Artykuł metodologiczny

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56974

⸱

23 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.

Streszczenie

Badania społeczności mikroorganizmów stały się powszechne dzięki rozwojowi stosunkowo taniego, szybkiego i wysokoprzepustowego sekwencjonowania. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich tych technologii, powtarzalne wyniki zależą od przepływu pracy w laboratorium, który obejmuje odpowiednie środki ostrożności i kontrole. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek o niskiej biomasie, w przypadku których zanieczyszczenie bakteryjnego DNA może generować mylące wyniki. Ten artykuł szczegółowo opisuje półautomatyczny przepływ pracy w celu identyfikacji drobnoustrojów w próbkach mleka kobiecego przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania regionu 16S rybosomalnego RNA (rRNA) V4 w skali od niskiej do średniej przepustowości. Protokół opisuje przygotowanie próbki z mleka pełnego, w tym: lizę próbki, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację regionu V4 genu 16S rRNA oraz przygotowanie biblioteki ze środkami kontroli jakości. Co ważne, w protokole i dyskusji uwzględniono kwestie, które są istotne dla przygotowania i analizy próbek o niskiej biomasie, w tym odpowiednie kontrole dodatnie i negatywne, usuwanie inhibitorów PCR, zanieczyszczenie próbki przez środowisko, odczynniki lub źródła eksperymentalne oraz najlepsze praktyki eksperymentalne mające na celu zapewnienie odtwarzalności. Chociaż opisany protokół jest specyficzny dla próbek mleka ludzkiego, można go dostosować do wielu rodzajów próbek o niskiej i wysokiej biomasie, w tym próbek pobranych na wymazach, zamrożonych w czystej postaci lub ustabilizowanych w buforze konserwującym.

Wprowadzenie

Uważa się, że społeczności mikrobiologiczne, które kolonizują ludzi, są niezwykle ważne dla ludzkiego zdrowia i chorób, wpływając na metabolizm, rozwój immunologiczny, podatność na choroby oraz reakcje na szczepienia i terapię lekową1,2. Wysiłki mające na celu zrozumienie wpływu mikrobioty na zdrowie człowieka kładą obecnie nacisk na identyfikację drobnoustrojów związanych ze zdefiniowanymi przedziałami anatomicznymi (tj. skórą, jelitami, jamą ustną itp.), a także zlokalizowanymi miejscami w tych przedziałach3,4. U podstaw tych wysiłków badawczych leży szybkie pojawienie się i zwiększona dostępność technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), które zapewniają masowo równoległą platformę do analizy zawartości genetycznej drobnoustrojów (mikrobiomu) w próbce. W przypadku wielu próbek fizjologicznych powiązany mikrobiom jest zarówno złożony, jak i obfity (tj. kał), ale w przypadku niektórych próbek mikrobiom jest reprezentowany przez niską biomasę mikrobiologiczną (tj. mleko ludzkie, dolne drogi oddechowe), gdzie wrażliwość, artefakty eksperymentalne i możliwe zanieczyszczenie stają się głównymi problemami. Typowe wyzwania związane z badaniami mikrobiomu i odpowiednim projektem eksperymentalnym były przedmiotem wielu artykułów przeglądowych5,6,7,8.

Prezentowany tutaj jest solidny eksperymentalny pipeline NGS oparty na ukierunkowanym sekwencjonowaniu regionu rRNA 16S V49 w celu scharakteryzowania mikrobiomu mleka ludzkiego. Analizę mikrobiomu mleka kobiecego komplikuje nie tylko z natury niska biomasa mikrobiologiczna10, ale także wysoki poziom tła ludzkiego DNA11,12,13,14 i potencjalne przeniesienie inhibitorów PCR15,16 w wyekstrahowanym kwasie nukleinowym. Protokół ten opiera się na dostępnych na rynku zestawach do ekstrakcji i półautomatycznych platformach, które mogą pomóc zminimalizować zmienność między partiami przygotowania próbek. Obejmuje dobrze zdefiniowaną społeczność makiet bakteryjnych, która jest przetwarzana wraz z próbkami jako kontrola jakości w celu walidacji każdego kroku w protokole i zapewnienia niezależnej metryki niezawodności rurociągu. Chociaż opisany protokół jest specyficzny dla próbek mleka ludzkiego, można go łatwo dostosować do innych typów próbek, w tym wymazów ze stolca, odbytu, pochwy, skóry, otoczek i jamy ustnej10,17 i może służyć jako punkt wyjścia dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić analizy mikrobiomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dla wszystkich kroków protokołu, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i stosować rygorystyczne podejścia do zapobiegania skażeniom. Obserwuj przepływ pracy z obszarów roboczych przed amplifikacją do obszarów roboczych po amplifikacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek. Wszystkie używane materiały są sterylne, wolne od RNaz, DNaz, DNA i pirogenów. Wszystkie końcówki do pipet są filtrowane. Dostępny jest schemat blokowy kroków protokołu (Rysunek 1).

