Artykuł metodologiczny

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

DOI:

10.3791/56973

⸱

8 maja 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość badania genezy hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) podczas rozwoju embrionalnego została ograniczona przez rzadkość prekursorów HSC we wczesnym stadium zarodka i brak testów, które funkcjonalnie identyfikują długoterminowy potencjał wszczepienia wieloliniowego poszczególnych domniemanych prekursorów HSC. W tym miejscu opisujemy metodologię, która umożliwia izolację i charakterystykę funkcjonalnie zwalidowanych prekursorów HSC na poziomie pojedynczej komórki. Po pierwsze, wykorzystujemy sortowanie indeksowe do skatalogowania dokładnego parametru fenotypowego każdej indywidualnie posortowanej komórki, wykorzystując kombinację markerów fenotypowych w celu wzbogacenia prekursorów HSC o dodatkowe markery do analizy eksperymentalnej. Po drugie, każda komórka posortowana indeksem jest hodowana wspólnie ze zrębem niszy naczyniowej z regionu aorta-gonad-mesonephros (AGM), co wspiera dojrzewanie niewszczepialnych prekursorów HSC do funkcjonalnego HSC z wieloliniowym, długoterminowym potencjałem wszczepienia w testach transplantacyjnych. Metodologia ta umożliwia korelację właściwości fenotypowych klonalnych prekursorów hemogennych z ich funkcjonalnym potencjałem wszczepienia lub innymi właściwościami, takimi jak profil transkrypcyjny, zapewniając środki do szczegółowej analizy rozwoju prekursorów HSC na poziomie pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania klonalne wykazały niejednorodność długoterminowych właściwości wszczepiania dorosłych HSC, dostarczając nowych informacji na temat podtypów HSC i zmian w zachowaniu HSC podczas starzenia1. Jednak podobne badania nad embrionalnymi HSC i ich prekursorami były bardziej wymagające. Podczas wczesnego rozwoju embrionalnego HSC powstają z populacji prekursorów znanych jako śródbłonek hemogenny w przejściowym procesie zwanym przejściem śródbłonka do układu krwiotwórczego2. Pierwszy HSC, zdefiniowany przez ich zdolność do zapewnienia solidnego, długoterminowego wszczepienia wieloliniowego po przeszczepieniu do uwarunkowanych dorosłych biorców, nie jest wykrywany aż do 10,5 dnia embrionalnego (E10,5) w zarodku mysim, z bardzo niską częstotliwością3. W trakcie swojego rozwoju prekursory HSC (pre-HSC) powstające z hemogennego śródbłonka muszą przejść proces dojrzewania przed uzyskaniem właściwości dorosłego HSC, które pozwalają na skuteczne wszczepienie w testach transplantacyjnych4,5,6. Przesłaniając badania nad rzadkim pochodzeniem HSC, wiele krwiotwórczych komórek progenitorowych o potencjale erytroidalnym, szpikowym i limfoidalnym zostało wykrytych jeszcze przed pojawieniem się HSC z klasy pre-HSC7,8. W związku z tym odróżnienie pre-HSC od innych hematopoetycznych komórek progenitorowych wymaga metod klonalnej izolacji komórek i dostarczenia im sygnałów wystarczających do ich dojrzewania do HSC, aby wykryć ich właściwości wszczepienia w testach transplantacyjnych.

Opisano wiele podejść, które pozwalają na wykrycie pre-HSC poprzez dojrzewanie do HSC ex vivo lub in vivo. Metody ex vivo zależały od hodowli tkanek embrionalnych, takich jak region AGM, w którym pierwsze HSC są wykrywane w develop9. Opierając się na tych metodach, protokoły, które obejmują dysocjację, sortowanie i ponowną agregację tkanek AGM, pozwoliły na scharakteryzowanie posortowanych populacji zawierających prekursory HSC podczas rozwoju od E9.5 do E11.5 w regionach przyaaortalnej splanchnopleury (P-Sp)/AGM4,5,10; Jednak podejścia te nie są podatne na wysokoprzepustową analizę prekursorów na poziomie pojedynczej komórki wymaganą do analizy klonalnej. Podobnie, dojrzewanie in vivo przez przeszczepienie nowonarodzonym myszom, gdzie zakłada się, że mikrośrodowisko jest bardziej odpowiednie do wspierania wcześniejszych stadiów prekursorów HSC, umożliwiło również badania posortowanych populacji z woreczka żółtkowego i AGM/P-Sp (P-Sp jest regionem prekursorowym AGM) z cechami pre-HSC, ale metody te również nie zapewniają solidnej platformy do analizy pojedynczych komórek11, 12.

