Ocena cytotoksycznego i immunomodulującego działania substancji w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Podsumowanie

Z punktu widzenia zasady 3R, modele oddechowe jako alternatywa dla badań na zwierzętach ewoluują. Zwłaszcza w odniesieniu do oceny ryzyka związanego z substancjami oddechowymi brakuje odpowiednich testów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc do oceny substancji unoszących się w powietrzu.

Streszczenie

Choroby układu oddechowego w swojej szerokiej różnorodności wymagają odpowiednich systemów modelowych, aby zrozumieć mechanizmy leżące u ich podstaw i umożliwić rozwój nowych terapii. Ponadto rejestracja nowych substancji wymaga odpowiedniej oceny ryzyka za pomocą odpowiednich systemów testowania, aby uniknąć ryzyka poniesienia szkody przez poszczególne osoby, na przykład w środowisku pracy. Takie oceny ryzyka są zwykle przeprowadzane w badaniach na zwierzętach. W świetle zasady 3R i publicznego sceptycyzmu wobec eksperymentów na zwierzętach, alternatywne metody stosowane u ludzi, takie jak precyzyjnie wycinane plastry płuc (PCLS), ewoluują. W niniejszej pracy opisano technikę ex vivo ludzkiego PCLS do badania potencjału immunomodulacyjnego substancji o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak heksachloroplatynian amonu (HClPt). Mierzone punkty końcowe obejmują żywotność i miejscowe zapalenie dróg oddechowych, charakteryzujące się zmienionym wydzielaniem cytokin i chemokin. Cytokiny prozapalne, czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i interleukina 1 alfa (IL-1α) były znacznie zwiększone w ludzkich PCLS po ekspozycji na subtoksyczne stężenie HClPt. Mimo że technika PCLS została znacznie zoptymalizowana w ciągu ostatnich dziesięcioleci, jej zastosowanie w testowaniu immunomodulacji jest nadal w fazie rozwoju. W związku z tym przedstawione tu wyniki mają charakter wstępny, mimo że wskazują na potencjał ludzkiego PCLS jako cennego narzędzia w badaniach nad układem oddechowym.

Wprowadzenie

Choroby układu oddechowego, takie jak astma alergiczna, astma zawodowa, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), rozedma płuc oraz infekcje górnych i dolnych dróg oddechowych rosną i stanowią ogólnoświatowe obciążenie zdrowotne1^,2. Wymagane są odpowiednie systemy testowe w celu zidentyfikowania niektórych podstawowych mechanizmów leżących u podstaw tych chorób, oprócz opracowania i przetestowania odpowiednich substancji. Badania podstawowe, jak również przedkliniczne opracowywanie leków, koncentrują się na wynikach uzyskanych w testach in vitro lub in vivo. Testy te mają jednak swoje ograniczenia³. Po pierwsze, testy in vitro wykorzystują ludzkie komórki, które zostały wyizolowane i usunięte z sąsiednich tkanek lub narządów, a zatem nie są już w stanie wchodzić w interakcje z innymi komórkami ani być przez nie chronione³. Po drugie, modele zwierzęce często nie są przekładalne na ludzi ze względu na różnice w fizjologii i rozbieżności biochemiczne⁴. W celu zminimalizowania tych ograniczeń oraz w kontekście zasady 3R (replacement, refinement, reduction) ⁵, stale rozwijają się nowe alternatywne modele.

Alternatywne modele 3D tkanek ludzkich, takie jak PCLS, są łącznikiem między ludzkimi modelami in vitro a złożonymi modelami in vivo na zwierzętach. PCLS odzwierciedla funkcjonalną heterogeniczność ze wszystkimi istotnymi typami komórek obecnymi w drogach oddechowych⁶. Dodatkowo technika PCLS ma tę zaletę, że umożliwia powtarzalne przygotowanie kilku cienkich plastrów o precyzyjnej grubości od jednego dawcy tkanek zwierzęcych lub ludzkich. Pozwala to na kontrolę wewnętrzną, a także na testowanie różnych stężeń lub leków.