1. Próbka Lysis

UWAGA: Liza próbki i ekstrakcja kwasów nukleinowych są wykonywane przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA/RNA w pomieszczeniu czystym, gdzie stosuje się zarówno kontrole inżynieryjne, jak i proceduralne, aby zminimalizować wprowadzanie bakterii środowiskowych do próbek.

  1. Przygotowanie miejsca pracy
    1. Wyczyść obszar roboczy komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) odpowiednim środkiem do czyszczenia powierzchni, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenie kwasami nukleinowymi.
    2. Włącz wirownik z regulowaną temperaturą i ustaw go na 37 °C.
  2. Przygotować bufor do lizy tiocyjanianu guanidyny (patrz tabela materiałów)
    1. Sprawdzić bufor do lizy pod kątem wytrąceń. Osady należy ponownie rozpuścić przez ogrzanie w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotować 600 μl buforu do lizy z 6 μl β-merkaptoetanolu (β-ME) dla każdej próbki. Rozważ dodatkowe 20% objętości na próbkę.
  3. Przygotowanie próbki
    1. Jeśli mleko pełne jest zamrożone, rozmrozić je na lodzie. Porcję 5 ml pełnego mleka przelać do sterylnej probówki o pojemności 15 ml lub 5 ml w BSC i przechowywać na lodzie.
    2. Wirować 5 ml porcji mleka przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C do komórek osadzania.
    3. Usuń warstwę tłuszczu, teraz górną warstwę w probówce, za pomocą plastikowej szpatułki lub końcówki pipety o dużym otworze.
    4. Nie naruszając osadu, usunąć cały sklarowany osad z wyjątkiem 100 μl.
    5. Przemyć osad przez ponowne zawieszenie w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    6. Przygotować 1 kontrolę ujemną, dodając 1 ml sterylnego PBS do probówki o pojemności 5 ml.
    7. Przenieść zawiesinę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować w mikrowirówce przez 1 minutę (5 000 x g w temperaturze pokojowej (RT)).
    8. Użyj sterylnej końcówki pipety z filtrem o pojemności 1 000 μl, aby usunąć całą warstwę supernatantu/tłuszczu.
    9. Jeśli nie zostanie wyekstrahowany tego samego dnia, zamroź granulki komórek, umieszczając je w zawiesinie etanolu/suchego lodu i natychmiast przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
  4. Rozbijanie i homogenizacja próbki (ubijanie kulek)
    1. Dodać 600 μl buforu do lizy zawierającego β-ME do osadu i przenieść zawiesinę do probówki z kulkami.
    2. Każda partia ekstrakcyjna składająca się z 12 próbek zawiera 10 próbek, 1 kontrolę ujemną (przygotowaną w kroku 3.7 powyżej) i 1 kontrolę dodatnią (przygotowaną w następnym etapie).
      1. Przygotować 1 kontrolę pozytywną z buforem do lizy i 20 μl próbki próbnej bakteryjnej (zastosowana grupa próbna ma stężenie, po ekstrakcji, około 0,2 ng/μl DNA).
    3. Energicznie obracaj wszystkie rurki koralikowe przez 15 sekund.
    4. Podgrzewać próbki w wirówce o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 °C przez 10 minut, z wytrząsaniem przy 700-800 obr./min.
    5. Załaduj probówki do zestawu adapterów automatycznego zakłócacza próbek.
    6. Bicie koralików przez 1 minutę przy 30 Hz.
    7. Zdemontuj zestaw adapterów i ręcznie przełącz zestaw adapterów z płytkami próbkami z lewego ramienia robota na prawe ramię robota przyrządu.
    8. Koralik bił przez kolejną 1 minutę przy 30 Hz.
    9. Probówki wirówkowe o pojemności 17 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C.
    10. Usunąć cały sklarowany osad za pomocą pipety o pojemności 200 μl, uważając, aby nie dostać się do warstwy tłuszczowej na górze próbki lub pozostałości kulki na dole próbki, a następnie nałożyć na kolumnę homogenizatora.
    11. Odwirować kolumny homogenizatora z maksymalną prędkością, 17 200 x g, przez 3 minuty w temperaturze 25 °C.
    12. Przenieść 350 μl eluatu do probówki mikrowirówkowej producenta o pojemności 2 ml w celu użycia z automatycznym urządzeniem do oczyszczania DNA i RNA (nie używać żadnej innej probówki). Uważaj, aby nie przenieść żadnej resztkowej warstwy tłuszczu.
    13. Jeżeli objętość przepływu jest mniejsza niż 350 μl, dodać bufor do lizy z β-ME do końcowej objętości 350 μl.
    14. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej do 2 godzin przed przystąpieniem do izolacji kwasów nukleinowych za pomocą automatycznego przyrządu do oczyszczania DNA lub zamrozić w temperaturze -80 °C.
  5. Sprzątanie obszaru roboczego
    1. Oczyść wszystkie używane powierzchnie nieenzymatycznym roztworem odkażającym, pozostaw na 10 minut, a następnie spryskaj 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię.