Badania przeprowadzone przez Rafii et al. wykazały, że zrąb komórek śródbłonka (EC) aktywowany Aktem może stanowić niszowy substrat do wspierania samoodnawiania się dorosłych HSC in vitro13,14,15. Niedawno ustaliliśmy, że EC aktywowany Aktem pochodzący z regionu AGM (AGM-EC) zapewnia odpowiednią niszę in vitro do dojrzewania prekursorów hemogennych, wyizolowanych już w fazie rozwoju E9, do wszczepienia HSC w wieku dorosłym, a także późniejszej samoodnowy wygenerowanej klasy HSC16. Biorąc pod uwagę, że system ten wykorzystuje prostą dwuwymiarową kokulturę, można go łatwo przystosować do analizy klonalnej potencjału HSC indywidualnie izolowanych prekursorów hemogennych.

Niedawno opisaliśmy podejście do badania potencjału HSC klonalnych prekursorów hemogenicznych poprzez połączenie sortowania indeksowego poszczególnych prekursorów hemogennych z mysich zarodków z kokulturą AGM-EC i późniejszą analizę funkcjonalną w testach transplantacyjnych17. Sortowanie indeksowe to tryb sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), który rejestruje (indeksuje) wszystkie parametry fenotypowe (tj. rozproszenie do przodu (FSC-A), rozproszenie boczne (SSC-A), parametry fluorescencji) każdej indywidualnie posortowanej komórki, tak aby cechy te można retrospektywnie skorelować z późniejszą analizą funkcjonalną po sortowaniu. Oprogramowanie FACS rejestruje zarówno informacje fenotypowe dla każdej komórki, jak i pozycję/dołek 96-dołkowej płytki, w której została umieszczona. Technika ta była wcześniej elegancko stosowana do identyfikacji heterogeniczności w dorosłym HSC, określania parametrów fenotypowych, które dodatkowo wzbogacają długoterminowy podzbiór HSC do wszczepiania, oraz korelowania parametrów fenotypowych HSC z właściwościami transkrypcyjnymi na poziomie pojedynczej komórki18,19. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię tego podejścia, która umożliwia identyfikację unikalnych parametrów fenotypowych i wkładu liniowego pre-HSC we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Badań nad Rakiem im. Freda Hutchinsona.

1. Przygotowanie monowarstw AGM-EC do kokultury

  1. Na 24 godziny przed rozbiorem i sortowaniem AGM, należy wysterylizować pożywkę hodowlaną AGM-EC i filtr.
  2. Dodać 0,1% żelatyny w wodzie (100 μl/basenik) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odessać żelatynę i pozostawić płytkę w kapturze do hodowli tkankowych ze zdjętą pokrywką, aż studzienki wyschną.
  3. Oddziel monowarstwy i płytkę AGM-EC na płytki 96-dołkowe.
    UWAGA: Utrzymuj AGM-EC, przygotowany zgodnie z wcześniejszym opisem16, w pożywce hodowlanej AGM-EC. W celu zachowania spójności, linie komórkowe AGM-EC powinny zostać zamrożone, gdy tylko uzyska się wystarczającą liczbę (zwykle pasaż 1-3) i wykorzystany przy określonym numerze pasażu (zwykle pasaż 5-12) do eksperymentów z kokulturą. Linie komórkowe AGM-EC wywodzą się z C57BL/6J (CD45.2) AGM. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się ze wszystkimi kompozycjami mediów.
    1. Odessać pożywkę z kultury AGM-EC do kolby o średnicy 75cm2 i dodać 5 ml PBS. Odessać PBS i dodać 3 ml roztworu trypsyny (patrz Tabela Materiałów).
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-4 minuty, aż większość komórek oderwie się od płytki. Dodać 7 ml pożywki hodowlanej AGM-EC i pipetować 8-10 razy pipetą o pojemności 10 ml w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 10 ml pożywki hodowlanej AGM-EC i oszacować liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej AGM-EC.
  4. Dodać 100 μl zawiesiny komórek AGM-EC (1 x 104 komórek) do każdego dołka żelatynizowanej 96-dołkowej płytki. Umieścić na noc w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić AGM-EC przyczepienie się i utworzenie zlewającej się monowarstwy.
    UWAGA: Równomiernie rozprowadź komórki zrębu AGM-EC, aby zminimalizować przerost lub zlepianie się komórek, aby uzyskać optymalną kohodowlę.
  5. Przygotować monowarstwę AGM-EC do kohodowli AGM.
    1. Następnego ranka przygotuj pożywkę bez surowicy AGM.
    2. Za pomocą 12-dołkowej pipety wielokanałowej wyjmij pożywkę hodowlaną AGM-EC z pożywki AGM-EC i dodaj 200 μl/studzienkę pożywki bez surowicy AGM bez cytokin, aby wypłukać wszelkie resztki pożywki zawierającej surowicę.
    3. Usunąć pożywkę i dodać 200 μl/studzienkę pożywki bez surowicy AGM z cytokinami. Pracuj szybko podczas wyjmowania i dodawania pożywki, aby warstwa śródbłonka nie została naruszona; Na przykład usuń i ponownie dodaj multimedia po jednym wierszu na raz. Umieścić 96-dołkowe płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C do momentu, gdy komórki zarodkowe będą gotowe do sortowania.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z tkanek embrionalnych myszy

