Method Article

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

DOI:

10.3791/56981

⸱

October 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Składane reportery to białka o łatwych do zidentyfikowania fenotypach, takich jak oporność na antybiotyki, których fałdowanie i funkcja są zagrożone, gdy są połączone ze słabo fałdowanymi białkami lub losowymi otwartymi ramkami odczytu. Opracowaliśmy strategię, w której za pomocą TEM-1 β-laktamazy (enzymu nadającego oporność na ampicylinę) w skali genomowej, możemy wybrać zbiory prawidłowo sfałdowanych domen białkowych z kodującej części DNA dowolnego genomu beztronowego. Fragmenty białek uzyskane w ten sposób, tak zwane "domenom", będą dobrze wyrażone i rozpuszczalne, dzięki czemu będą odpowiednie do badań strukturalnych/funkcjonalnych.

Poprzez klonowanie i wyświetlanie "domenomu" bezpośrednio w systemie wyświetlania fagów, pokazaliśmy, że możliwe jest wybranie określonych domen białkowych o pożądanych właściwościach wiązania (np. z innymi białkami lub przeciwciałami), dostarczając w ten sposób niezbędnych informacji eksperymentalnych do adnotacji genów lub identyfikacji antygenu.

Identyfikacja najbardziej wzbogaconych klonów w wybranej populacji poliklonalnej może być osiągnięta dzięki zastosowaniu nowatorskich technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Z tych powodów wprowadzamy głęboką analizę sekwencjonowania samej biblioteki i wyników selekcji, aby dostarczyć pełnych informacji na temat różnorodności, obfitości i precyzyjnego odwzorowania każdego z wybranych fragmentów. Przedstawione tutaj protokoły pokazują kluczowe etapy budowy, charakterystyki i walidacji biblioteki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę budowy i wyboru bibliotek złożonych i rozpuszczalnych domen białkowych z dowolnego źródła początkowego genicznego/genomowego. Podejście to łączy w sobie trzy różne technologie: wyświetlanie fagów, wykorzystanie składanego reportera i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) ze specjalnym narzędziem internetowym do analizy danych. Metody te mogą być stosowane w wielu różnych kontekstach badań opartych na białkach, do identyfikacji i adnotacji nowych białek/domen białkowych, charakterystyki właściwości strukturalnych i funkcjonalnych znanych białek, a także definiowania sieci interakcji białkowych.

Wiele otwartych pytań jest nadal obecnych w badaniach opartych na białkach, a rozwój metod optymalnej produkcji białka jest ważną potrzebą dla kilku dziedzin badań. Na przykład, pomimo dostępności tysięcy genomów prokariotycznych i eukariotycznych1, dla zdecydowanej większości organizmów nadal brakuje odpowiedniej mapy względnych proteomów z bezpośrednią adnotacją kodowanych białek i peptydów. Katalog kompletnych proteomów jawi się jako ambitny cel, wymagający ogromnego wysiłku pod względem czasu i zasobów. Złotym standardem w adnotacji eksperymentalnej pozostaje klonowanie wszystkich otwartych ramek odczytu (ORF) genomu, budując tak zwany "ORFeome". Zazwyczaj funkcja genu jest przypisywana na podstawie homologii do pokrewnych genów o znanej aktywności, ale to podejście jest słabo dokładne ze względu na obecność wielu nieprawidłowych adnotacji w referencyjnych bazach danych2,3,4,5. Co więcej, nawet w przypadku białek, które zostały zidentyfikowane i oznaczone, wymagane są dodatkowe badania, aby uzyskać charakterystykę pod względem liczebności, wzorców ekspresji w różnych kontekstach, w tym właściwości strukturalnych i funkcjonalnych, a także sieci interakcji.

Ponadto, ponieważ białka składają się z różnych domen, z których każda wykazuje specyficzne cechy i inaczej przyczynia się do funkcji białek, badanie i dokładna definicja tych domen może pozwolić na uzyskanie bardziej wszechstronnego obrazu, zarówno na poziomie pojedynczego genu, jak i na poziomie pełnego genomu. Wszystkie te niezbędne informacje sprawiają, że badania oparte na białkach są szeroką i wymagającą dziedziną.

Z tego punktu widzenia, ważnym wkładem mogłyby być bezstronne i wysokoprzepustowe metody produkcji białka. Jednak powodzenie takich podejść, oprócz wymaganych znacznych inwestycji, zależy od zdolności do produkcji rozpuszczalnych/stabilnych konstruktów białkowych. Jest to główny czynnik ograniczający, ponieważ szacuje się, że tylko około 30% białek może być z powodzeniem wyrażanych i wytwarzanych na wystarczających poziomach, aby były eksperymentalnie użyteczne6,7,8. Podejście mające na celu przezwyciężenie tego ograniczenia opiera się na wykorzystaniu losowo pofragmentowanego DNA do produkcji różnych polipeptydów, które razem zapewniają nakładającą się reprezentację fragmentów poszczególnych genów. Tylko niewielki procent losowo wygenerowanych fragmentów DNA to funkcjonalne ORF, podczas gdy zdecydowana większość z nich jest niefunkcjonalna (ze względu na obecność kodonów stop w ich sekwencjach) lub koduje nienaturalne (ORF w ramce innej niż oryginalna) polipeptydy bez znaczenia biologicznego.