2. Wyizoluj DNA/RNA

  1. Przygotowanie miejsca pracy
    1. Włącz blok grzewczy i ustaw temperaturę na 70 °C.
    2. Włącz wirownik z regulacją temperatury i ustaw temperaturę na 37 °C.
    3. Rozgrzać bufor elucyjny (EB) zawierający 10 mM Tris-Cl o pH 8,5 w probówce o pojemności 50 ml do temperatury 70 °C.
    4. Rozgrzać 350 μl zamrożonych lizatów w probówkach o pojemności 2 ml w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia bez osadu (około 10 min).
  2. Oczyszczanie DNA
    1. Zmieszać i odwirować probówki o pojemności 2 ml z próbką krótko (3000 x g przez 10 s).
    2. Włóż 2 probówki o pojemności 2 ml do wytrząsarki zgodnie z tabelą ładowania przyrządu do automatycznego oczyszczania DNA/RNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Weź adaptery wirnika i ustaw je na tacy w zależności od liczby próbek.
    4. Oznacz każdy adapter wirnika na podstawie identyfikacji próbki (ID).
    5. Odetnij pokrywki i wygładź krawędzie poszczególnych kolumn wirujących dla DNA i RNA.
    6. Włóż kolumnę wirową DNA bez rurki zbiorczej do adaptera wirnika. Wyrzuć probówkę zbiorczą.
    7. Oznacz probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml i włóż do adapterów wirnika.
    8. Umieść adaptery wirnika w wirówce zgodnie z tabelą ładowania automatycznego przyrządu do oczyszczania DNA/RNA.
    9. Włóż końcówki filtrujące o pojemności 1 000 μl do stojaków na końcówki.
    10. Dodaj wodę wolną od RNaz do probówki mikrowirówki producenta o pojemności 2 ml w oparciu o liczbę próbek (zgodnie z instrukcjami określonymi w protokole maszyny).
    11. Włóż probówkę do szczeliny probówki "A" w szczelinach probówek mikrowirówek.
    12. Wyrzuć odczynnik, który pozostał w butelkach z odczynnikiem i napełnij go minimalną objętością 10 ml.
    13. Włóż butelki z odczynnikiem do stojaka na butelki z odczynnikiem (z wyjątkiem butelki EB).
    14. Dodaj ciepły EB z probówki o pojemności 50 ml do butelki z odczynnikiem w pozycji 6.
    15. Sprawdź, czy probówki o pojemności 1.5 ml są szczelnie umieszczone w adapterach wirnika.
    16. Zamknij pokrywę instrumentu i wybierz: "RNA"→ "zestaw do ekstrakcji" → "Zwierzęta, tkanki i komórki" → "nazwa zestawu 350 μL część A niestandardowe DNA" → Edytuj objętość elucji na 100 μl (domyślnie) lub 50 μl dla próbek o niskiej biomasie → "Start".
    17. Po zakończeniu wyjmij adaptery wirnika z wirówki i umieść je na tacy.
    18. Wyrzuć kolumnę wirową DNA z pozycji adaptera wirnika 3.
    19. NIE wyrzucaj adapterów wirnika, RNA jest w pozycji 2.