  1. Odetnij AGM od dopasowań czasowych.
    1. Ustaw krycia czasowe w celu wygenerowania tkanek embrionalnych w pożądanym wieku.
    2. Pobieraj zarodki od ciężarnych samic po 9,5 do 11,5 dniu po stosunku (dpc), w zależności od stadium analizy pre-HSC.
      UWAGA: Tkanki embrionalne są pobierane od myszy C57BL/6J (CD45.2) zgodnie z wcześniejszym opisem i precyzyjnie klasyfikowane na podstawie liczby somitów16. Skupiliśmy się na analizie populacji z embrionalnego regionu AGM i jego prekursora, P-Sp, między E9,5 a E11,5, w oparciu o stopień zaawansowania somitów.
    3. Wypreparuj AGM z zarodków20.
      UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące preparacji AGM z mysich zarodków zostały opublikowane przez others20. Alternatywnie, woreczek żółtkowy lub inne tkanki, co do których istnieje podejrzenie, że mają aktywność przed HSC, mogą być również analizowane za pomocą tej metody.
  2. Oddziel wypreparowane tkanki embrionalne.
    1. Zbierz wypreparowane tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS z 10% FBS na lodzie. Grawitacyjnie osadzić tkanki, odessać PBS/FBS, a następnie natychmiast dodać 1 ml 0,25% kolagenazy i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 25 minut.
    2. Dodać 1 ml PBS/10% FBS i pipetować około 20-30 razy końcówką do pipety o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Dodaj dodatkowe 8 ml PBS/10% FBS i odwiruj komórki o sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.

3. Barwienie przeciwciał w mysich komórkach embrionalnych

  1. Przygotować bufor blokujący do barwienia przeciwciałami.
    1. Dodaj 10 μg/ml anty-mysi CD16/CD32 (blok receptora Fc (FcR)) i 1 μg/ml DAPI (1 mg/ml zapasu w H2O) do 1 ml PBS z 10% FBS.
    2. Pobrać do strzykawki o pojemności 3 ml i przepuścić przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. Ponownie zawiesić osad komórkowy ze zdysocjowanych mysich tkanek embrionalnych (z kroku 2.2.2) w buforze blokującym o pojemności 500 μl i inkubować na lodzie przez 5 minut.
  2. Przygotuj przeciwciała mix17.
    1. Dodać 10 μg/ml bloku FcR do 1 ml PBS z 10% FBS i 10 μl każdego przeciwciała anty-VE-Kadheryny sprzężonego z fluorochromem (CD144, patrz tabela materiałów) i przeciwciała anty-EPCR sprzężonego z fluorochromem (CD201, patrz tabela materiałów). Stosować końcowe rozcieńczenie przeciwciał w stosunku 1:100, chyba że wskazano inaczej na podstawie zaleceń producenta lub zgodnie z miareczkowaniem.
      UWAGA: Ta kombinacja przeciwciał jest używana do definiowania bramek do sortowania, jak opisano poniżej (krok 4.2). Sortowanie na podstawie koekspresji VE-kadheryny i EPCR umożliwia znaczne wzbogacenie części komórek pochodzących z AGM zawierających aktywność prekursorową HSC, jak opisano wcześniej17.
    2. Dodać dodatkowe przeciwciała sprzężone z fluorochromem w celu dalszej analizy fenotypowej poszczególnych prekursorów sortowanych indeksowo.
      UWAGA: Te przeciwciała niekoniecznie są używane do definiowania bramek do sortowania. W tym przykładowym protokole uwzględniliśmy przeciwciało anty-CD41 sprzężone z PE i przeciwciało anty-CD45 sprzężone z FITC, aby przeanalizować względną ekspresję tych markerów krwiotwórczych, które ewoluują podczas wyłaniania się pre-HSC z hemogennego śródbłonka4,5,16,17. Inne interesujące markery mogą być dołączone zgodnie z potrzebami. Próbki barwione kontrolami przeciwciał izotypu sprzężonego z fluorochromem służą do definiowania ujemnych i dodatnich bramek do analizy.
    3. Pobrać mieszaninę przeciwciał do strzykawki o pojemności 3 ml i przepuścić przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. Dodać 500 μl mieszaniny przeciwciał do zawiesiny komórek w buforze blokującym, pipetę do wymieszania i inkubować na lodzie przez co najmniej 15-20 minut.
  3. Umyj poplamione komórki.
    1. Dodać 8 ml PBS/10% FBS. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, aspirować i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml PBS/10% FBS.
    2. Usunąć grudki komórek, pipetując zawiesinę komórek przez nasadkę sitka o pojemności 35 μm na probówce o pojemności 5 ml. Umyj sitko do komórek dodatkowymi 3 ml PBS/10% FBS. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, aspirować, ponownie zawiesić w 500 μl PBS/10% FBS i umieścić na lodzie do FACS.