Aby rozwiązać wszystkie te problemy, nasza grupa opracowała wysokoprzepustową platformę do analizy ekspresji i interakcji białek, która może być używana w skali genomicznej9,10,11,12. Platforma ta integruje następujące techniki: 1) metodę selekcji zbiorów prawidłowo sfałdowanych domen białkowych z kodującej części DNA z dowolnego organizmu; 2) technologia wyświetlania fagów do wyboru partnerów interakcji; 3) NGS w celu pełnego scharakteryzowania całego badanego interaktomii i zidentyfikowania klonów będących przedmiotem zainteresowania; oraz 4) narzędzie internetowe do analizy danych dla użytkowników bez żadnych umiejętności bioinformatycznych lub programistycznych, aby przeprowadzić analizę Interactome-Seq w łatwy i przyjazny dla użytkownika sposób.

Korzystanie z tej platformy oferuje ważne korzyści w porównaniu z alternatywnymi strategiami badawczymi; przede wszystkim metoda jest całkowicie bezstronna, wysokoprzepustowa i modułowa do badań od pojedynczego genu do całego genomu. Pierwszym krokiem jest stworzenie biblioteki z losowo pofragmentowanego badanego DNA, które jest następnie głęboko charakteryzowane przez NGS. Biblioteka ta jest generowana przy użyciu zmodyfikowanego wektora, w którym geny/fragmenty będące przedmiotem zainteresowania są klonowane między sekwencją sygnałową do wydzielania białka do przestrzeni peryplazmatycznej (tj. liderem Sec) a genem TEM1 β-laktamazy. Białko fuzyjne zapewni oporność na ampicylinę i zdolność do przetrwania pod ciśnieniem ampicyliny tylko wtedy, gdy sklonowane fragmenty znajdują się w ramce z obydwoma tymi elementami, a powstałe białko fuzyjne jest prawidłowo złożone10,13,14. Wszystkie klony uratowane po selekcji antybiotykowej, tak zwane "przefiltrowane klony", są ORFami i zdecydowana większość z nich (ponad 80%) pochodzi z prawdziwych genów9. Co więcej, siła tej strategii polega na odkryciach, że wszystkie klony przefiltrowane przez ORF kodują prawidłowo złożone/rozpuszczalne białka/domeny15. Ponieważ wiele klonów, obecnych w bibliotece i mapujących w tym samym regionie/domenie, ma różne punkty początkowe i końcowe, pozwala to na bezstronną, jednoetapową identyfikację minimalnych fragmentów, które mogą skutkować rozpuszczalnymi produktami.

Dalsze ulepszenie technologii jest możliwe dzięki zastosowaniu NGS do scharakteryzowania biblioteki. Połączenie tej platformy i specjalnego narzędzia internetowego do analizy danych dostarcza ważnych, bezstronnych informacji na temat dokładnych sekwencji nukleotydów oraz lokalizacji wybranych ORF na badanym referencyjnym DNA bez konieczności dalszych obszernych analiz lub wysiłków eksperymentalnych.

Biblioteki domenomowe mogą być przeniesione do kontekstu wyboru i używane jako uniwersalne narzędzie do przeprowadzania badań funkcjonalnych. Wysokoprzepustowa platforma do analizy ekspresji i interakcji białek, którą zintegrowaliśmy i którą nazwaliśmy Interactome-Seq, wykorzystuje technologię wyświetlania fagów, przenosząc przefiltrowany ORF do wektora fagowego i tworząc bibliotekę fagów-ORF. Po ponownym sklonowaniu do kontekstu wyświetlania faga, domeny białkowe są wyświetlane na powierzchni cząstek M13; W ten sposób biblioteki domenomowe mogą być bezpośrednio selekcjonowane pod kątem fragmentów genów kodujących domeny o określonych aktywnościach enzymatycznych lub właściwościach wiązania, co pozwala na profilowanie sieci interaktomowych. Podejście to zostało początkowo opisane przez Zacchi i wsp.16 i później używane w kilku innych kontekstach13,17,18.

W porównaniu z innymi technologiami używanymi do badania interakcji białko-białko (w tym drożdże dwa hybrydowe systemy i spektrometria masowa19,20), jedną z głównych zalet jest wzmocnienie partnera wiążącego, które występuje podczas wielu rund selekcji fagów. Zwiększa to czułość selekcyjną, umożliwiając w ten sposób identyfikację domen białek wiążących o niskiej obfitości obecnych w bibliotece. Efektywność selekcji przeprowadzanej za pomocą biblioteki filtrowanej przez ORF jest dodatkowo zwiększona ze względu na brak niefunkcjonalnych klonów. Wreszcie, technologia pozwala na przeprowadzenie selekcji zarówno w odniesieniu do przynęt białkowych, jak i niebiałkowych21,22,23,24,25.