    20. Wyjąć 1,5 ml probówki zbiorcze zawierające eluowane DNA w pozycji 3 i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    21. Pobrać probówki zawierające próbkę z wytrząsarki i przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli pozostała jakakolwiek próbka, w przeciwnym razie wyrzucić.
    22. Kontynuuj z protokołem "nazwa zestawu 350 μL część B RNA" w celu dalszego oczyszczania RNA.
    23. Oczyszczanie RNA odbywa się z przepływu o objętości około 350 μl, który znajduje się w środkowej pozycji adapterów wirnika.
  3. Oczyszczanie RNA
    1. Włóż kolumnę wirową RNA bez rurki zbiorczej i pokrywy do adaptera wirnika.
    2. Oznacz nowe probówki zbiorcze o pojemności 1.5 ml i włóż je do adaptera wirnika, jak wskazano w instrukcji.
    3. Umieść adaptery wirnika w wirówce zgodnie z tabelą ładowania automatycznego przyrządu do oczyszczania DNA/RNA.
    4. Zamknij pokrywę instrumentu i wybierz: "RNA" → "Zestaw producenta" → "Zwierzęta, tkanki i komórki" → "Standardowa część B RNA" → "Start".
    5. Po zakończeniu wyjmij adaptery wirnika z wirówki i umieść je na tacy.
    6. Odrzuć kolumnę wirową RNA z pozycji 3.
    7. Wyjąć 1,5 ml probówki zbiorcze zawierające 30 μl eluowanego RNA w pozycji 3 i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    8. Wyjmij butelki z odczynnikami.
    9. Zawartość adaptera wirnika należy utylizować przez odpowiednie kanały na odpady niebezpieczne.
  4. Czysta stacja robocza
    1. Spryskaj wszystkie akcesoria do automatycznego urządzenia do oczyszczania DNA/RNA, takie jak stojaki na odczynniki, taca i wszelkie inne używane powierzchnie, nieenzymatycznym roztworem odkażającym, pozostaw na 10 minut i spłucz wodą dejonizowaną (DI), a następnie pozostaw do wyschnięcia.
    2. Spryskaj automatyczny instrument wyłącznie zatwierdzonym przez producenta nieenzymatycznym roztworem dekontaminacyjnym, wytrzyj wnętrze wirówki wraz ze wszystkimi używanymi powierzchniami, pozostaw na 10 minut, a następnie przetrzyj 70% etanolem. Nie używaj innych rodzajów roztworów odkażających, ponieważ mogą one uszkodzić instrument.

3. Ukierunkowana konfiguracja 16S PCR

UWAGA: Przygotowanie do PCR 16S odbywa się w wyznaczonym pomieszczeniu roboczym do wstępnego amplifikacji, znajdującym się w pomieszczeniu czystym. Odczynniki i próbki są przygotowywane, a następnie ładowane do urządzenia do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia PCR dla każdej próbki w trzech egzemplarzach (30 próbek, które obejmują prawdziwe próbki oraz kontrole ekstrakcyjne dodatnie i ujemne, plus 2 kontrole wody PCR w trzech egzemplarzach, co daje łącznie 96 połączonych próbek i kontroli). Po zmontowaniu i uszczelnieniu reakcji PCR, płytkę próbki przenosi się do termocyklera umieszczonego w obszarze po amplifikacji w celu jazdy na rowerze.

