Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię uzyskiwania spłaszczonych przekrojów stycznych z kory mózgowej ssaków i wizualizacji modułów korowych za pomocą metod histochemicznych i immunohistochemicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja modułów korowych w spłaszczonych korach ssaków
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kora mózgów ssaków jest podzielona na odrębne podstruktury lub moduły. Moduły korowe zazwyczaj leżą równolegle do arkusza korowego i można je wyznaczyć za pomocą pewnych metod histochemicznych i immunohistochemicznych. W tym badaniu zwracamy uwagę na metodę izolowania kory mózgowej od mózgów ssaków i spłaszczania ich w celu uzyskania odcinków równoległych do arkusza korowego. Ponadto podkreślamy wybrane metody histochemiczne i immunohistochemiczne do przetwarzania tych spłaszczonych odcinków stycznych w celu wizualizacji modułów korowych. W korze somatosensorycznej różnych ssaków przeprowadzamy histochemię oksydazy cytochromowej, aby ujawnić mapy ciała lub moduły korowe reprezentujące różne części ciała zwierzęcia. W przyśrodkowej korze śródwęchowej, obszarze, w którym generowane są komórki siatki, wykorzystujemy metody immunohistochemiczne, aby podkreślić moduły genetycznie zdeterminowanych neuronów, które są ułożone we wzór siatki w arkuszu kory mózgowej u kilku gatunków. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniamy ramy do izolowania i przygotowywania warstwowo spłaszczonych odcinków kory mózgowej oraz wizualizacji modułów korowych przy użyciu metod histochemicznych i immunohistochemicznych w wielu różnych mózgach ssaków.
Wprowadzenie
Niektóre z najbardziej znaczących zmian w strukturze mózgu w filogenezie można zaobserwować w korze mózgowej. Pomimo znacznych różnic, kora mózgowa zwierząt przebiega według wspólnego wzorca i może być ogólnie podzielona na dwa różne sposoby, według warstw i obszarów1. Warstwy korowe leżą równolegle do powierzchni mózgu i różnią się liczbą od 3 warstw w korze2 do 6 warstw w korze ssaków1. Z drugiej strony obszary korowe są odrębnymi obszarami kory mózgowej, które w dużej mierze odpowiadają różnym funkcjom, np. kora somatosensoryczna jest zaangażowana w odczuwanie dotyku, a kora wzrokowa w przetwarzanie bodźców wizualnych. Te obszary kory mózgowej można często podzielić na łaty lub moduły3, które są regularnie powtarzającymi się strukturami anatomicznymi, zasadniczo znajdującymi się równolegle do powierzchni mózgu. Moduły korowe mogą być ograniczone do określonej warstwy4, lub rozciągać się na kilka warstw5.
Standardowe metody podziału mózgu obejmują sekcje normalne do powierzchni mózgu, takie jak koronalne lub strzałkowe. Podczas gdy metody te mogą być używane do wizualizacji modułów korowych, wiele interesujących cech można ujawnić, gdy moduły korowe są wizualizowane stycznie, w płaszczyźnie równoległej do powierzchni mózgu. Na przykład moduły somatosensoryczne w mózgu gryzoni reprezentujące wąsy, pojawiają się jako beczki, gdy są wizualizowane normalnie do powierzchni mózgu, a zatem regiony te wywodzą nazwę kory beczkowej. Jednakże, po wizualizacji beczek w orientacji stejcznej, ujawniają one mapę wąsów, z beczkami ułożonymi w orientacji topograficznej odzwierciedlającej dokładny układ wąsów na zewnętrznej powierzchni ciała. W niektórych przypadkach układ modułowy wymykał się nawet wykryciu przez dłuższy czas, gdy był wizualizowany w sposób niestyczny. Przyśrodkowa kora śródwęchowa jest znana z obecności komórek siatkowych, neuronów, które wystrzeliwują w regularny sześciokątny wzór, gdy zwierzę przechodzi przez środowisko. Mimo że jest to obszar intensywnie badany, do niedawna obecność plam lub modułów komórek w przyśrodkowej korze śródwęchowej, które są fizycznie ułożone w sześciokątny wzór6, wymykała się wykryciu. Obecność i rozmieszczenie tych modułów w mózgu szczura było ułatwione dzięki stycznym sekcjom przyśrodkowej kory śródwęchowej i badaniu cytoarchitektury w sposób warstwowy.