Selekcja fagów przy użyciu biblioteki domainome-phage może być przeprowadzona przy użyciu przeciwciał pochodzących z surowic pacjentów z różnymi stanami patologicznymi, np. chorobami autoimmunologicznymi13, rak lub choroby infekcyjne jako przynęta. Podejście to służy do uzyskania tzw. "sygnatury przeciwciał" badanej choroby, co pozwala na masową identyfikację i charakterystykę antygenów/epitopów specyficznie rozpoznawanych przez przeciwciała pacjentów w tym samym czasie. W porównaniu z innymi metodami, zastosowanie wyświetlania fagów pozwala na identyfikację zarówno liniowych, jak i konformacyjnych epitopów antygenowych. Identyfikacja konkretnej sygnatury może potencjalnie mieć istotny wpływ na zrozumienie patogenezy, projektowania nowych szczepionek, identyfikacji nowych celów terapeutycznych oraz opracowania nowych i specyficznych narzędzi diagnostycznych i prognostycznych. Co więcej, gdy badanie koncentruje się na chorobach zakaźnych, główną zaletą jest to, że odkrycie białek immunogennych jest niezależne od hodowli patogenów.

Nasze podejście potwierdza, że składane reportery mogą być używane na skali genomowej do wyboru "domenomu": zbioru poprawnie złożonych, dobrze wyrażonych, rozpuszczalnych domen białkowych z kodującej części DNA i/lub cDNA z dowolnego organizmu. Po wyizolowaniu fragmenty białka są przydatne do wielu celów, dostarczając niezbędnych informacji eksperymentalnych do adnotacji genów, a także do badań strukturalnych, mapowania epitopów przeciwciał, identyfikacji antygenów itp. Kompletność danych o wysokiej przepustowości dostarczanych przez NGS umożliwia analizę bardzo złożonych próbek, takich jak biblioteki wyświetlania fagów, i ma potencjał do obejścia tradycyjnego pracochłonnego wybierania i testowania pojedynczych klonów uratowanych przez fagi.