  1. Przygotowanie miejsca pracy
    1. Wyczyść stację roboczą PCR. Spryskaj wszystkie używane powierzchnie środkiem odkażającym RNazy, DNazy, DNA, a następnie dwukrotnie wodą DI, a na koniec 70% etanolem.
    2. Przygotuj arkusz 16S PCR (patrz Arkusz ukierunkowany 16S PCR) z dokładną listą próbek i przypisz różne startery z kodami kreskowymi do każdej próbki9. Wydrukuj arkusz roboczy i mapy tablic rejestracyjnych (patrz tablica 1).
  2. Przygotowanie mieszanki wzorcowej PCR
    UWAGA: Wybór startera 16S zależy od regionu zainteresowania dla danego badania i może się różnić w zależności od badania lub typu próby. Dlatego przed zamówieniem starterów ważne jest, aby potwierdzić, jaki obszar 16S rRNA najlepiej wzmacnia drobnoustroje będące przedmiotem zainteresowania w danym badaniu. Ten protokół, tak jak napisano, służy do wzmacniania obszaru 16S V4. Jeśli wybrano różne podkłady/regiony, temperatura wyżarzania w cyklach termicznych może wymagać regulacji.
    1. Pracuj na stacji roboczej PCR, aby wszystko przygotować.
    2. Pobrać 50 - 100 μl próbek DNA o temperaturze od -20 °C oraz wszystkie potrzebne odczynniki i rozmrozić je na lodzie. Wiruj i krótko zakręć w dół.
    3. Startery są wstępnie rozcieńczane do stężenia roboczego 5 μM w minimalnej objętości 20 μL.
    4. Przygotuj główną mieszankę PCR w specjalnej probówce o pojemności 5 ml tylko z przednim starterem zgodnie z obliczeniami w arkuszu roboczym.
  3. Przygotowanie zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy do zautomatyzowanej konfiguracji PCR
    1. W przypadku próbek należy wyjąć adapter próbki z instrumentu 32-dołkowego i załadować 50 - 100 μl próbek DNA zgodnie z mapą płytki 96-dołkowej zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Dla każdej płytki PCR należy przeprowadzić 2 kontrole ujemne, umieszczając 30 μl wody do PCR w czystej probówce z próbką.
      2. Umieść wszystkie próbki na adapterze do próbek 32-dołkowego instrumentu z nasadkami zablokowanymi w pozycji otwartej.
    2. Dla starterów odwróconych9
      1. Zdejmij nakrętkę każdego odwróconego podkładu z określonymi kodami kreskowymi # pojedynczo (zmieniaj rękawice między nimi, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego).
      2. Umieść maksymalnie 32 startery na adapterze odczynnika instrumentu.
    3. Wyjmij 96-dołkową płytkę PCR i oznacz ją nazwą badania, numerem próbki, datą i inicjałami technika.
    4. Załadunek zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy
      1. Umieść adapter odczynnika w pozycji B1. Aby uniknąć efektu krawędzi, ostrożnie przyłóż jedną krawędź adaptera do strony uchwytu i powoli opuść drugą krawędź. Upewnij się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów.
      2. Umieść adapter próbki w pozycji C1. Upewnij się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów.
      3. Zmieszaj 5-mililitrową mieszankę główną, otwórz nakrętkę i umieść ją w pozycji A na mieszance głównej instrumentu i bloku odczynników.
      4. Umieść płytkę PCR na adapterze 96-dołkowego, który jest przeznaczony do przechowywania płytek do PCR z półspódniczką.
      5. Uruchom przebieg i zapisz jako nowy plik.
      6. Postępuj zgodnie z instrukcjami i zaznacz każdy monit: jeden, napiwki są dostępne, dwa, pojemnik na odpady jest dostępny, a trzy, start.
    5. Po zakończeniu przebiegu sprawdź, czy nie wystąpiły żadne błędy, sprawdzając maszynę pod kątem komunikatów o błędach.
    6. Zamknij płytkę 12 lub 8 nasadkami paskowymi, energicznie wiruj i wiruj przez 1 minutę za pomocą wirówki do płytek 96-dołkowych, a następnie umieść ją na lodzie lub w lodówce.
    7. Usunąć probówki zawierające startery odwrotne i próbki.
    8. Zabierz 96-dołkową płytkę do pomieszczenia po amplifikacji i załaduj płytkę do termocyklera i cykluj zgodnie z tabelą warunków cyklu termicznego (patrz Tabela 1).

4. Ukierunkowana kontrola jakości 16S Post-PCR przy użyciu platformy opartej na taśmie do elektroforezy żelowej

UWAGA: Kontrola jakości po PCR (QC) i wszystkie kolejne kroki są przeprowadzane w wyznaczonym obszarze laboratorium po amplifikacji. DNA jest analizowane w automatycznym analizatorze fragmentów DNA/RNA.