Po przecięciu, szczególny aspekt wizualizacji modułów korowych może być również realizowany na wiele sposobów. Klasycznie, badania mają wyznaczone moduły na podstawie gęstości komórek lub układu włókien1. Innym popularnym podejściem jest zastosowanie histochemii oksydazy cytochromowej, która ujawnia obszary o wyższej aktywności8. Nowsze podejścia obejmują przyjrzenie się genetycznie zdeterminowanym typom komórek, rozróżnianym na podstawie ich profili ekspresji białek6,8.
W tym badaniu podkreślamy metody izolacji kory mózgowej od mózgów ssaków, uzyskania spłaszczonych sekcji stycznych i wizualizacji modułów korowych na podstawie histochemii oksydazy cytochromowej i immunohistochemii białek specyficznych dla typu komórki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt pod nadzorem lokalnych komisji etycznych (LaGeSo). Dane dotyczące mózgów ludzi i nietoperzy pochodzą z pracy Naumann et al.5 Poniższa procedura jest wykonywana na dorosłym samcu szczura Wistar (szczep: RJHan:WI).
1. Perfuzyjność i wyodrębnianie mózgu
UWAGA: Aby uzyskać homogenicznie utrwalony i pozbawiony krwi mózg, wysoce zaleca się przeprowadzenie perfuzji transkardialnej zwierzęcia, ponieważ pozostałości krwi zwiększają niespecyficzny sygnał tła podczas barwienia. Niemniej jednak możliwe jest również uzyskanie spłaszczonych przekrojów z nieperfundowanych preparatów i ich zbarwienie. Łatwość manipulacji preparatem zależy od stężenia zastosowanego utrwalacza. Zbyt słaba fiksacja zwiększa ryzyko uszkodzenia mózgu podczas spłaszczania i cięcia, natomiast zbyt wysokie stężenia ograniczają elastyczność przy spłaszczaniu oraz pogarszają jakość sygnału barwienia.
- Przeprowadź perfuzję transkardialną zwierzęcia, używając igły 23G. Bardziej szczegółowy opis znajduje się w pracy Gage et al.9
- Użyj solistkiego buforu fosforanowego10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4), aby wypłukać krew z mózgu i ciała zwierzęcia. Kontynuuj proces, aż płyn infuzyjny stanie się klarowny, wprowadzając do układu naczyniowego co najmniej 150 mL PBS.
UWAGA: Najlepsze wyniki uzyskuje się przy ciśnieniu zbliżonym do zakresu fizjologicznego ciśnienia krwi perfundowanego zwierzęcia (np. szczura: 120-130 mmHg). Opcjonalnie można dodać do roztworu heparynę (10 U/mL), aby zapobiec koagulacji krwi1. - W celu utrwalenia mózgu wykonaj transkardialną infuzję minimum 10 mL paraformaldehydu12 (PFA, 4%; w 0.1 M buforze fosforanowym (PB)13) aż do momentu, gdy kark zwierzęcia stanie się sztywny.
OSTRZEŻENIE: PFA jest potencjalnym kancerogenem.
UWAGA: Najlepsze wyniki w przypadku barwień aktywności histochemicznej, np. dla oksydazy cytochromowej, uzyskuje się przy zastosowaniu 2% PFA. W przypadku innych barwień, takich jak immunohistochemia, zaleca się stosowanie 4% PFA.
- Użyj solistkiego buforu fosforanowego10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4), aby wypłukać krew z mózgu i ciała zwierzęcia. Kontynuuj proces, aż płyn infuzyjny stanie się klarowny, wprowadzając do układu naczyniowego co najmniej 150 mL PBS.
- Wyjmij mózg z czaszki.
UWAGA: Szczegóły znajdują się w pracy Gage et al.9.- Odizoluj głowę, używając dużych nożyczek lub kleszczykowatych nożyc do kości.
- Za pomocą precyzyjnych nożyczek przetnij skórę wzdłuż linii środkowej od karku do nosa. Rozchyl skórę, aby odsłonić czaszkę. Usuń mięśnie szyjne i skroniowe za pomocą precyzyjnych nożyczek.
