Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Doniesiono, że mitochondria mogą zawierać do 12 enzymatycznych źródeł reaktywnych form tlenu (ROS). Większość z tych miejsc obejmuje zależne od flawiny kompleksy oddechowe i dehydrogenazy, które wytwarzają mieszaninę ponadtlenku (O2●-) i nadtlenku wodoru (H2O2). Dokładna kwantyfikacja potencjału wytwarzania RFT w poszczególnych miejscach w izolowanych mitochondriach może być trudna ze względu na obecność antyoksydacyjnych systemów obronnych i reakcji ubocznych, które również tworzą O, 2●-/H2O2. Stosowanie niespecyficznych inhibitorów, które mogą zakłócać bioenergetykę mitochondriów, może również zagrozić pomiarom poprzez zmianę uwalniania ROS z innych miejsc produkcji. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę jednoczesnego pomiaru uwalnianiaH2O2i produkcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) przez oczyszczone dehydrogenazy flawinowe. Do naszych celów użyliśmy jako przykładów oczyszczonego kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (PDHC) i kompleksu dehydrogenazy α-ketoglutaranu (KGDHC) pochodzenia sercowego świni. Metoda ta pozwala na dokładny pomiar natywnych szybkości uwalnianiaH2O2przez poszczególne miejsca produkcji poprzez eliminację innych potencjalnych źródeł ROS i systemów antyoksydacyjnych. Ponadto metoda ta pozwala na bezpośrednie porównanie zależności między uwalnianiemH2O2a aktywnością enzymu oraz badanie przesiewowe skuteczności i selektywności inhibitorów produkcji ROS. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może pozwolić na dogłębną ocenę natywnych szybkości uwalniania ROS dla poszczególnych enzymów przed przeprowadzeniem bardziej wyrafinowanych eksperymentów z izolowanymi mitochondriami lub przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi.
Wprowadzenie
Ostatecznym celem metabolizmu składników odżywczych jest wytworzenie trifosforanu adenozyny (ATP). W komórkach ssaków dzieje się to w mitochondriach, organellach o podwójnej błonie, które przekształcają energię zmagazynowaną w węglu w ATP. Produkcja ATP rozpoczyna się, gdy węgiel jest spalany przez mitochondria tworzące dwa nośniki elektronów, NADH i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH2)1. NADH i FADH2 są następnie utleniane przez wielopodjednostkowe kompleksy oddechowe I i II, odpowiednio, a uwolnione elektrony są przenoszone do końcowego akceptora elektronów tlenu cząsteczkowego (O2) w kompleksie IV
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Chemikalia i oczyszczone enzymy
- Zaopatrzyć się w następujące materiały: PDHC i KGDHC pochodzenia sercowego świń (lub innego oczyszczonego flawoenzymu mitochondrialnego); H2O2(30% roztwór), pirogronian, α-ketoglutaran, NAD+, NADH, CoASH, pirofosforan tiaminy (TPP), mannitol, HEPES, sacharoza, EGTA, kwas 3-metylo-2-oksowalerinowy (KMV), dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), peroksydaza chrzanowa (HRP), odczynnik 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyny (AUR) i CPI-613.
2. Planowanie testu i przygotowanie odczynnika
- Ustawić test zgodnie z tabelą 1 na płytce 96-dołkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 3A przedstawia reprezentatywny zapis RFU zarejestrowany podczas jednoczesnego pomiaru produkcji H2O2 i NADH przez oczyszczoną KGDHC. Surowe dane RFU dla każdego przedziału czasowego przedstawiono na Rysunku 3B. Następnie surowe dane RFU są eksportowane do analizy. Poprzez ekstrapolację z krzywych standardowych przedstawionych na Rysunku 2, można określić bezwzględną iloś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten jest korzystny, ponieważ: 1) eliminuje wszelkie konkurencyjne reakcje, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać wykrywanieH2O2(np. systemy przeciwutleniające lub inne źródła ROS), 2) zapewnia bezpośrednią ocenę natywnej szybkości uwalniania ROS przez mitochondrialną dehydrogenazę zawierającą flawinę, 3) umożliwia porównanie natywnych szybkości uwalniania ROS dwóch lub więcej oczyszczonych dehydrogenaz na bazie flawiny, 4) może pozwolić na bezpośrednie porównanie szybkości uwa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC). Produkcja wideo została zrealizowana we współpracy z Center for Innovation in Teaching and Learning (CITL) na Memorial University of Newfoundland.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej | SIGMA | P7032-10UN | oczyszczony |
| kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu | flawoenzymu SIGMA | K1502-20UN | oczyszczony flawoenzym |
| 30% roztwór nadtlenku wodoru | odczynnik SIGMA | HX0640-5 | , krzywe standardowe |
| Odczynnik NAD+ | SIGMA | N0632-1G | , test |
| aktywności/uwalniania ROSOdczynnik NADH | SIGMA | N4505-100MG | , krzywe standardowe |
| pirogronian | Odczynnik SIGMA | P2256-5G | , test aktywności/uwalniania ROS |
| alfa-ketoglutaran | SIGMA | 75892-25G | , test aktywności/uwalniania ROS |
| Odczynnik CoASH | SIGMA | C3019-25MG | , test aktywności/uwalniania ROS |
| pirofosforan tiaminy | SIGMA | C8754-1G | odczynnik, test aktywności/uwalniania ROS |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | składnik buforowy |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buforowy |
| sacharoza | SIGMA | S7903-250G | buforowy |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buforowy |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | , inhibitor uwalniania ROS |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | odczynnik, inhibitor uwalniania ROS |
| SOD | Odczynnik SIGMA | S9697-15KU | , odczynnik do wykrywania uwalniania |
| persoksydazy chrzanowej | SIGMA | P8375-1KU | , odczynnik do wykrywania uwalniania ROS |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | , wykrywanie uwalniania ROS |
| Czytnik mikropłytek Biotech Synergy 2 | BioTek Instruments | czytnik mikropłytek do testów | |
| Oprogramowanie Gen5 | Oprogramowanie BioTek Instruments | , używane do zbierania surowych danych | |
| RFU Graphpad Prism | Oprogramowanie Graphpad | , analiza danych | |
| Oprogramowanie Microsoft EXCEL | Microsoft | , analiza danych |
Bibliografia
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