4. Sortowanie indeksowe pojedynczych prekursorów hemogennych do 96 dołków z AGM-EC Stroma dla kokultury

  1. Przygotuj maszynę FACS do trybu płytek i wyrównaj do sortowania do płytek 96-dołkowych zgodnie z instrukcjami producenta. Wybierz tryb pojedynczej komórki i tryb sortowania indeksów w oprogramowaniu, aby uzyskać maksymalne ustawienia maski czystości i umożliwić akwizycję parametrów indeksu dla każdej posortowanej komórki.
  2. Pobrać próbkę komórek z próbek barwionych przeciwciałami, aby ustawić bramki do sortowania.
    1. Załaduj wybarwioną próbkę komórek na maszynę FACS i pobierz komórki o najniższym natężeniu przepływu. Wykreśl FSC-A względem SSC-A i wybierz bramkę, która zawiera komórki o różnych rozmiarach (Rysunek 1B) (co opiera się na obserwacji, że aktywność pre-HSC jest identyfikowana w komórkach o różnych profilach wielkości w klasie AGM17). Wykreśl wersety FSC-A FSC-W i wersety SSC-A wersety SSC-W i wybierz bramki, aby wykluczyć dublety. Następnie wykreśl wersety FSC-A DAPI do bramki żywych komórek (ujemne dla DAPI) ( Rysunek 1B).
    2. Wykreślić PECy7 (lub odpowiedni fluorochrom dla barwienia VE-kadheryny) w porównaniu z PerCP (lub odpowiednim fluorochromem dla barwienia EPCR). Komórki bramkowe, które są dodatnie dla VE-kadheryny (która obejmuje mieszaną populację komórek śródbłonka, a także hematopoetyczne komórki progenitorowe i pre-HSC z AGM) i które mają wysoką ekspresję EPCR (która wzbogaca pre-HSC z P-Sp / AGM17). Jest to ostatnia bramka, która będzie używana do indeksowania sortowania pojedynczych komórek w kroku 4.3 (Rysunek 1B).
    3. Wykreśl dodatkowe fluorochromy używane do barwienia.
      UWAGA: W zależności od subpopulacji, która ma być analizowana, można ustawić dodatkowe bramki na podstawie wykrywania innych markerów zawartych w komórkach barwiących. Jednak sortowanie indeksowe umożliwia rejestrowanie parametrów fluorescencyjnych dla każdej posortowanej komórki, dzięki czemu parametry te mogą być analizowane retrospektywnie. W związku z tym w tym momencie nie jest konieczne dodatkowe bramkowanie. Dla wszystkich konfiguracji FACS próbki barwione pojedynczymi przeciwciałami powinny być używane do dostosowania kompensacji, aby uwzględnić rozlanie się emisji nakładających się fluorochromów oraz z przeciwciałami kontrolnymi izotypu, aby uwzględnić barwienie tła i określić bramki ujemne/dodatnie.
  3. Indeks sortuje komórki AGM.
    1. Umieścić 96-dołkową płytkę przygotowaną za pomocą zrębu AGM-EC w pożywce niezawierającej surowicy AGM z cytokinami (z kroku 1.5.3) w bloku płytki maszyny sortującej FAC. Załaduj próbkę i rozpocznij pobieranie próbki. Wybierz tryb sortowania indeksów/pojedynczych komórek i rozpocznij sortowanie pojedynczych komórek do pojedynczych 96 dołków. Użyj najniższego natężenia przepływu, aby zminimalizować naprężenia ścinające na komórkach embrionalnych.
    2. Upewnij się, że wszystkie zdarzenia są rejestrowane podczas sortowania indeksu. Umożliwi to wyliczenie całkowitej liczby komórek analizowanych w bramce sortującej w stosunku do rzeczywistej liczby posortowanych do poszczególnych 96 dołków, ponieważ nie wszystkie zarejestrowane zdarzenia zostaną posortowane do dołków.
    3. Po posortowaniu komórek na całą 96-dołkową płytkę umieścić ją w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i temperaturze 5% CO2 . Powtórz tę czynność dla dodatkowych płytek wymaganych na eksperyment.
    4. Hodowla indywidualnie posortowanych komórek w 96 dołkach zawierających AGM-EC (od kroku 4.3) przez okres do 7 dni (5 dni dla komórek posortowanych z zarodków E11-11,5, 6 dni z zarodków E10-10,5, 7 dni z zarodków E9-9,5). Wizualizuj kolonie krwiotwórcze o różnych rozmiarach i morfologiach za pomocą odwróconego mikroskopu przy 100-krotnym powiększeniu (Ryc. 2B) po okresie wspólnej hodowli.
      UWAGA: Pożywka nie musi być zmieniana w okresie wspólnej hodowli. Posortowane prekursory hemogenne mogą początkowo integrować się z warstwą AGM-EC o morfologii podobnej do EC i nie mogą być początkowo odróżnione od zrębu AGM-EC (Rysunek 2A). Jednak po 24-48 godzinach w kohodowli można wykryć małe, zaokrąglone komórki krwiotwórcze lub skupiska komórek. Pod koniec kohodowli (5-7 dni) poszczególne kolonie komórek krwiotwórczych można uwidocznić w podzbiorze 96 dołków, które otrzymały posortowaną komórkę o klonalnym potencjale hematopoetycznym. Jeśli zbadane wzrokowo studzienki zawierają więcej niż jedną odrębną kolonię, wówczas próbka ta jest wyłączona z dalszej analizy w celu wykluczenia próbek, które mogły otrzymać więcej niż jedną komórkę posortowaną na studzienkę.