- Wykonaj cięcie pośrodkowe przez kość międzyparietalną, zaczynając od otworu wielkiego (foramen magnum) w górę, aż do kości ciemieniowej.
- Użyj kleszczy typu Rongeurs, aby oddzielić kość międzyparietalną. Przesuń precyzyjne nożyczki wzdłuż szwu strzałkowego i przetnij od tylnego końca kości ciemieniowej do przedniego końca kości czołowych.
- Użyj kleszczy typu Rongeurs, aby oddzielić kości ciemieniowe i czołowe. Alternatywnie można unieść kości za pomocą pęsety. Użyj łyżeczki, aby przeciąć brzuszne pęczki nerwowe i wyjąć mózg. Przenieś mózg do PB (0.1 M; pH 7.4).
- Utrwal mózgi nieperfundowane poprzez zanurzenie w 4% PFA na 1-3 h w temperaturze 4 °C (zależnie od wielkości mózgu i badanego gatunku: ryjówka: ~ 1 h, człowiek: ~ 3 h).
UWAGA: W przypadku dużych mózgów z rozwiniętymi zakrętami, takich jak ludzki, należy odizolować i wyciąć obszar zainteresowania, aby skrócić czas utrwalania. - Aby uzyskać większe obszary kory na przekroju, spłaszcz mózg przed dalszą post-fiksacją; przejdź do kroku 2. Jednak w celu uzyskania przekrojów z trudniej dostępnych obszarów, takich jak przyśrodkowa kora entorynalna, utrwal mózg w 4% PFA przez 24 h przed przejściem do kroku 2.
2. Disekcja i spłaszczanie mózgu
- Oddziel półkule mózgu, używając żyletki (mózgi lissencefaliczne) lub skalpela (mózgi gyrencefaliczne).
UWAGA: Jeśli mózg nie został poddany post-fiksacji, jest podatny na uszkodzenia podczas manipulacji. - Krok opcjonalny wspomagający późniejszą rejestrację przekrojów i szacowanie skurczu tkanki:
- Nakłuj korę w obszarze nieobjętym analizą za pomocą igły 35G prostopadle do powierzchni kory. Powtórz ten krok dwukrotnie w określonych odstępach wzdłuż płata kory. Aby wyznaczyć odległość wzdłuż płata kory, użyj wcześniej dociętej nici o stałej długości (np. 5 mm) i ułóż ją wzdłuż powierzchni kory, aby wyznaczyć punkty nakłucia.
- Mózgi lissencefaliczne: Usuń struktury podkorowe za pomocą szpatułki do preparowania. Krytyczne: Przez cały czas trwania procedury utrzymuj mózg w wilgotności, używając PB (0.1 M; pH 7.4).
- Przytrzymaj mózg za móżdżek i ostrożnie wprowadź szpatułkę, aby otworzyć płaszczyznę preparowania w obrębie ciała kalosowego. Zaokrąglona końcówka szpatułki powinna być skierowana w stronę przeciwną do kory.
- Przesuń szpatułkę dalej i delikatnie pociągnij, aż znajdzie się ona między wzgórzem a korą. Oddziel struktury podkorowe wykonując ruchy zdrapujące.
- Sprawdź, czy półkula ma równomierną grubość.
UWAGA: Wszelkie niejednorodności mogą prowadzić do powstania gradientu międzywarstwowego podczas sekcjonowania. W przypadku sekcjonowania stycznego użyj skalpela, aby wykonać czyste cięcie przez mózg, równolegle do powierzchni pialnej obszaru, z którego pożądane są przekroje styczne. - Kroki opcjonalne w celu poprawy jakości spłaszczania:
- Wykonaj czyste cięcie przez prążkowie, jądro półleżące i korę oczodołowo-czołową, ponieważ zwiększają one grubość kory w obszarze bocznym. Dodatkowo wykonaj nacinanie odciążające u podstawy wewnętrznej części kory przedczołowej, co umożliwi rozłożenie przyśrodkowych części kory.
- Umieść półkulę (korą do dołu) na szkiełku przedmiotowym. Przejdź do kroku 2.6.
