Pasy ruchu: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = ryba A (delecja 4 pz, niezgodność 1 pz). (B) Te ryby F1 zostały zidentyfikowane od tego samego założyciela, a mimo to wykazują różne wzorce heterodupleksowe, co wskazuje na transmisję linii zarodkowej wielu zmodyfikowanych alleli od jednego założyciela. Pasy: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = ryba B (wtrącenie 4 pz, niezgodność 7 pz), 3 = ryba C (delecja 4 pz, niezgodność 4 pz). Każdy z tych indeli utworzył przedwczesny kodon stop w sekwencji kodującej gen docelowy, zgodnie z NGS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje wytwarzanie nokautów genów w systemie modelowym kręgowców danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Wcześniej opisano szereg protokołów mających na celu przeprowadzenie inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR u danio pręgowanego 15,25,26,50,51,52. Protokół ten opiera się na wcześniejszych wysiłkach, łącząc szereg prostych, ale odtwarzalnie spójnych technik eksperymentalnych, w szczególności HMA i NGS wielu heterozygotycznych ryb, w celu stworzenia prostego, ekonomicznego i solidnego eksperymentalnie protokołu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u danio pręgowanego, który jest odpowiedni dla laboratoriów zatrudniających personel z różnymi szkoleniami i doświadczeniem, a także laboratoriów dydaktycznych.

Zalecenia dotyczące projektowania i syntezy przewodnikowych RNA są zawarte w tym protokole. Głównym czynnikiem branym pod uwagę przy projektowaniu przewodnika RNA jest minimalizacja efektów poza celem. Opracowano kilka algorytmów predykcyjnych, aby umożliwić użytkownikom CRISPR dostęp do narzędzi obliczeniowych z przyjaznymi dla użytkownika interfejsami graficznymi, które przewidują zarówno aktywność przewodnika na celu, jak i prawdopodobieństwo wystąpienia efektów niedocelowych 34,35,36. Szczególną zaletą systemu danio pręgowanego jest obniżone wskaźniki efektów niedocelowych, ponieważ Cas9 jest wstrzykiwany do zarodków, a zatem ekspresja jest przejściowa, co, jak wykazano u myszy, powoduje zmniejszenie efektów poza celem53. Niemniej jednak wykazano, że efekty niezamierzone występują u danio pręgowanego54. Jednym ze sposobów kontrolowania efektów niedocelowych jest fenotypowanie danio pręgowanego, który został wygenerowany przez dwa niezależne przewodniki RNA, które celują w ten sam gen, ponieważ te przewodniki z dużym prawdopodobieństwem wpłynęłyby na różne miejsca poza celem. Alternatywną metodą minimalizacji efektów off-target, która nie jest opisana w tym protokole, jest użycie zmutowanego Cas9, który generuje pojedyncze pęknięcia nici w docelowym DNA, które są naprawiane z wysoką wydajnością. Parowanie nacięć DNA w pobliżu siebie, które są komplementarne do przeciwległych nici, powoduje skuteczne tworzenie indel w pożądanym locus i minimalizuje efekty off-target55,56.

Oprócz różnych wskaźników efektów off-target, różne sgRNA mogą mieć różne wskaźniki mutagenezy pożądanego celu 57,58,59. Protokół ten wykorzystuje HMA do analizy skuteczności mutagenezy danego sgRNA przy użyciu tworzenia pasma heterodupleksu33,40. Pasma heterodupleksowe są tworzone przez hybrydyzację nici DNA generowanych przez PCR, które zawierają niezgodności i można je łatwo rozwiązać za pomocą elektroforezy żelowej. W przeciwieństwie do innych metod powszechnie stosowanych do pomiaru tworzenia indelu, takich jak test endonukleazy T7 lub analiza stopu w wysokiej rozdzielczości25,26, HMA nie wymaga drogiego enzymu do cięcia niedopasowanego DNA i nie wymaga skomplikowanej analizy krzywych topnienia PCR. Co ważne, wykorzystanie HMA do weryfikacji wysokiego tempa powstawania indeli w wstrzykiwanej populacji umożliwia również badaczowi zminimalizowanie liczby ryb potrzebnych do późniejszej produkcji linii knock-out, co zmniejsza koszt identyfikacji mutacji o pożądanych cechach.

Względna łatwość generowania indeli opartych na CRISPR umożliwia tworzenie wielu alleli wielu genów jednocześnie. Oprogramowanie internetowe jest dostępne do analizy pojedynczych mutacji u ryb heterozygotycznych przy użyciu sekwencjonowania Sangera produktów PCR49. W przypadku, gdy analizowane są trzy lub więcej alleli z mutacją CRISPR, NGS w celu scharakteryzowania charakteru indela będzie prawdopodobnie bardziej opłacalne w celu scharakteryzowania charakteru indelu, ponieważ takie podejście pozwala na scharakteryzowanie puli do 50 różnych alleli jednocześnie (patrz Tabela materiałów)60,61, Lokal mieszkalny 62. Taka ekonomia skali byłaby prawdopodobnie szczególnie przydatna w warunkach laboratoryjnych na studiach licencjackich.

