Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rekrutacja leukocytów po urazie lub stanie zapalnym do miejsc urazu lub uszkodzenia tkanek była badana w ostatnich dziesięcioleciach i zaowocowała koncepcją kaskady adhezji leukocytów. Jednak dokładne mechanizmy molekularne zaangażowane w rekrutację leukocytów nie zostały jeszcze w pełni zidentyfikowane. Ponieważ rekrutacja leukocytów pozostaje ważnym tematem w dziedzinie badań nad infekcjami, stanami zapalnymi i (auto)immunologią, przedstawiamy prosty test oparty na przepływie laminarnym w celu zbadania podstawowych mechanizmów adhezji, deadhezji i transmigracji leukocytów w reżimach przepływu żylnego i tętniczego. Test in vitro może być wykorzystany do badania mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi w różnych modelach zapalenia naczyń krwionośnych. Protokół ten opisuje test oparty na przepływie laminarnym przy użyciu komory o przepływie równoległym i mikroskopu kontrastowego z odwróconą fazą połączonego z kamerą w celu zbadania interakcji leukocytów i komórek śródbłonka lub płytek krwi, które można wizualizować i rejestrować, a następnie analizować w trybie offline. Komórki śródbłonka, płytki krwi lub leukocyty można wstępnie potraktować inhibitorami lub przeciwciałami w celu określenia roli określonych cząsteczek podczas tego procesu. Warunki ścinania, tj. tętnicze lub żylne naprężenia ścinające, można łatwo dostosować na podstawie lepkości i natężenia przepływu perfundowanych płynów oraz wysokości kanału.
Wprowadzenie
Po urazie, zapaleniu lub infekcji, leukocyty szybko reagują na wzorce molekularne związane z patogenami lub uszkodzeniami (PAMPs, DAMPs), przechodzą w stan aktywowany i przemieszczają się z krwiobiegu do miejsc stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek. Zdolność leukocytów do interakcji ze środowiskiem komórkowym i molekularnym jest niezbędna do ich prawidłowego funkcjonowania jako komórek odpornościowych, co podkreślają zaburzenia genetyczne, takie jak niedobór adhezji leukocytów1. Adhezja leukocytów była przedmiotem intensywnych badań w ciągu ostatnich dziesięcioleci, co zaowocowało koncepcją kaskady adhezji leukocytów na początku lat 90. XX wieku....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Radę ds. Etyki Medycznej i Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Maastricht.
1. Test oparty na przepływie z komórkami ludzkimi
- Izolacja płytek krwi z krwi ludzkiej
- Pobrać krew żylną w antykoagulantach cytrynianowych (3,2%).
- Dodać 1/15 objętości kwaśnego cytrynianu dekstrozy (ACD: 80 mM cytrynian trisodowy, 52 mM kwas cytrynowy i 183 mM glukozy) do krwi.
- Wirować przy 350 x g bez hamulca przez 15 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP).
- Przenieść supernatant do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 1....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu zbadania adhezji leukocytów do śródbłonka, fluorescencyjnie znakowane komórki THP-1 przepływano nad monowarstwą komórek śródbłonka stymulowaną TNFα lub niestymulowaną przez 2 min przy wartości 3 dyne/cm2. Całkowitą liczbę przylegających komórek monocytarnych określono po 2 min perfuzji, rejestrując 6 niezależnych pól w czasie od 2 do 6 min. Liczbę przyległych komórek oszacowano na co najmniej 6 zdjęciach wykonanych za pomocą odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego/fl.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten test in vitro jest prostą metodą badania podstawowych mechanizmów rekrutacji leukocytów podczas zapalenia naczyń, ale należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów. Pierwszym wymogiem pomyślnego przeprowadzenia tego testu jest perfuzja leukocytów przez nienaruszoną i zlewającą się monowarstwę naczyniową lub płytkową. Można to osiągnąć poprzez wcześniejsze pokrycie powierzchni kolagenem typu I. Ogólnie rzecz biorąc, podczas pracy z pierwotnymi komórkami naczyniowymi ważne jest, aby delikatnie odłączyć kom.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy doktorom Martinowi M. Schmittowi i Line Fraemohs. Prace te były wspierane przez Niderlandzką Fundację Badań Naukowych (ZonMW VIDI 016.126.358), Fundację Landsteinera na rzecz Badań nad Transfuzjami Krwi (LSBR Nr. 1638) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) przyznaną R.R.K.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny, np. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pompa np. model: 210-CE& | nbsp; światowe instrumenty precyzyjne | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| strzykawka 50 ml | Rurka silikonowa Becton Dickinson | 300137 | |
| VWR | 228-0700 | ||
| Złącze kolankowe Luer męskie | Ibidi | 10802 | |
| Żeńskie złącze Luer Lock | Ibidi | 10823 | |
| Komora przepływowa | Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strö mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä ngen an Zelloberflä Chen. 2005 r. | |
| Ibidi Szkiełko samoprzylepne VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Szkiełka nakrywkowe do szkiełek samoprzylepnych | Ibidi | 10812 | |
| Kolagen typu I, ogon szczura | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Rekombinowany ludzki TNF-α | Peprotech | 300-01A Aktywator receptora trombiny | |
| dla peptydu 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks' Zrównoważony roztwór soli 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| Roztwór buforowy HEPES 1M, płyn | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumina, 25% | Baxter | 60010 | |
| Woda do wstrzykiwań | B. Braun | 3624315 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Merck | 102382 | |
| Chlorek magnezu sześciowodny | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (gotowa do użycia) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Podłoże z komórek naczyniowych | ATCC | PCS-100-030 | |
| Zestaw do wzrostu komórek śródbłonka-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Zestaw do wzrostu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych | ATCC | PCS-100-042 | |
| Ludzka linia komórkowa śródbłonka, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Linia komórek śródbłonka myszy, transformacja SV 40 (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Ludzka linia komórek monocytowych, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 z ultra-glutaminą | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mosimy monocyt/makrofag RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Plastikowe probówki do pobierania krwi Vacutainer z heparyną sodową | Becton Dickinson | 367876 | |
| PROBÓWKA VACUETTE 9 ml 9NC Koagulacja cytrynian sodu 3,2% | Greiner Bio | 455322 | |
| mieszanina HCl/EtOH (1,2 mol/L HCl i 50% etanolu) w wodzie | Sigma-Aldrich Chemie | Przygotować przez zmieszanie 0,3 l HCl (4 mol/L) z 0,7 l etanolu 70% v/v w dygestoriach |
Bibliografia
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leuko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
