Ta praca przedstawia protokół wytwarzania mikrokapsułek z wolframianu sodu i molibdenianu sodu za pomocą bakterii i odpowiadających im nanocząstek.
Artykuł metodologiczny
Ta praca przedstawia protokół wytwarzania mikrokapsułek z wolframianu sodu i molibdenianu sodu za pomocą bakterii i odpowiadających im nanocząstek.
Prezentujemy metodę, bakteryjne wydzielanie minerałów (BME), do syntezy dwóch rodzajów mikrokapsułek, wolframianu sodu i molibdenianu sodu, oraz odpowiadających im nanocząsteczek dwóch tlenków metali - pierwsza z nich jest tak mała jak 22 nm, a druga 15 nm. Karmiliśmy dwa szczepy bakterii, algi Shewanella i Pandoraea sp., różnymi stężeniami jonów wolframu lub molibdenianu. Stężenia wolframu i molibdenianu dostosowano tak, aby uzyskać mikrokapsułki o różnych proporcjach długości do średnicy. Odkryliśmy, że im wyższe stężenie, tym mniejsze były nanocząstki. Nanocząstki uzyskano w trzech proporcjach długości do średnicy: 10:1, 3:1 i 1:1, które osiągnięto poprzez karmienie bakterii odpowiednio niskim stężeniem, średnim stężeniem i wysokim stężeniem. Obrazy pustych mikrokapsułek zostały wykonane za pomocą skaningowej mikrosfery elektronowej (SEM). Ich struktury krystaliczne zweryfikowano za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) - struktura krystaliczna mikrokapsułek molibdenianu wynosi Na2MoO4, a mikrokapsułek wolframianowych to Na2WO4 z Na2W2O7. Wszystkie te syntezy zostały przeprowadzone w warunkach zbliżonych do warunków otoczenia.
Nanocząsteczki tlenku metalu są wykorzystywane do dostarczania leków1, sztuczne kości konstrukcyjne2, kataliza heterogeniczna3, emisja w terenie4,5, ogniwa słoneczne6, czujniki gazu7, oraz baterie litowe8. W praktycznych zastosowaniach kluczowa jest wytrzymałość mechaniczna zarówno nanokryształów, jak i ich mikrostruktura. Wśród mikrostruktur, puste struktury skorupowe mogą być używane do tworzenia lekkich, wytrzymałych mechanicznie materiałów9. Wśród pustych struktur skorupowych kształt kulisty jest znany z tego, że jest sztywniejszy niż kształt elipsoidalny; Ten drugi ma większy stosunek długości do średnicy niż pierwszy10,11. W pracy opisano protokół syntezy sferycznych mikrokapsułek za pomocą bakterii metodą nietoksyczną w warunkach otoczenia, który kontrastuje z metodami alternatywnymi, w tym metodą syntezy matrycowej12, metodą syntezy wspomaganej rozpylaniem ultradźwiękowym13 i metodą hydrotermalną14. Niektóre z alternatywnych metod wymagają szablonów12, niektóre temperatury sięgającej 500 °C13, a niektóre wysokiego ciśnienia14. Jeśli chodzi o wynikową strukturę, metoda syntezy matrycy wykorzystująca matrycę drożdży prowadzi do struktury rdzeń-powłoka15, zamiast jednej z pojedynczą ścianką, a ta wykorzystująca matrycę E. coli tworzy strukturę o stosunku długości do średnicy 1,7:0,8 i nie jest kulista. 16.
W tej pracy stworzyliśmy mikrokapsułki z tlenku metalu o pojedynczej ściance i kulistym kształcie w warunkach otoczenia, wykorzystując metabolizm bakterii. W glikolizie bakteryjnej, procesie chemicznym, który metabolizuje źródła węgla, takie jak glukoza i laktoza, źródła węgla są uważane za źródło wytwarzanej w nich mocy redukującej. Manipulowaliśmy metabolizmem bakterii, dostosowując stężenie źródeł węgla, aby osiągnąć pożądane cele. Ta metoda jest przyjazna dla środowiska, wykorzystuje nietoksyczne środki i zużywa znacznie mniej energii elektrycznej. Wreszcie, metoda ta pozwala na masową produkcję mikrokapsułek po prostu poprzez zwiększenie objętości bulionu.
