Artykuł metodologiczny

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56990

⸱

25 grudnia 2017

 ,  , 
1Department of Entomology and Riverside Center of Disease Vector Research, Institute for Integrative Genome Biology, University of California, Riverside, 2Section of Cell and Developmental Biology, Division of Biological Sciences, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Streszczenie

Osa klejnotowa Nasonia vitripennis stała się skutecznym systemem modelowym do badania procesów, w tym między innymi determinacji płci, haplo-diploidalnej determinacji płci, syntezy jadu i interakcji gospodarz-symbiont. Głównym ograniczeniem pracy z tym organizmem jest brak skutecznych protokołów do przeprowadzania ukierunkowanych modyfikacji genomu. Ważną częścią modyfikacji genomu jest dostarczanie odczynników do edycji, w tym cząsteczek CRISPR/Cas9, do zarodków poprzez mikroiniekcję. Podczas gdy mikroiniekcja jest dobrze znana w wielu organizmach modelowych, technika ta jest szczególnie trudna do wykonania u N. vitripennis, przede wszystkim ze względu na mały rozmiar zarodka oraz fakt, że rozwój embrionalny zachodzi całkowicie w obrębie spasożytowanej poczwarki muchówki. Poniższa procedura przezwycięża te znaczące wyzwania, demonstrując jednocześnie uproszczoną, wizualną procedurę skutecznego usuwania zarodków osy z poczwarek pasożytniczego żywiciela, mikrowstrzykiwania ich i ostrożnego przeszczepiania z powrotem do gospodarza w celu kontynuacji i zakończenia rozwoju. Protokół ten znacznie zwiększy zdolność grup badawczych do przeprowadzania zaawansowanych modyfikacji genomu w tym organizmie.

Wprowadzenie

Osa szlachetna, N. vitripennis, jest jednym z czterech gatunków w obrębie rodzaju Nasonia, które są ektoparazytoidami much mięsożernych, takich jak Sarcophaga bullata1. Ze względu na ich szybkie okresy pokoleniowe, łatwość hodowli w laboratorium oraz szereg unikalnych i ważnych cech biologicznych, N. vitripennis był przedmiotem rozwoju wielu narzędzi eksperymentalnych występujących w tradycyjnych organizmach modelowych. Na przykład niektóre unikalne atrybuty biologiczne obejmują haplo-diploidalny system rozmnażania2, związek z pasożytami mikrobiologicznymi i genetycznymi3,4 oraz chromosom nadliczbowy (B)5,6,7. Podsumowując, sprawiają one, że N. vitripennis jest ważnym systemem eksperymentalnym do eksperymentów mających na celu wyjaśnienie molekularnych i komórkowych aspektów tych procesów, a także innych, w tym produkcji jadu8,9, determinacja płci10,11, oraz ewolucja i rozwój formacji wzorców osi12,13,14. Co więcej, zestaw narzędzi genetycznych do badania biologii N. Vitripennis dramatycznie wzrósł w ciągu ostatniej dekady, dzięki sekwencjonowaniu genomu o wysokiej rozdzielczości15, kilku badaniom ekspresji genów16,17,18, oraz zdolności do funkcjonalnego zakłócania ekspresji genów w oparciu o interferencję RNA (RNAi)19,20, które razem poprawiły podatność i możliwości przeprowadzania odwrotnej genetyki w tym organizmie.

Pomimo wielu ważnych osiągnięć naukowych i rozszerzonych zestawów narzędzi w tym organizmie, zgodnie z obecną wiedzą, tylko jedna grupa z powodzeniem przeprowadziła mikrozastrzyki embrionalne w celu wygenerowania dziedzicznych modyfikacji genomu21. Wynika to przede wszystkim z trudności w pracy z zarodkami N. vitripennis, ponieważ są one dość delikatne i małe, są ~2/3 wielkości zarodków Drosophila melanogaster, co czyni je generalnie trudnymi do manipulowania. Dodatkowo samice N. vitripennis składają jaja w poczwarkach plujki przed użądleniem, w których zachodzi cała embriogeneza, rozwój larwalny i poczwarki. Dlatego, aby mikroiniekcje były udane, w stadium przed blastodermą, zarodki muszą być skutecznie pobrane od poczwarek gospodarza, szybko mikrowstrzyknięte i natychmiast przeszczepione z powrotem do gospodarzy w celu rozwoju. Etapy te wymagają precyzji i zręczności, aby uniknąć uszkodzenia mikrowstrzykniętych zarodków lub gospodarzy poczwarek, co sprawia, że technika ta jest wyjątkowo trudna. Niezależnie od tego, istnieje jeden krótki protokół opublikowany ponad dziesięć lat temu, który opisuje mikroiniekcję zarodka N. vitripennis22. Jednak procedura ta wymaga wysuszenia świeżo złożonych zarodków, wykorzystuje taśmę klejącą do zakotwiczenia jaj do mikroiniekcji i nie obejmuje wizualnej demonstracji techniki. Dlatego opisano tutaj zaktualizowany i poprawiony protokół, w tym procedurę wizualną, szczegółowo opisujący ulepszony protokół krok po kroku dla mikroiniekcji zarodków N. vitripennis, który może być stosowany przez dowolne podstawowe laboratorium w celu wygenerowania dziedzicznych modyfikacji genomu u tego ważnego owada modelowego.

