Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

DOI:

10.3791/57011

⸱

13 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnienie i znaczenie komórek inicjujących nowotwór (TIC) zostało poparte coraz większą ilością dowodów w ciągu ostatniej dekady. Wykazano, że te TIC są odpowiedzialne za inicjację guza, przerzuty i oporność na leki. Dlatego ważne jest, aby opracować specyficzną terapię ukierunkowaną na TIC jako dodatek do obecnych strategii chemioterapii, które koncentrują się głównie na większości pacjentów niebędących TIC. Aby lepiej zrozumieć mechanizm stojący za złośliwością TICs, opisujemy metodę izolacji i charakterystyki TIC w mięsakach ludzkich. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) ludzkich mięsaków oraz izolowania TIC przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytarnego klasy I (HLA-1) jako markera ujemnego. Opisujemy również, jak funkcjonalnie scharakteryzować te TIC, w tym test tworzenia kuli i test tworzenia guza, oraz indukować różnicowanie wzdłuż szlaków mezenchymalnych. Izolacja i charakterystyka TIC PDX dostarczają wskazówek do odkrycia potencjalnych odczynników terapii celowanej. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że protokół ten może być dalej rozszerzany w celu izolowania i charakteryzowania TIC z innych typów nowotworów u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrznowotworowa heterogeniczność komórkowa nowotworów u ludzi została poparta rosnącą liczbą dowodów w ciągu ostatniej dekady1. Podobnie jak normalna tkanka, tkanka rakowa składa się z niewielkiej subpopulacji TIC (zwanych również rakowymi komórkami macierzystymi), które wykazują zdolność do tworzenia guza; Tymczasem większość komórek rakowych wykazuje zróżnicowane fenotypy2. Te TIC wykazują właściwości podobne do komórek macierzystych, w tym ekspresję markera komórek macierzystych oraz zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i asymetrycznego podziału komórek, a zatem mogą inicjować tworzenie komórkowego heterogenicznego nowotworu3. Ostatnie badania wykazały, że TIC są nie tylko odpowiedzialne za inicjację nowotworu, ale są również związane z agresywnością guza4, metastasis5 i lekooporność6. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć biologię TIC, a tym samym opracować specyficzną strategię leczenia ukierunkowaną na te TIC.

Metody oparte na FACS zostały użyte do identyfikacji TIC za pomocą znaczników TICs, w tym CD133, CD24 i CD441. Większość z tych markerów ulega również ekspresji w normalnych komórkach macierzystych7. Jednak żaden z tych markerów nie oznacza wyłącznie TIC. Rola, jaką te cząsteczki odgrywają w złośliwości TIC, nadal nie jest jasna. Na przykład, CD133 może być często inaktywowany przez metylację DNA, a zatem ta międzynowotworowa heterogeniczność może sprawić, że dokładność tych markerów będzie miała znaczenie8. ALDH1 jest markerem, który również działa w celu utrzymania macierzystej TICs9. Wydaje się, że jest bardziej skuteczny w identyfikacji TIC raka piersi, ale nadal jest wątpliwy w przypadku innych typów nowotworów9. Niektóre szlaki sygnałowe odgrywają ważną rolę w biologii komórek macierzystych, w tym Wnt (miejsce integracji związane z bezskrzydłymi), TGF-β (transformujący czynnik wzrostu beta) i Hedgehog1. Trudno jest jednak udowodnić, że szlaki te są specyficzne dla TIC i wykorzystać aktywność tych szlaków do wyizolowania TIC z guzów pierwotnych. W związku z tym pilnie potrzebny jest niezawodny nowy marker TIC.

