Artykuł metodologiczny

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

DOI:

10.3791/57040

⸱

10 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowle organoidów jelitowych dają unikalną okazję do badania biologii komórek macierzystych jelit i krypt in vitro, chociaż skuteczne metody manipulowania ekspresją genów w organoidach poczyniły ograniczony postęp w tej dziedzinie. Podczas gdy technologia CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjną edycję genomu komórek w celu generowania organoidów, strategia ta wymaga rozległej selekcji i badań przesiewowych za pomocą analizy sekwencji, co jest zarówno czasochłonne, jak i kosztowne. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół skutecznej transdukcji wirusowej organoidów jelitowych. Takie podejście jest szybkie i wysoce wydajne, zmniejszając w ten sposób czas i koszty związane z technologią CRISPR/Cas9. Przedstawiamy również protokół generowania zamrożonych skrawków z nienaruszonych kultur organoidowych do dalszej analizy za pomocą barwienia immunohistochemicznego lub immunofluorescencyjnego, które można wykorzystać do potwierdzenia ekspresji genów lub wyciszenia. Po pomyślnej transdukcji wektorów wirusowych w celu ekspresji genów lub wyciszenia, można szybko ocenić funkcję jelitowych komórek macierzystych i krypty. Chociaż większość badań organoidowych wykorzystuje testy in vitro, organoidy można również dostarczyć myszom w celu przeprowadzenia analiz funkcjonalnych in vivo. Co więcej, nasze podejścia są korzystne w przewidywaniu odpowiedzi terapeutycznych na leki, ponieważ obecnie dostępne terapie na ogół działają poprzez modulację ekspresji genów lub funkcji białek, a nie zmianę genomu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do hodowli mysich lub ludzkich komórek kryptowych jako trójwymiarowych (3D) organoidów z jelita cienkiego lub okrężnicy przez dłuższy czas stanowiła duży przełom, ponieważ kultury te wykazują cechy charakterystyczne nabłonka jelitowego in vivo1,2,3. Organoidy pochodzące z pierwotnych krypt są zdolne do samoodnawiania się i samoorganizacji, wykazując funkcje komórkowe podobne do tkanek ich pochodzenia. Rzeczywiście, organoidy podsumowują nie tylko strukturalną organizację krypt in vivo, ale także wiele cech molekularnych, dostarczając w ten sposób użytecznych narzędzi do badania normalnej biologii i stanów chorobowych. Aby to zilustrować, badania organoidowe ujawniły nowe szlaki molekularne zaangażowane w regenerację tkanek1,2,3,4,5 a także leki, które mogą poprawić funkcjonowanie w warunkach patologicznych6,7.

Badanie komórek macierzystych jelit jest szczególnie interesujące, ponieważ wyściółka jelitowa jest jedną z najbardziej regenerujących tkanek ssaków, odnawiając się co 3-5 dni, aby chronić organizm przed bakteriami, toksynami i innymi patogenami w świetle jelita. Jelitowe komórki macierzyste (ISC) są odpowiedzialne za tę niezwykłą zdolność regeneracyjną i tym samym zapewniają unikalny paradygmat do badania funkcji dorosłych komórek macierzystych1,2. Eksperymenty ze śledzeniem linii na myszach wykazały, że wyizolowane komórki macierzyste Lgr5-dodatnie mogą być hodowane w celu wytworzenia organoidów 3D lub "mini-jelit" in vitro, gdzie ściśle odzwierciedlają swoje odpowiedniki in vivo. Hodowle organoidów można również uzyskać z izolatów komórek krypty jelitowej składających się z komórek progenitorowych, ISC i komórek Panetha, z których te ostatnie stanowią nabłonkowe komórki niszowe in vivo. W rzeczywistości hodowla organoidów z pierwotnych komórek krypty jelita przekształciła się w stosunkowo rutynową technikę, którą można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów przy użyciu powszechnie dostępnych odczynników. Model ten jest również podatny na ilościową analizę ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i białek za pomocą spektrometrii mas, immunohistochemii lub barwienia immunofluorescencyjnego2,4,8. Ponadto genetyka funkcjonalna może być badana przy użyciu podejść gain-of-function (nadekspresja genu lub ekspresja aktywującego zmutowanego genu) lub utraty funkcji (wyciszenie genu lub ekspresja mutanta tracącego funkcję) 2.