  1. Przygotowanie miejsca pracy
    1. Wyczyść stację roboczą, spryskując wszystkie używane powierzchnie środkiem odkażającym RNazy, DNazy, DNA, a następnie dwukrotnie wodą DI, a na koniec 70% etanolem.
    2. Zgromadź wszystkie potrzebne zapasy i sprzęt.
  2. Przygotowanie odczynników
    1. Umieścić bufor i drabinkę do próbek w wirze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 °C na co najmniej 30 minut.
  3. Podczas nagrzewania się odczynników przygotuj próbki PCR, łącząc 3 powtórzenia PCR dla każdej próbki w jednej probówce
  4. Załaduj próbki na urządzenie.
  5. Krótko zwirować i odwirować probówki z połączonym produktem PCR.
  6. Umieść 96-dołkową płytkę instrumentu na stojaku w RT i oznacz ją.
    7. Krótko przetrząsnąć
  7. i odwirować bufor próbki i drabinkę.
  8. Dodać 3 μl buforu próbki do każdego dołka płytki 96-dołkowej (potrzeba co najmniej 53 μl/taśmę sitową).
  9. Uruchomić parzystą liczbę próbek; jeśli liczba próbek jest nieparzysta, dodać 4 μl buforu do pustej studzienki.
  10. Dodaj 1 μl drabiny do studzienki drabiny.
  11. Postępując zgodnie z mapą, dodaj 1 μl zbiorczego produktu PCR do wyznaczonego dołka.
  12. Płyta pokrywy z uszczelką foliową
  13. Wirować płytkę za pomocą wirownika i adaptera instrumentu z prędkością 2,000 obr./min przez 1 min.
  14. Odwirować w dół, aby umieścić próbkę na dnie probówki, jeśli są pęcherzyki, ponownie zawirować.
  15. Uruchom oprogramowanie.
  16. Załaduj taśmę sitową i końcówki ładujące do instrumentu.
  17. Załaduj próbki do analizatora fragmentów za pomocą adaptera 96-dołkowego.
  18. Skonfiguruj przebieg za pomocą oprogramowania sterownika.
  19. Upewnij się, że wybierasz studnie o numerach parzystych.
  20. Napisz przykładowe identyfikatory.
  21. Sprawdź, czy wszystkie dołki taśmy ekranowej są podświetlone na szaro.
  22. Upewnij się, że analizator rozpoznaje wszystkie końcówki pipet.
  23. Wybierz start i określ nazwę pliku, aby zapisać wyniki (nazwa badania, numery próbek i data).
  24. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z instrukcją producenta.
  25. Po zakończeniu biegu wyrzuć końcówkę, taśmę sitową i rurki.
  26. Analizuj dane dla szczytu 16S nM (w zakresie 315 - 450 pz dla V4). Ten szczyt będzie się różnił w zależności od wybranych podkładów.