Ludzki MHC klasy I, zwany także HLA-1, jest białkiem powierzchniowym komórki wyrażającym się w prawie wszystkich komórkach jądrzastych10. HLA-1 funkcjonuje jako antygen prezentujący cząsteczkę, która jest specyficznie rozpoznawana przez limfocyty T CD810. Cytotoksyczne działanie limfocytów T CD8 może być aktywowane, gdy komórki rakowe prezentują antygen nowotworowy przez HLA-1. Dlatego brak HLA-1 na powierzchni komórek nowotworowych może prowadzić do ucieczki immunologicznej z cytotoksycznych limfocytów T CD8. Obniżenie poziomu HLA-1 zostało opisane w różnych typach nowotworów u ludzi i jest skorelowane ze złym rokowaniem, przerzutami i opornością na leki11. Wykazaliśmy, że utrata ekspresji HLA-1 na powierzchni komórki może być wykorzystana do identyfikacji TIC w mięsakach, a także w raku prostaty6,12.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji TIC z ludzkich mięsaków PDX za pomocą FACS, używając HLA-1 jako markera ujemnego, oraz dalszego walidacji i charakteryzowania tych HLA-1-ujemnych TICs.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie omawiane tutaj protokoły eksperymentów na myszach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Mount Sinai Medical Center, Institutional Human Research Ethics Committee oraz Animal Care and Use Committee.

1. Przetwarzanie próbki tkanki mięsaka i tworzenie PDX

  1. Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną, personel patomorfologii powinien przygotować próbki mięsaka z próbek chirurgicznych i natychmiast umieścić każdą próbkę na lodzie na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Umieść próbkę w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml z 6 ml zimnej pożywki hodowlanej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Natychmiast przetworzyć próbkę tkanki.
  3. (Opcjonalnie) Tylko w przypadku kostniakomięsaka wykonaj następujące kroki, które można pominąć w przypadku mięsaka tkanek miękkich.
    1. Pokrój tkankę na 20 mm3 kawałki za pomocą skalpela. Przenieść fragmenty tkanek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml roztworu kolagenazy (RPMI 1640 z 1 mg/ml kolagenazy).
    2. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
    3. Dokładnie wymieszaj probówkę, a następnie dodaj 3 ml RPMI 1640 uzupełnionego 10% FBS, aby zneutralizować aktywność kolagenazy.
    4. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
  4. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść próbkę tkanki na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Dodać 500 μl sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do tkanki. Za pomocą sterylnego skalpela mechanicznie rozdrobnij tkankę na małe kawałki, aż żaden widoczny fragment tkanki nie będzie większy niż 0,1 mm.
  5. Przenieść zawiesinę komórek o objętości 500 μl do sitka o pojemności 35 μm i zebrać przefiltrowaną zawiesinę za pomocą probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml. Umieść tę probówkę polistyrenową o pojemności 50 ml z zawiesiną komórek na lodzie.
  6. Dodaj kolejne 500 μl PBS do tkanki. Rozcierać po raz drugi, przenieść zawiesinę przez sitko do komórek i zebrać ją do tej samej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Powtarzaj te kroki (kroki 1.5–1.6), aż wycinek tkanki zostanie całkowicie zdysocjowany, zwykle 6x - 8x.
  8. Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad za pomocą 5 ml buforu do hemolizy (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA) i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia czerwonych krwinek.
  9. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej i usunąć bufor do hemolizy. Umyj granulki 5 ml PBS. Ponownie odwirować przez 5 minut przy 350 x g i usunąć supernatant.
  10. Zawiesić osad w 1 ml PBS i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru lub innej alternatywnej metody. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 107 komórek w 200 μl PBS. Pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie.
  11. Pozostaw matrycę błony podstawnej na lodzie, aby mogła się stopić. Dodać 200 μl macierzy błony podstawnej do zawiesiny komórek o objętości 200 μl. Delikatnie wymieszaj i trzymaj na lodzie.
  12. Podskórnie wstrzyknąć mieszaninę zawiesiny komórkowej i macierzy błony podstawnej (1:1) dwóm myszom NOD scid gamma (NSG) w ich boki. Do każdego wstrzyknięcia należy użyć 200 μl.
  13. Monitoruj tworzenie się PDX, sprawdzając miejsce wstrzyknięcia myszy 2 razy w tygodniu. Usuń ksenoprzeszczep guza, gdy osiągnie 1 cm średnicy.