Co ważne, niska skuteczność i wysoka toksyczność standardowych protokołów transdukcji plazmidu DNA lub wirusa z polibrenem pozostają główną przeszkodą w tej dziedzinie. Chociaż technologia CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjną edycję genomu, podejście to wymaga czasochłonnej selekcji, a następnie walidacji sekwencji9. W tym miejscu przedstawiamy protokół transdukcji wirusa dla organoidów jelitowych pierwotnych, który optymalizuje dostarczanie cząstek wirusa poprzez koniugację z nanocząstkami magnetycznymi i zastosowanie pola magnetycznego. Kluczowe modyfikacje poprzednich protokołów4,5,10,11,12,13 oraz zalecenia dotyczące zwiększenia wydajności. Opisujemy również podejście do generowania zamrożonych skrawków z nienaruszonych organoidów hodowanych w matrycy 3D (zwanej dalej macierzą błony podstawnej lub matrycą) w celu dalszej analizy za pomocą immunohistochemii lub barwienia immunofluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Ten protokół jest modyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanych metod10,11,12,13.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować świeżą pożywkę 293T kilka godzin wcześniej i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej przez co najmniej 10 minut przed użyciem (Tabela 1).
  2. Przygotuj plazmidowe DNA2,13,14 do pakowania wirusów. (Tabela 2).
  3. Zdobądź wszystkie inne wymagane materiały (Tabela materiałów).

