Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostra białaczka szpikowa (AML) jest chorobą niejednorodną, a jeśli nie jest leczona, śmiertelna. Jest to najczęstsza przyczyna śmiertelności związanej z białaczką u dorosłych. Początkowo AML jest chorobą hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) charakteryzującą się zatrzymaniem różnicowania, późniejszą akumulacją komórek blastycznych białaczki i zmniejszoną produkcją funkcjonalnych elementów hematopoetycznych. Heterogeniczność rozciąga się na obecność komórek macierzystych białaczki (LSC), przy czym ten dynamiczny przedział komórkowy ewoluuje, aby przezwyciężyć różne naciski selekcyjne wywierane podczas progresji i leczenia białaczki. Aby dokładniej określić populację LSC, dodanie CD90 i CD45RA pozwala na dyskryminację normalnych HSC i multipotencjalnych komórek progenitorowych w przedziale komórek CD34 + CD38. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji kilku przypuszczalnych markerów LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) na pierwotnych komórkach blastycznych ludzkiej AML za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Ponadto pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów. Ta metoda wykrywania i ilościowego oznaczania przypuszczalnego LSC może być stosowana do klinicznej obserwacji odpowiedzi na chemioterapię (tj. minimalnej choroby resztkowej), ponieważ resztkowa LSC może powodować nawrót AML.
Wprowadzenie
Ostra białaczka szpikowa (AML) jest najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z białaczką. Początkowo AML jest chorobą klonalną hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) charakteryzującą się zatrzymaniem różnicowania, późniejszą akumulacją komórek blastycznych i zmniejszoną produkcją funkcjonalnych elementów krwiotwórczych. Ostatnio ustalono heterogeniczność klonalną populacji komórek blastycznych głównie przy użyciu strategii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i wykazując istnienie wewnątrzklonalnej ewolucji komórek nowotworowych1.
Heterogeniczność rozciąga się na obecność białaczkowych komórek macierzystych (LSC). Przypuszcza się, że ten dynamiczny przedział komórkowy ewoluuje, aby przezwyciężyć różne naciski selekcyjne wywierane podczas progresji i leczenia białaczki. W związku z tym uważa się, że LSC jest oporny na obecne schematy chemioterapeutyczne i pośredniczy w nawrocie choroby, co ma głębokie implikacje kliniczne2. Opisano różne markery charakteryzujące LSC, takie jak CD1233, CLL-14, CD975 lub TIM-36. Uważa się, że kompartment CD34 + CD38- komórek blastycznych jest wzbogacony dla LSC7, ale obejmuje również normalny HSC. Ekspresja CD90 i CD45RA zastosowana do przedziału CD34+CD38- (P6) (Rysunek 1) pozwala na segregację kilku etapów prawidłowych i złośliwych prekursorów układu krwiotwórczego 8. W szczególności w większości przypadków AML można określić normalne komórki progenitorowe CD34 + CD38-CD90 + CD45RA, multipotencjalne komórki progenitorowe (MPP), takie jak CD34 + CD38-CD90 dimCD45RA- i CD34 + CD38-CD90-CD45RA + limfoidalne multipotencjalne komórki progenitorowe (LMPP) 8,9. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) CD38 jest szczególnie ważna, aby wziąć ją pod uwagę w przedziale komórkowym CD34 +. Ponieważ intensywność CD38 definiuje trzy nowe przedziały komórkowe: CD38 ujemny (P6), CD38 przyciemniony (P7) i CD38 jasny (P8) (Rysunek 1). MFI CD38 można określić przy użyciu hematogonów i/lub komórek plazmatycznych jako wewnętrznej kontroli pozytywnej, ponieważ komórki te silnie eksprymują CD38.
Mysi modelNOD/SCID/IL2Rγc null (NSG) z niedoborem odporności jest powszechnie stosowany do wszczepiania prawidłowych i złośliwych ludzkich komórek krwiotwórczych10,11. Seryjne testy ksenotransplantacji są stosowane do eksperymentalnej walidacji funkcji LSC lub HSC. Badania te zostały szeroko przeanalizowane za pomocą podejść sekwencjonowania na dużą skalę. Niemniej jednak mniej wiadomo na temat immunofenotypu LSC i HSC populacji blastów AML wszczepionych myszom NSG w porównaniu z jej pierwotną AML (Figura 2).