Od pierwszego wprowadzenia wypełnionych agarem plastrów ludzkiego płuca w 1994 roku przez Fishera i wsp.⁷ Technika krojenia i hodowli tkanki płucnej została znacznie ulepszona. Christian Martin i wsp. Ulepszyliśmy tę technikę do dalszych zastosowań chemicznych i farmakologicznych8. Nasza grupa została wprowadzona do tej techniki przez Christiana Martina w 2007 roku. Od tego czasu zastosowanie PCLS w badaniach poszerzyło się z testowania odpowiedzi funkcjonalnych, takich jak airway^9,10 i vasoconstriction¹¹, do immunologicznych, farmakologicznych^12,13 i toksykologicznych⁷ testów na różnych gatunkach w kilku laboratoriach. Na przykład Schlepütz i wsp.¹⁴ badał reakcje dróg oddechowych na różnice gatunkowe i porównywał aktywację neuronów obwodowych przez stymulację polem elektrycznym (EFS) lub przez kapsaicynę u myszy, szczurów, świnek morskich, owiec, marmozet i ludzi. Odkryli, że różne gatunki mają różne, ale różne wzorce zwężenia oskrzeli za pośrednictwem nerwów i doszli do wniosku, że powszechnie używane zwierzęta laboratoryjne (myszy i szczury) nie zawsze odzwierciedlają ludzką reakcję. Do badania toksyczności płuc i w celu zmniejszenia liczby zwierząt w tym kontekście, Hess i wsp.¹⁵ wstępnie zatwierdzony PCLS na szczurach jako alternatywa ex vivo dla badań toksyczności inhalacyjnej. To wieloośrodkowe badanie prewalidacyjne zaowocowało opracowaniem dwóch modeli predykcyjnych wykorzystujących PCLS, które przyniosły obiecujące wyniki.

Ponadto, w badaniach podstawowych, PCLS zostały wykorzystane do wyjaśnienia sygnalizacji wapniowej¹⁶, wczesnych reakcji alergicznych¹⁷, oraz odpowiedzi na infekcje wirusowe^18,19. Postęp techniczny jest w toku, a dalsze postępy są badane. Na przykład dziedzina ta zwiększa korzyści płynące z tkanek ludzkich poprzez przechowywanie i ponowne wykorzystanie zamrożonych tkanek. Rosner i wsp. opisali technikę zamrażania i rozmrażania mysich PCLS, która zachowuje zdolność dróg oddechowych do kurczenia się po stymulacji: w związku z tym technika ta wydłuża ograniczone okno czasowe, w którym tkanki pozostają żywotne, a więc dalsze testy mogą być stosowane w czasie do tego samego dawcy²⁰. Oprócz tych postępów badawczych, Lauenstein i wsp.²¹ niedawno zbadał ocenę ryzyka różnych substancji chemicznych, które mogą działać jako potencjalne czynniki uczulające na astmę zawodową u ludzi PCLS.