Podsumowując, protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące powtarzalnego generowania wysokiej jakości odczynników CRISPR (w szczególności sgRNA), dzięki czemu trzeba tworzyć i analizować mniej dorosłych ryb, aby skutecznie zidentyfikować zmutowane allele będące przedmiotem zainteresowania, co również skraca czas i koszt generowania pożądanych linii. Co ważne, protokół ten został opracowany w taki sposób, aby mógł być stosowany przez laboratoria o ograniczonych zasobach do produkcji zmutowanych danio pręgowanego w przystępny sposób. Co więcej, stwierdziliśmy, że takie podejście jest odpowiednie dla studentów studiów licencjackich, a tym samym rozszerza możliwości edukacji i szkolenia studentów studiów licencjackich zainteresowanych praktycznym doświadczeniem w edycji genomu opartej na CRISPR.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez New England Biolabs.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R21CA182197 do J.O.), Ralph W. and Grace M. Showalter Research Trust, oraz przez program Purdue Agricultural Science and Extension for Economic Development (AgSEED). Dane sekwencjonowania Sangera zostały pozyskane przez placówkę Purdue Genomics Core wspieraną przez P30 CA023168. Mary Witucki była wspierana przez Purdue University Center for Cancer Research Summer Undergraduate Research Program, wspierany przez Carroll County Cancer Association. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Benjaminowi Carterowi, Ellen Denning i Taylor Sabato za krytyczne opinie na temat rękopisu. Dziękujemy Wydziałowi Biochemii za wsparcie tej pracy oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Purdue za ich poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy Purdue Genomics Core Facility oraz wkładowi Phillipa San Miguela w usługi NGS.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie doanalizy sgRNA
Breaking-Cas. https://omictools.com/breaking-cas-tool
oprogramowanie do analizy sgRNA ChopChop
Konstrukcja startera PCRPrimer 3
wolna od rnazhttp://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
Woda wolna od RNazDowolna markaSynteza przewodnikowych RNA. Zarówno Thermo Fisher, jak i Qiagen mają przy sobie odpowiednią wodę.
Etanol bez rnazyEtanol dowolnej markiklasy biologii molekularnej nie zawiera Rnazy. Fischer, VWR sprzedają odpowiedni etanol.
Białko Cas9PNA BioCP01Białko Cas9 z sygnałem lokalizacji jądrowej.
Celuj w specyficzne oligonukleotydyZintegrowane technologie DNA (IDT)Syntetyzuj przewodnikowe RNA.
Startery PCR flankujące prowadnicę RNA miejsce cięcia Zintegrowanetechnologie DNA (IDT)Służy do analizy heterodupleksowej, produkt 100-300 pz.
Startery PCR flankujące prowadnicę RNAZintegrowane technologie DNA (IDT)Służy do sekwencjonowania alleli CRISPR, zalecany produkt 300-600 pz.
Zestaw do syntezy sgRNA EnGenNew England BioLabsE3322Przewodnik transkkrybacji in vitro RNA.
10X TBEThermo FisherB52Bufor wolny od RNaz do elektroforezy kwasów nukleinowych.
6X Load DyeNew England BioLabsB7025SŁadowanie DNA do elektroferezy.
5M octan amonuThermo FisherAM9071Odczynnik czyszczący do oczyszczania prowadzących RNA.
Etanol (200 proof, bez nukleazy)Odczynnik do czyszczenia dowolnej markido oczyszczania przewodnikowych RNA. Materiały klasy molekularnej są wolne od RNaz.
Woda wolna od nukleazDowolna markaDo syntezy i oczyszczania przewodnikowych RNA.
RNase awayThermo Fisher10328011Eliminuje zanieczyszczenie RNazą z powierzchni, sprzętu, szkła.
Drabinka DNA, 100 pzNew England BioLabsN0467SWzorce masy cząsteczkowej do elektroforezy żelowej DNA.
Drabinka DNA, 1 kbNew England BioLabsN0552S Wzorcemasy cząsteczkowej do elektroforezy żelowej DNA.
RNA LadderNew England BioLabsN0364SJednoniciowy marker RNA do sprawdzenia, czy zsyntetyzowano sgRNA na całej długości
TEMEDThermo Fisher17919Casting żel poliakrylamidowy.
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678Odlewniczy żel poliakrylamidowy.
40% Poliakrylamid (19:1)BioRad161-0154Odlewniczy denaturujący żel poliakrylamidowy.
MocznikSigma-AldrichU5378-100GOdlewniczy żel poliakrylamidowy denaturujący.
Barwnik ładujący żel RNA (2x)Thermo FisherR0641Przewodnik ładowania RNA na żel denaturujący do elektroforezy.
Bromek etydynySigma-AldrichE1510-10MLWizualizacja kwasów nukleinowych.
SYBER GreenThermo FisherS7563Alternatywna metoda do bromku etydyny do wykrywania dsDNA w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych.
MikrowirówkaEppendorf5424Oczyszczanie RNA, oczyszczanie PCR.
MyTaq PolimerazaBiolineBIO-21105Do amplifikacji DNA za pomocą PCR.
TermocyklerWzmacniacz PCRdowolnej marki
Spektrofotometrdowolnej markiNanoDrop lub pokrewny produkt do ilościowego określania ilości DNA / RNA.
Pożywka dla zarodków E3Wykonana w domuPożywka do hodowli zarodków i wytwarzania płytki injeciton. Przepis: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene BlueSigma-AldrichM9140Dodawany do 1x pożywki E3, aby zapobiec rozwojowi grzybów na zarodkach.
szalka PetriegoThermo FisherFB0875711ZPrzechowuj zarodki, odlewana płytka iniekcyjna.
AgarozaDenvilleCA3510-8Odlewnicza płytka wtryskowa, żele agarozowe.
Forma mikroinekcyjnaAdaptacyjne narzędzia naukoweTU-1Do tworzenia studzienek do przetrzymywania zarodków podczas wstrzykiwania.
Czerwień fenolowaSigma-AldrichP0290 Barwnik do wizualizacji iniekcji.
Olej mineralnySigma-AldrichM5904-5MLDo kalibracji objętości iniekcji igły.
Pipety transferoweDowolna markaPrzenoszenie zarodków.
ŻyletkaThermo Fisher11295-10Igła do iniekcji tnącej, obcinanie ogona dorosłej ryby.
InkubatorDowolna markaUtrzymywanie zarodków w temperaturze 28,5 oC.
