Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Podsumowanie

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Streszczenie

Liczne patofizjologiczne uszkodzenia mogą powodować uszkodzenia błon komórkowych, a w połączeniu z wrodzonymi defektami w naprawie lub integralności błon komórkowych, mogą prowadzić do choroby. Zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z naprawą błon komórkowych jest zatem ważnym celem dla opracowania nowych strategii terapeutycznych w chorobach związanych z dysfunkcyjną dynamiką błon komórkowych. Wiele badań in vitro i in vivo mających na celu zrozumienie ponownego uszczelniania błon komórkowych w różnych kontekstach chorobowych wykorzystuje dwufotonową ablację laserową jako standard do określania funkcjonalnych wyników po eksperymentalnym leczeniu. W tym teście błony komórkowe są poddawane zranieniu laserem dwufotonowym, co powoduje pęknięcie błony komórkowej i infiltrację komórki przez barwnik fluorescencyjny. Intensywność fluorescencji w komórce można następnie monitorować w celu ilościowego określenia zdolności komórki do ponownego uszczelnienia. Istnieje kilka alternatywnych metod oceny odpowiedzi błony komórkowej na uszkodzenie, a także duże różnice w samym podejściu do ranienia laserem dwufotonowym, dlatego pojedynczy, ujednolicony model zraniania komórek korzystnie posłużyłby do zmniejszenia różnic między tymi metodologiami. W tym artykule przedstawiamy prosty protokół ranienia laserem dwufotonowym do oceny naprawy błony komórkowej in vitro zarówno u zdrowych, jak i pacjentów z dysferlinopatią komórek fibroblastów transfekowanych z plazmidem dysferliny o pełnej długości lub bez niego.

Wprowadzenie

Błona komórkowa komórek eukariotycznych składa się z podwójnej warstwy naszpikowanych białkami fosfolipidów, które definiują wewnątrz/zewnątrzkomórkowe środowisko komórki i są niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej i przetrwania komórki. Uszkodzenia błony komórkowej wynikające z urazów mechanicznych lub chemicznych są powszechne w różnych typach komórek ssaków, w tym w komórkach mięśni szkieletowych i sercowych, żołądka i płuc^1,2,3,4. Oprócz urazów wynikających z codziennych funkcji fizjologicznych, błony komórkowe mogą być również uszkodzone przez zniewagi środowiskowe, toksyny bakteryjne i reperfuzję niedokrwienną⁵. Brak ponownego uszczelnienia pęknięć w błonie komórkowej prowadzi do nieuregulowanego napływu zewnątrzkomórkowego Ca²⁺- wraz z innymi potencjalnie toksycznymi składnikami zewnątrzkomórkowymi - do komórki, wywołując kaskady sygnałów w dół, które mogą szybko doprowadzić do śmierci komórki^1,4,5,6.

Do tej pory zaproponowano kilka modeli naprawy błon komórkowych. W zależności od wielkości i charakteru pęknięcia membrany mogą zostać aktywowane różne mechanizmy naprawcze. Na przykład sugeruje się, że błony komórkowe mogą wykorzystywać przepływ boczny lub zatykanie białek do naprawy małych zakłóceń (<1 nm). Model fuzji bocznej sugeruje, że pęknięcia błony są szybko naprawiane poprzez boczną rekrutację błony zawierającej dysferlinę⁷, podczas gdy model zatykania białek sugeruje, że małe perforacje są naprawiane przez agregacje białek (głównie aneksyny)⁸. I odwrotnie, większe zmiany błonowe wywołują zależną od Ca²⁺ fuzję pęcherzyków za pośrednictwem dysferliny i tworzenie łaty naprawczej. W modelu łaty naprawczej szybki napływ Ca²⁺ do komórki wyzwala rekrutację wielu białek (dysferliny, aneksyn, mitsuguminy-53 i białek EDH), które tworzą kompleks lub "łatkę", wraz z fuzją wewnątrzkomórkowych pęcherzyków lub lizosomów w miejscu uszkodzenia błony^4,9,10,11,12. Ważne jest, aby pamiętać, że modele te niekoniecznie wzajemnie się wykluczają i mogą współpracować w celu ułatwienia naprawy membrany. Brak prawidłowego uszczelnienia błony komórkowej jest związany z wieloma stanami chorobowymi, w tym dystrofią mięśniową (dysferlinopatia - w tym miopatia Miyoshiego, dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa typu IIB i miopatia dystalna z początkiem przedniej kości piszczelowej)¹³, kardiomiopatia¹⁴ i zespół Chediaka-Higashiego (CHS)¹⁵.