2. Izolacja komórek inicjujących nowotwór przez FACS z PDX

  1. Chirurgicznie usuń PDX z myszy, jak opisano wcześniej12.
  2. Przetnij guz na pół. Utrwal połowę ksenoprzeszczepu za pomocą 4% paraformaldehydu przez noc. Służy do analizy histologicznej. Przetwórz drugą połowę tkanki zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.3–1.8), aby uzyskać zawiesinę komórek nowotworowych.
  3. Ponownie zawiesić osad za pomocą PBS i policzyć liczbę żywotnych komórek.
  4. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w PBS uzupełnionym 5% FBS do stężenia 2 x 106 komórek/ml. Pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie na 30 minut. Podzielić zawiesinę komórek na dwie probówki. Oznacz probówki odpowiednio kontrolą izotopową i przeciwciałem. Zwróć uwagę na liczbę komórek w każdej probówce.
  5. Przygotować 2x przeciwciało HLA-1-PE, rozcieńczając przeciwciało PBS uzupełnionym 5% FBS (1:250). Rozcieńczyć ujemne przeciwciało kontrolne izotypu w tym samym stanie. Zmieszać zawiesinę komórkową z probówki z "przeciwciałem" z rozcieńczonym przeciwciałem (1:1), aby uzyskać końcowe rozcieńczenie przeciwciała w stosunku 1:500. Zmieszać zawiesinę komórek z probówki "kontrola izotopów" z kontrolą izotopową (1:1). Zawiesiny komórek umieścić na lodzie na 90 minut.
  6. Wirować przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Dodaj 10 ml PBS, aby umyć granulkę 2x.
  7. Dodać 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) do PBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dodaj ten roztwór DAPI do osadu komórkowego, aby uzyskać zawiesinę komórek o stężeniu 107 komórek/ml (używając numerów komórek z kroku 2.4).
  8. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nasadki sitkowe 35 μm do probówek polistyrenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm.
  9. Użyj cytometru przepływowego, aby posortować subpopulację TIC HLA-1-ujemną6. Bramkować żywe komórki (DAPI-ujemne) i zbierać zarówno HLA-ujemne, jak i -dodatnie subpopulacje do dwóch probówek zbiorczych o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 4 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640.