- Mózgi gyrencefaliczne: Usuń białą treść, aby rozwinąć zakręty (szczegółowe protokoły: Sincich et al.14; Tootell i Silverman15). Krytyczne: Przez cały czas używaj PB (0.1 M; pH 7.4), aby utrzymać mózg w wilgotności.
- Umieść obszar zainteresowania na wilgotnym papierze filtracyjnym w dużej płytce Petriego, korą do góry.
- Usuń błonę pajęczynową i miękką oponę za pomocą dwóch pęset.
- Użyj wilgotnego patyczka bawełnianego i ostrożnie wprowadź go w każdą bruzdę, aby oddzielić zrosty między zakrętami.
- Obróć mózg, używając innego wilgotnego papieru filtracyjnego.
- Użyj dwóch zakrzywionych mikro-szpatułek do rozwijania pojedynczych zakrętów. Wykorzystaj wypukłą stronę szpatułek do rozdzielania białej treści, aż dotrzesz blisko wklęsłego końca zakrętu. Użyj wilgotnego patyczka bawełnianego i wykonuj ruchy okrężne, aby dotrzeć do wklęsłego końca zakrętu.
- Rozdziel pojedyncze zakręty. W razie potrzeby wykonaj niewielkie nacięcia odciążające, jeśli napięcie tkanki jest zbyt duże.
- Spłaszcz rozwinięty mózg w płytce Petriego lub podobnym pojemniku.
- Opcjonalnie, większe mózgi można umieścić na gąbce przykrytej papierem filtracyjnym, aby zapobiec wysychaniu poszczególnych obszarów.
- Po obu stronach umieść dwa zwinięte kawałki gliny. Krytyczne: Ponieważ grubość gliny określa stopień spłaszczenia półkuli, upewnij się, że glina jest o 10-20% cieńsza niż niespłaszczona kora.
- Delikatnie dociśnij drugie szkiełko przedmiotowe lub małą płytkę Petriego do kory, aż półkula zostanie całkowicie spłaszczona. Aby uzyskać najlepsze wyniki dla wybranego obszaru, najpierw przyłóż szkiełko do odpowiedniego miejsca. W przypadku mózgów lissencefalicznych, aby uzyskać najlepsze rezultaty, najpierw przyłóż szkiełko stycznie do części bocznej i wywrij skoncentrowany nacisk na ten region.
- Połóż obciążenie (np. ceramiczne szkiełko zegarkowe) na szkiełkach przedmiotowych/płytce Petriego i spłaszczaj półkulę przez 3-5 h w temperaturze 4 °C w PB.
- W celu przeprowadzenia post-fiksacji zdejmij obciążenie i usuń szkiełka przedmiotowe. Umieść spłaszczoną półkulę w PFA (wolno pływającej) na 24 h w wytrząsarce w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Najlepsze wyniki dla barwień aktywności histochemicznej uzyskuje się przy użyciu 1% PFA. W przypadku innych barwień, takich jak immunohistochemia dla mózgów nieperfundowanych, można zastosować 2% PFA.
Rysunek 1: Schematyczny przebieg procesu rozprostowania półkuli kory mózgu szczura oraz wizualizacji modułów w korze somatosensorycznej. Po perfuzji transkardialnej wypreparowano mózg myszy (A). Struktury podkorowe zostały usunięte, a korę spłaszczono pomiędzy dwiema szkiełkami przedmiotowymi w buforze fosforanowym (B). Spłaszczona półkula (C) poddano utrwaleniu po badaniu, przecięto stycznie i wybarwiono w celu oceny aktywności cytochromydeksydazy (D). Paski skali = 1 cm. R: rostralnie, C: kaudalnie, L: lateralnie, M: medialnie. Rycina dostosowana na podstawie opracowania Lauer i wsp.23 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Wycinanie przekrojów stycznych
UWAGA: W zależności od wymagań protokołów barwienia, procedurę i grubość cięcia można dostosować. Do wycinania półkul na potrzeby dalszej obróbki histochemicznej (krok 3.2) przy grubości 80-150 µm użyto wibratomu. Jednak w przypadku obróbki immunohistochemicznej pożądane są cieńsze przekroje, dlatego do sekcjonowania (krok 3.3) przy grubości 10-60 µm zastosowano mikrotom kriostatyczny. Patrz Wideo 1.