5. Analiza klonalnego potomstwa hematopoetycznego po kokulturze

  1. Zbierz klony z każdego 96-dołka do analizy FACS.
    1. Energicznie pipetować w celu dysocjacji komórek krwiotwórczych od warstw śródbłonka za pomocą wielokanałowej pipety z końcówkami do pipet o pojemności 200 μl. Staraj się nie rozdzielać warstwy śródbłonka. Usunąć 100 μl (~50% próbki) w celu analizy fenotypowej potomstwa hematopoetycznego za pomocą FACS.
    2. Przenieść na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirować przy 300 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek. Wyjmij nośnik, strzepując go z płyty jednym szybkim ruchem, gdy płyta jest odwrócona (płyta przesuwna).
    3. Pozostałe 100 μl komórek umieścić na oryginalnej 96-dołkowej płytce w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu wykorzystania w kolejnym teście wszczepienia (krok 6).
  2. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami do analizy krwiotwórczej.
    1. Ponownie zawiesić osady komórkowe w każdym dołku 96-dołkowego dna w kształcie litery V z 50 μl PBS/2% FBS zawierającego 10 μg/ml bloku FcR i 1 μg/ml DAPI. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    2. Dodać 50 μl PBS/2% FBS zawierającego 10 μg/ml bloku FcR i mieszaninę przeciwciał do analizy HSC zawierającą anty-VE-kadherynę sprzężoną z PE-cyjaniną7, anty-CD45 sprzężoną z PerCP, anty-EPCR sprzężoną z PE, anty-Sca1 sprzężoną z APC oraz anty-Gr1 i anty-F4/80 sprzężoną z FITC (każde przeciwciało w końcowym rozcieńczeniu 1:100, chyba że wskazano inaczej na podstawie zaleceń producenta lub zgodnie z miareczkowaniem). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez co najmniej 20 minut.
  3. Usuń niezwiązane przeciwciało za pomocą sekwencyjnych rozcieńczeń i przeanalizuj komórki.
    1. Dodać 200 μl/studzienka PBS/2% FBS i wirować przy 300 x g przez 2 minuty, aby osadzać komórki. Następnie przesunąć płytkę, aby odrzucić supernatant i dodać 200 μl PBS/2% FBS do każdej osadki komórkowej i odwirować przy 300 x g przez 2 minuty do komórek osadu.
    2. Przetrzeć płytkę, aby odrzucić supernatant i dodać 50 μl/basenik PBS/2% FBS do analizy. Przystąp do analizy komórek za pomocą FACS za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w czytnik płytek.
      UWAGA: Należy pobrać ustaloną objętość komórek (np. 35 μl z całkowitej ilości 50 μl użytych do re-zawiesiny) w celu wyliczenia podzbiorów potomstwa krwiotwórczego.
  4. Przeanalizuj dane FACS dla każdej studzienki zawierającej potomstwo hematopoetyczne w celu zbadania kolonii zawierających potencjał HSC (Rysunek 3).
    1. Najpierw należy wziąć pod uwagę populację CD45 dodatnią, która jest ujemna dla markerów szpikowych Gr1 i F480. Nie należy wykluczać komórek, które nadal wykazują niski poziom kadheryny VE. Komórki z warstwy AGM-EC, które ulegają rozerwaniu podczas zbioru kolonii krwiotwórczych, są VE-kadheryny dodatnie i CD45-ujemne.
    2. Bramka CD45 + VE-Cad-/low Gr1-F4 / 80- komórki znajdujące się dalej w podzbiorze, które wyrażają wysokie poziomy EPCR i Sca1 (Rysunek 3A - C).
      UWAGA: W poprzednich badaniach kolonie pozbawione komórek z fenotypem CD45 + VE-Cad-/low Gr1-F4 / 80-Sca1 hiEPCRhi (Rysunek 3D) nie zapewniały wykrywalnego wieloliniowego wszczepienia krwi obwodowej u napromieniowanych myszy biorców17 (dane nie pokazane); W związku z tym kolonie te nie muszą być uwzględniane w późniejszej analizie przeszczepu w kroku 6.