2. Produkcja cząsteczek lentiwirusa lub retrowirusa

  1. Wysiewanie komórek 293T ludzkiego zarodka nerki (HEK) (dzień 1)
    1. Przygotować jedno naczynie hodowlane o średnicy 150 mm, pokrywając 50 μg/ml poli-D-lizyny rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 10 ml/naczynie) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Usunąć sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)/poli-D-lizynę i dwukrotnie umyć powlekane naczynie 5 ml PBS.
    3. Umieść komórki 293T (8\u201210 x 106) w podłożu 293T (Tabela 1) do całkowitej objętości 15 ml.
    4. Hodować komórki 293T przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Transfekcja komórek HEK 293T (dzień 2)
    1. Wykonaj transfekcję, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji (zwykle około 24 godziny po wysianiu 8\u201210 x 106 komórek).
    2. Przygotuj mieszaninę transfekcyjną przy użyciu wydajnego podejścia, takiego jak komercyjny preparat liposomu kationowego (tabele 1\u20122, tabela materiałów)2.
      1. Rozcieńczyć konstrukty DNA lentiwirusa12 (całkowita ~24 μg plazmidowego DNA, Tabela 2) w 1,2 ml pożywki transfekcyjnej i inkubować przez 5 minut w RT w probówkach 1,5 ml (tabela materiałów).
      2. Rozcieńczyć regent do transfekcji (36 μl) w 1,2 ml pożywki do transfekcji (tabela materiałów) i inkubować w probówkach o pojemności 5 ml przez 5 minut zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Dodać odczynnik do transfekcji (etap 2.2.2.1) do odczynnika do transfekcji (etap 2.2.2.2) i delikatnie wymieszać, powoli pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
      4. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Delikatnie przemyć komórki 293T 5 ml pożywki do transfekcji i zastąpić 10 ml pożywki do transfekcji.
    4. Dodać kompleksy DNA-lipid (z kroku 2.2.2.3) kroplami do pożywki komórek 293T i ostrożnie wymieszać pożywki w szalkach hodowlanych, poruszając się w kierunku poziomym i pionowym, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kompleksów DNA-lipid w każdym naczyniu.
    5. Inkubować przez 6 godzin w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
    6. Po inkubacji zastąpić pożywkę 20 ml świeżego wirusa (Tabela 1).
  3. Kolekcja wirusów (dni 3–5)
    1. Zebrać pożywkę z wirusem w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C w celu dalszego zagęszczenia.
    2. Wymieniaj 20 ml świeżej pożywki zbierającej wirusa co 24 godziny i hoduj przez noc (~24 godziny). Powtórz zbieranie multimediów w ciągu następnych 2 dni (dni 4–5).
    3. Upewnij się, że całkowita objętość pożywki pobranej po 5 dniu wynosi ~ 60 ml (20 ml / dzień x 3 dni).
  4. Stężenie wirusa (dzień 5)
    1. Odwirować zebrane podłoże (60 ml) przez 5 minut przy 400 x g. Następnie przepuść supernatant przez filtr (pory 0,45 μm), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
  5. Zagęścić wirusa, dodając 15 ml przefiltrowanej pożywki wirusowej do odśrodkowej jednostki filtrującej (tabela materiałów). Wirować przy 2 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ponieważ wirus nie może przejść przez ten filtr, zostanie skoncentrowany w górnej komorze filtra.
    1. Odessać przepływ z probówki (dolnej komory) i dodać kolejne 15 ml pozostałego supernatantu pożywki do zbierania wirusów do tej samej jednostki filtra odśrodkowego. Odwirować jak wyżej (2 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C) w celu zagęszczenia dodatkowego wirusa z supernatantu.
    2. Powtórz proces, używając tego samego filtra dla pożywki o pojemności 60 ml z pojedynczej wydrążonej płytki, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia (~100-krotnie).
      Uwaga: Zazwyczaj koncentrujemy ~60 ml pożywki do zbierania wirusów do ~600 μL.
    3. Usunąć skoncentrowany wirus z górnej komory filtra za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie podwielokrotnić i przechowywać w probówkach o pojemności 1,5 ml (50\u201260 μl/probówkę) w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Przechowuj skoncentrowane cząstki do 6-12 miesięcy.