Jednocześnie, dzięki cechom filtrowanej biblioteki oraz ekstremalnej czułości i mocy analizy NGS, możliwe jest zidentyfikowanie domeny białkowej odpowiedzialnej za każdą interakcję bezpośrednio w początkowym ekranie, bez potrzeby tworzenia dodatkowych bibliotek dla każdego związanego białka. NGS pozwala na uzyskanie kompleksowej definicji całego domomu dowolnego źródła wyjściowego genów/genomu, a narzędzie internetowe do analizy danych umożliwia uzyskanie wysoce specyficznej charakterystyki zarówno z jakościowego, jak i ilościowego punktu widzenia domen białek interaktomowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa biblioteki ORF (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie insercji DNA
    1. Przygotowanie fragmentów z syntetycznego lub genomowego DNA
      1. Ekstrakcja/oczyszczanie DNA przy użyciu standardowych metod26.
      2. Fragmentacja DNA metodą sonikacji. Jeśli używasz standardowego sonikatora, jako ogólną sugestię, zacznij od impulsów 30 s przy 100% mocy wyjściowej.
        UWAGA: Eksperymenty pilotażowe powinny być przeprowadzane z różną mocą i czasem sonikacji, aby ustalić optymalne warunki do przygotowania DNA. Po każdym badaniu należy określić wielkość fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
      3. Załaduj sonikowane DNA na 1,5% żel agarozowy wraz z drabinką DNA o długości 100 pz. Wykonać krótką elektroforezę przebieg przy napięciu 5 V/cm przez 15 minut i odciąć część żelu zawierającą rozmaz fragmentarycznego DNA.
      4. Oczyść wstawione DNA za pomocą kolumnowego zestawu do ekstrakcji żelu i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV.
        UWAGA: Po tym etapie należy uzyskać co najmniej 500 ng oczyszczonych wkładek, które należy podwiązać 1 μg strawionego wektora, jak opisano w kroku 1.3. Sprawdź jakość przygotowania fragmentów, oceniając proporcje A260nm/A280nm i A260nm/A230nm, ponieważ niska jakość próbki wpłynie na wydajność ligacji.
      5. Potraktuj do 5 μg wkładek 1 μl mieszanki enzymatycznej Quick Blunting Kit, zgodnie z instrukcjami producenta. Dezaktywować enzymy przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 10 min. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Przygotowanie fragmentów z cDNA
      1. Ekstrakcja RNA standardowymi metodami (np. przy użyciu TRizolu lub podobnych odczynników).
      2. Fragmentuj mRNA przez ogrzewanie przed wykonaniem odwrotnej transkrypcji. Ostateczna długość fragmentu DNA jest kontrolowana przez czas wrzenia mRNA i losowe stężenie startera. Na przykład podgrzewać próbkę przez 6 minut w temperaturze 95 °C.
      3. Przygotuj cDNA za pomocą losowych starterów z dowolnym dostępnym zestawem zgodnie z protokołem producenta.
      4. Zubożyć cDNA ogonów poly-dT przez hybrydyzację z biotynylowanym poli-dA przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i rozdzielić na kulkach magnetycznych streptawidyny, jak opisano przez Carninci i wsp.13
      5. Odzyskaj niezwiązany materiał i oczyść go za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV. Patrz uwaga w kroku 1.1.1.4.
  2. Przygotowanie wektora filtrującego
    1. Strawij 5 μg oczyszczonego wektora klonowania pFILTER312 z 10 U enzymu restrykcyjnego EcoRV, zgodnie z protokołem producenta.
    2. Załaduj 2 μl (200 ng) strawionego wektora wraz ze 100 ng niestrawionego wektora i markerem molekularnym 1k pz na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy trawienie jest prawidłowe. Ciepło dezaktywuje enzym restrykcyjny.
    3. Dodać 1/10 objętości 10-krotnego buforu fosfatazy i 1 μl (5 j.) fosfatazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 65 °C.
    4. Oczyść strawiony plazmid przez ekstrakcję z żelu agarozowego i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Podwiązanie i transformacja
    1. Wykonać ligację w następujący sposób: na 1 μg strawionego plazmidu dodać 400 ng fosforylowanych insertów (stosunek plazmidu do mola wstawki 1:5), 10 μL 10x buforu dla ligazy DNA T4, 2 μl ligazy DNA T4 o wysokim stężeniu w końcowej objętości 100 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 16 °C przez noc. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 min.
    2. Wytrącić produkt ligacji, dodając 1/10 objętości roztworu octanu sodu (3 M, pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu. Wymieszać i zamrozić w temperaturze -80 °C przez 20 minut.
    3. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Dodać 500 μl zimnego 70% etanolu do osadu i odwirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    5. Wysuszyć pelety na powietrzu. Ponownie zawiesić wytrącone DNA w 10 μl wody.
    6. Wykonaj elektroporację komórek bakteryjnych.
      UWAGA: Wymagane jest stosowanie ogniw o wysokiej sprawności (powyżej 5x109 transformantów na μg DNA). Sugerujemy stosowanie Escherichia coli DH5αF' (F'/endA1 hsd17 (rK − mK+) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) wyprodukowanego we własnym zakresie lub zakupionego od kilku producentów.
      1. Umieść odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek i kuwet do elektroporacji o średnicy 0,1 cm na lodzie. Dodać 1 μl oczyszczonego roztworu do ligacji (w wodzie demineralizowanej) do 25 μl komórek i kilkakrotnie przesunąć probówkę.
      2. Przenieś mieszaninę komórek DNA do zimnej kuwety, stuknij w blat 2x, wytrzyj wodę z zewnętrznej części kuwety, umieść w module elektroporacyjnym i naciśnij impuls.
      3. Wykonaj elektroporację za pomocą standardowego elektroporatora przy użyciu 25 μF, 200 Ω i 1,8 kV. Stała czasowa musi wynosić 4-5 ms.
    7. Natychmiast dodać 1 ml płynnej pożywki 2xYT bez antybiotyku, przenieść do probówki o pojemności 10 ml i pozostawić do wzrostu w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 220 obr./min przez 1 godzinę.
    8. Płytka przekształcona DH5αF' na 15 cm płytkach agarowych 2xYT uzupełniona 34 μg/ml chloramfenikolu (odporność pFILTER) i 25 μg/ml ampicyliny (selektywny marker dla ORF) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
    9. Rozcieńczenia płytki z biblioteki na 10 cm płytkach agarowych 2xYT uzupełnionych chloramfenikolem + ampicyliną i tylko chloramfenikolem, w celu przeprowadzenia miareczkowania bibliotecznego. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
  4. Walidacja biblioteki pFILTER-ORF
    1. Przetestuj 15-20 kolonii zarówno z płytek chloramfenikolowych, jak i chloramfenikolu/ampicyliny, aby oszacować rozkład wielkości płytki. Zbieraj pojedyncze kolonie za pomocą końcówki i rozcieńczaj je osobno w 100 μl pożywki 2xYT bez antybiotyków. Użyj 0,5 μl tego roztworu jako matrycy DNA do reakcji PCR, z dowolną standardową polimerazą TaqDNA zgodnie z protokołem producenta.
    2. Wykonać 25 cykli amplifikacji przy użyciu wyżarzania T w temperaturze 55 °C i czasie wydłużenia 40 s w temperaturze 72 °C. Sekwencje podkładowe są podane w tabeli materiałów.
    3. Załaduj produkty PCR na 1,5% żel agarozowy wraz z drabinką DNA 100 pz i uruchom.
  5. Kolekcja bibliotek pFILTER-ORF
    1. Zebrać bakterie z płytek o średnicy 150 mm, dodając 3 ml świeżej pożywki 2xYT i zbierając je sterylnym skrobakiem, dokładnie wymieszać, uzupełnić 20% sterylnym glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach.
    2. Oczyść plazmidowe DNA z jednej podwielokrotności biblioteki (przed dodaniem glicerolu) za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu opartego na kolumnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania ich do przygotowania biblioteki fagów i/lub scharakteryzowania za pomocą NGS.