Liczby LSC są z natury niskie, dlatego identyfikacja i kwantyfikacja LSC są trudne, a opisana tutaj metoda może być użyta jako test cytometrii przepływowej przy diagnozie i podczas obserwacji klinicznej w celu oceny odpowiedzi na chemioterapię (ponieważ resztkowe LSC może powodować nawrót AML). Obecność LSC może wskazywać na dodatnią minimalną chorobę resztkową (MRD). Do tej pory monitorowanie MRD w AML opiera się głównie na metodach molekularnych (tj. RT-PCR, NGS)10,12. Jednak w tym protokole wykrywamy jednoczesną ekspresję białka kilku markerów HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) na pierwotnych komórkach blastycznych ludzkiej AML za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej2,8,9. Ta kombinacja przeciwciał może być stosowana w każdym standardowym laboratorium cytometrii przepływowej, a ten test MRD przepływu jest szczególnie interesujący, gdy MRD za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) nie jest możliwe, tj. jeśli markery molekularne specyficzne dla białaczki nie są wykrywalne w próbce diagnostycznej AML. Co więcej, protokół ten jest komplementarny z bardziej czułymi molekularnymi technikami MRD, ponieważ ma na celu wykrycie i ilościowe określenie nieprawidłowych hematopoetycznych komórek progenitorowych, które reprezentują funkcjonalną charakterystykę komórki (Rysunek 3).
Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje krwiotwórczych progenitorów i przypuszczalny przedział LSC o różnym stopniu dojrzewania za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałami dostępnymi w większości laboratoriów klinicznych. Ponadto potwierdziliśmy obecność tych przedziałów komórkowych w odpowiednich ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów (PDX) i podczas obserwacji leczenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przestrzegamy europejskich standardów wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. To badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (#3097-2015120414583482v3).
1. Przygotowanie próbki
- Pobrać szpik kostny (2 ml) z ostrej białaczki szpikowej de novo w probówkach zawierających antykoagulant kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w stężeniu 1,8 mg na ml szpiku kostnego.
- Wykonaj separację Ficoll, separację gradientu gęstości w celu wyizolowania komórek jednojądrzastych z krwinek czerwonych i granulocytów, jak pokazano poniżej. Rozcieńczyć szpik kostny w 3 objętościach buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Ostrożnie nałożyć 1 objętość Ficollu na 1 objętość rozcieńczonego szpiku kostnego. Wirować 30 minut przy 300 x g bez hamulca. Przenieś warstwę białego kożuchowego płaszcza komórek jednojądrowych do nowej sterylnej probówki.
- Przemyć komórki dwukrotnie w 10 ml PBS) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, w celu usunięcia zanieczyszczających składników surowicy.
2. Liza czerwonych krwinek (RBC)
- Dodać 2 ml buforu do lizy (chlorek amonu 0,8%) do osadu komórkowego, delikatnie wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
Uwaga: w razie potrzeby powtórz ten krok. - Przemyć komórki w PBS, jak opisano wcześniej (1.3.).
3. Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów.
- Pozyskanie komórek blastycznych ze szpiku kostnego po oddzieleniu Ficollu i po wyczerpaniu limfocytów za pomocą negatywnej selekcji immunomagnetycznej (CD3 dla limfocytów T i CD20 dla limfocytów B). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wstrzyknij 5 x 106 komórek blastycznych AML do żyły ogonowej nieuwarunkowanych myszy NSG. Użyj urządzenia krępującego, aby ułatwić wstrzyknięcie żyły ogonowej. Trzymaj myszy w konwencjonalnych warunkach, a zwłaszcza w warunkach wolnych od określonych patogenów przez cały czas, używając indywidualnych wentylowanych klatek i manipulując pod kapturem z przepływem laminarnym. Co dwa tygodnie pobieraj 60 μl krwi metodą pobierania podżuchwowego za pomocą naczynia włosowatego hematokrytu. Umieść kapilar w probówce o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Zatamować krwawienie, delikatnie uciskając go małym sterylnym gazikiem. Wydalić krew czystą strzykawką.