Astma zawodowa, której objawami są niedrożność dróg oddechowych i nadreaktywność dróg oddechowych, podobnie jak astma alergiczna, jest wywoływana przez ekspozycję na substancje o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW)²² lub substancje o niskiej masie cząsteczkowej (LMW)²³ (np. związki platyny) w środowisku pracy. Środki LMW mają wysoki potencjał uczulający podczas tworzenia haptenów i wiążą się z białkami nośnikowymi²¹. Rejestracja nowych chemikaliów HMW lub LMW wymaga oceny ryzyka in vitro i in vivo w odniesieniu do ich przypuszczalnego potencjału uczulającego (np. wytyczna OECD 429)²⁴. Testy użyte do określenia przypuszczalnego potencjału uczulającego nie były jednak pierwotnie przeznaczone do oceny ryzyka związanego z substancjami uczulającymi drogi oddechowe, ale z substancjami uczulającymi kontaktowo, chociaż wydawało się, że istnieje pewna zgodność dla niewielkiego podzbioru substancji²⁵. Praca Lauensteina i in. została zaprojektowana w ramach projektu Unii Europejskiej Sens-it-iv, mającego na celu opracowanie alternatywnych strategii testowania oceny ryzyka domniemanego kontaktu lub czynników uczulających płuca²¹. W ramach tego projektu skupiliśmy się na przetestowaniu użyteczności ludzkiego PCLS jako alternatywnego narzędzia testowego. W związku z tym wybrano zestaw immunomodulujących punktów końcowych (np. żywotność i wydzielanie cytokin) w celu określenia potencjału drażniącego lub zapalnego substancji chemicznych, takich jak związki platyny LMW. Lauenstein i in. nie znaleźli ogólnego wzorca, który można by zastosować do wszystkich substancji uczulających drogi oddechowe; Jednak ich praca stała się podstawą dla niedawno opublikowanych protokołów²⁶.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół przygotowania i późniejszej ekspozycji ludzkiego PCLS dostarcza pomocnej metody oceny potencjalnie toksycznych dla płuc i/lub immunomodulujących substancji, które mogą być zaangażowane w rozwój chorób układu oddechowego, takich jak astma zawodowa.

Protokół

Eksperymenty z ludzkimi PCLS muszą być przeprowadzone zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy i zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (przykładowe eksperymenty PCLS pokazane tutaj zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki Szkoły Medycznej w Hanowerze; numer 2701-2015). Pisemna świadoma zgoda na wykorzystanie ludzkiego materiału płucnego jest wymagana od wszystkich pacjentów dawców lub ich najbliższych krewnych. Wyniki opisane w tym manuskrypcie uzyskano z wycinków tkanek od dawców w różnym wieku, płci, historii medycznej i przyczyny resekcji, chociaż większość otrzymanych tkanek pochodziła od pacjentów cierpiących na raka płuc. Do eksperymentów użyto tylko tkanki wolnej od guza.

1. Ogólne przygotowanie ludzkich PCLS i późniejsza ekspozycja na chemikalia

UWAGA: Do napełnienia płuca potrzebne są dwie osoby. Zalecana jest aktualna książeczka szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A i B. Pacjenci są rutynowo poddawani badaniom przesiewowym w kierunku HCV i HIV przed przeszczepieniem płuc. W przypadku zdiagnozowania lub podejrzenia czynnego zakażenia Mycobacterium tuberculosis należy odrzucić płuco. Niemniej jednak cała świeża ludzka tkanka płucna i pobrane z niej próbki muszą być traktowane jako potencjalnie zakaźne i należy podjąć odpowiednie środki ochronne (maski z filtrem cząstek stałych (FFP2), okulary ochronne, rękawice) w celu zapewnienia bezpieczeństwa pracy personelu. Zabieg trwa 60 - 90 min.