2. Subklonowanie przefiltrowanych ORF-ów w wektorze fagowym (Rysunek 2)

  1. Przygotowanie przefiltrowanych przez ORF fragmentów DNA
    1. Ustaw trawienie enzymem restrykcyjnym 5 μg oczyszczonego wektora z wektora biblioteki pFILTER-ORF, dodając 10 U BssHII i inkubując zgodnie z protokołem producenta. Dezaktywować enzym i trawić za pomocą 10 U NheI.
    2. Załaduj strawione DNA na 1,5% żel agarozowy wraz z drabinką DNA o długości 100 pz. Wykonać krótką elektroforezę przebieg przy napięciu 5 V/cm przez 15 minut lub tylko tyle, aby rozróżnić rozmaz wyciętych fragmentów i odciąć część żelu, która je zawiera.
    3. Oczyść DNA insercji za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu na podstawie kolumny i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV.
  2. Przygotowanie fagowego DNA
    1. Ustaw trawienie enzymem restrykcyjnym 5 μg oczyszczonego pDAN527 jak dla wkładek.
    2. Oczyść strawiony plazmid, uruchamiając strawione DNA na 0,75% żelu agarozowym i ekstra z żelu za pomocą zestawu opartego na kolumnie.
    3. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Ligacja, przekształcanie i gromadzenie bibliotek
    1. Wykonaj ligację i transformację zgodnie z opisem dla wektora pFILTER.
    2. Płytkę przekształconą DH5αF' na 150 mm płytkach agarowych 2xYT uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
    3. Rozcieńczenia płytki biblioteki na 100 mm płytkach agarowych 2xYT uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny w celu określenia wielkości biblioteki.
    4. Przeprowadź walidację biblioteki metodą PCR losowo wybranych klonów zgodnie z opisem w kroku 1.4.
    5. Zebrać bibliotekę fagów-ORF, zbierając bakterie z płytek o średnicy 150 mm, dokładnie wymieszać, uzupełnić je 20% sterylnym glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach.
    6. Oczyść plazmidowe DNA z jednej podwielokrotności biblioteki za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu opartego na kolumnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Zmierzyć stężenie na spektrofotometrze UV. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania ich do charakterystyki za pomocą NGS.