3. Izolowanie krypt

  1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC.
  2. Połóż uśpione zwierzę na plecach i umyj brzuch, spryskując go 70% etanolem.
  3. Wykonaj podłużne nacięcie linii środkowej od mostka do pachwiny, nacinając najpierw skórę, a następnie tkankę podskórną.
  4. Usuń jelito cienkie z żołądka do jelita ślepego.
  5. Zidentyfikuj obszary zainteresowania w jelicie cienkim; krypty można wyizolować z dwunastnicy, jelita czczego i jelita krętego.
  6. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przepłukać wyizolowane jelito cienkie buforem dysocjacyjnym krypty (wstępnie schłodzony PBS zawierający 1 mM ditiotreitol (DTT), 1% penicyliny/streptomycyny (bez Ca2+ i Mg2+)) w 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej (Tabela 1)
  7. Usuń obwodową tkankę tłuszczową i otwórz lub "zafiletuj" tkankę jelitową wzdłużnie na sterylnej szklanej płytce (15 cm x 15 cm).
  8. Delikatnie zeskrob kosmki nabłonka jelitowego za pomocą skrobaka do komórek.
  9. Jelito cienkie przeciąć na odcinki o długości 2–3 cm.
  10. Przenieść tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej wstępnie schłodzony PBS za pomocą płaskich kleszczy (116 mm). Umyj fragmenty tkanki energicznie potrząsając ręcznie przez ~30 s (przesuwając rurkę w przeciwnych kierunkach ~60 razy).
  11. Odśwież PBS i powtarzaj mycie, aż PBS stanie się przezroczysty.
    Uwaga: Zazwyczaj myjemy fragmenty 2-3 razy.
  12. Inkubować tkankę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforu dysocjacyjnego krypty (Tabela 1) przez 10 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej ze średnią prędkością, gdy PBS jest czysty.
  13. Energicznie potrząsaj probówką ręcznie przez ~30 s (w przeciwnych kierunkach ≈60 razy) i przenieś tkankę za pomocą płaskich kleszczyków do innej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforu dysocjacyjnego krypty. Inkubować tę frakcję na lodzie. Nie używaj pierwszej frakcji do hodowli organoidów, ponieważ zawiera ona głównie kosmki.
  14. Powtórz kroki 3.11\u20123.13 3\u20124 razy, zbierając każdą frakcję i umieszczając je na lodzie.
  15. Wybierz frakcję, która jest wzbogacona o najwyższy procent krypt jelitowych, skanując 200 μl próbek z każdej frakcji pod mikroskopem odwróconym (4x). Zidentyfikuj krypty według typowej morfologii, jak opisano wcześniej (Rysunek 1A)10.
    nuta: Będą miały kształt okrągły lub owalny i będą zawierały granulowane komórki Panetha. Natomiast kosmki są strukturami przypominającymi palce, pozbawionymi ziarnistych komórek Panetha (Ryc. 1B).
  16. Przepuść wybraną frakcję przez sitko do komórek o wielkości 40 μm, aby w razie potrzeby uzyskać krypty o podobnej wielkości. Alternatywnie, wyizolować komórki macierzyste Lgr5 + na podstawie cytometrii przepływowej dla białka zielonej fluorescencji (GFP), jeśli myszy są krzyżowane na tle EGFP-Lgr5 + lub innym odpowiednim modelu, który umożliwia identyfikację komórek Lgr5 + < sup class="xref">2.
  17. Policz całkowitą liczbę krypt w wybranej frakcji w następujący sposób.
    1. Odpipetować 50 μl wybranej frakcji do hemocytometru i policzyć liczbę krypt za pomocą mikroskopu ze światłem odwróconym (4x). Umieść ~ 100 krypt na studzienkę podczas korzystania z płytki 48-dołkowej, aby umożliwić eksperymenty transdukcji, w których 3-6 dołków zostanie transdukowanych na warunki eksperymentalne w celu wyciszenia lub nadekspresji genów.
    2. Na podstawie liczby krypt na 50 μl oblicz potrzebną objętość bufora dysocjacji krypt i przenieś tę objętość do probówki o pojemności 1,5 ml.
      Uwaga: Na przykład zlicza się 10 krypt na 50 μL, 6 x 50 μL lub 300 μL jest potrzebnych na 300 krypt.
  18. Odwirować krypty w probówkach o pojemności 1,5 ml przy 300 x g przez 5 minut.
  19. Ostrożnie wyrzucić supernatant, delikatnie pipetując górną warstwę cieczy i ponownie zawiesić osad w 100 μl matrycy błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu na lodzie (tabela materiałów).
  20. Zasiać krypty zawierające matrycę na wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytce o temperaturze 37 °C (30 μL/studzienkę, ~100 krypt/studzienkę). Inkubować płytkę w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 5–15 minut, aby umożliwić żelowanie matrycy (37 °C, 5% CO2 ).
  21. Na każdy żel nałożyć 250 μl pożywki do hodowli organoidów (ENR) (Tabela 1) i umieścić 48-dołkowe płytki z powrotem w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Sprawdź kultury pod kątem organizacji krypty w małe, okrągłe, torbielowate kształty po 24 godzinach; Pąki uformują się po 2\u20125 dniach.
  22. Delikatnie wymieniaj pożywkę ENR co 3 dni. Usuń stare nośniki ENR za pomocą delikatnego odsysania, uważając, aby nie dotknąć matrycy podczas wymiany nośnika.
  23. Hodowle organoidów pasują co 4\u20127 dni, jak wcześniej opisano11.

