Method Article

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

DOI:

10.3791/56980

⸱

April 2nd, 2018

 ,  , 
1Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Center for Information and Neural Networks

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie fizjologicznej dynamiki mózgu i tkanek obwodowych jest niezbędne do odpowiedzi na szereg pytań dotyczących tego, jak mózg kontroluje funkcje ciała i rytmy narządów wewnętrznych, gdy zwierzęta są narażone na wyzwania emocjonalne i zmiany w ich środowisku życia. Ogólnie rzecz biorąc, sygnały z różnych narządów, takich jak mózg i serce, są rejestrowane przez niezależne systemy rejestrujące, które wymagają wielu urządzeń rejestrujących i różnych procedur przetwarzania plików danych. Badanie to opisuje nową metodę, która może jednocześnie monitorować biosygnały elektryczne, w tym dziesiątki lokalnych potencjałów pola w wielu regionach mózgu, elektrokardiogramy reprezentujące rytm serca, elektromiogramy, które reprezentują skurcze mięśni związane ze snem i czuwanie/snem oraz sygnały oddechowe u swobodnie poruszającego się szczura. Konfiguracja zapisu tej metody opiera się na konwencjonalnym układzie mikronapędów do korowych zapisów potencjału pola lokalnego, w którym mieszczą się dziesiątki elektrod, a sygnały uzyskane z tych elektrod są zintegrowane w jednej tablicy elektrycznej zamontowanej na głowie zwierzęcia. W tym przypadku ten system nagrywania został ulepszony tak, aby sygnały z narządów obwodowych były również przesyłane na płytkę interfejsu elektrycznego. Podczas pojedynczej operacji elektrody są najpierw oddzielnie wszczepiane do odpowiednich części ciała i docelowych obszarów mózgu. Otwarte końce wszystkich tych elektrod są następnie lutowane do poszczególnych kanałów tablicy elektrycznej nad głową zwierzęcia, dzięki czemu wszystkie sygnały można zintegrować w jednej tablicy elektrycznej. Podłączenie tej płytki do urządzenia rejestrującego pozwala na zebranie wszystkich sygnałów w jednym urządzeniu, co zmniejsza koszty eksperymentów i upraszcza przetwarzanie danych, ponieważ wszystkie dane mogą być obsługiwane w tym samym pliku danych. Technika ta pomoże w zrozumieniu neurofizjologicznych korelatów powiązań między narządami centralnymi i obwodowymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy kontroluje stany ciała w odpowiedzi na różne zmiany środowiskowe, a ta kontrola jest zazwyczaj reprezentowana jako zmiany w tętnie, częstości oddechów i skurczach mięśni. Jednak niewiele badań sprawdzało, w jaki sposób takie obwodowe czynniki fizjologiczne są związane z aktywnością kory mózgowej. Aby rozwiązać ten problem, konieczna jest metoda rejestracji na dużą skalę do monitorowania biosygnałów elektrycznych zarówno z tkanek centralnych, jak i obwodowych. W korze mózgowej sygnały potencjału pola lokalnego (LFP) są rejestrowane zewnątrzkomórkowo przez elektrody, które są wprowadzane do tkanek korowych1,2,3. Aby jednocześnie rejestrować wiele sygnałów LFP z obszarów korowych małych ssaków, takich jak szczury i myszy, w wielu badaniach opracowano różne rodzaje niestandardowych zespołów elektrod, które określa się mianem mikronapędów. Konwencjonalny mikronapęd składa się z metalowych przymocowanych do środkowych części elektrod (które zazwyczaj są tetrodami), korpusu rdzenia, który mieści i elektrody, oraz płytki interfejsu elektrycznego (EIB), która mieści metalowe otwory do łączenia otwartych końców elektrod (Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 3). Ten zespół elektrod umożliwia operatorowi kontrolowanie głębokości wielu elektrod wprowadzanych do mózgu w ciągu kilku dni lub tygodni i umożliwia prowadzenie długotrwałych, przewlekłych zapisów aktywności neuronalnej, gdy zwierzę jest poddawane różnym zadaniom behawioralnym. W narządach obwodowych sygnały bicia serca są rejestrowane jako elektrokardiogramy (EKG) przez parę elektrod, które są wszczepiane w obszar serca lub wokół niego4,5,6, a sygnały mięśni szkieletowych są rejestrowane jako elektromiogramy (EMG) z elektrodami, które są wprowadzane do tkanki mięśniowej7,8,9. Związek między sygnałami elektrycznymi opuszki węchowej a rytmem oddychania (BR) został zbadany za pomocą nagrań pojedynczych jednostek10,11. W konwencjonalnych systemach rejestrujących te sygnały z różnych tkanek zostały przechwycone przez niezależne urządzenia rejestrujące, co oznacza, że wymagany jest dodatkowy system eksperymentalny do precyzyjnej synchronizacji tych wielu urządzeń do jednoczesnego nagrywania sygnałów mózg-ciało. Ten system został opracowany w celu przezwyciężenia tego problemu. W tym systemie wszystkie sygnały elektryczne zarejestrowane z narządów obwodowych, w tym EKG, EMG i sygnały elektryczne z opuszki węchowej, które odzwierciedlają rytm oddychania, są zintegrowane w jedną tablicę mikronapędów1,2,3, tutaj nazywany integracyjnym układem mikronapędów. Ten system wymaga tylko jednego wielokanałowego urządzenia rejestrującego i może być stosowany do każdej konwencjonalnej macierzy mikronapędów. Zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga żadnych specjalnych urządzeń ani sygnałów wyzwalających, aby dopasować się do czasu nagrywania wielu urządzeń, a także pozwala na wygodniejsze przetwarzanie danych, ponieważ wszystkie sygnały są rejestrowane jako podobne typy danych. Technika ta pomoże w zrozumieniu neurofizjologicznych korelatów powiązań między narządami centralnymi i obwodowymi. W artykule opisano procedury związane z tą techniką i przedstawiono reprezentatywne zestawy danych uzyskane od szczura.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