3. Procedura przygotowania i wyboru biblioteki fagów

  1. Produkcja fagów
    1. Rozcieńczyć podwielokrotność podstawową biblioteki fagów w 10 ml płynnego bulionu 2xYT uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny, aby uzyskać OD600 nm = 0,05.
    2. Rozcieńczoną bibliotekę hodować w sterylnej kolbie 5-10 razy większej niż oryginalna objętość, w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min, aż do osiągnięcia OD600nm = 0,5.
    3. Zakażenie bakterii fagiem pomocniczym (np. M13K07) przy wielokrotności infekcji 20:1. Pozostawić w temperaturze 37 °C na 45 minut, od czasu do czasu mieszając (co 10 minut).
    4. Odwirować bakterie przy 4000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad bakteryjny w 40 ml płynnego bulionu 2xYT uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny i rosnąć w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min przez noc.
    5. Następnego dnia odwirować bakterie w sile 4000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant zawierający fagi.
  2. PEG - wytrącanie fagów.
    1. Dodać 1/5 objętości przefiltrowanego roztworu PEG/NaCl o stężeniu 0,22 μm (20% w/v PEG 6000, 2,5 M NaCl) do oczyszczonych fagów i inkubować na lodzie przez 30-60 min.
      UWAGA: Roztwór stał się zadymiony po kilku minutach, co wskazuje na udane wytrącanie fagów. Zmętnienie roztworu zwiększy się w czasie inkubacji.
    2. Wirować przy 4000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Utworzy się biała mała osadka fagów.
    3. Zawiesić go ponownie w 1 ml jałowego PBS. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut z maksymalną prędkością w celu usunięcia bakterii zanieczyszczających. Utworzy się brązowa granulka.
    4. Przenieść supernatant zawierający fagi do nowej probówki. Utrzymuj fagi na lodzie w celu sukcesywnego miareczkowania i selekcji fagów.
  3. Miareczkowanie fagów
    1. Przygotować seryjne rozcieńczenia roztworu fagowego. Umieścić 10 μl roztworu faga w 990 μl PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 10-2. Rozcieńczyć ponownie ten preparat, aby uzyskać 10-4 i z tego uzyskać rozcieńczenie 10-6.
    2. Hodować komórki bakterii DH5αF w płynnym podłożu 2xYT w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem aż do osiągnięcia OD600nm = 0,5. Przenieść 1 ml przygotowanych bakterii do probówki o pojemności 1,5 ml i natychmiast zainfekować 1 μl rozcieńczenia 10-4 fagów. Inkubować bez wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Powtórzyć tę samą procedurę dla rozcieńczenia 10-6.
    3. Rozcieńczenie zakażonych bakterii na 100 mm płytkę 2xYT. Umieść talerz w temperaturze 30 °C na noc.
    4. Umieścić 100 μl niezakażonego DH5αF' na płytce agarowej 2xYT uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny w celu sprawdzenia braku zanieczyszczeń w preparacie.
    5. Dzień później policz liczbę kolonii i oblicz miano faga. Wyraź miano jako liczbę fagów/ml. Przewidywane miano wynosi 1012-13 fagów/ml.
  4. Selekcja fagów
    1. Selekcja fagów przy użyciu oczyszczonych przeciwciał jako przynęty
      1. Nasycić fagi, rozcieńczając 200 μl preparatu fagowego w równej objętości odtłuszczonego mleka PBS-4% i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy powolnych obrotach. Ten krok umożliwia blokowanie fagów w celu niespecyficznego wiązania. Przenieś 30 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem G do probówki o pojemności 1,5 ml.
      2. Przemyć dwa razy w następujący sposób: dodać 500 μl PBS, inkubować na kole na wolnych obrotach przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, narysować kulki na jedną stronę probówki za pomocą magnesu i usunąć supernatant.
      3. Inkubować nasycone fagi z przemytymi kulkami przez 30 minut w temperaturze pokojowej z powolną rotacją.
      4. Przyciągnij koraliki na bok za pomocą pola magnetycznego. Zebrać supernatant zawierający fagi, który ma być użyty na etapie selekcji.
      5. Przygotuj kulki magnetyczne podczas wykonywania poprzedniego kroku, koniugując oczyszczone przeciwciała. Umyj 30 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem G, jak opisano powyżej. Rozcieńczyć 10 μg oczyszczonych przeciwciał w 500 μl PBS, dodać do umytych kulek i inkubować w wolnym tempie obrotowym w temperaturze pokojowej przez 45 min. Umyć dwukrotnie PBS.
        UWAGA: Wykonaj dwa różne preparaty kulek magnetycznych: jeden z przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania, a drugi z przeciwciałami kontrolnymi, np. przeciwciałami oczyszczonymi ze zdrowych dawców. Sekwencja antygenów wybranych za pomocą przeciwciał kontrolnych jest odejmowana na etapie analizy wyników. Alternatywnie, kulki magnetyczne załadowane przeciwciałami kontrolnymi mogą być użyte do przeprowadzenia etapu wstępnego oczyszczania fagów (postępuj zgodnie z protokołem inkubacji z niesprzężonymi kulkami).
      6. Wybór fagów: narysuj koraliki po jednej stronie probówki za pomocą magnesu, usuń ostatnie płukanie, dodaj fagi i inkubuj z powolną rotacją w temperaturze pokojowej przez 90 min. Przemyj 5 razy 500 μl PBS-0,1% Tween-20 i 5 razy PBS.
      7. Elute związane fagi, reprezentujące wynik selekcji, mieszając kulki z 1 ml komórek DH5αF' hodowanych w OD600 = 0,5. Inkubować bakterie z kulkami przez 45 minut w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając (co 10 minut). Utrzyj wynik na płytce agarowej 2xYT o średnicy 150 mm uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny.
      8. Płytka 100 μl nierozcieńczonego i o różnych rozcieńczeniach wyjściowych (10-1 do 10-5) w celu przeprowadzenia miareczkowania. Następnego dnia należy zebrać bakterie z płytek o średnicy 150 mm, dodając 3 ml świeżej pożywki 2xYT i zbierając je sterylnym skrobakiem, dokładnie wymieszać, uzupełnić 20% sterylnym glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach.
      9. Ponownie wyhoduj jedną porcję, aby przeprowadzić drugą rundę selekcji. Powtórz całą procedurę panoramowania, jak opisano powyżej, z wyjątkiem warunków prania. W takim przypadku przemyć 10 razy PBS-1% Tween-20 (wlać roztwór do probówki i natychmiast ponownie wylać). Następnie dodać 500 μl PBS i inkubować na zmianę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonaj pozostałe 10 prań za pomocą PBS. Postępuj zgodnie z etapem elucji, jak w pierwszej rundzie selekcji.
      10. Ekstrahować plazmidowe DNA z jednej podwielokrotności wyjścia za pomocą zestawu opartego na kolumnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C, aż zostanie użyty do głębokiego sekwencjonowania.
    2. Selekcja fagów przy użyciu rekombinowanych białek jako przynęty
      1. Nasycić fagi, rozcieńczając 200 μl preparatu fagowego w równej objętości odtłuszczonego mleka PBS-4% i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy powolnych obrotach.
      2. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych streptawidyny. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby wybrać fagi wiążące streptawidynę. Usuń fagi związane ze streptawidyną, przyciągając kulki na bok za pomocą magnesu. Weź supernatant z poprzedniego kroku i dodaj biotynylowane białko (w stężeniu 100-550 nM) i inkubuj na wirniku w temperaturze pokojowej przez 30 min do 1 h.
      3. Przygotuj kulki magnetyczne: wykonując poprzedni krok, umyj 100 μl kulek magnetycznych streptawidyny PBS, ponownie zamieszaj w PBS 2% odtłuszczonym mleku i inkubuj z rotacją w temperaturze pokojowej przez 30 min do 1 godziny.
      4. Wybór fagów: Narysuj koraliki po jednej stronie rurki za pomocą magnesu, usuń mleko PBS-2% i ponownie zamieszaj kulki z mieszanką fagów i białek. Inkubować z powolną rotacją w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
      5. Narysuj koraliki po jednej stronie probówki za pomocą magnesu, wyrzuć supernatant i umyj je dokładnie pięć razy 500 μl PBS 0,1% Tween-20. Wykonaj elucję zgodnie z opisem w poprzedniej sesji.