- Dodać 1 ml buforu do lizy i inkubować przez 5 minut. Następnie wirować przy 300 x g przez 5 minut. Przemyć PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, dodać 100 μl PBS z 10% barwnikiem albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 3 μl anty-ludzkiego CD45-FITC i 1 μl anty-mysiego CD45-APC i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut.
- Przemyć osad komórkowy dwa razy w PBS (2 ml) z 10% BSA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
- Podwielokrotność do 1 x 106 komórek na 100 μl PBS do probówek do cytometrii przepływowej.
- Wszczepianie ankietowe co dwa tygodnie za pomocą analizy chimeryzmu ekspresji CD45 (człowiek kontra mysz) przy użyciu cytometrii przepływowej (Figura 2A i B).
- Podczas składania ofiary (liczba blastów obwodowych większa niż 70% lub ciężkie objawy kliniczne choroby) należy pobrać jednojądrzaste komórki blastyczne ze zmiażdżonych śledzionów i szpiku kostnego, przepłukując piszczele i kości udowe PBS, jak opisano wcześniej13. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi.
- Jeśli osad komórkowy zawiera erytrocyty, należy przeprowadzić lizę czerwonych krwinek za pomocą buforu do lizy (krok 2.1).
- Przemyć komórki dwa razy w PBS (2 ml) z 10% BSA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
- Zebrać komórki i podwielokrotność do 1 x 106 komórek na 100 μl PBS do probówek do cytometrii przepływowej.
4. Barwienie
- Dodaj sprzężone przeciwciała (patrz krok 4.2) i wir. Inkubuj komórki przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Poniższy panel należy zastosować do próbek pierwotnych lub PDX składających się z 10 μl anty-CD36-FITC, 5 μl anty-CD19-ECD, 5 μl anty-CD33-PC5.5, 5 μl anty-CD90-APC, 5 μl anty-CD34-AA700, 5 μl anty-CD45RA-APC-H7, 5 μl anty-CD38-Pacific Blue, 5 μL anty-CD123-PC7 i 2,5 μL anty-CD45-KO.
- Usunąć niezwiązane przeciwciała, przemłukując komórki w 2 ml PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w 450 μl PBS w celu końcowej analizy cytometrycznej przepływu.
5. Strategia bramkowania do analizy cytometrii przepływowej
- Wykonaj akwizycję danych (co najmniej 500 000 komórek) na cytometrze przepływowym wyposażonym w lasery czerwony, niebieski i fioletowy. Codziennie sprawdzaj ustawienia cytometru pod kątem 1) wyrównania optycznego, 2) układu fluidycznego, 3) czułości optycznej i 4) standaryzacji za pomocą fluorosfer
- Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania sekwencyjnego, aby zdefiniować wyrażenie CD38 (Rysunek 1).
- Użyj komórek z normalnych próbek szpiku kostnego, aby zdefiniować hematogonie lub komórki plazmatyczne, które będą służyć jako pozytywna kontrola ekspresji CD38.
Uwaga: ta bramka jest szczególnie ważna do oceny, ponieważ kolejne przypuszczalne populacje LSC zależą od jej definicji. - Zdefiniuj fizjologiczne komórki prekursorowe (normalne komórki blastyczne) za pomocą kryteriów niskiej populacji CD45dim / SSC (rozproszenie boczne) (Rysunek 1A). W tej populacji blastów zdefiniuj hematogoni, które wykazują fenotyp CD38 + + CD19 + (Figura 1B) i na koniec użyj wyrażenia CD36 i CD33 do zdefiniowania mieloblastów, monoblastów i erytroblastów (Figura 1C). Określ ekspresję CD34 na hematogoniach, jak pokazano na (Rysunek 1E). Oceń kilka subpopulacji prekursorów w komórkach blastycznych zdefiniowanych jako P6-P10 (Rysunek 1D). Oddziel przedział CD34 komórek blastycznych na subpopulacje progenitorowe P6, P7, P8 w oparciu o wstępnie ustawione bramki CD38. Upewnij się, że przedział P8 zawiera blasty, które mają taką samą intensywność CD38 jak hematogony, że P6 zawiera komórki, które są oparte na CD38 fluorescencji minus jeden (FMO) kontrola i że komórki P7 znajdują się pomiędzy dwoma skrajnościami w odniesieniu do ekspresji CD38 (Figura 1D).