Ściągacz do pipet pionowychDavid Kopf Instruments700CIgły Geneate do wstrzykiwań. Dodatkowe instrukcje dotyczące wyciągania igły: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Rurki kapilarneSutter InstrumentsBF100-58-10Igły Geneate do wstrzykiwań.
Końcówki do mikroładowarkiEppendorf930001007Roztwór należy załadować do igieł iniekcyjnych.
MikrowstrzykiwaczWorld Precision InstrumentsPV 820Wstrzykiwanie zarodków.
Mikroskop preparacyjnyLeicaWstrzykiwanie zarodków.
30% Poliacyloamid (29:1)BioRad161-0156Odlew żelowy Heteroduplex.
MS-222 (Tricaine)Sigma-AldrichA-5040Znieczulenie danio pręgowanego do obcinania ogonów i ekstrakcji gDNA z zarodków. Przepis: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Kuchenka mikrofalowaDowolna markaOdlewana płytka wtryskowa, żele agarozowe.
SkalaDowolna markaOdlewana płyta wtryskowa, żele agarozowe.
RękawiceDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
N2Dowolna markaDo usuwania płynu z naczynia włosowatego w celu wstrzyknięcia zarodka.
1 000 i mikro; L  wskazówkiDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
200 i mikro; L napiwkiDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
10 &mikro; L napiwkiDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
Probówki paskowe do PCRDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
MikropipetyDowolna markaDla wszystkich aspektów protokołu.
Platforma sekwencjonowania NGS: WideseqJeśli Twoja instytucja nie oferuje tej usługi, odwiedź: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (koszt zewnętrzny: 35 USD).
Oprogramowanie do analizyDo sekwencjonowania Sangera ryb heterozygotycznych. Odwiedź: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Oprogramowanie do analizySnapGene Viewer, Sequence Scanner do analizy sekwencjonowania NGS.
CRISPOR. Oprogramowanie do analizy sgRNA http://crispor.tefor.net/. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/Technika . sekwencji sekwencji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
  3. Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
  4. Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
  6. Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061(2013).
  7. Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process? PLoS Genet. 10 (1), e1004086(2014).
  8. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  10. Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
  11. Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
  12. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
  13. Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
  14. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141(2013).
  15. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
  18. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  19. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  20. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  21. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  22. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  23. Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
  24. Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547(2016).
  25. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  26. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  27. Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
  28. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  29. Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
  30. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555(2016).
  31. Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
  32. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186(2014).
  33. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  34. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  35. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148(2016).
  36. Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
  37. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  38. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  39. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  40. Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
  41. Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
  42. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319(2015).
  43. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
  44. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  45. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  46. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
  47. Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
  48. Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
  49. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  50. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  51. Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
  52. Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
  53. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479(2015).
  54. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  55. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  56. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  57. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  58. Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  59. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
  60. Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002(2014).
  61. Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
  62. Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Gene KnockoutZebrafish ModelMicroinjection TechniqueHeteroduplex Mobility AssayIn Vitro TranscriptionsgRNA SynthesisCas9 ProteinGermline TransmissionNext Generation Sequencing

Related Articles