4. Platforma głębokiego sekwencjonowania biblioteki fagów (Rysunek 3)

  1. Odzyskiwanie wstawień DNA z biblioteki pFILTER-ORF, biblioteki pDAN5-ORF lub wybranych bibliotek fagowych
    1. Rozmrozić jedną porcję biblioteki, określić ją ilościowo za pomocą spektrofotometru, odzyskać wstawki DNA przez amplifikację określonymi starterami.
      UWAGA: Startery używane do ratowania insercji są połączone na końcu 5' z sekwencjami adaptorów, umożliwiając w ten sposób kolejne indeksowanie otrzymanych pul amplikonów i bezpośrednie sekwencjonowanie wstawień DNA odzyskanych za pomocą sekwenatorów. Ich kolejność znajduje się w Tabeli materiałów. Adaptery są zaznaczone pogrubioną czcionką, a konkretne podkłady są zaznaczone kursywą.
    2. Użyj 2,5 μl biblioteki (pFILTER/phagemid/selected-phage) jako matrycy DNA do reakcji PCR.
    3. Użyj następującego programu: 95 °C przez 3 min; 25 cykli po 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 5 min. Przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym momencie zaleca się przeprowadzenie 1 μl produktu PCR na bioanalizatorze lub stacji TapeStation w celu sprawdzenia wielkości amplikonów i sprawdzenia, czy znajdują się one w prawidłowym zakresie.
  2. Oczyszczanie PCR
    1. Doprowadź kulki magnetyczne (np. AMPure) do temperatury pokojowej. Przenieś cały produkt PCR z probówki do PCR do probówki o pojemności 1,5 ml. Wiruj koraliki magnetyczne przez 30 sekund, aby upewnić się, że koraliki są równomiernie rozproszone. Dodać 20 μl kulek magnetycznych do każdej probówki zawierającej produkt PCR, wymieszać delikatnie pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej bez wstrząsania przez 5 minut.
    2. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty lub do momentu, gdy supernatant się usunie. Trzymając produkty PCR na stojaku magnetycznym, wyjmij i wyrzuć supernatant.
    3. Przemyć kulki świeżo przygotowanym 80% etanolem, z produktami PCR na stojaku magnetycznym, w następujący sposób: dodać 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej studzienki próbki; inkubować płytkę na stojaku magnetycznym przez 3 s; ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
    4. Wykonaj drugie płukanie etanolem, umieszczając produkty PCR na stojaku magnetycznym; pod koniec drugiego prania ostrożnie usuń cały etanol i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
    5. Wyjmij produkty PCR ze stojaka magnetycznego, dodaj 17,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 do każdej probówki, delikatnie pipetuj w górę i w dół 10 razy, upewnij się, że kulki są całkowicie zawieszone. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty lub do momentu, gdy supernatant się oczyści, ostrożnie przenieś 15 μl supernatantu zawierającego oczyszczone produkty PCR do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Oczyszczone produkty PCR należy przechowywać w temperaturze od -15 ° C do -25 °C przez okres do tygodnia, jeśli nie przystąpisz natychmiast do Index PCR.
  3. Indeks PCR
    UWAGA: Po oczyszczeniu PCR wykonaj Index PCR. Użyj zestawu Nextera XT Index; w ten sposób możliwe będzie sekwencjonowanie powstałych podwójnie indeksowanych bibliotek w multipleksowanych przebiegach Illumina.
    1. Przenieść wszystkie 15 μl zawierające każdy oczyszczony produkt do nowej probówki PCR i przeprowadzić następującą reakcję zawierającą: 15 μl oczyszczonego produktu amplikonowego, 5 μl Index Primer 1 i 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2x PCR mix; końcowa objętość 50 μL.
    2. Wykonaj PCR na termocyklerze za pomocą następującego programu: 95 °C przez 3 min, 8 cykli po 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72°C przez 5 min, następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
  4. Oczyszczanie metodą PCR 2
    1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, który opisano w sekcji 4.2 dotyczącej oczyszczania PCR, z następującymi zmianami: w pierwszym kroku dodaj 56 μl kulek magnetycznych do każdych 50 μl produktu PCR.
    2. Ponownie zawiesić kulki w 27,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 w końcowym etapie oczyszczania i przenieść 25 μl do nowej probówki (jest to oczyszczona biblioteka końcowa gotowa do kwantyfikacji, a następnie sekwencjonowania).
    3. Płytkę należy przechowywać w temperaturze od -15 °C do -25 °C przez okres do tygodnia, jeśli nie przechodzi się do kwantyfikacji bibliotecznej.
  5. Ocena jakościowa i ilościowa biblioteki sekwencjonowania
    1. Po oczyszczeniu należy przeprowadzić 1 μl rozcieńczenia końcowej biblioteki w stosunku 1:10 na bioanalizatorze, aby zweryfikować rozmiar i określić go ilościowo, wybierając region końcowego śladu bibliotecznego.
    2. Równolegle należy przeprowadzić kwantyfikację biblioteki metodą Real Time PCR przy użyciu zestawu do kwantyfikacji biblioteki zgodnie z protokołem producenta.
  6. Sekwencjonowanie bibliotek
    1. Połącz biblioteki z podwójnym indeksowaniem utworzone razem z innymi bibliotekami sekwencjonowania z podwójnym indeksem. Sekwencjonuj tego rodzaju bibliotekę, generując długie odczyty, co najmniej 250 bp sparowane końcówki, używając zarówno instrumentów Hiseq2500, jak i MiSeq, aby uzyskać w pierwszym przypadku odczyty 250 bp PE, a w drugim przypadku 300 bp odczyty PE.