1. Przygotowanie zintegrowanej macierzy mikronapędów

  1. Utwórz macierz mikronapędów dla korowych nagrań LFP, jak opisano w innym miejscu1,2,3. Pozostaw co najmniej 6 metalowych otworów otwartych na płytce interfejsu elektrody (EIB) do użycia jako kanały EKG/EMG/BR, które są podłączone do przewodów bioflex, jak opisano w 1.2.
  2. Przetnij drut bioflex na 6 części o długości 5,0 cm. Zdejmij powłokę z politetrafluoroetylenu (PTFE) z obu końców wszystkich kawałków drutu o długości ~5,0 mm. Podłącz jeden koniec każdego z kawałków drutu do jednego z otwartych metalowych otworów (kanały EKG/EMG/BR) w EIB za pomocą złotego kołka.
  3. Pokrój drut emaliowany na dwa kawałki o długości 5,0 cm. jeden koniec każdego z tych przewodów do kanałów uziemienia/odniesienia (g/r) w EIB (Rysunek 3, zobacz także poprzednie artykuły12,13).
  4. W celu przygotowania elektrod EKG należy przeciąć drut bioflex na dwa 16-centymetrowe kawałki. Odklej powłokę PTFE z końców tych kawałków drutu na długości ~5.0 mm na jednym końcu (krótki koniec) i ~15 mm na drugim końcu (długi koniec).
  5. Uformuj druciany pierścień o średnicy 2,0 mm, zginając długi koniec drutu i ustalając kształt pierścienia przez.
  6. W celu przygotowania elektrod EMG należy przeciąć drut bioflex na 2 części o długości 8 cm. Zdjąć powłokę PTFE z obu końców tych kawałków drutu o długości ~5,0 mm.
  7. W celu przygotowania elektrod BR należy przeciąć drut bioflex na 2 części o długości 6,0 cm. Odkleić powłokę emaliowaną z obu końców tych kawałków drutu o długości ~5,0 mm. jeden koniec każdego z tych kawałków drutu do łba ze stali nierdzewnej (średnica trzpienia: 1,0 mm, długość trzpienia: 4,0 mm).
  8. W celu przygotowania elektrod uziemiających/referencyjnych (gr) należy przeciąć drut emaliowany na 2 części o długości 6,0 cm. Odklej powłokę emaliowaną z obu końców tych kawałków drutu o długości ~5,0 mm. jeden koniec każdego z tych kawałków drutu do łba ze stali nierdzewnej (średnica trzpienia: 1,4 mm, długość trzpienia: 3,0 mm).
  9. Sterylizuj gazem wszystkie elektrody i ze stali nierdzewnej i przechowuj je w czystej przestrzeni.

2. Implantacja elektrod EKG/EMG

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki chirurgiczne z zachowaniem aseptyki, używając wysterylizowanych rękawiczek i autoklawowanych narzędzi. W przypadku wszystkich etapów związanych z wykonaniem nacięcia, należy wcześniej wysterylizować skórę 70% etanolem i przykryć nacięcie serwetami chirurgicznymi.