4. Przygotowanie fragmentu organoidu

  1. Transdukuj organoidy po ich utworzeniu (w ciągu 1–2 tygodni) lub po pasażowaniu. Do pojedynczego eksperymentu transdukcji przygotuj 2\u20123 dołki hodowanych organoidów na 48-dołkowej płytce na warunek z ~100\u22200 organoidami/studzienką lub ~200\u2012600 organoidów na eksperymentalny warunek transdukcji.
  2. Wymienić ENR z pożywką transdukcyjną o pojemności 250 μl (Tabela 1) i hodować w pożywce transdukcyjnej przez 3 lub więcej dni lub do momentu, gdy organoidy przyjmą morfologię torbielowatą. Uwzględnij zarówno Wnt3a, jak i inhibitor ROCK (Y27632) w pożywce transdukcyjnej, aby zwiększyć liczbę komórek macierzystych i komórek Panetha; Nikotynamid (Nic) poprawia wydajność hodowli (patrz pożywka transdukcyjna w Tabeli 1).
  3. Mechanicznie rozerwać przypominającą kopułę strukturę matrycy błony podstawnej za pomocą pożywki i końcówki pipety za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  4. Przenieść organoidy i pożywkę do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Mechanicznie rozerwać matrycę poprzez pipetowanie pipetą o pojemności 200 μl ~10\u201215 razy.
  6. Odwirować fragmenty organoidów w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 5 minut.
  7. Ostrożnie odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki DMEM/F12 (Tabela 1).
  8. Dodać dypazę I (6 μl przy 10 mg/ml) i DNazę I (2,5 μl przy 10 mg/ml). Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  9. Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C przez 20 minut w probówce o pojemności 1,5 ml.
  10. Dodać 500 μl pożywki ENR, aby zakończyć reakcję dysocjacji; surowica w ENR kończy reakcję.
  11. Przepuścić komórki organoidu przez sitko do komórek o wielkości 20 μm i odwirować fragmenty organoidów przy 400 x g przez 5 minut.
  12. Zawiesić fragmenty organoidów za pomocą pożywki transdukcyjnej o stężeniu 150 μl (tabela 1).

5. Inżynieria genetyczna organoidów lub komórek krypty za pomocą transdukcji wirusa

UWAGA: Zobacz Rysunek 2.

  1. Nasienne klastry komórek organoidowych z 200 μl pożywki/basenika transdukcyjnego na 48-dołkowej płytce i inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Alternatywnie, umieścić świeżo wyizolowane komórki krypty (~ 1,000 krypt) w 200 μl pożywki/dołku transdukcyjnym na 48-dołkowej płytce i inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Rozmrozić fiolki z wirusem do transdukcji, co pozwala na ~50 μl skoncentrowanego wirusa do transdukcji każdego dołka w 48-dołkowych płytkach lub ~100 μL zagęszczonego wirusa na studzienkę w 24-dołkowych płytkach.
  3. Inkubować wirusa z 12 μl roztworu nanocząstek magnetycznych przez 15 minut w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1,5 ml (tabela 3).
  4. Dodaj roztwór nanocząstek magnetycznych i mieszaninę wirusa do komórek, które mają być transdukowane.
  5. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej na płytce magnetycznej i inkubować przez co najmniej 2 godziny (i do ~6 godzin) w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).

6. Zasiewanie zainfekowanych fragmentów organoidów

  1. Przenieś zakażone klastry komórek organoidowych i pożywki transdukcyjne z każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
  3. Odsysać supernatant przez delikatne odsysanie i schładzać probówkę zawierającą osad na lodzie przez 5 minut.
  4. Dodać 120 μl matrycy membrany podstawnej i ponownie zawiesić osad, pipetując powoli w górę i w dół.
  5. Umieść 30 μl kropli mieszaniny matrycy i komórek na nowej 48-dołkowej płytce.
  6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5–15 minut, aż matryca zastygnie.
  7. Dodać pożywkę transdukcyjną do każdej studzienki i inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 3–4 dni (37 °C, 5% CO2 ).
  8. Po 3\u20124 dniach zbadaj kultury pod mikroskopem świetlnym (10x), aby upewnić się, że skupiska komórek są zorganizowane w struktury organoidowe. Następnie delikatnie zastąp pożywkę transdukcyjną pożywką ENR o pojemności 250 μl.
  9. Wymieniaj nośniki co 3–4 dni.