6. Analiza właściwości wszczepienia poszczególnych klonów i korelacji z właściwościami fenotypowymi wyjaśnione przez sortowanie indeksowe

  1. W dniu (jeśli to możliwe) lub rano następującym po analizie fenotypowej w kroku 5, ponownie zawiesić pozostałe 100 μl komórek z każdej 96-studzienki zawierającej kolonie krwiotwórcze po jednoczesnej hodowli (od kroku 5.1) poprzez energiczne pipetowanie przy użyciu końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  2. Przygotuj i dodaj komórki ratunkowe z całego szpiku kostnego kongenicznego szczepu B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) dorosłe myszy 16,17.
    1. Policz jądrzaste komórki szpiku kostnego w roztworze Turksa pod hemocytometrem. Rozcieńczyć do stężenia 5 x 105 komórek jądrzastych/ml w PBS z 2% FBS.
    2. Dodać 100 μl ratunkowych komórek szpiku kostnego (5 x 104) do każdej studzienki zawierającej potomstwo hematopoetyczne do analizy transplantacyjnej i wymieszać pipetując.
  3. Przeszczep potomstwo pojedynczych klonów do pojedynczego, śmiertelnie napromieniowanego biorcy kongenicznego szczepu B6. SJL-Ptprctodorosła mysz Pepcb/BoyJ (B6 CD45.1).
    1. Śmiertelnie napromieniuj taką samą liczbę myszy B6 CD45.1, jak liczbę klonów, aby indywidualnie wstrzyknąć potomstwo pojedynczego klonu (przy użyciu 1,000 cGy ze źródła cezu).
    2. Pobrać 200 μl całkowitej zawiesiny komórek (w tym komórki z klonu, a także 5 x 104 B6 CD45.1 ratunkowych komórek szpiku kostnego) do strzykawki insulinowej 1/2 ml z igłą 29G 1/2 cala.
    3. Śmiertelne napromienianie B6 CD45.1 u dorosłych biorców na 2-24 godziny przed wstrzyknięciem.
    4. Używając plastikowego ogranicznika dla myszy, który umożliwia dostęp do ogona, wstrzyknij przez żyłę ogonową objętość 200 μl zawierającą obie komórki z każdego klonu i 5 x 104 4 B6 CD45.1 dorosłych komórek ratunkowych szpiku kostnego, aby pomóc w przeżyciu biorcy.
    5. Umieść kolczyk w uchu i zważ myszy biorcę oraz sprawdzaj ich wagę/stan zdrowia w regularnych odstępach czasu (np. 3-4 razy w tygodniu po napromieniowaniu/przeszczepie lub zgodnie z indywidualnymi standardowymi procedurami operacyjnymi instytucji), aby zapewnić dobry stan zdrowia.
  4. Wykonuj analizę przeszczepu krwi obwodowej w regularnych odstępach czasu (np. 2, 16, 24 tygodnie) po przeszczepie.
    1. Usuń 50-100 μl krwi za pomocą krwawienia zadoczodołowego lub innej etycznie zatwierdzonej metody upuszczania krwi.
    2. Dodać 3 ml buforu do lizy (16,6 g NH4Cl, 2 gNaHCO3 i 74,4 mg EDTA do 2 L H2O) do krwi i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Odessać i ponownie zawiesić osad z 2 ml PBS/2% FBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    3. Ponownie zawiesić osad ze 150 μl PBS/2% FBS zawierającym 10 μg/ml bloku FcR i 1 μg/ml DAPI i dozować 1/3 objętości do studzienki zawierającej 50 μl izotypu kontrolnego dla dawcy i linii, 1/3 do studzienki zawierającej 50 μl przeciwciała dla dawcy i izotypu kontrolnego dla linii, i 1/3 do studzienki zawierającej 50 μl przeciwciał w celu wykrycia zarówno dawcy, jak i linii.
      UWAGA: Przeciwciała do wykrywania wszczepienia wieloliniowego: anty-CD45.2 sprzężone z APCeFluor780, anty-CD45.1 sprzężone z Pe-cyjaniną7, anty-CD3 sprzężone z FITC, anty-F4/80 sprzężone z PE, anty-Gr1 sprzężone z PerCP i anty-CD19 sprzężone z APC lub odpowiednie kontrole izotypu.
    4. Zidentyfikuj klony z długotrwałym wszczepieniem, oceniając udział krwi obwodowej przez FACS w czasie komórek krwiotwórczych pochodzących z CD45.2 (dawcy) do mieloidów (Gr1 i/lub F4/80 dodatnich), komórek B (CD19 dodatnich) i limfocytów T (CD3 dodatnich) (Figura 4A-B).
      UWAGA: Wszczepienie hematopoetyczne można również analizować pod kątem wkładu CD45.2 (dawcy) pochodzącego z populacji krwiotwórczych z tkanek pobranych ze szpiku kostnego, śledziony, grasicy i otrzewnej lub po wtórnym przeszczepieniu komórek szpiku kostnego myszom B6 CD45.1 w celu analizy właściwości przeszczepu seryjnego17.