Protokół

1. Hodowla kolonii N. Vitripennis

  1. Stwórz kilka kolonii (~ 3-5), umieszczając 200-500 dorosłych osobników N. vitripennis (ze stosunkiem 3:1 samicy do samca) w klatkach dla owadów.
    UWAGA: Alternatywą dla korzystania z akademików na owady, osy mogą być również rozmnażane w wielu, małych szklanych probówkach zatkanych bawełną z około 15-20 osami na fiolkę.
    1. Utrzymuj osy w temperaturze 25 ± 1 °C przy wilgotności względnej 30% i cyklu światła ciemności 12:12, karmiąc je codziennie małymi kropelkami roztworu sacharozy/wody w proporcji 1:10 (v/v).
      UWAGA: Rozmnażanie kolonii i kolekcji os można również prowadzić w temperaturze pokojowej bez kontrolowanej wilgotności; jednak temperatury niższe niż 25 °C nieznacznie skrócą czas rozwoju zarodków.
  2. Pozwól osom łączyć się w pary przez co najmniej 4 dni przed wstrzyknięciem.
    1. Przez pierwsze dwa dni pozwól krytym samicom żywić się świeżymi poczwarkami S. bullata, a także małymi kropelkami roztworu sacharozy i wody w stosunku 1:10 (v/v).
    2. Przez następne dwa dni usuwaj poczwarki muchówki, aby pozbawić samice os miejsca składania jaj, czyniąc je bardzo ciężkimi.

2. Pobieranie i wyrównanie zarodków N. Vitripennis w stadium przedblastoderm

  1. Pozwól samicom os pasożytować (zarodki jajowe) na młodych żywicielach (poczwarki S. bullata). Aby żywiciele były świeże, przechowuj je w temperaturze 4 °C natychmiast po ich uzyskaniu i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to konieczne.
    UWAGA: Młode żywiciele można określić na podstawie czerwonego koloru poczwarki, podczas gdy starsi żywiciele mają poczwarkę o ciemniejszym kolorze (Rysunek 1A).
    1. Umieść pojedyncze świeże poczwarki S. bullata w piankowym korku z otworem wielkości poczwarki wyciętym w środku. Odsłonięto tylko ~ 0,2 cm przedniego końca (preferowane miejsce składania jaj) żywiciela, aby uzyskać maksymalną koncentrację pasożytowania i łatwiejsze pobieranie zarodków.
      UWAGA: Przedni koniec jest zaokrąglony, podczas gdy tylny koniec jest grubszy i zawiera "kraterowy" otwór (Ryc. 1B).
    2. Umieść poczwarki gospodarza (około 5 poczwarek gospodarza na 100 os) w tym układzie w klatce i odczekaj około 45 minut, aby osy mogły je pasożytować (Rysunek 2- ii).
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zarodki były jak najmłodsze, najlepiej w ciągu pierwszej godziny od złożenia jaj, aby upewnić się, że znajdują się w stadium poprzedzającym blastodermę. Starych zarodków (> 1,5 h) nie należy wstrzykiwać.
    3. Usuń pasożytniczych żywicieli, pobierając ich ręcznie i delikatnie szczotkując/zdmuchując wszelkie przebywające osy. Zastąp je świeżymi żywicielami po co ~ 15 minutach, aby kontynuować zbieranie jaj we wczesnym stadium podczas wstrzyknięć.
  2. Usuń ręcznie świeżo spasożytowanych żywicieli z klatki. Pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą kleszczy, ostrożnie oderwij tylny koniec (0,4 cm) zewnętrznej poczwarki (skorupy poczwarki), aby odsłonić jaja N. vitripennis (Rycina 2- iii).
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przebicia skóry poczwarki; Jeśli tak się stanie, hemolimfa zwilży zarodki osy, które będą bardzo trudne do usunięcia w celu mikroiniekcji.
  3. Użyj płynnego kleju, aby przykleić szkiełko nakrywkowe do czystego szkiełka podstawowego, aby przygotować szkiełko wyrównujące zarodki (Rysunek 3).
    UWAGA: Wysokowydajny klej błyskawiczny służy do zwiększenia siły wiązania i szybkości schnięcia, jednak dopuszczalny jest każdy klej, który może zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego na szkiełku.
  4. Ostrożnie zetrzyj zarodki z żywiciela mokrym pędzlem z cienką końcówką, uważając, aby nie uszkodzić miękkiej skóry poczwarki żywiciela.
    UWAGA: Zamiast pędzla można użyć "szpikulca do zarodków", który jest zasadniczo połową pary ultracienkich kleszczyków.
  5. Przenieś ~ 20 zarodków jeden po drugim na szkiełko, bezpośrednio przylegające do boku szkiełka nakrywkowego za pomocą mokrego pędzla. Ustaw przedni koniec zarodka na krawędzi szkiełka okładkowego tak, aby tylny koniec zarodków był skierowany w tym samym kierunku (Rysunek 2- iv). Pozwoli to na większą precyzję wstrzykiwania w tę samą pozycję wśród wszystkich zarodków.
    UWAGA: Ta ulepszona technika nie wymaga dwustronnej taśmy klejącej do mocowania zarodków do szkiełka, jak opisano wcześniej21,22. Ponadto nie należy wysuszać zarodków ani przykrywać jaj olejem halowęglowym podczas wstrzykiwania, jak opisano wcześniej dla mikroiniekcji zarodków N. vitripennis22.

3. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji

  1. Umieść glinokrzemianową szklaną szklankę kapilarną w ściągaczu do igieł.
    UWAGA: Dobra igła ma kluczowe znaczenie dla udanych wstrzyknięć zarodków N. vitripennis. Igły do wstrzykiwań powinny mieć ostrą i cienką końcówkę, aby umożliwić łatwą penetrację przez kosmówkę. Można również użyć igieł kapilarnych kwarcowych i borokrzemianowych (Rysunek 4).
  2. Ustaw ciepło na 605, prędkość na 130, opóźnienie na 80, ciągnięcie na 70, a ciśnienie na 500 na ściągaczu igłowy.
    UWAGA: Dodatkowe ustawienia ściągacza igieł do ciągnięcia igieł kwarcowych i borokrzemianowych można zobaczyć w Tabeli 1; Parametry mogą się różnić dla różnych ściągaczy i filamentów.
  3. Aktywuj ściągacz do igieł, aby utworzyć właściwą igłę. Powtórz w razie potrzeby do produkcji wielu igieł.
    UWAGA: Wyciągnięte igły można przechowywać, umieszczając je na szalce Petriego zawierającej kilka równoległych rolek komercyjnej gliny modelarskiej.
  4. Skosować końcówkę igły, lekko dotykając końcówki diamentowej płytki ściernej około 10 s w temperaturze 25 °C (Rysunek 2- iii).
    UWAGA: Igły do wstrzykiwań czerpią korzyści z ukosowania, ułatwiając wnikanie do zarodków przy minimalnym uszkodzeniu, jednocześnie zwiększając przepływ regentów przez igłę.