Biorąc pod uwagę, że prawidłowa integralność błony komórkowej i ponowne uszczelnienie odgrywa tak ważną rolę w zdrowiu i chorobie, głębsze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw naprawy błony komórkowej byłoby korzystne w poszukiwaniu nowych strategii terapeutycznych. Dlatego konieczne jest posiadanie odpowiednich technik eksperymentalnych w celu monitorowania kinetyki i oceny zdolności naprawy błony komórkowej. Opracowano kilka metod modelowania naprawy błon in vitro. Jedna ze strategii obejmuje uraz mechaniczny, który można ułatwić poprzez skrobanie komórek za pomocą pipety/ostrza chirurgicznego/maszynki do golenia lub poprzez toczenie szklanych koralików po komórkach¹⁶. Jednak ten rodzaj urazu mechanicznego generuje większe zmiany i powoduje duże zróżnicowanie uszkodzeń komórek, zarówno w obrębie hodowli, jak i między nimi.

Inną metodą generowania ran błonowych jest ablacja laserowa za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W przeciwieństwie do tradycyjnej laserowej mikroskopii konfokalnej, która wykorzystuje wzbudzenie pojedynczych fotonów, laser dwufotonowy jednocześnie wykorzystuje dwa długofalowe, niskoenergetyczne fotony, aby ułatwić wzbudzenie wysokoenergetycznego elektronu ¹⁷. Ten nieliniowy proces powoduje wzbudzenie wyłącznie w płaszczyźnie ogniskowej, a nie wzdłuż całej ścieżki światła¹⁷ (rysunek 1). Ta zmniejszona objętość wzbudzenia pomaga zminimalizować fotouszkodzenia podczas obrazowania żywych komórek^18,19. Naukowcy są zatem w stanie generować precyzyjne zmiany w błonie komórkowej i monitorować ponowne uszczelnianie błony w czasie rzeczywistym, stosując barwniki fluorescencyjne i obserwując zmiany intensywności fluorescencji w miarę pękania, a następnie ponownego uszczelniania błony komórkowej.

To podejście było wielokrotnie wykorzystywane do badania uszkodzeń błon komórkowych in vitro i in vivo oraz w wielu typach komórek^20,21. Na przykład defekty naprawy błon w fibroblastach i miotubkach pochodzących od pacjentów z dysferlinopatią oceniano za pomocą tej techniki^22,23. Również pojedyncze włókna mięśniowe wyizolowane od myszy zostały wykorzystane do monitorowania tworzenia łat naprawczych^13,24,25. Ruch fluorescencyjnie znakowanych białek można również zaobserwować podczas naprawy błony w pojedynczych włóknach mięśniowych⁹. Co więcej, proces naprawy sarkolemmalnej po dwufotonowym zranieniu laserowym w zarodkach danio pręgowanego można obserwować w czasie rzeczywistym in vivo²⁶.

W tym artykule przedstawiamy metodologię oceny dynamiki naprawy błony komórkowej w fibroblastach za pomocą dwufotonowego ranienia laserowego, chociaż ta metodologia może być stosowana do różnych typów komórek w celu ilościowego określenia zdolności do ponownego uszczelniania błony plazmatycznej in vitro. W tej metodzie komórki są inkubowane z FM4-64, lipofilowym, nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który szybko fluoryzuje, wiążąc się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami w cytoplazmie po wejściu do komórki przez uszkodzenie błony (Rysunek 2&3). Kwantyfikacja fluorescencji barwnika przylegającego do zmiany błony pozwala na monitorowanie czasu potrzebnego do ponownego uszczelnienia błony komórkowej. Aby zilustrować użyteczność tej metody, używamy fibroblastów pacjentów z dysferlinopatią transfekowanych plazmidami dysferliny o pełnej długości (DYSF) sprzężonymi z GFP, aby ocenić ratunek naprawy błony komórkowej.

Protokół

Ludzkie komórki fibroblastów użyte w tym badaniu zostały użyte za zgodą Komisji Etyki Człowieka Wydziału Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberta.

1. Transfekcja komórek z pełnowymiarowym plazmidem DYSF

1. Hodowla komórek fibroblastów w kolbie T225 zawierającej 40 ml pożywki wzrostowej - 36 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM), 4 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20 μl penicyliny/streptomycyny (P/S) - w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C.
   UWAGA: Komórki powinny być hodowane do około 70-80% zbiegu i nie powinny być dopuszczone do całkowitego zlewania się.
2. Aby przygotować komórki do wysiewu, przepłucz komórki dwukrotnie 40 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodaj 5 ml 0,05% trypsyny, aby odłączyć komórki. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i inkubować komórki przez 5 minut.
   1. Gdy komórki zostaną całkowicie odłączone, dodaj 40 ml pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję trypsyny.
   2. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek.
3. Umieść 2 ml komórek w proporcji 1x10⁵ komórek/ml do 35 mm pokrytych kolagenem naczyń ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Następnego dnia komórki powinny być w około 50-60% zlewane.
4. Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 2 ml pożywki pozbawionej surowicy (pożywka wzrostowa bez FBS).
5. Transfekcja komórek plazmidem dysferlin na całej długości za pomocą lipotransfekcji.
   1. Przygotować 150 μl pożywki pozbawionej surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na każde naczynie do transfekcji).
   2. Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do każdej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę pozbawioną surowicy. Inkubuj go co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Do osobnej probówki o pojemności 1,5 ml dodać 175 μl pożywki pozbawionej surowicy i 3,5 μg plazmidowego DNA.
      UWAGA: Pomnóż powyższe ilości dla każdej dodatkowej potrawy, która ma być transfekowana.
   4. Połączyć 150 μl pożywki zawierającej plazmidowe DNA w probówce ze 150 μl pożywki pozbawionej surowicy i odczynnikiem do transfekcji. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Równomiernie rozprowadzić 300 μl pożywki z plazmidem i odczynnikiem do transfekcji na naczyniu. Inkubować szalki przez 24 godziny w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37°C.
6. Zastąp pożywkę świeżą pożywką wzrostową zawierającą surowicę i inkubuj ją przez dodatkowe 24 godziny w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie komórek do testu zranienia dwufotonowego