Przed tą metodą, istniały dwie inne metody wykorzystujące metabolizm bakterii do wytwarzania minerałów: biologicznie indukowana mineralizacja (BIM)17 i biologicznie kontrolowana mineralizacja (BCM)18. Ani BIM, ani BCM nie mogą być używane do wytwarzania mikrokapsułek wolframianu sodu i molibdenianu, takich jak nasz proces, który jest oznaczony jako bakteryjne wydzielanie minerałów (BME)19. W tym eksperymencie kształt mikrokapsułek można kontrolować tak, aby miał stosunek długości do średnicy od 10:1 do 1:1, a wielkość ziaren nanocząstek, które tworzą otoczki, można regulować w zakresie od 15 nm do 110 nm.
Uwaga: Do przeprowadzenia eksperymentu używaj rękawiczek lateksowych, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego. Za każdym razem, gdy korzystasz z szafy bezpieczeństwa biologicznego, włącz wentylator szafki i utrzymuj drzwi szafy do połowy zamknięte.
1. Przygotowanie szklanych koralików
2. Przygotowanie bulionu lizogenicznego (LB)
3. Kultura glonów Shewanella
4. Przygotowanie szalek Petriego LB-Lennox (rosół z agarem)
5. Przygotowanie bakterii monoklonalnych
6. Namnażanie bakterii monoklonalnych
7. Przygotowanie bulionu LB-Lennox z glukozą i solą
8. Przygotowanie wolframianu sodu
9. Przygotowanie LB z glukozą, solą i wolframianem sodu
10. Hodowla bakterii
11. Zbiory minerałów BME
12. Temperatura oscylacyjna z Pandoraea sp. i molibdenianem
Rysunek 1 przedstawia rzeczywiste mikrokapsułki sferyczne. Oba szczepy bakterii, Shewanella algae i Pandoraea sp., mają pierwotnie stosunek długości do średnicy wynoszący 3:1. Aby uzyskać stosunek długości do średnicy 1:1, wymagane jest wysokie stężenie (>10 mM) oksyanionów metali. Niskie stężenie (<5 mM) oksyanionów może prowadzić do stosunku długości do średnicy 10:1, jak na Rysunku 2, co może wynikać z napływu oksyanionów blokującego podział binarny bakterii. Wreszcie, aby uzyskać stosunek długości do średnicy 3:1, taki jak na Rysunku 3, potrzebne jest średnie stężenie (~20 mM) oksyanionów. Formowanie się sferycznych powłok o stosunku długości do średnicy 1:1 może być wywołane przez mechanizmy bakteryjne dążące do zmniejszenia powierzchni w celu zrównoważenia poboru oksyanionów podczas ich dyfuzji przez błonę komórkową. Trzy powyższe rysunki wspólnie wskazują, że stosunek długości do średnicy można regulować w zakresie od 10:1 do 1:1 poprzez prostą zmianę stężenia oksyanionów.
Rycina 4 oraz Rycina 5 przedstawiają ziarna nanocząsteczek molibdenianu sodu o różnych rozmiarach: mniejsze o wielkości 15 nm i większe o wielkości 10 nm. Należy zauważyć, że na Rycynie 5, na niezniszczonych powłokach, cząstki o rozmiarze 10 nm wciąż mogą tworzyć łańcuchy, formując powłoki porowate. Większe ziarna uzyskano poprzez 5-krotne oscylowanie temperatury pożywki hodowlanej między 25 °C a 37 °C, przy czym każda temperatura była utrzymywana przez 12 h. Podczas oscylacji temperatury możliwe jest nie tylko otrzymanie ziaren o różnych rozmiarach, ale także zachowanie struktury mikrosferycznej, co oznacza, że poprzez samą kontrolę temperatury pożywki możemy wytwarzać mikrokapsułki o różnej wielkości ziaren, od 15 nm do 10 nm.