4. Mikroiniekcja zarodka

  1. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników modyfikujących genom (np. transpozon + transpozaza pomocnicza lub odczynniki CRIPSR itp.) i przechowywać ją na lodzie.
  2. Naładować igłę iniekcyjną 2 μl mieszaniny iniekcyjnej za pomocą końcówek do mikroładowania.
    UWAGA: Mieszanina iniekcyjna przedstawiona w protokole składa się z jednoprowadnicowego RNA (sgRNA)(s) i rekombinowanego białka Cas9 zmieszanego wH2O.
  3. Umieścić szkiełko podstawowe z wyściełanymi zarodkami na stoliku mikroskopu złożonego.
  4. Ostrożnie wbij igłę w tylny koniec zarodka pod kątem pionowym 25-35 °. Wstrzyknąć 1-5 ml mieszaniny do wstrzykiwań (około 2-10% objętości zarodka) i upewnić się, że zarodek wydaje się lekko puchnąć, gdy mieszanina jest do niego wstrzykiwana (Rysunek 2- iv).
    UWAGA: Jeśli do zarodka zostanie wstrzyknięta zbyt duża ilość mieszaniny do wstrzykiwań, może ona pęknąć, rozpraszając cytoplazmę z zarodka. Dodatkowo nieprawidłowo ścięte lub złamane igły ze zbyt dużym otworem mogą również spowodować pęknięcie zarodka.
    1. Spróbuj ponownie ukosować igły, jeśli dojdzie do zatkania. Cytoplazma zarodków N. vitripennis jest niezwykle lepka i lepka, co prowadzi do częstego zatykania się igieł (1/25 wstrzyknięć).
      UWAGA: Ważne jest, aby zarodki były wilgotne w okresie iniekcji poprzez regularne dodawanie wody dejonizowanej za pomocą pędzla. Ilość wody na szczoteczce jest kluczowa do łatwego przesuwania zarodków i ich wyrównywania. Zbyt duża ilość wody powoduje, że zarodki unoszą się na wodzie, a zbyt mała ilość wody utrudnia ich poruszanie się.
    2. Wstrzyknij ~ 20-40 jaj na raz (powinno to zająć około 10 minut), a następnie przestań. Przenieś wstrzyknięte jaja mokrym pędzlem, lekko dotykając wstrzykniętych jaj i umieść je w żywicielu. Następnie kontynuować wstrzykiwanie, używając świeżej, nowo złożonej partii jaj (> 1 godzin).
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby ten protokół był najbardziej skuteczny, jeśli jedna osoba stale zbiera i ustawia w szeregu jaja, podczas gdy inna osoba wstrzykuje składniki modyfikacji genomu i przeszczepia wstrzyknięte zarodki do poczwarek gospodarza.

5. Przeszczepianie wstrzykniętych zarodków G0 N. vitripennis na wstępnie użądlonego żywiciela

  1. Ostrożnie umieść wstrzyknięte zarodki G0 na uprzednio użądlonych poczwarkach S. bullata (Rysunek 2- vi) mokrym pędzlem po mikroiniekcji.
    UWAGA: W tym celu sprawdzi się poczwarka gospodarza używana do pobierania zarodków do mikroiniekcji. Ponadto, pomimo znacznych wysiłków, obecnie nie ma dostępnej sztucznej diety, którą można by zastosować22.
    1. Umieszczać do 40 wstrzykniętych zarodków pojedynczo na jednym wstępnie użądlonym żywicielu, aby uniknąć przeludnienia i konkurencji larw.
      UWAGA: Wstrzyknięcie spowoduje uszkodzenie zarodków; Nieostrożne przeszczepienie wstrzykniętych zarodków poczwarkom gospodarza może spowodować wyciśnięcie wstrzykniętego składnika lub żółtka i doprowadzić do śmierci zarodków.
  2. Umieść poczwarki gospodarza na szalce Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną i wacikami i inkubuj je w temperaturze 25 °C przy wilgotności około 70%, aż do wyklucia się wstrzykniętych zarodków (około 1-2 dni) (Rysunek 2- vii).
    UWAGA: Co ważne, żywiciele mogą pozostać z oderwanym poczwarką, a jaja N. vitripennis będą się normalnie rozwijać, o ile będą inkubowane w wilgotnej komorze (szalka Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną i wacikami), aby zapobiec wysuszeniu. Inkubacja w temperaturze pokojowej i przy wilgotności z zwilżonych wacików jest wystarczająca w przypadku, gdy nie można kontrolować wilgotności.
  3. Przenieść poczwarki gospodarza na nową szalkę Petriego przy wilgotności 70% i temperaturze 25°C po wykluciu się zarodków G0.
    1. Codziennie monitoruj poczwarki żywiciela i wstrzyknięte larwy G0. Jeśli poczwarki żywiciela mają nieprzyjemny zapach, przenieś wstrzyknięte larwy do nowych, zdrowych poczwarek gospodarza.

6. Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu

  1. Usuń każdą poczwarkę N. vitripennis z żywiciela za pomocą cienkiego pędzla lub szpikulca do zarodków. LarwyG0, którym wstrzyknięto zastrzyk, powinny przepoczwarzyć się około 8 dni po wstrzyknięciu.
  2. Umieść każdą usuniętą poczwarkę w izolowanej szklanej fiolce zatkanej bawełną i pozwól im wyłonić się jako dorosłe G0, upewniając się, że wyklute samice będą dziewicze, co pomoże w dalszych krzyżówkach genetycznych.
    UWAGA: Samice można sortować od samców według długości skrzydeł: samice mają dłuższe skrzydła, które wystają poza profil ciała, gdy są obrócone na bok. Wszystkie poczwarki żeńskie z mikrowstrzykniętymi mikroiniekcjami można umieścić razem w zatkanej fiolce, to samo dotyczy poczwarek płci męskiej.
  3. Badanie przesiewowe G0 osób, po ekleksji, za pomocą PCR lub wizualnie (w przypadku zaburzenia genu fenotypowego). Na przykład, jeśli CRISPR jest używany do tworzenia delecji w danym genie, a zaburzony gen nadaje widoczny fenotyp, posortuj i zachowaj osoby ze zmutowaną wersją dotkniętego fenotypu (Rysunek 2- viii)21. Jeśli jednak dotknięty gen koduje niewidoczny fenotyp, taki jak mutacja niezbędnego genu, należy przeprowadzić schemat krzyżowania (krzyżowanie samca G0 z samicą typu dzikiego lub krzyżowanie samicy G0 z samcem typu dzikiego) w celu odzyskania i przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem dziedzicznych mutantów poprzez oznaczenie śmiertelności lub bezpłodności.
    UWAGA: Podobnie jak D. melanogaster, dorośli N. vitripennis mogą być unieruchomieni przez ekspozycję na CO2 , co pozwala na prostą manipulację. Co więcej, niekryte samice dadzą początek 100% haploidalnym lęgom męskim, więc zmutowana niepokryta samica może dać początek dużej liczbie zmutowanych samców, które można wykorzystać do późniejszej analizy.
    UWAGA: Mutacje w podstawowych genach będą musiały być utrzymywane przez kojarzenie ocalałych samic, którym wstrzyknięto G0 (przypuszczalnie heterozygotyczne pod względem mutacji) z samcami typu dzikiego; w tym konkretnym przypadku połowa męskiego potomstwa G1 powinna umrzeć z powodu dziedziczenia mutacji letalnej, podczas gdy połowa żeńskiego potomstwa G1 będzie nosicielami mutacji letalnej.
  4. Krzyżuj dorosłe osoby G0 i przesiewaj potomstwo G1 pod kątem insercji transgenu za pomocą markerów transgenezy, jeśli celem jest transgeneza. Obecnie transgeneza nie została jeszcze wykazana u N. vitripennis.

Wyniki

Niniejszy protokół zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące hodowli kolonii, zbierania embrionów w stadium przedblastodermy, ich ustawiania, mikroiniekcji oraz późniejszej transplantacji po iniekcji i może być wykorzystany do wydajnej inżynierii genomu u N. vitripennis. Jak pokazano na Ryc. 2, ogólna sekwencja kroków niezbędnych do przeprowadzenia udanej mikroiniekcji u N. vitripennis obejmuje: (i) umożliwienie kopulacji dorosłym osobnikom płci męskiej i żeńskiej (~ 4 dni), (ii) dostarczenie zapłodnionym samicom świeżych poczwarek muchy gospodarza (S. bullata) umieszczonych w zmodyfikowanym korku z pianki i umożliwienie zniesienia jaj (~ 45 min), (iii) ostrożne oddzielenie kutykuli zapasożyconych poczwarek gospodarza w celu odsłonięcia i zebrania embrionów osy w stadium przedblastodermy (~ 15 min), (iv) ustawienie zebranych embrionów (~ 15 min), (v) mikroiniekcję komponentów modyfikacji genomu do embrionów (~ 15 min), (vi) ostrożne umieszczenie zainiektowanych embrionów z powrotem w gospodarzach po żądleniu, aby umożliwić prawidłowy rozwój (~ 15 min), oraz (vii) zapobieganie odwodnieniu zainiektowanego embrionu/gospodarza poprzez przeniesienie ich do komory nawilżonej z wilgotnością względną około 70% (~ 15 min). Zapasożyconych gospodarzy inkubuje się następnie przez około 14 dni, aby umożliwić pełny rozwój embrionów N. vitripennis. Po iniekcji dorosłe osobniki wykluwają się z gospodarza (viii), po czym zostają odizolowane, doprowadzone do kopulacji i indywidualnie przesiewane pod kątem występowania oczekiwanych mutacji.