1. Potwierdź nienaruszony ludzki płat płuca.
   UWAGA: Rozdarcie opłucnej uniemożliwia jednorodne wypełnienie tkanki. Materiał z płuc ludzkich musi pochodzić z dnia resekcji. Tolerowane są okresy przechowywania około 2 godzin w temperaturze pokojowej (RT) przed napełnieniem go agarozą na lodzie. Tkanka, którą wykorzystujemy w tym protokole, pozyskiwana jest od pacjentów poddawanych resekcji. Nie pochodzi od zmarłych pacjentów. Jeśli tkanka była przechowywana na lodzie, przed napełnieniem należy ją wstępnie ogrzać do temperatury RT, w przeciwnym razie agaroza natychmiast ulegnie polimeryzacji i nie będzie możliwe jednorodne wypełnienie.
   Ostrzeżenie: Upewnij się, że wszystkie osoby mające kontakt z rodzimym materiałem ludzkim zakładają odzież ochronną składającą się z fartucha laboratoryjnego, dwóch par rękawiczek, czapki, maski na twarz i pary okularów ochronnych. Materiał ludzki jest potencjalnie zakaźny.
2. Odważyć 7,5 g agarozy o niskiej żelytacji i dodać ją do 250 ml wody destylowanej dwudestylowanej. Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Schłodzić do około 40 °C, w zależności od temperatury topnienia i żelowania agarozy.
   UWAGA: Wymaganych jest kilka kolb, w zależności od rozmiaru płata.
3. Wstępnie ogrzać i utrzymać pożywkę hodowlaną (tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Jeśli agaroza jest zbyt gorąca, witaminy w pożywce hodowlanej stracą skuteczność, a komórki zostaną uszkodzone. Jeśli temperatura roztworu pożywki/agarozy jest niższa niż 37 °C, rozpoczyna się proces żelowania, który pogarsza jednorodne wypełnienie płuc. Zalecany jest tylko zakres temperatur od 37 °C do 39 °C.
4. Przed rozpoczęciem umieść wszystkie wymagane materiały w zasięgu ręki: 5 - 10 zacisków, elastyczny cewnik o długości około 1 m, odpowiednią strzykawkę (np. 50 ml) pasującą do połączenia z cewnikiem oraz pojemnik na lód wypełniony lodem.
5. Kankaniutować tchawicę/oskrzela główne, wkładając rurkę silikonową i mocując ją za pomocą zacisku zorientowanego równolegle do rurki, tak aby zacisk ściskał tkankę razem wzdłuż rurki silikonowej bez jej ściskania. Sprawdź, czy rurka silikonowa jest zamocowana w środku i nie może wysunąć się podczas procedury napełniania. Zamknij wszystkie inne oskrzela, naczynia krwionośne i urazy zaciskami, aby agaroza nie mogła wyciekać podczas procedury napełniania.
6. Zmieszać równoważną objętość 3% agarozy o niskiej żelowości z pożywką hodowlaną w zlewce. Wkraplanie mieszaniny do płuc za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Przed ponownym napełnieniem strzykawki pożywką należy zacisnąć cewnik palcami lub zaciskiem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i refluksu agarozowego. Wypełnij płat płuca, aż zostanie całkowicie napompowany. Ostrożnie dotknij opłucnej płucnej z boku; Opłucna powinna być równa i twarda.
   UWAGA: W zależności od wielkości płata płuc może być wymagane do 2 lub 3 l roztworu agarozy/pożywki.
7. Powtórz kroki 1,5 - 1,6 dla każdego oskrzela w przypadku kilku oskrzeli w jednej próbce.
8. Płuco należy umieścić na lodzie w celu polimeryzacji agarozy do żelu na 20 - 40 minut, w zależności od ilości wkroplonej agarozy. Ostrożnie dotknij opłucnej z kilku stron, aby sprawdzić, czy jest twarda i chłodna, wskazując, że polimeryzacja została zakończona, w przeciwnym razie kontynuuj czekanie. Niech patolodzy pokroją płuco na plasterki, pobiorą próbki i przechują materiał płucny na lodzie do transportu.
9. Ludzką tkankę płucną pociąć ostrym nożem na 3 - 5 cm kawałki.