3. Charakterystyka komórek inicjujących nowotwór

  1. Powstawanie sarkosfery
    1. Zrób pożywkę do wzrostu sarkosfery, używając pożywki do hodowli komórek alfa-MEM. Dodaj suplementy, aby uzyskać końcowe stężenie suplementów B-27 (1x), suplementów N2 (1x), podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (20 ng / ml) i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (20 ng / ml) i penicyliny / streptomycyny (100 IU / ml). Przed użyciem przefiltrować pożywkę za pomocą filtra do hodowli komórkowych 0,2 μm.
    2. Zebrać posortowaną subpopulację HLA-1-ujemną i -dodatnią z kroku 2.9 i policzyć liczbę komórek każdej subpopulacji.
    3. Rozcieńczyć 1,5 x 106 komórek w 15 ml pożywki wzrostowej sarkosfery, aby rozcieńczyć komórki 1 x 105 komórek/ml.
    4. Seryjnie rozcieńczyć komórki świeżą pożywką wzrostową sarkosfery, aby uzyskać 15 ml z każdej komórki rozcieńczenia 10,4, 10,3 i 10,2 komórek/ml. Następnie przygotuj cztery 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyłączeniu, każda do rozcieńczenia komórek.
    5. Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej z rozcieńczenia 10 5 komórek/ml do każdej studzienki pierwszej 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyłączeniu. Ta płytka ma 104 komórek w każdym dołku.
    6. Użyj pozostałych trzech 96-dołkowych płytek do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie do pozostałych trzech rozcieńczeń komórek: 104, 103 i 102 komórki/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyczepie. Te trzy płytki hodowlane mają odpowiednio 1,000 komórek / dołek, 100 komórek / dołek i 10 komórek / dołek.
    7. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    8. Dodawać nowe bFGF i EGF bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej (końcowe stężenie 20 ng/ml) co trzy dni bez zmiany pożywki, aby uniknąć utraty komórek w hodowli zawiesinowej.
    9. Używając mikroskopu świetlnego, monitoruj formowanie się sarkosfery codziennie przez trzy tygodnie, jak pokazano na Rysunek 2A.
    10. Po trzech tygodniach policz liczbę dołków sarkosfero-dodatnich i dołków ujemnych sarkosfery w każdym rozcieńczeniu komórek zarówno dla komórek HLA-1-ujemnych, jak i HLA-1-dodatnich.
    11. Oblicz częstość komórek tworzących sferę na podstawie rozkładu prawdopodobieństwa Poissona13. Porównaj HLA-1-ujemne TIC z HLA-1-dodatnimi komórkami masowymi.
  2. Test tworzenia się guza w seryjnym rozcieńczeniu
    1. Policz subpopulacje HLA-1-ujemne i -dodatnie z kroku 2.9.
    2. Wykonać seryjne rozcieńczenia komórek PBS do stężeń 106, 105, 104 i 103 komórek/ml. Użyj 1 ml każdego rozcieńczenia do tworzenia guza u 10 myszy.
    3. Dodać 1 ml matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórek o objętości 1 ml z każdego rozcieńczenia (1:1). Trzymaj 2 ml każdej mieszaniny na lodzie.
    4. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl mieszaniny macierzy komórka: błona podstawna na boki myszy NGS, używając komórek HLA-1-ujemnych na jednym boku i komórek HLA-1-dodatnich na drugim boku tej samej myszy. Do każdego rozcieńczenia użyj 10 myszy. Do wstrzykiwań należy używać strzykawek 25G z igłą.
    5. Monitoruj powstawanie guza u myszy przez cztery do ośmiu tygodni, w zależności od tempa wzrostu guza.
    6. Oblicz częstość komórek inicjujących nowotwór przez procent powstawania guza przy różnych liczbach komórek wejściowych. Porównaj HLA-1-ujemne TIC z HLA-1-dodatnimi komórkami masowymi.
  3. Indukowane różnicowanie wzdłuż szlaków mezenchymalnych
    1. Użyj sarkosfer utworzonych w poprzednich krokach (krok 3.1.9). Przenieś sarkosfery na nową 6-dołkową płytkę. Hoduj sarkosferę z 2,5 ml alfa-MEM uzupełnionym 10% FBS, aby komórki mogły przyczepić się do powierzchni płytki hodowlanej.
    2. Po przyłączenia przez dwa dni zmień pożywkę hodowlaną z alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS na mieszaninę 1:1 alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS i pożywką wzrostową ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC).
    3. Po dwóch dniach zmień na kompletną pożywkę wzrostową hMSC.
    4. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, odessać pożywkę hMSC i dodać pożywkę różnicującą. W celu różnicowania kościogennego dodać pożywkę do różnicowania osteogennego (pożywka wzrostowa hMSC uzupełniona 10 nM deksametazonem, 5 mM β-glicerofosforanu, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego i 10 mM chlorku litu). W celu różnicowania lipogennego dodać pożywkę do różnicowania adipocytów (pożywka wzrostowa hMSC uzupełniona 0,5 μM deksametazonem, 0,5 μM izobutylometyloksantyny i 50 μM indometacyny).
    5. Zmieniaj pożywkę różnicującą co trzy dni.
    6. Po trzech do czterech tygodniach przerwij różnicowanie i umyj komórki PBS. Następnie odessaj PBS i dodaj 2 ml 10% formaliny do komórek w celu utrwalenia. Pozostaw komórki na 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj je wodą dejonizowaną. Komórki są teraz gotowe do barwienia czerwienią Alizaryny S (krok 3.3.6.1) lub barwienia czerwienią olejową O (krok 3.3.6.2).
      1. Aby wykryć różnicowanie osteogenne, należy wykonać barwienie czerwienią S alizaryny. Odessać wodę i dodać 2 ml roztworu roboczego Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6,0) do komórek i pozostawić je na 5 minut w celu barwienia. Umyj komórki wodą dejonizowaną i obserwuj reakcję pod mikroskopem.
      2. Aby wykryć różnicowanie adipogenne, należy wykonać barwienie czerwienią olejową O.
        1. Przygotuj roztwór czerwieni olejowej O. Przygotować roztwór podstawowy, dodając 300 mg proszku Oil Red O do 100 ml izopropanolu.
        2. W ciągu 2 godzin przed użyciem wymieszać trzy części (30 ml) roztworu podstawowego Oil Red O z dwiema częściami (20 ml) wody dejonizowanej. Pozostaw mieszaninę na 10 minut w temperaturze pokojowej.
        3. Przefiltruj roztwór roboczy przed użyciem.
        4. Usunąć wodę z komórek przygotowanych zgodnie z krokiem 3.3.6. Dodaj 2 ml 60% izopropanolu, aby pokryć monowarstwę komórek, a komórki pozostają przez 2 minuty.
        5. Usuń izopropanol i dodaj 2 ml roztworu roboczego Oil Red O. Pozostaw komórki na 5 minut w temperaturze pokojowej.
        6. Opłucz komórki wodą dejonizowaną i obserwuj reakcję pod mikroskopem świetlnym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki mięsak PDX został wygenerowany i zabarwiony. Niejednorodność wewnątrznowotworową wykazano za pomocą immunohistochemii z użyciem przeciwciała HLA-1. Ksenoprzeszczep składał się z dwóch odrębnych subpopulacji, a mianowicie HLA-1 dodatniej i ujemnej (Ryc. 1A)12. Mięsak PDX wykazywał histologiczne podobieństwa do pierwotnego guza rodzicielskiego (Figura 1A). Mięsaki PDX TIC izolowano za pomocą FACS. Stosując metodę podwójnego sortowania, komórki HLA-1-ujemne zostały znacznie wzbogacone w stosunku do populacji komórek rodzicielskich (Rysunek 1B)12.

