Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Summary

Zaprojektowaliśmy białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu E jako nanocząstkę teranostyczną (HEVNP). HEVNP samoorganizuje się w stabilną klatkę dwudziestościenną podczas dostarczania błony śluzowej. W tym miejscu opisujemy modyfikację HEVNP do celowania w guz poprzez mutację reszt wystawionych na powierzchni do cystein, które sprzęgają syntetyczne ligandy, które specyficznie wiążą komórki nowotworowe.

Abstract

Wirusopodobne cząsteczki (VLP) były używane jako nanonośniki do wyświetlania obcych epitopów i/lub dostarczania małych cząsteczek w wykrywaniu i leczeniu różnych chorób. Ta aplikacja opiera się na modyfikacji genetycznej, samoorganizacji i koniugacji cysteiny w celu spełnienia ukierunkowanej na nowotwór aplikacji rekombinowanych VLP. W porównaniu z samą modyfikacją genetyczną, chemiczna koniugacja obcych peptydów z VLP oferuje znaczną przewagę, ponieważ pozwala na sprzężenie różnych jednostek, takich jak syntetyczne peptydy lub oligosacharydy, z powierzchnią VLP w modulowany i elastyczny sposób bez zmiany zespołu VLP.

Tutaj pokazujemy, jak używać nanocząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu E (HEVNP), modularyzowanej kapsułki teranostycznej, jako wielofunkcyjnego nośnika dostawczego. Funkcje HEVNP obejmują celowanie w tkanki, obrazowanie i dostarczanie terapeutyczne. Opierając się na ugruntowanych badaniach strukturalnych HEVNP, strukturalnie niezależne i odsłonięte powierzchniowo reszty wybrano do zastąpienia cysteiny jako miejsca koniugacji grup chemicznych związanych z maleimidem za pośrednictwem wiązań tiolowo-selektywnych. Jeden szczególny HEVNP zmodyfikowany cysteiną (zamiennik Cys asparaginy przy 573 aa (HEVNP-573C)) został sprzężony z ligandem specyficznym dla komórek raka piersi, LXY30 i znakowany barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni (NIR) (Cy5.5), dzięki czemu HEVNP ukierunkowane na nowotwór stały się skutecznymi kapsułkami diagnostycznymi (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Podobne strategie inżynieryjne można zastosować w przypadku innych kompleksów makromolekularnych o dobrze znanych strukturach atomowych w celu zbadania potencjalnych zastosowań w dostarczaniu teranostycznym.

Introduction

Rozwój nano-rozmiarowych wektorów w dostarczaniu terapeutycznym i diagnostycznym, znanych jako nanotheranostics, przesunął znaczną część dziedziny biomedycyny z leczenia uogólnionego na ukierunkowane dostarczanie¹. Ukierunkowane dostarczanie nanotheranostyczne integruje nanowektory (nanocząstki) z cząsteczkami teriologicznymi, aby stabilnie skierować cząsteczki teranostyczne do określonej chorej tkanki lub szlaku biochemicznego^2,3,4. Nanomedycyna wysunęła się na czoło w dziedzinie celowanego dostarczania, ponieważ nanocząstki o optymalnej wielkości maj....

Protocol

1. Produkcja HEVNP w komórkach owadów

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonywane w kapturze do hodowli komórkowych. Zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją, aby uzyskać bardziej szczegółowe procedury produkcji HEVNP¹¹.

1. Hodowla komórek Sf9 w pożywce z komórek owadów (patrz tabela materiałów) do 50 - 75% konfluencji w płytkach 6-dołkowych.
2. Używając odczynników do transfekcji komórek owadów zgodnie z protokołami producenta, transfekuj Bacmids zawierające HEVNP-573C ORF2 do komórek Sf99 w celu wytworzenia rekombinowanego bakulowirusa. Inkubować transfekowane komórki w....

Results

Podobnie jak w przypadku HEV-VLPs, wszystkie zmodyfikowane przez Cys HEVNP tworzyły rozpuszczalne kapsydy ikozaedryczne i nie agregowały się w roztworze podczas produkcji lub oczyszczania. Przed i po jednoetapowej koniugacji maleimid-biotyna, każdy z modyfikowanych przez Cys HEVNP był nie do odróżnienia od HEV-VLP w ujemnym barwieniu EM (Rysunek 2). Skuteczność koniugacji maleimidu i biotyny z HEVNP modyfikowanymi przez Cys została po raz pierwszy przetestowana za pomo.......

Discussion

W przeciwieństwie do czasochłonnej procedury inżynierii genetycznej, która zwykle trwa tygodnie, tutaj demonstrujemy proste dwuetapowe i jednoetapowe procedury koniugacji chemicznej, które można zakończyć w ciągu 3 dni, polegające na dodaniu liganda celującego w raka i/lub barwnika do wykrywania fluorescencji do miejsc Cys/Lys HEVNP. Technika ta może być wykorzystana do badań przesiewowych w poszukiwaniu najlepszego celu liganda z puli kandydatów, a tym samym wykorzystuje dostępne usługi syntezy peptydów/małych cząstecze.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI jednostki dializacyjne, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini stacja dializy
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5
Cells Komórki SF9	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 Cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	System ekspresji bakulowirusa
Bac-to-Bac System ekspresji bakulowirusa Life	Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	owad pożywka komórkowa
Cy5.5 NHS ester, 5 mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Kolumny odsalające, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	wirowa kolumna odsalająca
Hydrat MES	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-przezroczysta wirówka Cienkościenne ultra-wirówki	Beckman Coulter, Inc	Zależy od wirnika	probówka ultrawirówkowa
NuPage 4-12% Bis-Tris Żele białkowe	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	Żel białkowy SDS
Odczynnik do celulektyny II Odczynnik	transfekcji	Thermo Fisher Scientific	10362100
EMS Glow Discharge	Mikroskopia elektronowa Science		wyładowanie jarzeniowe