   UWAGA: Użyj nowego ostrza do każdego płuca, aby zapewnić ostrość.
10. Napełnij krajalnicę do chusteczek 400 ml lodowatego roztworu soli Earle's Balanced Salt (EBSS). Natychmiast wyciąć cylindryczne rdzenie tkankowe z płyt płuc za pomocą półautomatycznego śrubokręta z narzędziem do wiercenia o preferowanej średnicy (np. 8 mm; 10 mm).
    UWAGA: Średnica ta musi być równa średnicy uchwytu na chusteczki wewnątrz urządzenia.
11. Dostosuj grubość plastrów płuc do żądanej wartości grubości.
    UWAGA: Grubość około 250 μm jest powszechnie stosowana w eksperymentach PCLS. Producent krajalnicy do tkanek zaleca miernik grubości plastra tkanki w celu weryfikacji grubości plasterka. Alternatywnie, barwienie całościowe w połączeniu z mikroskopią konfokalną może być użyte do określenia grubości warstwy, jak opisano przez Brismara i wsp.²⁷
12. Przenieś rdzenie tkanek do uchwytu na tkanki krajalnicy do tkanek. Umieść ciężarek (część uchwytu na chusteczkę) na wierzchu rdzenia tkanki. Ustaw prędkość ramienia i prędkość ostrza na 6 na slicerze do tkanek. Rozpocznij krojenie rdzenia tkanki na PCLS.
13. Uzupełnij 500 ml dostępnego w handlu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM): Mieszanka składników odżywczych F-12 DMEM/F12 (1:1) z 5 ml penicyliny (10 000 jednostek/ml) i streptomycyny (10 000 μg/ml). Przechowuj pożywkę hodowlaną przez kilka dni w sterylnych warunkach w lodówce. Podgrzej tylko wymaganą objętość podłoża.
    UWAGA: Penicylina zostanie dezaktywowana, jeśli będzie przechowywana w temperaturze 37 °C przez dłuższy czas. Używaj pożywki hodowlanej bez surowicy i barwnika, ponieważ skład surowicy różni się w zależności od partii, a barwniki, takie jak czerwień fenolowa, mogą zakłócać testy.
14. Napełnij szalkę Petriego (100 x 15 mm) 25 ml lodowatej pożywki hodowlanej. Pożywkę należy odsączyć z krajalnicy do tkanek do zlewki, otwierając zacisk szklanego cylindra. Przenieść plastry ze zlewki na szalkę Petriego z pożywką hodowlaną za pomocą aplikatora (np. pętli inokulacyjnej). Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂, 100% wilgotności). Poczekaj, aż podłoże się rozgrzeje przed etapami prania.
    UWAGA: Wszystkie dalsze kroki wykonywane są w sterylnych warunkach.
15. Umieścić sitko do komórek na szalce Petriego w celu umycia PCLS. Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przez sitko do komórek i dodać 25 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki o temperaturze 37 °C. Powtarzaj ten krok 3 - 4 razy co 30 minut.
    UWAGA: Sitko do komórek zapobiega zasysaniu plastrów do pipety, aby uniknąć ich uszkodzenia.
16. Ostrożnie przenieść wycinki płuc na 24-dołkową płytkę hodowlaną z co najmniej 500 μl pożywki hodowlanej na dwie próbki na dołek. Wystawić tkankę płucną na działanie substancji (patrz kroki 3.1 - 3.4), np. przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
    UWAGA: Do transferu najlepiej użyć pętli do zaszczepiania i pozwolić plasterkom unosić się na pętli, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki. Nie jest konieczne dalsze rozdzielanie wycinków, ponieważ tylko niedobór wystarczającej ilości świeżej pożywki spowoduje śmierć komórek w wycinkach tkanki. Plastry mogą nachodzić na siebie lub stykać się ze sobą w studzience: nie ma to wpływu na żywotność tkanek.
17. Umieścić cały pozostały materiał ludzki w plastikowej kolbie z utrwalaczem (np. 10% buforowanym formaldehydem) na co najmniej 24 godziny i spalić go w procesie utylizacji.
    Uwaga: Formaldehyd jest toksyczny, wykonaj ten krok pod maską.