W celu skutecznej penetracji igłą i mikroiniekcji do zarodków N. vitripennis przetestowano kilka rodzajów szklanych igieł kapilarnych wykonanych z kwarcu, aluminokrzemianu oraz borokrzemianu. Stwierdzono, że jakość igły ma krytyczne znaczenie dla uniknięcia pęknięć lub zapchania podczas iniekcji, a także dla osiągnięcia wysokiego poziomu przeżywalności zarodków i wydajności transformacji. Dla każdego rodzaju szkła opracowano skuteczny protokół wyciągania igieł w celu uzyskania pożądanej, długiej końcówki przypominającej igłę hipodermiczną, efektywnej dla mikroiniekcji zarodków N. vitripennis, przy użyciu różnych wyciągarek do mikropipet (P-1000 oraz P-2000) (Tabela 1, Rysunek 4).

Aby zoptymalizować procedurę, mierzy się wskaźniki przeżywalności po wstrzyknięciu różnych ilości komponentów do modyfikacji genomu. Komponentami wykorzystanymi w tej pracy były mieszane sgRNA oraz białko Cas9 do edycji genomu za pomocą systemu CRISPR, co zostało wcześniej wykazane jako skuteczna metoda u N. vitripennis21. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, zaprojektowano i zsyntetyzowano tutaj sgRNA celujące w gen cinnabar. Poprzez celowanie i zakłócenie tego genu uzyskuje się łatwo identyfikowalną zmianę fenotypową w kolorze oczu organizmu19,21. Przygotowano mieszaninę do iniekcji, łącząc różne stężenia sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 i 320 ng/µL) z białkiem Cas9 (0, 20, 40, 80, 160 i 320 ng/µL), a następnie wstrzyknięto ją do embrionów N. vitripennis typu dzikiego. Stwierdzono, że przeżywalność wstrzykniętych embrionów jest zależna od dawki (Tabela 2)21. Zwiększenie stężenia sgRNA i białka Cas9 prowadzi do spadku wskaźników przeżywalności (Tabela 2), co może wynikać z addytywnych efektów off-target. Ustalono również, że wysoka wilgotność (~ 70%) jest istotna dla przeżywalności embrionów po transplantacji do gospodarzy, ponieważ niska wilgotność (~ 10%) skutkowała 100% śmiertelnością wszystkich wstrzykniętych embrionów.

figure-results-1
Rycina 1Przygotowanie poczwarek gospodarza (S. bullata) dla *N. vitripennis* składanie jaj z embrionami (AMłode i stare *S. bullata* poczwarki. Starsze poczwarki mają ciemniejszą kutykulę, podczas gdy młodsze poczwarki mają kutykulę o bardziej czerwonym odcieniu. W celu maksymalizacji składania jaj preferowane są młodsze poczwarki. Koniec tylny i przedni poczwarek można również rozróżnić na podstawie "otwór przypominający krater na końcu tylnym, podczas gdy koniec przedni kończy się zaokrąglonym wierzchołkiem. (B) Gospodarz (S. bullata) przygotowanie poczwarki do *N. vitripennis* składanie jaj z zarodkiem. Umieszczenie poczwarek gospodarza w piankowym korku z wyciętym otworem o rozmiarze poczwarki. Należy skierować tylną część poczwarki gospodarza do wnętrza korka, pozostawiając 0,2 cm przedniego końca na zewnątrz, aby zapewnić maksymalną koncentrację składania jaj w obszarze przednim. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2. Harmonogram tworzenia mutantów N. vitripennis metodą mikroiniekcji. Harmonogram zbierania embrionów N. vitripennis, mikroiniekcji CRISPR/Cas9 oraz procedur poiniekcyjnych. Dorosłe osobniki N. vitripennis pozostawiono do kopulacji w warunkach braku miejsca do składania jaj przez 4 dni (i). Następnie świeże poczwarki gospodarza, muchy mięsnej S. bullata, umieszczone w korku z pianki w taki sposób, aby odsłonić jedynie 0,5 cm tylnego końca, podano zapłodnionym samicom na 45 min w celu umożliwienia zapasożytowania (ii). Równocześnie przygotowano materiały do iniekcji, w tym igły do mikroiniekcji oraz komponenty CRISPR/Cas9 (iii). Embriony pobrano z gospodarza (iv), ustawiono w linii (v) i wstrzyknięto im komponenty CRISPR/Cas9 (vi). Wstrzyknięte embriony ostrożnie przeniesiono z powrotem do wcześniej zapasożytowanego gospodarza (vii) i inkubowano do pełnego rozwoju (14 dni) (viii). Po wykluciu się osobników dorosłych, mutanty przesiewano pod kątem fenotypów oczekiwanych mutacji wywołanych przez CRISPR/Cas9 w genie docelowym (ix). Cała procedura trwa zazwyczaj 19 dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Modyfikowane szkiełko przedmiotowe do ustawiania zarodków. (A) Szkiełko nakrywkowe. (B) Szkiełko przedmiotowe. (C) Urządzenie do ustawiania zarodków. Szkiełko nakrywkowe można przykleić do szkiełka przedmiotowego, aby służyło do ustawiania zarodków przed iniekcją. Celem zastosowania szkiełka nakrywkowego jest stworzenie krawędzi umożliwiającej łatwą manipulację i ustawianie zarodków w linii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Przygotowanie igły do iniekcji. (A) Przykłady prawidłowo i nieprawidłowo wykonanych igieł ze szkła glinoślączkowego. (B) Końcówki igieł bez ścięcia, z prawidłowym ścięciem oraz z niewłaściwym ścięciem. Kapilary ze szkła glinoślączkowego zostały wyciągnięte przy użyciu wyciągacza mikropipet. Wytworzone końcówki igieł zostały następnie delikatnie rozszerzone i dopracowane za pomocą ścięcia. Prawidłowo ścięta igła posiada bardzo ostrą końcówkę, natomiast niewłaściwie ścięta igła ma końcówkę tępa. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Typ szkła kapilarnegoModel wyciągacza igieł SutterCiepłoFilamentPrędkośćOpóźnieniePociągnijCiśnienie
KwarcP-2000750440150165-
AluminokrzemianP-1000605-1308070500
BorokrztalP-1000450-1308070500