  5. Skoreluj właściwości fenotypowe każdego klonu określone przez początkowe sortowanie indeksu pojedynczej komórki z jego właściwościami wszczepienia. Korzystając z oprogramowania do analizy przepływu, prześlij parametry sortowania dla każdej komórki posortowanej indeksowo (skorelowane z 96-dołkiem, do którego została posortowana). Mapuj dane funkcjonalne na wykresy przepływu, aby ocenić właściwości fenotypowe pojedynczych komórek w odniesieniu do ich funkcjonalnej wydajności (na przykład długotrwałe, wieloliniowe wszczepienie) (Rysunek 4C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A przedstawia schemat projektu eksperymentalnego. Po wypreparowaniu, połączeniu i dysocjacji tkanek P-Sp / AGM w kolagenazie, są one barwione przeciwciałami przeciwko VE-kadherynie i EPCR w celu sortowania indeksu. Pre-HSC są wzbogacone w komórki posortowane wwysokiej VE-Cadherin+EPCR (Rysunek 1B). Inne przeciwciała sprzężone z fluorochromem można włączyć w celu retrospektywnej analizy dodatkowych parametrów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie genezy HSC podczas rozwoju embrionalnego wymaga środków do wykrywania potencjału HSC w prekursorach hemogennych, ale brakuje im kompetencji do zapewnienia długotrwałej wieloliniowej rekonstytucji krwiotwórczej u przeszczepionych dorosłych biorców. W tym protokole przedstawiamy test klonalny embrionalnych prekursorów hemogennych metodą kohodowli zrębu na niszowych EC naczyniowych z AGM, który wspomaga dojrzewanie prekursorów do HSC, z późniejszą analizą funkcjonalną w testach transplantacyjnych. Włączenie sortowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Andrew Bergerowi, Stacey Dozono i Brianowi Radenowi z Fred Hutchinson Flow Cytometry Core za pomoc w FACS. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health NHLBI UO1 grant #HL100395, Ancillary Collaborative Grant #HL099997 oraz NIDDK grant #RC2DK114777. Brandon Hadland jest wspierany przez Fundację Alex's Lemonade Stand i Fundację Hyundai Hope on Wheels.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AGM-EC podłoża hodowlane
Materiały do hodowli komórek śródbłonka
TrypLE ExpressGibco12605-028Służy do dysocjacji monowarstw AGM-EC
Żelatyna 0,1% w wodzieStemCell Technologies7903Służy do przyklejania monowarstw AGM-EC do tworzywa sztucznego
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3599Służy do wspólnej hodowli monowarstw AGM-EC i klonów sortowanych indeksowo
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Gibco14190-144Służy do rozwarstwiania i barwienia FACS
Butelki filtracyjne 500 mlFisher Scientific 9741202Służy do sterylnego filtrowania Pożywki śródbłonkowe
AGM-EC podłoża hodowlane (500 ml)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 ml
Hyclone Płodowa surowica bydlęcaFisher ScientificSH30088.03100 ml
Penicylina StreptomycynaGibco15140-1225 ml
HeparynaSigmaH314950 mg rozpuszczona w 10 ml pożywki
L-glutamina (200 mM)StemCell Technologies71005 ml
Mitogen śródbłonka (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Dodaj 10 ml pożywki do rozpuszczenia i dodaj
Materiały do sortowania indeksu AGM
Collagenaza (0,25%)StemCell Technologies7902Zastosowanie do dysocjacji tkanek embrionalnych
Strzykawka 3mlBD Biosciences309657Służy do sterylnego filtrowania roztworów przeciwciał dla FACS
0,22 i mikro; Filtr napędzany strzykawkąMilliporeSLGP033RSSłuży do sterylnego filtrowania roztworów przeciwciał do probówki polistyrenowej FACS
5 ml z nasadką sitowąCorning352235Służy do usuwania grudek komórek przed FACS
DAPI (przygotowany jako 1 mg/ml zapasu w H2O)Milipore268298Służy do wykluczania martwych komórek z sortowania
anty-mysie CD16/CD32 (blok FcR)BD Biosciences553141Służy do blokowania niespecyficznego barwienia receptorów Fc
Przeciwciała do sortowania indeksu AGM
Anti-mysz CD144 PE-cyjanina7eBioscience25-1441-82Barwienie
szczura IgG1 kappa Kontrola izotypu, PE-cyjanina7eBioscience25-4301-81Kontrola izotypu dla CD144 PE-cyjanina7