2. Analiza histologiczna PCLS

1. Przygotuj kasety do biopsji z dwiema piankowymi podkładkami nasączonymi utrwalaczem (np. 4% buforowanym formaldehydem). Umieść PCLS między podkładkami piankowymi w kasecie biopsyjnej i natychmiast przenieś tkankę do roztworu utrwalającego. Utrwal tkankę na noc w 4% buforowanym formaldehydzie.
2. Przetwarzaj tkankę do zatapiania w parafinie poprzez odwadnianie próbek w etanolu (70%, 90%, 100%, 100%, 100%) przez 1 godzinę każda, a następnie mycie w ksylenie (3 x 1 h) i ciekłej parafinie (3 x 1 h) zgodnie ze standardowymi protokołami histopatologicznymi.
3. Przenieś PCLS do formy do zatapiania. Użyj pętli do zaszczepiania. Zanurzyć tkankę PCLS w ciekłej parafinie. Upewnij się, że chusteczka jest równomiernie umieszczona w formie podczas odlewania bloku parafinowego.
4. Przeciąć blok tkanki zawierający PCLS za pomocą mikrotomu obrotowego, aż uzyska płaską i równą powierzchnię. Pobrać odcinki szeregowe o żądanej grubości (np. 4 μm), umieszczając je pojedynczo na kolejno ponumerowanych szkiełkach ze szkła powlekanego (zwykle można wziąć 25 - 30 sekcji), aż do przetworzenia całego PCLS.
5. Pojedyncze szkiełka podstawowe (co 8 - 10 sekcji) należy zabarwić hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu orientacji. Wybierz sekcje do eksperymentu na podstawie slajdów orientacyjnych (pierwsze i ostatnie 8 sekcji jest zwykle niekompletnych).
   UWAGA: (Opcjonalnie) W przypadku dłuższego przechowywania szkiełka można zanurzyć w płynnej parafinie w celu konserwacji.

3. Przygotowanie roztworów substancji

UWAGA: Przygotuj działające roztwory i kontrole bezpośrednio przed użyciem.

Uwaga: Z substancjami należy obchodzić się zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa lub, jeśli nie są znane, jako potencjalnie szkodliwe i przestrzegać rutynowych środków ostrożności.

1. Substancje rozpuszczalne w wodzie rozpuścić bezpośrednio w pożywce hodowlanej. W przypadku nierozpuszczalnych lub słabo rozpuszczalnych substancji chemicznych należy najpierw rozpuścić substancję w odpowiednich rozpuszczalnikach w zależności od rozpuszczalności substancji. Substancje o ograniczonej rozpuszczalności w wodzie (<0,1 mg/ml) można rozpuścić, na przykład w DMSO lub etanolu. Stężenia nietoksycznych rozpuszczalników należy wcześniej oznaczyć przez miareczkowanie. Upewnij się, że substancje nie wytrącają się z roztworu po rozcieńczeniu do podłoża.
   UWAGA: Przygotowuje się roztwory HClPt i laurylosiarczanu sodu (SLS).
2. Przygotować roztwory podstawowe substancji o stężeniu 100-krotnym od pożądanego najwyższego stężenia w pożywce hodowlanej lub rozpuszczalniku. Odważyć 12,5 mg HClPt i 34,4 mg SLS i przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając substancje chemiczne w 1 ml pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Do tych chemikaliów nie jest wymagany rozpuszczalnik
.
3. Przygotować końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:100 we wstępnie podgrzanym podłożu. W przypadku wcześniejszego użycia rozpuszczalnika, podejście to prowadzi do uzyskania takiego samego końcowego stężenia rozpuszczalnika dla wszystkich stężeń substancji.
4. Końcowe stężenie rozpuszczalnika (np. 1%, jak opisano w kroku 3.3) należy zastosować do referencyjnego traktowania PCLS. Nie była wymagana kontrola rozpuszczalnika w przypadku substancji chemicznych wymienionych w sekcji dotyczącej wyników.