Tabela 1. Ustawienia wyciągacza igieł.
Uwaga: Ustawienia wyciągacza igieł różnią się w zależności od urządzenia, dlatego każde laboratorium musi zoptymalizować własne ustawienia wyciągacza igieł. Tabela ta została opracowana na podstawie pracy Li et al.21

sgRNA-1Cas9Łączna liczba embrionówPrzeszczepienie (wilgotność 10%)Przeszczepienie (wilgotność 70%)
Przeżywalność larwPrzeżywalność larwPrzeżywalność osobników dorosłych
Suma (%)Suma (%)♂♀Suma (%)
Brak iniekcjiBrak iniekcji10094 (94)96 (96)662692 (92)
WodaWoda1000 (0)78 (78)443276 (76)
20 ng/µL20 ng/µL1000 (0)74 (74)343468 (68)
40 ng/µL40 ng/µL1000 (0)67 (67)303262 (62)
80 ng/µL80 ng/µL1000 (0)53 (53)242246 (46)
160 ng/µL160 ng/µL1000 (0)41 (41)162238 (38)
320 ng/µL320 ng/µL1000 (0)25 (25)101020 (20)

Tabela 2. Przeżywalność po iniekcji i transplantacji oraz wskaźniki mutagenezy w zależności od iniekcji różnych stężeń sgRNA i Cas9. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Li et al.21

Dyskusja

Niedawne sekwencjonowanie genomu N. vitripennis wyzwoliło ważne zapotrzebowanie na narzędzia molekularne do funkcjonalnego charakteryzowania nieznanych genów tego gatunku23. System CRISPR-Cas9 i wiele innych narzędzi do edycji genów okazały się cenne w badaniu funkcji genów u wielu organizmów24. Jednak, aby wygenerować mutacje dziedziczne, narzędzia te wymagają wykonania mikroiniekcji zarodków. W związku z tym zademonstrowano tutaj szczegółową technikę wizualną, która obejmuje szereg innowacji, które pozwalają na skuteczne mikroiniekcje zarodków N. vitripennis .

Ogólnie rzecz biorąc, ta szczegółowa technika oferuje szereg istotnych innowacji w stosunku do istniejących metod23, które pozwalają na skuteczne mikroiniekcje zarodków N. vitripennis . Na przykład, aby ułatwić szybkie pobieranie zarodków, tworzy się narzędzie do składania jaj (korek piankowy), które jest używane do całkowitego ograniczenia składania jaj do tylnego końca gospodarza (ryc. 1), co znacznie ułatwia pobranie wielu zarodków w krótkim czasie. Udoskonalono również i zdefiniowano techniki hodowli kolonii os o dużej liczbie w celu zebrania większej liczby jaj. Dodatkowo, aby przyspieszyć wyrównanie zarodka, opracowano urządzenie do wyrównywania zarodków, które pozwala na skuteczne wyrównanie zarodków i wstrzyknięcie ich bez konieczności używania dwustronnej taśmy klejącej w celu zabezpieczenia zarodków na miejscu (ryc. 3).