- Przemywać spłaszczoną półkulę w buforze fosforanowym PB (0.1M; pH 7.4) przez 15 min.
- Przeciąć półkulę na wibratomie.
- Umieścić półkulę stycznie na uchwycie do krojenia. Opcjonalnie, ponownie delikatnie docisnąć szkiełkiem przedmiotowym przed utrwaleniem jej w pozycji (np. za pomocą superkleju).
UWAGA: Należy zminimalizować ilość użytego kleju, ponieważ ze względu na niewielką grubość spłaszczonych półkul mogą powstać artefakty cięcia. - Przecinać półkulę od końca grubszego i bardziej stabilnego w kierunku końca cieńszego (tutaj: od tyłu do przodu) przy wymaganej grubości. Przejść do kroku 3.4.
UWAGA: Jeśli zastosowano niskie stężenia utrwalacza, przecinać z małą prędkością i przy wysokiej amplitudzie.
- Umieścić półkulę stycznie na uchwycie do krojenia. Opcjonalnie, ponownie delikatnie docisnąć szkiełkiem przedmiotowym przed utrwaleniem jej w pozycji (np. za pomocą superkleju).
- Przeciąć półkulę na mikrotomie kriostacie.
- Krioprotektować mózg, zanurzając go w 30% roztworze sacharozy (w PB), aż do momentu jego zatonięcia.
UWAGA: W zależności od wielkości krioprotektowanej tkanki, czas zatapiania w roztworze może wynosić od kilku godzin do kilku dni. W przypadku większych mózgów można rozważyć alternatywne metody krioprotekcji (patrz Rosene et al.16). - Utworzyć podstawę lodową na mikrotomie kriostacie w celu zamontowania mózgu. Podstawę lodową przygotować poprzez zamrożenie PB na powierzchni bloku mikrotomu kriostatu. Krytyczne: Upewnić się, że powierzchnia podstawy lodowej jest równoległa do ostrza mikrotomu. W tym celu przeciąć pustą podstawę lodową ostrzem mikrotomu, aby dokładnie wyrównać ją równolegle do powierzchni cięcia.
- Zatopić mózg w medium mrożącym i zamocować go do powierzchni bloku mikrotomu tak, aby obszar zainteresowania był równoległy do powierzchni bloku. Skierować powierzchnię pialną mózgu w stronę powierzchni bloku mikrotomu. Krytyczne: Dostosować temperaturę zamrażania w zależności od wielkości próbki; wyższe temperatury zapewniają lepszą integralność przekrojów podczas krojenia, ale większe przekroje wymagają niższych temperatur w celu jednorodnego zamrożenia próbki.
- Przeciąć mózg stycznie przy wymaganej grubości (wolna i jednostajna prędkość cięcia zapewnia najlepszą jakość przekrojów).
- Krioprotektować mózg, zanurzając go w 30% roztworze sacharozy (w PB), aż do momentu jego zatonięcia.
- Przemywać przekroje w PB przez 15 min na wytrząsarce.
Wideo 1: Schematyczne wideo przedstawiające cięcie styczne przyśrodkowej kory entorynalnej szczura oraz układ modułów parasubikularnych i entorynalnych. Przyśrodkowa kora entorynalna mózgu gryzonia znajduje się w tylnej części kory i jest nachylona w kierunku przyśrodkowym oraz brzuszno-stronnym. Przekroje styczne uzyskuje się poprzez ustawienie noża pod kątem zgodnym z tą orientacją. W konsekwencji odpowiednie barwienie specyficzne dla poszczególnych typów komórek ujawnia struktury modułowe w przyśrodkowej korze entorynalnej oraz sąsiadującym parasubiculum. Wideo zaadaptowane z Ray i Brecht8. Prosimy kliknąć tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
4. Wizualizacja modułów korowych za pomocą barwienia cytochromem oksydazą
UWAGA: Opracowano różne protokoły barwienia do histochemicznego wykrywania aktywności cytochromu oksydazy, np. najpierw przez Wong-Riley17, a później zmodyfikowane przez Divac et al.18 Niniejszy protokół opiera się na metodzie Divac et al.18, ponieważ zastosowanie siarczanu niklu i amonu (NiAS) pozwala uzyskać wyższy kontrast i lepiej zdefiniowane moduły w zabarwionych obszarach kory.