4. Pozytywne i negatywne referencje dla testów cytotoksyczności

1. Dla wszystkich testów żywotności należy przygotować następujące kontrole dodatnie i ujemne:
   1. Kontrola tkankowa: inkubować PCLS w pożywce hodowlanej tylko jako odniesienie dla PCLS niepoddanych działaniu substancji przez 24 godziny w warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO₂, wilgotność 100 %).
   2. Kontrola nośnika (w razie potrzeby): inkubować PCLS z końcowym stężeniem rozpuszczalnika jako odniesieniem dla PCLS poddanych działaniu samego nośnika (patrz etap 3.4) przez 24 godziny w warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5 % CO₂, 100 % wilgotności).
   3. Kontrola pozytywna: inkubować PCLS z 1% detergentem w roztworze buforowym przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli PCLS staną się bezbarwne, tkanka jest martwa. Całkowita dehydrogenaza L-mleczanowa (LDH) jest oznaczana w supernatancie, przy absorpcji około 1,9 - 2,3 (patrz kroki 6.1 - 6.4). Tkanka jest używana do testu WST-1 (patrz kroki 5.1 - 5.5), z absorpcją około 0.

5. Pomiar chemicznie indukowanej cytotoksyczności u ludzkich PCLS za pomocą testu WST-1

UWAGA: Test WST-1 jest wykonywany na 24-dołkowej płytce z dwoma PCLS na studzienkę. Najlepiej użyć duplikatów dla każdego parametru i zebrać wyniki tych duplikatów po pomiarze.

1. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając odczynnik WST-1 w pożywce bezpośrednio przed rozpoczęciem. Wymagana ilość roztworu roboczego to 250 μl/dołek z płytki 24-dołkowej. Dlatego należy zmieszać 25 μl odczynnika z 225 μl pożywki dla jednego dołka.
2. Po inkubacji PCLS z kroku 1.16 należy odrzucić lub użyć supernatantu do pomiarów cytokin lub innych testów, takich jak test LDH. Pozostała tkanka jest używana do następnego kroku.
3. Odmierzyć pipetą 250 μl stężenia roboczego odczynnika WST-1 do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę. Upewnij się, że PCLS są całkowicie pokryte odczynnikiem WST-1 podczas inkubacji.
4. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min) i ostrożnie wstrząsać przez 30 s, aby zapewnić dokładne wymieszanie odczynnika WST-1. Pobrać nową płaskodenną 96-dołkową płytkę i odpipetować 100 μl w dwóch egzemplarzach z supernatantu z każdego dołka 24-dołkowej.
5. Zmierzyć absorpcję każdej studzienki przy 450 nm (odniesienie: 630 nm) za pomocą czytnika mikropłytek. Odjąć absorpcję przy 630 nm od 450 nm. Wartości te zostaną użyte do obliczeń w kroku 5.6).
   UWAGA: Wiarygodne dane do oceny cytotoksyczności można uzyskać tylko z żywotnej tkanki. W związku z tym te kryteria akceptacji opublikowane przez Hessa i wsp.¹⁵ powinno być spełnione w każdym eksperymencie. Jeśli te kryteria nie są spełnione, eksperyment należy powtórzyć.
6. Wchłanianie nietraktowanej pożywki kontrolnej powinno wynosić powyżej 0,6, w przeciwnym razie eksperyment należy powtórzyć. Jeśli dane spełniają ten wymóg, należy ustawić wartość absorpcji kontroli tkankowej na 100% i obliczyć redukcję WST-1 próbek poddanych działaniu substancji w stosunku do kontroli tkankowej.

6. Test LDH

Uwaga: Test LDH jest wykonywany na 96-dołkowej płytce z 100 μL supernatantu hodowlanego w sumie po okresie po inkubacji.