Geny wyrażane w komórkach macierzystych (np. Oct4, Nanog i Myc) okazały się wysoce ekspresyjne w izolowanych komórkach HLA-1-ujemnych w porównaniu z ich HLA-1-dodatnim odpowiednikiem (Rysunek 1C). Sox-9, gen rozwojowy, o którym mówi się, że odgrywa ważną rolę w innych nowotworowych komórkach macierzystych, takich jak rak piersi, ulegał specyficznej ekspresji w komórkach HLA-1-ujemnych (Ryc. 1D).

Aby zweryfikować izolowaną subpopulację HLA-1-ujemną, przeprowadzono test tworzenia sarkosfery w celu zbadania zdolności komórek do samoodnawiania się. Komórki HLA-1-ujemne były w stanie tworzyć kule z początkowym wkładem wynoszącym zaledwie 10 komórek ( Rysunek 1E) < sup class = "xref">12. W celu zbadania zdolności do tworzenia guza przeprowadzono test tworzenia guza w seryjnym rozcieńczeniu. Taką samą liczbę komórek HLA-1-ujemnych i -dodatnich wstrzyknięto podskórnie do każdego boku tej samej myszy. Komórki HLA-1-ujemne wykazywały znacznie wyższą zdolność do tworzenia nowotworów (Rysunek 1F) < sup class = "xref">12, podczas gdy ksenoprzeszczepy utworzone zarówno przez subpopulacje HLA-1-ujemne, jak i -dodatnie były komórkowymi guzami heterogenicznymi (Figura 1H).

Przeprowadziliśmy analizę ekspresji genów izolowanych HLA-1-ujemnych TICs12. Geny związane z prawidłowym różnicowaniem komórek mezenchymalnych były podwyższone w TICs12. W związku z tym sprawdziliśmy również, czy TIC HLA-1 mogą być indukowane do końcowego różnicowania i powodować zmniejszenie zdolności do tworzenia guza. Wyniki wykazały, że komórki HLA-1-ujemne mogą być indukowane do różnicowania się zarówno wzdłuż szlaków lipogennych, jak i osteogennych i wykazują silne barwienie czerwienią olejową O i czerwienią alizarynową S (Figura 1G). Natomiast komórki HLA-1-dodatnie nie różnicują się w tych samych warunkach. W związku z tym wyniki te wskazują na obiecującą zróżnicowaną strategię terapeutyczną, która może być stosowana do zwalczania TIC mięsaka.