- Przygotować roztwór do barwienia oksydazy cytochromowej (patrz Divac et al.18). Do przygotowania 10 mL roztworu dodać: 10 mL buforu HEPES (0,1 M, pH 7,4), 40 mg sacharozy, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytochromu C, 6 mg diaminobenzydyny (DAB).
UWAGA: DAB i NiAS są substancjami rakotwórczymi.
UWAGA: DAB należy dodać bezpośrednio przed inkubacją skrawków. - Przemyć skrawki w buforze HEPES (0,1 M, pH 7,4) na wytrząsarce przez 15 min.
- Inkubować skrawki w roztworze barwiącym w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
UWAGA: Monitorować szybkość barwienia. W przypadku braku widocznej reakcji zmienić temperaturę inkubacji na 37 °C. W zależności od stopnia utrwalenia, barwienie może być widoczne po 10 min lub po kilku godzinach. - Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 4% PFA; zapobiega to niepożądanemu ponownemu barwieniu i zwiększeniu sygnału tła.
- Przemyć skrawki trzy razy buforem HEPES przez 10 min.
- Zamontować i wysuszyć skrawki na szkiełkach przedmiotowych.
- Odwodnić skrawki w serii alkoholi o rosnącym stężeniu:
- Przemyć szkiełka w 60% etanolu przez 1 min. Przemyć szkiełka w 80% etanolu przez 1 min. Przemyć szkiełka w 96% etanolu przez 2 min. Przemyć szkiełka w 10% etanolu przez 3 min. Przemyć szkiełka w izopropanolu przez 5 min. Przemyć szkiełka w ksylenie przez 5 min.
- Natychmiast dodać szybko twardniejące medium montażowe i nałożyć szkiełko zakrywowe. Krytyczne: Nie używać mediów montażowych na bazie wody, ponieważ NiAS zostanie wypłukany, co spowoduje degradację barwienia.
- Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do długoterminowego magazynowania.
5. Wizualizacja modułów korowych za pomocą barwienia immunohistochemicznego
UWAGA: Dostępnych jest wiele protokołów immunohistochemii, zoptymalizowanych pod kątem konkretnego preparatu i rodzaju sondy. W razie potrzeby można wprowadzić modyfikacje, zmieniając stężenia przeciwciał, środki permutyzujące oraz czasy inkubacji. Poniższy protokół pozwala na uzyskanie dobrych wyników przy wykrywaniu szerokiego zakresu przeciwciał i wizualizacji za pomocą sond fluorescencyjnych.
- Przemyć skrawki w PBS (0.1 M; pH 7.4) przez 15 min.
- Opcjonalnie: Przeprowadzić odsłanianie antygenu w celu odmaskowania epitopu, korzystając z łaźni wodnej (na podstawie Jiao et al.19; alternatywne metody opisano w Pileri et al.20).
- Rozgrzać łaźnię wodną do 80 °C. Przygotować bufor cytryniano-sodowy19 (pH 8.0) i podgrzać go w łaźni wodnej do 80 °C.
- Przenieść skrawki do buforu cytryniano-sodowego. Inkubować skrawki przez 30 min w 80 °C
- Ostudzić skrawki do temperatury pokojowej
- Przemyć skrawki w PBS przez 15 min.
- Przemyć skrawki dwukrotnie w PBS-X (0.5% Triton-X w 0.1 M PBS) przez 15 min.
- Zablokować niespecyficzne epitopy, inkubując skrawki w roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA; 2.5%) i Triton-X (0.75%) w PBS przez 2 h.
- Inkubować skrawki z przeciwciałem pierwotnym, np. Calbindin- D28k (1:5,0, 1% BSA w PBS-X), przez 2-3 dni na wytrząsarce w 4 °C.
UWAGA: Optymalne rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego zależy od zastosowanego konkretnego przeciwciała. Należy zapoznać się z informacjami producenta w celu uzyskania kryteriów rozcieńczenia dla konkretnego przeciwciała. Można stosować wiele przeciwciał jednocześnie, pod warunkiem, że zostały one wytworzone przeciwko różnym gatunkom. - Przemyć skrawki trzykrotnie w PBS, po 15 min każde mycie.