- Użyj komórek z normalnych próbek szpiku kostnego, aby zdefiniować hematogonie lub komórki plazmatyczne, które będą służyć jako pozytywna kontrola ekspresji CD38.
- Z komórek bramkowanych CD34 + 38- (P6) oddziel HSC od przypuszczalnego LSC za pomocą ekspresji CD90 i CD45RA (Rysunek 1F).
Uwaga: fenotyp HSC to CD34+CD38-CD90+CD45RA-, a multipotencjalne czynniki progenitorowe (MPP) są zdefiniowane jako CD34+CD38-CD90-CD45RA-. Przypuszczalny fenotyp LSC to CD34+CD38-CD90dimCD45RA+, a bardziej niedojrzała populacja to progenitorzy zaszczepieni limfoidami (LMPP) zdefiniowani jako CD34+CD38-CD90-CD45RA+.
6. Monitorowanie MRD za pomocą RT-PCR
- Monitoruj poziomy MRD za pomocą RT-PCR, jak opisano wcześniej14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiamy tutaj metodę oznaczania populacji progenitorowych w prawidłowych i złośliwych próbkach szpiku kostnego człowieka. Pobrano szpik kostny oraz śledzionę z udanego modelu PDX i przeprowadzono multiparametryczną cytometrię przepływową zgodnie z powyższym opisem. Porównano kilka subpopulacji blastów w diagnostycznej próbce pacjenta oraz w odpowiadającym jej modelu PDX, a w szczególności przedział progenitorowy CD34+CD38-, w którym stwierdzono znaczne wzbogacenie domniemanych LSC. Wykazano, że frakcja blastów CD34...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dokładna i powtarzalna ocena markerów błonowych lub cytoplazmatycznych za pomocą cytometrii przepływowej wymaga, aby ustawienia przyrządu były codziennie weryfikowane pod kątem wyrównania optycznego, prawidłowego funkcjonowania układu fluidycznego, czułości optycznej i standaryzacji za pomocą koralików kalibracyjnych.
Wykrywanie populacji komórek blastycznych w AML za pomocą CD90 i CD45RA za pomocą wieloparametrycznej analizy cytometrii przepływowej jest stosunkowo prostą i niezawodną metodą. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Francuskie Stowarzyszenie Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Północne Centrum), Fondation de France (Komitet ds. Białaczki), SIRIC Oncolille i Francuski Narodowy Instytut Raka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Bufor do lizy RBC (10x) | Ozym | BLE420301 | roztwór do lizy RBC A: 8,29 g NH4Cl + 0,037 g Na2EDTA w 100 ml sterylnego roztworu do lizy H2O i RBC: 1 g KHCO3 w 100 ml sterylnego H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγ cnull (NSG) myszy | JACKSON LABORATORY | Nr katalogowy: 005557 | |
| PBS | Gibco firmy life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – Bufor separacyjny MACS | Bufor MACS Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (klon FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (klon D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (klon 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (klon J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (klon 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (klon HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (klon LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (klon J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anty-CD123-PC7 | Beckman Redlica | B13647 | |
| Zestaw przepływowy | Beckman Coulter | A63492 | |
| Kontrola przepływu | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| Zestaw selekcyjny EasySep do badania ludzkiego PE | Technologie komórek macierzystych | 18000 | |
| EasySep magnes | Technologie komórek macierzystych | 18551 |
Bibliografia
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587(2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