figure-results-1
Rycina 1: Izolacja komórek HLA-1-ujemnych z wewnątrznowotworowych mięsaków heterogennych PDX. (A) Komórki HLA-1-ujemne (strzałki) znaleziono w różnych podtypach ludzkich mięsaków za pomocą immunohistochemii (IHC). lit. a) i b) Mięsak jasnokomórkowy. lit. c) i d) Tłuszczakomięsak pleomorficzny. lit. E oraz F) Mięśniakomięsak gładkokomórkowy. (g oraz h) Nowotwór złośliwy osłonki nerwów obwodowych. (I oraz J) Tłuszczakomięsak, nieokreślony inaczej. (k oraz l) Tłuszczakomięsak bez różnicowania. Pasek skali = 100 μm. (B) Mięsaki PDX były histologicznie podobne do guza rodzicielskiego (barwienie hematoksyliną i eozyną [H&E]) i wykazywały niejednorodność komórkową w ekspresji HLA-1 przez IHC. Poniżej przedstawiono reprezentatywne zdjęcia PDX mięsaka, w tym mięsaka jasnokomórkowego (CCS), chrzęstniakomięsaka odróżnicowanego (DCS) i tłuszczakomięsaka odróżnicowanego (DDL). Podziałka = 100 μm. (C) Subpopulację komórek HLA-1-ujemnych wyizolowano za pomocą cytometrii przepływowej metodą podwójnego sortowania. Od góry do dołu: pierwsze sortowanie, drugie sortowanie i kontrola czystości. Wyizolowane komórki HLA-1-ujemne i HLA-1-dodatnie poddano późniejszej analizie funkcjonalnej, w tym testowi tworzenia guza. Wyniki z tego rysunku pochodzą z poprzedniej publikacji12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka HLA-1-ujemnych TIC za pomocą testów funkcjonalnych. (A) Test tworzenia kul wykazał, że zaledwie 10 komórek HLA-1-ujemnych było w stanie utworzyć kule mięsaka. Po lewej: reprezentatywne zdjęcia kul mięsaka. Po prawej: częstotliwość formowania kuli; średnia ± SD. Podziałka = 100 μm. (B) Komórki HLA-1-ujemne wyizolowane z mięsaka PDX były wysoce rakotwórcze. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy guza utworzonego przez HLA-1-ujemne i -dodatnie komórki z DDL. Tysiąc komórek HLA-1-ujemnych i HLA-1-dodatnich komórek DDL wstrzyknięto w oddzielne boki tej samej myszy. (C) Poziomy mRNA genów komórek macierzystych Oct4, Nanog i Myc ulegały ekspresji na wyższych poziomach w komórkach HLA-1-ujemnych w porównaniu z komórkami HLA-1-dodatnimi. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 5). (D) Silne dodatnie barwienie czerwieni olejowej O i czerwieni alizarynowej S wykazuje końcowe różnicowanie wzdłuż szlaków lipogennych i osteogennych, które są indukowane przez TIC mięsaka. (E) Barwienie immunologiczne HLA-1 PDX utworzonych przez subpopulacje HLA-1-dodatnie (po lewej) i -ujemne (po prawej). Podziałka = 100 μm. Wyniki z tego rysunku pochodzą z poprzedniej publikacji12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka krytycznych etapów, które ograniczają powodzenie tego protokołu w celu wyizolowania i scharakteryzowania komórek inicjujących nowotwór z ludzkich mięsaków PDX. Mięsak ludzki obejmuje wiele różnych podtypów. Zaobserwowaliśmy, że powstawanie PDX jest silnie zależne od podtypów mięsaków. Kliniczne agresywne mięsaki o histologicznie niezróżnicowanym fenotypie (np. pleomorficzne mięsaki niezróżnicowane [wskaźnik sukcesu 100%, n = 2], niezróżnicowane tłuszczakomięsaki [wskaźnik sukcesu 100%, n = 2] i mięsaki maziowe [wskaźnik sukcesu 100%, n = 3]) mają wysoki wskaźnik powodzenia w tworzeniu PDX. Tymczasem mięsaki o zróżnicowanych fenotypach (np. dobrze zróżnicowane tłuszczakomięsaki [wskaźnik sukcesu 0%, n = 3]) wykazują niższe wskaźniki tworzenia PDX. Możliwe, że komórki inicjujące nowotwór są obecne w bardziej złośliwych podtypach w większym procencie niż w mniej złośliwych, zróżnicowanych podtypach. Ponadto zalecamy zakończenie procedury izolacji komórek inicjujących nowotwór w ciągu jednego dnia bez żadnej przerwy, aby zminimalizować utratę żywotności komórek.