- Inkubować skrawki przez noc z przeciwciałem wtórnym (1:200, 1% BSA w PBS) w 4 °C na wytrząsarce.
UWAGA: Można zastosować wiele przeciwciał wtórnych o różnych widmach, jeśli użyto wielu przeciwciał pierwotnych. - Usunąć przeciwciało wtórne, przemywając skrawki trzykrotnie w PBS, po 10 min każde mycie.
- Zamontować i wysuszyć skrawki na szkiełku do mikroskopii.
UWAGA: Skrawki powinny być nadal wilgotne przed nałożeniem szkiełka cover-slip. - Nałożyć na skrawki tkanki medium montażowe odpowiednie do barwników fluorescencyjnych i przykryć szkiełkiem cover-slip.
- Wysuszyć skrawki przez 1 h.
- Do długoterminowego przechowywania zabezpieczyć krawędzie szkiełka cover-slip lakierem do paznokci i przechowywać w ciemności w 4 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Uzyskaliśmy spłaszczone przekroje kory somatosensorycznej z różnych mózgów, które następnie poddano histochemii oksydazy cytochromowej w celu wizualizacji modułów somatotopicznym reprezentujących różne części ciała. Takie podejście porównawcze pozwala na badanie sił ewolucyjnych kształtujących korę, wykazując np. wysoce konserwatywną reprezentację wibrysów pyszczkowych u gryzoni i zajacзоpodobnych w formie tzw. beczek (barrels)21 (Rysu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modułowość kory mózgowej została zidentyfikowana przy użyciu różnych technik. Najwcześniejsze badania zazwyczaj identyfikowały moduły korowe poprzez wizualizację gęstych obszarów komórek lub brak włókien1. Kolejne metody wykorzystywały obecność wiązek dendrytycznych24, aferentów z określonego regionu25 lub wzbogacenie neuroprzekaźników26. Tutaj pokazujemy dwie techniki, (i) histochemię oksydazy cytochromowej i (ii) barwienie i...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Humboldt Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, Niemieckie Centrum Chorób Neurodegeneracyjnych (DZNE), Niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure oraz nagrodę Gottfrieda Wilhelma Leibniza DFG. Dziękujemy Shimpei Ishiyama za doskonały projekt graficzny i Juliane Diederichs za doskonałą pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Barwienie oksydazą cytochromową | |||
| Cytochrom c z serca koni | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Hydrat tetrachlorowodorku 3,3'diaminobenzydyny | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-sacharoza | Carl Roth | 4621.1 | |
| Sześciowodny siarczan amonu nikiel(II) | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Nazwa< | strong>Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Odzyskiwanie antygenu | |||
| Cytrynian trisodowy dwuwodny | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Kwas cytrynowy jednowodny | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Bufor fosforanowy/sól fizjologiczna buforowana fosforanem/prefiks/PFA | |||
| Diwodorofosforan potasu | Carl Roth | 3904.2 | |
| Chlorek sodu | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-sodowy wodorofosforan dwuwodny | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyd | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k oczyszczony z jelita kurczaka, Mysz monoklonalna | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k z rekombinowanego szczura kalbindyna D-28k, Królik poliklonalny | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Frakcja albuminy V, wolny od biotyny | Carl Roth | 0163.4 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Materiały montażowe lub zamrażające | |||
| Fluoromount (immunofluorescencja) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt ( histochemia) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Podłoże do zamrażania tkanek | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Odwodnienie alkoholowe | |||
| Etanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Etanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Substytut ksylenu | Fluka | 78475 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Urządzenia/narzędzia | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Kleszcze - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Kleszcze Dumont #5 - Wskazówka do biologii Inox | Narzędzia naukowe | 11252-30 | |
| Kleszcze Dumont #5SF - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Nożyce do kości - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| nożyczki | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Nożyczki chirurgiczne - duże pętle | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Nożyczki chirurgiczne - ostre- | narzędzia naukowe | 14001-13 | |
| Nożyczki do cienkiej tęczówki | Narzędzia do nauki o drobnych naukowcach | 14094-11 |
Bibliografia
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343(2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