7. Wybór (jeśli dotyczy)

  1. Po 2\u20123 dniach, w razie potrzeby, dodaj odpowiednie antybiotyki lub hormony do selekcji do pożywki transdukcyjnej.
    nuta: Użyliśmy puromycyny (2 μg / ml) do wyboru transdukcji soczewicowacej, ponieważ plazmidy zawierały gen oporności na puromycynę2,14.

8. Potwierdzenie udanej transdukcji i ekspresji genów lub wyciszenia

  1. W przypadku korzystania z lentiwirusa FUGW2,14, oszacuj wydajność transdukcji, mierząc sygnały GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub cytometrii przepływowej.
  2. Walidacja nadekspresji lub wyciszenia genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) w celu ilościowego porównania mRNA w kontrolnych i eksperymentalnych kulturach organoidów.
  3. Potwierdź poziomy białka dla ekspresji genu kodującego białko lub wyciszenia za pomocą Western Blot lub immunostaining2.

9. Kriosekcja organoidów w matrycy błony podstawnej

UWAGA: Zobacz Rysunek 3.

  1. Usunąć podłoże ENR przez delikatne odsysanie, uważając, aby nie naruszyć matrycy błony podstawnej i delikatnie przemyć raz 500 μl PBS.
  2. Utrwalić organoidy za pomocą 1,0 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Usunąć PFA przez odsysanie i delikatnie przemyć dwukrotnie 1 ml PBS.
  4. Usunąć PBS przez odsysanie i dodać 1,0 ml 30% buforu sacharozy do każdej próbki. Utrwalone organoidy inkubować w sacharozie przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w chłodni, lodówce lub na lodzie w celu odwodnienia próbek.
  5. Usunąć bufor sacharozy przez odsysanie i dodać tylko tyle związku do osadzania (tabela materiałów), aby pokryć warstwę matrycy (~ 300 μl / studzienkę) w każdym dołku.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  7. Próbki należy umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 10 minut lub do momentu, gdy substancja do zatapiania stanie się stała i biała.
  8. Umieść naczynie z zamrożoną masą do zatapiania w temperaturze pokojowej, aby umożliwić minimalne stopienie związku wzdłuż krawędzi. Użyj skalpela, aby oddzielić blok od ścian studni.
  9. Usuń blok związku zatapiającego matrycę za pomocą kleszczy i umieść go w bloku próbki (np. krioformie), działając szybko, aby zapobiec stopieniu.
  10. Całkowicie napełnij formę masą do zatapiania i zamrażaj w temperaturze -80 °C przez 30 minut.
  11. Blok służy do krojenia lub przechowywania w zamrażarce w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szybką i wysoce efektywną technikę transdukcji, która wykorzystuje nanocząstki magnetyczne wystawione na działanie pola magnetycznego do dostarczania lentiwirusa do interesujących komórek. Dysponując łatwo dostępnymi narzędziami, zastosowaliśmy to podejście nie tylko do transdukcji świeżo wyizolowanych komórek kryptowych (Rysunek 1A), ale także do organoidów (Rysunek 2) i innych komórek, które są oporne na bardziej rutynowe podejścia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna hodowla nabłonka jelitowego dorosłego człowieka w postaci organoidów stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w funkcję komórek macierzystych, homeostazę nabłonka jelitowego i patologię 1,2,3,4. Chociaż technologia CRISPR/Cas9 może być wykorzystywana do genetycznej inżynierii organoidów9, jest ograniczona przez potrzebę szer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American Lung Association, Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund oraz Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMThermo Fisher Scientific11965092Pożywka bazowa dla komórek 293T