1. Usunąć pożywkę przez pipetowanie i przepłukać komórki raz 1 ml roztworu Tyrode, a następnie dodać 1 ml świeżego roztworu Tyrode'a zawierającego 1 μl 2,5 mM barwnika FM 4-64.
   UWAGA: Końcowe stężenie barwnika FM 4-64 wynosi 2,5 μM.
2. Jeśli pożądana jest ocena naprawy błony w środowisku zubożonym w wapń, przepłucz komórki 1 ml PBS, a następnie dodaj 1 ml PBS zawierającego 1 mM EGTA.
   UWAGA: Ponieważ PBS spowoduje z czasem oderwanie się komórek, test zranienia powinien zostać zakończony tak szybko, jak to możliwe.

3. Dwufotonowy test laserowego ranienia

1. Korzystając z odwróconego mikroskopu konfokalnego i powiązanego oprogramowania, utwórz cel o wymiarach 0,2 μm x 2 μm i umieść go na krawędzi błony komórkowej tak, aby linia docelowa zachodziła na siebie i leżała prostopadle do kierunku błony komórkowej ( Rysunek 2) .
2. Użyj lasera HeNe o długości fali 543 nm, aby wzbudzić sygnał barwnika FM i ustaw zakres wykrywania na 600-760 nm. Użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm, aby wzbudzić sygnał GFP (Rysunek 4) i ustaw zakres wykrywania na 500-550 nm.
   1. Utwórz 5-minutową serię czasową sekwencyjnych skanów obrazu, obrazując komórki co 5 sekund.
   2. Aby wygenerować uszkodzenie błony, wybielaj komórki za pomocą lasera dwufotonowego ustawionego na 820 nm, używając 15% mocy lasera z 10 iteracjami i wybielaj komórki 25 s po rozpoczęciu szeregu czasowego.
3. Aby określić ilościowo fluorescencję barwnika FM 4-64, użyj oprogramowania, aby narysować obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 6 μm x 6 μm i umieść go w sąsiedztwie miejsca zranienia i w komórce (Rysunek 3).
   UWAGA: Unikaj próbkowania obszarów przesycenia pikseli, korzystając z funkcji "Wskaźnik zasięgu" w oprogramowaniu - w tej aplikacji czerwone piksele reprezentują przesycone piksele. Eksportuj surowe wartości fluorescencji do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego w celu analizy statystycznej.
4. Oblicz względne wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego, odejmując wartość tła (średnia wartość fluorescencji punktów czasowych przed uszkodzeniem błony) i dzieląc wzrost netto przez wartość fluorescencji przy t = 0 (Rysunek 5, 6).

Wyniki

Zdrowe ludzkie fibroblasty, nieleczone fibroblasty pacjentów z dysferlinopatią oraz fibroblasty pacjentów transfekowane plazmidem zawierającym pełnowymiarową sekwencję dysferliny zostały poddane dwufotonowemu laserowemu zranieniu w celu oceny zdolności ponownego uszczelnienia błony w czasie rzeczywistym. Zdrowe ludzkie komórki fibroblastów wykazywały niski poziom aktywacji fluorescencji FM 4-64 po zranieniu laserowym, a nieleczone fibroblasty pacjentów wykazywały wysoki stopień względnej ...

Dyskusja

Dwufotonowe laserowe ranienie błony komórkowej jest precyzyjną i wszechstronną techniką oceny dynamiki ponownego uszczelniania błony in vitro. W tym artykule opisaliśmy protokół określania zdolności do ponownego uszczelniania błony komórkowej w komórkach pacjentów z dysferlinopatią za pomocą dwufotonowego testu ranienia laserowego. Nasze wyniki pokazują, że komórki pacjentów z dysferlinopatią są wadliwe w ponownym uszczelnianiu błony komórkowej, co jest zgodne z ustaleniami innych badaczy i co dodatkowo podkreśl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F1051
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	D8537
35mm naczynia ze szklanym dnem pokryte kolagenem	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Podłoża pozbawione surowicy	Thermo Fisher	31985070
Odczynnik do transfekcji	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Dye	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Roztwór soli	Sigma-Aldrich	T2397
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Carl Zeiss	NA
Kameleon Laser dwufotonowy	Koherentny	NA