Anty-mysz CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Barwienie
szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Kontrola izotypu dla CD201 PerCP-eFluor710
Anty-mysi CD41 PEBD Biosciences558040Barwienie
szczura IgG1 kappa Kontrola izotypu, PEBD Biosciences553925Kontrola izotypu dla CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITCeBioscience11-0451-85Barwienie
szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, FITCeBioscience11-4031-81Kontrola izotypu dla pożywki wolnej od surowicy CD45 FITC
AGM (10 ml)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 ml
rekombinowany czynnik mysich komórek macierzystych (SCF)Peprotech250-0310 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 100 ng/ml
rekombinowany ludzki ligand FLT3 (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 100 ng/ml
rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (TPO)Peprotech300-182 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 20 ng/ml
rekombinowana mysia interleukina-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 20 ng/ml
Materiały do barwienia współhodowanych komórek
96 dołk, V-bottomCorning3894Zastosowanie do analizy FACS
Przeciwciała do analizy klonów sortowanych indeksowo współhodowanych z komórkami śródbłonka
Anti-mouse CD45 PerCP-cyjanina5.5eBioscience45-0451-82Barwienie
szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PE-cyjaninina5.5eBioscience35-4031-80Kontrola izotypu dla CD45 PerCP-Cyjanina5.5
Anty-mysi CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Barwienie
szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PEeBioscience12-4031-81Kontrola izotypu dla CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83barwiącego
IgG2a kappa, APCeBioscience17-4321-81Kontrola izotypu Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITCeBioscience11-4801-81
Kontrola izotypu IgG2a kappa Staining Rat, FITCeBioscience11-4321-41Kontrola izotypu dla F4/80 FITC
Anti-mysz Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Barwienie
szczurów IgG2b kappa Kontrola izotypu, FITCBD Biosciences556923Kontrola izotypu dla Ly-6G/C i CD3 FITC
Materiały do iniekcji żyły ogonowej do przeszczepu
/2 ml strzykawki insulinowe z igłami 29G 1/2"BD Biosciences309306Służy do wstrzykiwania żyły ogonowej do przeszczepu
Przeciwciała do analizy krwi obwodowej po translant
Anti-mysim Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426
Barwienie Kontrola izotypu szczura IgG2b kappa, Kontrola izotypu PerCPBiolegend400629dla Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Barwienie
Kontrola izotypu szczura IgG2a kappa, PEeBioscience12-4321-80Kontrola izotypu dla F4/80 PE
Anty-mysie CD3 FITCBD Biosciences555274Barwienie
anty-mysie CD19 APCBD Biosciences550992Barwienie
szczura IgG2a kappa Kontrola izotypu, APCBD Biosciences553932Kontrola izotypu dla CD19 APC
Anti-mysz CD45.1 (A20) PE-cyjanina7eBioscience25-0453-82Barwienie
szczura IgG2a kappa Kontrola izotypu, PE-cyjanina7eBioscience25-4321-81Kontrola izotypu dla CD45.1 PE-cyjaniny7
Anty-mysia CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82
Kontrola izotypu IgG2a kappa Staining Rat IgG2a, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Kontrola izotypu dla CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II z oprogramowaniem DIVABD Biosciences
BD FACSCanto II z czytnikiem płytekBD Biosciences
HemocytometrFisher ScientificS17040Do liczenia komórek
Pipeta wielokanałowaFisher Scientific14-559-417Do Oprogramowanie do analizy FACS komórek dozujących
FlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Kontrola izotypu szczura 1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hematopoietic Stem CellSingle Cell Index SortingEndothelial Cell Niche Co cultureEmbryonic HSC PrecursorsAorta gonad mesonephros AGMFlow Cytometry AnalysisClonal Hematopoietic AnalysisVascular Endothelial CadherinEndothelial Protein C ReceptorLong term Engraftment Potential

Powiązane artykuły