Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania społeczności mikroorganizmów stały się powszechne dzięki rozwojowi stosunkowo taniego, szybkiego i wysokoprzepustowego sekwencjonowania. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich tych technologii, powtarzalne wyniki zależą od przepływu pracy w laboratorium, który obejmuje odpowiednie środki ostrożności i kontrole. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek o niskiej biomasie, w przypadku których zanieczyszczenie bakteryjnego DNA może generować mylące wyniki. Ten artykuł szczegółowo opisuje półautomatyczny przepływ pracy w celu identyfikacji drobnoustrojów w próbkach mleka kobiecego przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania regionu 16S rybosomalnego RNA (rRNA) V4 w skali od niskiej do średniej przepustowości. Protokół opisuje przygotowanie próbki z mleka pełnego, w tym: lizę próbki, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację regionu V4 genu 16S rRNA oraz przygotowanie biblioteki ze środkami kontroli jakości. Co ważne, w protokole i dyskusji uwzględniono kwestie, które są istotne dla przygotowania i analizy próbek o niskiej biomasie, w tym odpowiednie kontrole dodatnie i negatywne, usuwanie inhibitorów PCR, zanieczyszczenie próbki przez środowisko, odczynniki lub źródła eksperymentalne oraz najlepsze praktyki eksperymentalne mające na celu zapewnienie odtwarzalności. Chociaż opisany protokół jest specyficzny dla próbek mleka ludzkiego, można go dostosować do wielu rodzajów próbek o niskiej i wysokiej biomasie, w tym próbek pobranych na wymazach, zamrożonych w czystej postaci lub ustabilizowanych w buforze konserwującym.
Wprowadzenie
Uważa się, że społeczności mikrobiologiczne, które kolonizują ludzi, są niezwykle ważne dla ludzkiego zdrowia i chorób, wpływając na metabolizm, rozwój immunologiczny, podatność na choroby oraz reakcje na szczepienia i terapię lekową1,2. Wysiłki mające na celu zrozumienie wpływu mikrobioty na zdrowie człowieka kładą obecnie nacisk na identyfikację drobnoustrojów związanych ze zdefiniowanymi przedziałami anatomicznymi (tj. skórą, jelitami, jamą ustną itp.), a także zlokalizowanymi miejscami w tych przedziałach3,4. U podstaw tych wysiłk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Dla wszystkich kroków protokołu, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i stosować rygorystyczne podejścia do zapobiegania skażeniom. Obserwuj przepływ pracy z obszarów roboczych przed amplifikacją do obszarów roboczych po amplifikacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek. Wszystkie używane materiały są sterylne, wolne od RNaz, DNaz, DNA i pirogenów. Wszystkie końcówki do pipet są filtrowane. Dostępny jest schemat blokowy kroków protokołu (Rysunek 1).
1. Próbka Lysis
UWAGA: Liza próbki i ekstrakcja kwasów nukleinowych są wykonywane przy użyciu zestawu do ekstrakc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiony tutaj protokół obejmuje istotne etapy kontroli jakości (QC), aby zapewnić, że wygenerowane dane spełniają normy w zakresie czułości protokołu, swoistości oraz kontroli zanieczyszczeń. Pierwszy etap QC protokołu następuje po amplifikacji PCR regionu 16S V4 (Rycina 2). 1 µL produktu PCR z każdej próbki poddano analizie elektroforetycznej, aby potwierdzić, że mieści się on w oczekiwanym zakresie wielkości 315 - 450 bp (Rycina 2.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ukierunkowane sekwencjonowanie 16S rRNA nowej generacji jest szeroko stosowaną, szybką techniką charakteryzacji mikrobiomu18. Jednak wiele czynników, w tym wpływ partii, zanieczyszczenie środowiska, zanieczyszczenie krzyżowe próbki, czułość i odtwarzalność, może niekorzystnie wpływać na wyniki eksperymentalne i zakłócać ich interpretację 7,19,20. Aby jak najlepiej ułatwić solidne analizy 16S, przepływy pr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Helty Adisetiyo i dr Shangxin Yang za opracowanie protokołu. Ogólne wsparcie dla Międzynarodowej Grupy ds. Badań Klinicznych AIDS u Młodzieży Matki (IMPAACT) zostało udzielone przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) w ramach nagród o numerach UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) i UM1AI106716 (IMPAACT LC), przy współfinansowaniu ze strony Eunice Kennedy Shriver Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka (NICHD) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (NIMH). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNazy, DNazy, dekontaminacja DNA |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | z kontrolowaną temperaturą | |
| Bufor wirowy RLT plus | Qiagen | 1053393 | bufor do lizy tiocyjanianu guanidyny/ Część zestawu |
| Allprepß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME to środek redukujący, który nieodwracalnie denaturuje RNazy poprzez redukcję wiązań dwusiarczkowych |
| Koraliki LME MP | Biomedicals | 116914050 | rurka z kulkami |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | zautomatyzowany zestaw adapterów zakłócających próbki |
| Kolumna QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
| Probówka do mikrowirówek producenta | |||
| QIAcube i powiązane wyroby z tworzyw sztucznych | Qiagen | 9001292 | zautomatyzowany instrument do oczyszczania DNA/RNA |
| Wyjście DNA plus | Applichem | A7089 | nieenzymatyczny roztwór do dekontaminacji |
| Bufor | elucyjny Qiagen | 19086 | |
| QIAgility i pokrewne tworzywa sztuczne | Qiagen | 9001532 | zrobotyzowana maszyna do obsługi cieczy |
| PCR woda | MO BIO | 17000-5PRIME | |
| HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Odwrócone podkłady z kodami kreskowymi | Eurofin | Nr katalogu # | zaprojektowali i zamówili |
| 96-dołkową płytkę PCR | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 i powiązane wyroby | z tworzyw sztucznychAutomatyczny | analizator fragmentów DNA/RNA | G2964AA |
| odczynniki D1000 do Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Bufor i drabinka do próbek są częścią tego zestawu |
| Zestaw do usuwania inhibitorów PCR OneStep | Zymo Research | 50444470 | usuwanie inhibitora PCR odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta. |
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestaw | Qiagen | 28104 | : oczyszczanie produktów PCR na podstawie membrany krzemionkowej |
| Zestaw testowy Qubit dsDNA HS Bufor | rozcieńczający na bazie dimetylosulfotlenku Thermo | Fisher | Q32854 |
| Fluorometr kubitowy | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Spektrofotometr mikroobjętościowy | Thermo Fisher | |
| Zestaw MiSeq 300 V2 | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | Brak katalogu # | sekwencer nowej generacji |
Bibliografia
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolite....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