Ponadto stwierdzono, że utrzymywanie zarodków w wilgoci z wodą podczas wstrzykiwania i nie wysuszanie zarodków ani nie pokrywanie ich olejem poprawiło wskaźniki przeżycia. Dodatkowo testuje się kilka rodzajów szkła kapilarnego i określa parametry pozwalające na skonstruowanie idealnych igieł do mikroiniekcji N. vitripennis (Tabela 1, Rysunek 4). Co więcej, po mikroiniekcji wskaźniki przeżywalności zarodków mogą znacznie wzrosnąć dzięki inkubacji wstrzykniętych jaj w wstępnie użądlonych żywicielach umieszczonych w komorach o wysokiej wilgotności (70%). Innowacje te pozwalają na bardziej usprawnioną i skuteczną procedurę mikroiniekcji w przypadku N. vitripennis.

W zależności od preferencji użytkownika można wprowadzić drobne modyfikacje w zakresie aparatury iniekcyjnej i procedur hodowlanych. Jednak kilka krytycznych etapów będzie niezbędnych do pomyślnego wygenerowania mutantów u N. vitripennis. Na przykład niezbędna będzie szybka praca, tak aby wstrzyknięte zarodki miały > 1 godzinę, oraz upewnienie się, że igły do wstrzykiwań są wystarczająco ostre, aby zminimalizować uszkodzenie zarodka. Chociaż protokół ten powinien być skuteczny w generowaniu mutacji w wielu (jeśli nie wszystkich) genach, jednym z głównych ograniczeń jest wymóg CRIPSR/Cas9 dotyczący ukierunkowania sekwencji PAM (NGG), która będzie dyktować sekwencję docelową.

Podsumowując, ta ulepszona technika może być wykorzystana do generowania wielu rodzajów modyfikacji genomu, takich jak mutacje, delecje, a być może nawet insercje przy użyciu technologii CRIPSR/Cas921, a nawet insercje transgenów w celu wygenerowania transgenicznego N. vitripennis, co powinno znacznie przyspieszyć badania funkcjonalne w tym organizmie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez hojny fundusz startowy Uniwersytetu Kalifornijskiego, Riverside (UCR) dla O.S.A., projekt Hatch (1009509) dla O.S.A. Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa (NIFA) USDA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BugdormBugdorm41515Klatka do hodowli owadów
Szklane probówkiFisher Scientific982010
Poczwarki muchy mięsnej, Sarcophaga bullataCarolina Insects144440
Beveler mikroelektrodSutter InstrumentsBV10
Diamentowa płyta ścierna (rozmiary końcówek od 0,7u do 2,0u)Sutter Instrumenty104E
MikromanipulatorŚwiat Instrumenty precyzyjneKite R
Programowalny mikrowtryskiwacz Femtojet Express ŚciągaczEppendorf
SutterInstrumentsP-1000 lub P-2000
Mikroskop złożony OlympusSZ51
Leica DM-750
Rurka kapilarna ze szkła glinokrzemianowego 1 mm (średnica zewnętrzna) X 0,58 mm (średnica wewnętrzna)Sutter InstrumentsBF100-58-10Może również używać zatyczek borokrzemianowych lub kwarcowych
JAECEL800-BZatyczki piankowe
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-A3
Szkło Micro CoverVWR48366045
KlejAron AlphaAA471Do przyklejania szkiełek nakrywkowych do szkiełek mikroskopowych
Pędzel z cienką końcówkąZEM2595
Szczypiec z bardzo cienką końcówkąFisher Scientific16-100-121
Końcówki Femtotip Końcówki do mikroładowarekFisher ScientificE5242956003
do mikropipet Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

  1. Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
  2. Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
  3. Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
  4. Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
  5. Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551(2017).
  6. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
  7. Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
  8. Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
  9. de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
  10. Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
  11. Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
  12. Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
  13. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
  14. Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
  15. Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
  16. Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
  17. Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
  18. Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984(2013).
  19. Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
  20. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  21. Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901(2017).
  22. Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
  23. Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
  24. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transplantacja poczwarek gospodarzaCRISPR Cas9wyci ganie mikropipetustawianie zarodk wci cie ko c wki ig yzarodki w fazie G0poczwarki S bullata

Powiązane artykuły