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010Pożywka bazowa do pożywki do hodowli organoidów i buforu do trawienia organoidów
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021Pożywka do transfekcji plazmidów wirusowych
Surowica bydlęcapłodu Corning35-011-CVSkładnik pożywki do zbierania wirusów i pożywki 293T
Pen/StrepThermo Fisher Scientific15140122Składnik pożywki do hodowli organoidów i buforu dysocjacji krypt
PBS (bez Ca2+, Mg2+)Thermo Fisher Scientific10010049Bufor płuczący i składnik bufora dysocjacyjnego krypt
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050Składnik pożywki do hodowli organoidów
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061Składnik pożywki do hodowli organoidów
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Składnik pożywki do hodowli organoidów
EGFMillipore SigmaE9644Składnik pożywki do hodowli organoidów
NogginPeprotech250-38 BSkładnik pożywki do hodowli organoidów
R-spondynaR& D7150-RS-025/CFSkładnik pożywki do hodowli organoidów
Insulina ludzka rekombinowanaMillipore SigmaI9278-5mlSkładnik pożywki do hodowli organoidów
NikotynamidMillipore SigmaN3376-100GSkładnik pożywki transdukcyjnej
Wnt3AR& D5036-WN-010Składnik ośrodka transdukcyjnego
Y27632Millipore SigmaY0503-1MGSkładnik ośrodka transdukcyjnego
0,5 MEDTA Thermo Fisher Scientific15575020Składnik bufora dysocjacyjnego Crypts
DTT (ditiothreitol)Thermo Fisher ScientificR0861Składnik bufora dysocjacyjnego Crypts
Dispase IMillipore SigmaD4818-2MGSkładnik buforu do trawienia organoidów
DNase IMillipore Sigma11284932001Składnik matrycy buforowej do trawienia organoidów
(Zmniejszony czynnik wzrostu)Corning356231Stosowany jako matryca do osadzania organoidów
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Pożywka do transfekcji w produkcji wirusów
ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200Cząstki magnetyczne transdukcji wirusa
Płyta magnetycznaOz BiosiencesMF10000Płytka magnetyczna ułatwiająca transdukcję wirusa
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Środek transfekcyjny w produkcji wirusów
Poli-D-LizynaMilipora SigmaA-003-EPowłoka na płytki przed wysiewem komórek 293T
4% roztwór formaldehyduBosterAR1068Roztwór do mocowania organoidów
Związek do zatapiania OCTThermo Fisher Scientific4583SDo zatapiania organoidów
5 ml probówek polistyrenowych FalconCorning352054
50 ml Falcon TubesSarstedt62.547.100
Rotator Orbitron II Rocker ShakerBoekel Scientific260250
Mikroskop odwrócony Olympus CK30OlympusCK30do skanowania i liczenia krypt
Zeiss Axiovert 200 odwrócona fluorescencjaNikonAxiovert 200do oglądania fluorescencji w kryptach
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-100Milipore SigmaUFC910024Do koncentracji wirusów
pluriSitko 20 i mikro; m (Cell Strainer)pluriSelectSKU 43-50020Do przygotowania fragmentów organoidów
Falcon Cell StrainerFisher Scientific352340Do przygotowania cyrptów o podobnej wielkości po izolacji krypty
Greiner CELLSTAR  wielodołkowe płytki hodowlane 48 dołków (TC traktowane pokrywką)Millipore SigmaM8937-100EAForD2:D37+D16:D37g fragmenty organoidów
Szczep zwierzęcy: C57BL / 6JJackson Lab#000664Do hodowli organoidów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transdukcja wektora wirusowegohodowla organoid w jelitowychin ynieria genetyczna organoid wprotok kriosekcjonowaniaprzygotowanie skrawk w mro onychbarwienie immunofluorescencyjnetransdukcja wektora lentiwirusowegomacierz b ony podstawnejkriokonserwacja organoid w

Powiązane artykuły