Stwierdziliśmy, że komórki HLA-1-ujemne występują powszechnie w mięsakach ludzkich. Ale procent komórek HLA-1-ujemnych może się różnić w zależności od próbek od różnych pacjentów. Dzięki tej metodzie udało nam się wyizolować komórki inicjujące nowotwór z próbek, które zawierają komórki HLA-1-ujemne w zakresie od mniej niż 0,5% do ponad 30%12. Ważne jest, aby funkcjonalnie scharakteryzować komórki HLA-1-ujemne poprzez tworzenie kul i testy tworzenia guza, aby potwierdzić tożsamość komórek inicjujących nowotwór izolowanych komórek HLA-1-ujemnych.

Prezentowany tutaj protokół ma jednak również ograniczenia. Wcześniejsze dane wykazały, że ekspresja HLA-1 jest regulowana epigenetycznie, co jest zgodne z obserwacją niejednorodności komórkowej ekspresji HLA-1 w obrębie tego samego guza12. Mutacje genomowe HLA-1 wykryto w mięsakach i innych typach nowotworów. Mutacje w genach HLA-1 mogą prowadzić do całkowitej utraty HLA-1 na powierzchni komórki w całym guzie lub do ekspresji niefunkcjonalnego zmutowanego HLA-1. W obu przypadkach negatywność HLA-1 nie może być wykorzystana do identyfikacji TIC w guzie.

Używając HLA-1 jako markera ujemnego, z powodzeniem wyizolowaliśmy TIC z różnych podtypów mięsaka ludzkiego i zweryfikowaliśmy nasze wyniki za pomocą analizy funkcjonalnej. W związku z tym byliśmy w stanie przeprowadzić badania molekularne, w tym analizę ekspresji genów na TICs, w celu opracowania specyficznego leczenia ukierunkowanego na te TICs.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NCI-P01-CA087497 (do C.C.-C. i D.H.) oraz NIH-U 54-0OD020353 (do C.C.-C., D.H. i J.D.-D.), Agilent Thought Leader Award (dla C.C.-C.) oraz Fundację Martel (dla C.C.-C. i J.D.-D.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m filtr do hodowli komórkowychThermoFisher450-0020
100 mm szalka PetriegoFalcon353003
15 mL rurka stożkowaFalcon352196
35 μ m sitko komórkoweFalcon352340
50 ml probówka polistyrenowaFalcon352070
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyłączeniuCorning7007
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
B-27Gibco08-0085SA
bFGFInvitrogenPHG0021
deksametazonSigma-AldrichD4902
EGFInvitrogenPHG0311
przeciwciało HLA-1-PEAbcamab43545
pożywka wzrostowa hMSCATCCPCS-500-030
indometacynaSigma-AldrichI7378
izobutylometyloksantynaSigma-AldrichI5879
izopropanolSigma-AldrichW292907
Przeciwciało kontrolujące izotypAbcamab103534
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA5960
chlorek lituSigma-Aldrich62476
Matrigel matryca membrany podstawnejCorning354230
MEM AlphaGibco12571-063
N2Gibco17502-048
Myszy NSGJackson Lab005557
Oil Red OSigma-AldrichO0625
PBSCorning21-040-CM
penicylina/streptomycynaGibco15140-122
RPMI 1640Gibco11875-093
Strzykawka z igłąBD309626
β-glicerofosforanSigma-AldrichG9422

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).
  2. Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).
  3. Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood? Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).
  4. Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  5. Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).
  6. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).
  7. Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  8. Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).
  9. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  10. Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).
  11. Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
  12. Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
  13. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sortowanie kom rek aktywowane fluorescencjmarker HLA I negatywnytest tworzenia sfertest tworzenia guz wr nicowanie mezenchymalnedownregulation HLA Inowotworowe kom rki macierzysteksenoprzeszczepy mi saka

Powiązane artykuły