5. Obliczanie biblioteki, pooling, czyszczenie i kontrola jakości

  1. Po określeniu rozmiaru amplikonu i molarności wszystkich próbek, połącz biblioteki, aby uzyskać ostateczną żądaną wolumin i nM dla biblioteki w puli (patrz Obliczanie próbki).
  2. Oczyść i skoncentruj zbiorczą bibliotekę za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR na bazie membrany krzemionkowej, zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
    1. Eluować DNA z końcową objętością 50 μl.
  3. Natychmiast zmierz stężenie w czyszczonej bibliotece za pomocą zestawu o wysokiej czułości dwuniciowego DNA do fluorometru, zgodnie z protokołem producenta.
    1. Rozcieńczyć 2 μl połączonej i oczyszczonej biblioteki 198 μl buforu rozcieńczającego z barwnikiem (rozcieńczenie 1:100).
    2. Zapisz zmierzoną wartość z urządzenia fluorometrycznego i przelicz ją zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia.
  4. Korzystając z odczytu stężenia (ng/μL) dla biblioteki puli, oblicz molowość biblioteki w nM. Użyj 1 μl nierozcieńczonej biblioteki do pomiaru OD260/280 na spektrofotometrze mikroobjętościowym.
    UWAGA: Wartość 1,8 - 2,0 wskazuje na odpowiednią czystość biblioteki.
  5. Przechowuj ostateczną bibliotekę w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowa do sekwencjonowania nowej generacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje istotne etapy kontroli jakości (QC), aby zapewnić, że wygenerowane dane spełniają kryteria czułości, swoistości protokołu oraz kontroli zanieczyszczeń. Pierwszy etap QC protokołu następuje po amplifikacji PCR regionu V4 16S (Rycina 2). Jeden µL produktu PCR z każdej próbki poddano elektroforezie w celu potwierdzenia, że mieści się on w oczekiwanym zakresie wielkości 315 - 450 bp (Rycina 2, cz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ukierunkowane sekwencjonowanie 16S rRNA nowej generacji jest szeroko stosowaną, szybką techniką charakteryzacji mikrobiomu18. Jednak wiele czynników, w tym wpływ partii, zanieczyszczenie środowiska, zanieczyszczenie krzyżowe próbki, czułość i odtwarzalność, może niekorzystnie wpływać na wyniki eksperymentalne i zakłócać ich interpretację 7,19,20. Aby jak najlepiej ułatwić solidne analizy 16S, przepływy pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Helty Adisetiyo i dr Shangxin Yang za opracowanie protokołu. Ogólne wsparcie dla Międzynarodowej Grupy ds. Badań Klinicznych AIDS u Młodzieży Matki (IMPAACT) zostało udzielone przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) w ramach nagród o numerach UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) i UM1AI106716 (IMPAACT LC), przy współfinansowaniu ze strony Eunice Kennedy Shriver Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka (NICHD) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (NIMH). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA
EliminaseFisher Scientific435532RNazy, DNazy, dekontaminacja DNA
Thermo MixerFisher Scientificz kontrolowaną temperaturą
Bufor wirowy RLT plusQiagen1053393bufor do lizy tiocyjanianu guanidyny/ Część zestawu
Allprepß-MercaptoethanolSigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME to środek redukujący, który nieodwracalnie denaturuje RNazy poprzez redukcję wiązań dwusiarczkowych
Koraliki LME MPBiomedicals116914050rurka z kulkami
QIAgen TissueLyzerQiagen85300zautomatyzowany zestaw adapterów zakłócających próbki
Kolumna QIAshredderQiagen79654
Probówka do mikrowirówek producenta
QIAcube i powiązane wyroby z tworzyw sztucznychQiagen9001292zautomatyzowany instrument do oczyszczania DNA/RNA
Wyjście DNA plusApplichemA7089nieenzymatyczny roztwór do dekontaminacji
Buforelucyjny Qiagen19086
QIAgility i pokrewne tworzywa sztuczneQiagen9001532zrobotyzowana maszyna do obsługi cieczy
PCR wodaMO BIO17000-5PRIME
HotMasterMixQuantabio2200400
Odwrócone podkłady z kodami kreskowymiEurofinNr katalogu #zaprojektowali i zamówili
96-dołkową płytkę PCRUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 i powiązane wyrobyz tworzyw sztucznychAutomatycznyanalizator fragmentów DNA/RNAG2964AA
odczynniki D1000 do TapestationAgilent5067-5585Bufor i drabinka do próbek są częścią tego zestawu
Zestaw do usuwania inhibitorów PCR OneStepZymo Research50444470usuwanie inhibitora PCR odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta.
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR ZestawQiagen28104: oczyszczanie produktów PCR na podstawie membrany krzemionkowej
Zestaw testowy Qubit dsDNA HS Buforrozcieńczający na bazie dimetylosulfotlenku ThermoFisherQ32854
Fluorometr kubitowyThermo FisherQ33216
NanoDropSpektrofotometr mikroobjętościowyThermo Fisher
Zestaw MiSeq 300 V2Illumina15033624/15033626
MiSeqIlluminaBrak katalogu #sekwencer nowej generacji
QIAgen RB w zestawie EB Agilent Research do oczyszczania DNA i barwnik są częścią tego zestawu.

Bibliografia

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561(2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588(2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29(2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26(2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24(2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487(2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19(2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73(2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie 16Sniska biomasaprzygotowanie pr bekekstrakcja kwas w nukleinowychamplifikacja regionu V4przygotowanie bibliotekikontrola jako cikontrole zanieczyszczeprotok p automatyczny

Powiązane artykuły