Rysunek 6 przedstawia uszkodzoną ścianę z większymi ziarnami pozostającymi obok otworu w ścianie. Grubość ściany wynosi około 2 nm, a większe ziarno ma około 40-60 nm. Różnica w wielkości może wynikać z odmiennych procesów metabolicznych, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane.

Rysunek 1: Obraz SEM pustych sferycznych powłok o stosunku długości do średnicy wynoszącym 1:1. Struktura ta była zbudowana z wolframianu sodu wydzielanego przez Shewanella algae z glukozą jako źródłem węgla. Przedrukowano za zgodą ECS J. of Solid State Sci. and Tech., 6(3), N313 (2017). Copyright 2017, The Electrochemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rysunek 2: Obraz SEM pustych powłok długich filamentów o stosunku długości do średnicy 10:1. Struktura ta była zbudowana z molibdanu sodu wydzielanego przez Pandoraea sp. z glukozą jako źródłem węgla. Przedrukowano za zgodą ECS J. of Solid State Sci. and Tech., 6(3), N313 (2017). Copyright 2017, The Electrochemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Obraz SEM uszkodzonych pustych powłok w kształcie prętów o stosunku długości do średnicy wynoszącym 3:1. Struktura ta była zbudowana z tungstenu sodu wydzielanego przez Shewanella algae z glukozą jako źródłem węgla. Przedrukowano za zgodą ECS J. of Solid State Sci. and Tech., 6(3), N313 (2017). Copyright 2017, The Electrochemical Society. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rysunek 4: Obraz SEM rozbitych powłok molibdenianu sodu o rozmiarze ziarna 15 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Obraz SEM rozbitych i nierozbitych powłok molibdenianu sodu o rozmiarze ziarna 10 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rycina 6: Obraz SEM pękniętych pustych powłok o stosunku długości do średnicy wynoszącym 1:1. Struktura ta była zbudowana z wolframianu sodu wydzielanego przez Shewanella algae z glukozą jako źródłem węgla. Ziarna o rozmiarze około 40-60 nm znajdują się na zewnątrz otoczki, bezpośrednio obok dużego otworu, podczas gdy sama otoczka składa się z ziaren o rozmiarze około 2 nm. Przedrukowano za zgodą ECS J. of Solid State Sci. and Tech., 6(3), N313 (2017). Copyright 2017, The Electrochemical Society. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Jeśli chodzi o samospójność wyników eksperymentalnych, kluczowe znaczenie ma przygotowanie i namnażanie bakterii monoklonalnych. W tym eksperymencie, różniącym się od eksperymentów z syntezą matryc15,16, wykorzystano bioaktywne bakterie Gram-ujemne. Aby uzyskać pojedynczą ścianę, wybraliśmy bakterie prokariotyczne zamiast bakterii eukariotycznych, takich jak drożdże15. Aby uzyskać kulisty kształt ze stosunkiem długości do średnicy 1:1, zamiast większego stosunku długości do średnicy16, karmiliśmy bakterie znacznie wyższym stężeniem oksyanionów, aby manipulować nimi, aby skurczyły się do kulistego kształtu, tworząc mikrokapsułki o pojedynczej, okrągłej i cienkiej ściance (<30 nm).
Ponieważ BME opiera się głównie na dostosowaniu stężenia oksyanionów w celu kontrolowania metabolizmu bakterii, ma dwa ograniczenia. Po pierwsze, stężenie oksyanionów jest ograniczone przez rozpuszczalność, chociaż stężenie powinno być jak najwyższe. Po drugie, metabolizm większości bakterii zatrzyma się w temperaturze powyżej 45 °C lub poniżej 5 °C, odpowiednio górnej i dolnej granicy naszego eksperymentu.