  1. Zamocuj znieczulonego (1,0-3,0% izofluranu) szczura na grzbiecie na płaskiej poduszce grzewczej. Podawaj buprenorfinę jako środek przeciwbólowy. Umieść maść weterynaryjną na oczach szczura, aby zapobiec wysuszeniu. Użyj betadyny, aby oczyścić powierzchnię skóry.
  2. Wykonaj nacięcie o długości ~2,0 cm w przyśrodkowej części klatki piersiowej. Odsłoń mięśnie międzyżebrowe, oddzielając mięśnie klatki piersiowej. Zszyj pierścienie elektrod EKG z mięśniami międzyżebrowymi.
  3. Zamocuj żołądek zwierzęcia na poduszce grzewczej. Wykonaj nacięcie o długości ~1,0 cm w okolicy grzbietowej szyi.
  4. Wprowadzić elektrody EKG podskórnie przez nacięcie w klatce piersiowej. Wsuń końce do grzbietowej części szyi i wyciągnij je z nacięcia szyi. Zszyj nacięcie klatki piersiowej.
  5. Wprowadzić jeden koniec każdej z elektrod EMG podskórnie na długość ~2,0 cm przez nacięcie szyi. Przymocuj elektrody EMG do mięśnia szyi za pomocą zszycia.

3. Implantacja układu Integrative Micro-Drive i elektrod BR

  1. Napraw szczura na urządzeniu stereotaktycznym. Wykonaj nacięcie ~3,0 cm na głowie wzdłuż linii środkowej od punktu między oczami do obszaru szyi. Odsłoń czaszkę.
  2. Wykonaj dwie okrągłe kraniotomia o średnicach 0,7-1,0 mm powyżej opuszki węchowej 11,0 mm z przodu i 1 mm obustronne do bregmy za pomocą wiertła szybkoobrotowego. Wszczepij dwie elektrody BR w czaszkę, aż końcówki trzpieni zostaną przymocowane do powierzchni mózgu.
  3. Wykonaj dwie okrągłe kraniotomia o średnicach 0,7-1,0 mm powyżej kory czołowej, 2,7 mm z przodu i 2,7 mm obustronnie do bregmy. Wszczepić dwie elektrody g/r w czaszkę, aż końcówka trzpienia zostanie przymocowana do powierzchni mózgu.
  4. Wykonaj od sześciu do ośmiu otworów o średnicy 1,0 mm w obszarze otaczającym dużą kraniotomię. kotwiące implant (średnica trzpienia: 1,4 mm, długość trzpienia: 3,0 mm) w czaszce.
  5. Wykonaj dużą okrągłą kraniotomię o średnicy ~2,0 mm powyżej hipokampa, 3,8 mm z tyłu i 2,5 mm obustronnie do bregmy. Umieść całkujący układ mikronapędów w taki sposób, aby końcówka kaniuli układu napędowego znajdowała się nad dużą kraniotomią
  6. Szczelinę między końcówką kaniuli a powierzchnią mózgu wypełnić ~100 μL dwóch roztworów, tj. 0,5% (masowo) alginianu sodu i 10% (masowo) chlorku wapnia.
    UWAGA: W ten proces powstaje przezroczysty żel w ciągu ~5 minut, po zmieszaniu dwóch roztworów na czaszce.
  7. Przykryj kaniulę, elektrody BR, elektrody g/r i kotwiące cementem dentystycznym o grubości 0.5 cm. Na tym etapie UWAŻAJ, aby NIE zakrywać otwartych końców elektrod BR i g/r cementem.
  8. otwarte końce elektrod EKG, EMG, BR i g/r do poszczególnych końcówek przewodów, które były wcześniej podłączone do EIB (patrz kroki 1.2 i 1.3).
  9. Przykryj dolną część zintegrowanego układu mikronapędów i wszystkie przewody elektrod cementem dentystycznym. Upewnij się, że wszystkie druty elektrod są całkowicie zakryte, aby szczur nie mógł ich wydrapać po implantacji.
  10. Po odzyskaniu przytomności na tyle, aby utrzymać pozycję leżącą mostka, należy umieścić zwierzę z powrotem w przezroczystej domowej kabinie z pleksiglasu i trzymać je samodzielnie ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia. Po operacji należy leczyć zwierzę antybiotykami (gentamycyną).
  11. Po zabiegu należy obserwować zwierzęta za pomocą codziennej obserwacji. Sprawdź, czy chodzą prawidłowo i czy nie piszczą, gdy eksperymentator dotyka układu mikronapędów.