5. Analiza danych bioinformatycznych za pomocą narzędzia internetowego Interactome-Seq

  1. Przeanalizuj odczyty pochodzące z sekwencjonowania biblioteki pFILTER/phagemid/selected-phage za pomocą potoku analizy danych Interactome-seq. Narzędzie internetowe jest dostępne bezpłatnie pod następującym adresem: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście do filtrowania jest schematyczne w Rysunek 1. Można użyć każdego rodzaju beztronowego DNA. W Rysunek 1A reprezentowana jest pierwsza część podejścia do filtrowania: po załadowaniu na żel agarozowy lub bioanalizator, pojawia się dobra fragmentacja interesującego DNA jako rozmaz fragmentów o rozkładzie długości w pożądanym rozmiarze 150-750 pz. Podawany jest reprezentatywny wirtualny obraz żelowy uzyskanego fragmentaryczn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzenie wysokiej jakości, wysoce zróżnicowanej, filtrowanej biblioteki ORF jest pierwszym krytycznym krokiem w całej procedurze, ponieważ będzie miało wpływ na wszystkie kolejne kroki potoku.

Ważną zaletą naszej metody jest to, że każde źródło (beztronowego) DNA (cDNA, genomowe DNA, DNA pochodzące z PCR lub syntetyczne DNA) nadaje się do budowy biblioteki. Pierwszym parametrem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że długość fragmentów DNA sklonowanych do wektora pFILTER powinna zapewniać...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z włoskiego Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa (2010P3S8BR_002 dla CP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Homogenizator ultradźwiękowy SonopulsBandelinHD2070lub równoważny
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo ScientificSM0321lub równoważny
GeneRuler 1 kb DNA LadderThermo Fisher ScientificSM0311lub równoważny
Biologia molekularnaAgaroza BioRad161-3102lub równoważny
Green Gel PlusFisher Molecular BiologyFS-GEL01lub odpowiednik
6x barwnik ładujący DNAThermo Fisher ScientificR0611lub równoważny
zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28704lub równoważny
zestaw do szybkiego stępianiaNew England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 Spektrofotometr UV-VisThermo Fisher ScientificND-2000
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific4368813
Kulki magnetyczne streptawidynyNew England BiolabsS1420Slub równoważny
zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104lub równoważny
EcoRVNew England BiolabsR0195L
Fosfataza antarktycznaNew England BiolabsM0289S
T4 DNA LigazaNew England BiolabsM0202T
Octan sodu 3M pH5.2ogólny dostawca
Etanol do biologii molekularnejSigma-AldrichE7023lub równoważny
Komórki bakteryjne DH5aF ThermoFisher Scientific
0,2 ml probówkiogólny dostawcalaboratoryjny
Probówki 1,5 ml Ogólnydostawca
Kuwety do elektroporacji 0,1 cmBiosigma4905020
Electroporator 2510Eppendorf
2x YT mediumSigma-AldrichY1003
Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA9518
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
DreamTaq DNA PolimerazaThermo Fisher ScientificEP0702
Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) NewEngland BiolabsN0447S
96-dołkowy termocykler (z podgrzewaną pokrywą)Ogólny dostawca
Płytki 150 mmOgólny dostawca
laboratoryjny Płytki 100 mm Ogólnydostawcalaboratoryjny
GlycerolSigma-AldrichG5516
BssHIINew England BiolabsR0199L
NheINew England BiolabsR0131L
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104lub odpowiednik
M13KO7 Helper PhageGE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
Siarczan kanamycyny ze Streptomyces kanamyceticusSigma-AldrichK1377
Glikol polietylenowy (PEG)Sigma-AldrichP5413
Kloryd sodu (NaCl)Sigma-AldrichS3014
PBSOgólny dostawca
Dynabeads Białko G do immunoprecypitacjiThermo Fisher Scientific10003Dlub równoważny
MagnaRack Magnetic Separation RackThermo Fisher ScientificCS15000lub równoważny
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Beztłuszczowe mleko w proszkuEuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems, Fisher Scientific7958935001
Koraliki AMPure XPAgencourt, Beckman CoulterA63881
Nextera XT podwójne podkładyindeksowe IlluminaFC-131-2001 lub FC-131-2002 lub FC-131-2003 lub FC-131-2004
MiSeq lub Hiseq2500Illumina
SpectrophotomerNanodrop
Agilent Bioanalizator lub TapeStationAgilent
Forward PCR starterdla ogólnego dostawcylaboratoryjnego 5' TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'
Starter do odwróconego PCRogólny dostawca5 ' TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'
Podkład do przodu dlaogólnego dostawcy5' TCGTCGGCAGCGTCAGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCCCATGC 3';
Odwrócony podkład dlaogólnego dostawcy5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';
laboratoryjnylaboratoryjnylaboratoryjnylaboratoryjny laboratoryjny laboratoryjnego NGS laboratoryjnego NGS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170(2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284(2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867(2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110(2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146(2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Domainome LibraryPhage DisplayNext Generation SequencingORF Library ConstructionGel ElectrophoresisDNA LigationElectroporationAntibiotic SelectionPlasmid PurificationNGS Analysis

Related Articles