Pomimo tych dwóch ograniczeń, BME ma ogromny potencjał w zakresie wytwarzania materiałów z tlenków metali o znaczeniu praktycznym. Aby uzasadnić to twierdzenie, wypróbujemy tę metodę do wytwarzania mikrokapsułek cyrkonowych i mikrokapsułek żelaza - te pierwsze są dobrym materiałem kandydującym na sztuczne kości, a drugie do dostarczania leków.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca jest wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii, Tajwan, Republika Chińska, w ramach grantu o numerze MOST 105-2221-E-011-008, a także przez Advanced-Connectek Inc., Taipei, Taiwan, ROC pod numerem kontraktu RD Ref. No. 6749 i Dept. Ref. No. 011 przez Graduate Institute of Electro-Optical Engineering, National Taiwan University of Science and Technology.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LB(Lennox)bulion z tabletkami agarowymi | Sigma-Aldrich | L7075 | 1 tabletka na 50 ml bulionu z agarem |
| Bulion LB (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | LB (Lennox) w proszku 1 kg |
| Dekstroza bezwodna | Odczynnik Nihon Shiyaku | PL 78695 | glukoza |
| Odczynnik do butelizacji wolframianu sodu | Nihon Shiyaku | PL 76050 | Na2WO4 · 2H2O |
| Odczynnik do Molibdenianu Sodu | Nihon Shiyaku | PL103564 | Na2MoO4 · 2H2O |
| Odczynnik do chlorku sodu | Nihon Shiyaku | PL 68131 | |
| NaCl Etanol 99,5% | Acros organiczne | AC615090040 | CH3CH2OH |
| Woda | Wyprodukowana na naszym uniwersytecie | wody dejonizowanej | |
| Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Tajpej, Tajwan, ROC | TM-329 | ciepło do 120 stopni C przez 10 minut | |
| systemu cyfrowego wirówki | , Nowe Tajpej, Tajwan, wirówka DSC302SD ROC | przy 2025 x | |
| g-80 ° C Lodówka | Panasonic | MDF-U3386S | Służy do głębokiego zamrażania szczepu kriokonserwacyjnego |
| Homogenizator ultradźwiękowy Sonikator Procesor Zakłócacz komórek | Lenox | UPS-150 | częstotliwość 20 KHz moc 150 W |
| Inkubator | klienta | zamówienie | ciepło do 40 & stopni; C lub schłodzić do 18 & deg; C z czasem cotrol |
| Wzajemne kąpiele wstrząsowe | Kingtech Scientific Co., Ltd | WBS-L | |
| Cyfrowa płyta grzejna do mieszania | Corning | #6797-620D | używać z mieszadłem magnetycznym PTFE |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Zong Yen co., LTD | ZYBH-420 | Wszystkie procesy związane z bakteriami są wykonywane tutaj |
| Skaningowy mikroskop elektronowy | JEOL | JSM-6500F | Obrazy SEM |
| Probówka wirówkowa 50 ml | Falcon | 14-432-22 | |
| 15 ml probówka wirówkowa | Falcon | 14-959-53A Butelka laboratoryjna | |
| 100 ml | Duran | 21 801 24 5 | |
| Butelka laboratoryjna 500 ml | Duran | 21 801 44 5 | |
| Szpatułka ze stali nierdzewnej | Chemglass | CG-1981-10 | |
| Jednorazowe mieszadła z PTFE | Fisher | S68066 | |
| Plastikowe szalki Petriego | Fisher | S33580A | |
| Algi Shewanella | Dzięki uprzejmości autora #3 | Dzięki uprzejmości autora #3 | |
| Pandoraea sp. | Dzięki uprzejmości autora #3 | Dzięki uprzejmości autora #3 |