4. Nagrania in vivo

UWAGA: Wszystkie sygnały są wzmacniane, próbkowane z częstotliwością 2 kHz i filtrowane pasmowo-przepustowo (0,1 - 500 Hz), z wyjątkiem czynności jednostkowych (próbkowane z częstotliwością 30 kHz i filtrowane pasmowo-przepustowo (500 - 6 kHz)).

  1. Podłącz EIB zintegrowanego układu mikronapędów do stopnia głównego urządzenia rejestrującego.
  2. Przesuwaj tetrody, przekręcając przez kilka tygodni po zabiegu. Gdy tetrody znajdą się w sąsiedztwie docelowych obszarów mózgu, osadź tetrody w tych obszarach przez kilka dni, aby uzyskać stabilne zapisy.
  3. Monitoruj sygnały elektryczne, gdy zwierzę swobodnie porusza się w komorze rejestracyjnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda może jednocześnie rejestrować sygnały bioelektryczne z wielu narządów, które reprezentują aktywność neuronalną mózgu, tętno, rytm oddychania i skurcze mięśni szkieletowych (Rysunek 1). Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne dane z zapisu swobodnie poruszającego się szczura, który swobodnie żerował w prostokątnym pudełku (25 × 40 cm2). Przykładowy zestaw danych zawiera typowe przejścia behawior...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć, w jaki sposób mózg moduluje poziomy aktywności obwodowej i odwrotnie, konieczne są metody rejestrowania na dużą skalę, aby jednocześnie przechwytywać biosygnały elektryczne z wielu obszarów ciała. W badaniu tym opisano zabieg chirurgiczny i system rejestracji do monitorowania potencjałów lokalnego pola mózgowego, częstości akcji serca, wielkości budowy mięśni i częstości oddechów, które zostały ulepszone w systemie rejestrowania, który jest używany do zapisów zewnątrzkomórkowych w tkance mózgowej. System t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kaken-hi (17H05939; 17H05551), Fundację Nakatomi i Fundację Pamięci Suzuken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Drut przyłączeniowy FEP ze skręconej stali nierdzewnej Cooner Wire Company, Chatsworth, CAAS 633Drut Bioflex
EIB-36-PTBNeuralynx, Inc., Bozeman, MTEIB-36-PTB
EIB Cereplex  MSkała  Microsystems, Salt Lake City, UTCyfrowa stacja czołowa
Cereplex Direct Skała  Microsystems, Salt Lake City, UTSystem akwizycji danych
Drut magnesów poliuretanowych UEWOyaide.com, Tokio, JaponiaUEW 0,14mm 20m Drut emaliowany
SD-102Narishige, Tokio, JaponiaSD-102Wiertarka szybkoobrotowa
Minimo ONE SERIES ver.2Minitor Co., Ltd, Tokio, JaponiaC2012Wiertarka wysokociśnieniowa Zasilacz 
Provinice 250 mLShofu Inc., Kioto, Japonia213620136Cement dentystyczny
Środek znieczulający dla małych zwierząt Biomaszyny, Chiba, JaponiaZnieczulaczTK-7
Chlorowodorek buprenorfinySigma-Aldrich, St. Louis, MOB7536-1MLPrzeciwbólowy
izofluranDS Pharma Animal Health, Osaka, Japonia Isoflu 250mL
wazelina, biała Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia224-00165 Maść weterynaryjna 
  Alginian soduNacalai tesque, Kioto, Japonia31131-85
Dihydrat chlorku wapniaWako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia031-00435 
Śruba ze stali nierdzewnej M1.0 i razy; 4.0 MonotaRO, Hyogo, Japonia42617504Śruba ze stali nierdzewnej do elektrod BR
Śruba ze stali nierdzewnej M1,4 i razy; 3.0MonotaRO, Hyogo, Japonia42617687Śruba ze stali nierdzewnej do elektrod g / r i kotew
 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094(2009).
  2. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098(2009).
  3. Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
  4. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
  5. Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697(2014).
  6. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
  7. Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
  8. Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
  9. Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678(2016).
  10. Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
  11. Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
  12. Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
  13. Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cortical Local Field PotentialsElectrocardiogram RecordingElectromyogram MonitoringBreathing Rhythm AnalysisFreely Moving RatSimultaneous Signal RecordingMicro drive Array ImplantationMulti channel Data IntegrationWavelet Analysis ApplicationCentral Peripheral Correlation

Related Articles