1. Po inkubacji PCLS z czynnikami badanymi lub bez nich, pobrać 50 μl supernatantu z kroku 1.16 i przenieść go w dwóch egzemplarzach na nową płytkę 96-dołkową. W ten sposób generowane są duplikaty z każdej poddanej działaniu dołka płytki 24-dołkowej.
2. Przygotować roztwór roboczy odczynnika LDH bezpośrednio przed badaniem. Roztwór roboczy składa się z roztworu katalizatora (liofilizat rozpuszczony w 1 ml wody wodorodestylowanej) i roztworu barwnika dostarczonego przez producenta. Na jedną 96-dołkową płytkę dokładnie wymieszaj 125 μl roztworu katalizatora z 6,25 ml roztworu barwnika.
   Ostrzeżenie: Nie wystawiaj roztworu na bezpośrednie działanie światła.
3. Odpipetować 50 μl roztworu roboczego do każdej studzienki zawierającej już 50 μl supernatantu i inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Nie jest wymagane dalsze mieszanie.
4. Zmierzyć absorpcję każdej studzienki przy długości fali 492 nm (odniesienie: 630 nm) za pomocą czytnika mikropłytek. Odjąć absorpcję przy 630 nm od 492 nm. Wartości te zostaną użyte do obliczeń w kroku 6.5.
   UWAGA: Wiarygodne dane do oceny cytotoksyczności można uzyskać tylko z żywotnej tkanki. Absorpcja kontroli poddanej działaniu detergentu powinna wynosić ponad 1.
5. Do celów analizy należy ustawić wartość absorpcji kontroli dodatniej z kroku 4.1 na 100 % i obliczyć uwalnianie LDH w próbkach poddanych działaniu substancji w odniesieniu do kontroli dodatniej (tj. maksymalnego uwalniania LDH).

7. Mikroskopowy test żywotności za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (cLSM)

Uwaga: Do mikroskopowego testu żywotności, dwa z normalnych PCL o grubości 250 μm są barwione w 250 μL/studzienka na 24-dołkowej płytce. Ponieważ każdy wycinek jest obrazowany osobno, nie są wymagane żadne dodatkowe duplikaty.

1. Po inkubacji PCLS z elementami do badań lub bez nich, należy odrzucić supernatant lub użyć go do pomiarów cytokin lub innych testów, takich jak test LDH. Użyj pozostałej tkanki do opisanej tutaj procedury.
2. Przygotować robocze rozcieńczenie kalceiny-AM i etydyny homodimeru 1 (EthD-1) o stężeniu roboczym obu odczynników wynoszącym 4 μM w pożywce hodowlanej. W tym celu dodać 1 μl kalceiny-AM (4 mM) i 2 μl EthD-1 (2 mM) do 997 μl pożywki hodowlanej. Ta objętość jest wymagana do zabarwienia 4 studzienek po dwa PCLS każdy.
   UWAGA: Unikaj wystawiania odczynników na bezpośrednie działanie światła.
3. Odpipetować 250 μl roztworu roboczego do każdego dołka i inkubować 24-dołkową płytkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min podczas inkubacji, aby zapewnić lepszą ekspozycję tkanki na roztwór barwiący.
4. Po 45 minutach wyrzucić roztwór barwiący i przemyć PCLS 1 ml roztworu buforowego przez wytrząsanie z prędkością 150 obr./min przez 3 - 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Powtórz ten krok dwukrotnie.
5. Nałożyć 500 μl roztworu buforowego do każdej studzienki zawierającej barwione PCLS, aby uniknąć autofluorescencji z pożywki hodowlanej. W celu oceny mikroskopowej wykonaj co najmniej dwa losowo rozmieszczone stosy z cLSM.
6. Kliknij zakładkę Okular, aby wybrać obiektyw 10X/0,3 i kliknij Online, aby użyć cLSM jako standardowego mikroskopu świetlnego w celu znalezienia powierzchni PCLS. Kliknij Offline, aby wyjść z ustawień okularu.
7. Kliknij na zakładkę Akwizycja i włącz odpowiednie lasery dla fluoroforów.
   UWAGA: Użyliśmy lasera argonowego o długości fali 488 nm dla barwnika polianionowego kalceiny (długość fali wzbudzenia 495 nm) oraz lasera HeNe o długości fali 543 nm do detekcji kompleksu EthD-1/DNA (długość fali wzbudzenia 533 nm). Laser argonowy powinien zwykle pracować z prędkością 30 - 50% maksymalnego prądu, aby umożliwić prąd lampy o natężeniu około 5,7 A, ponieważ znacznie wydłuża to żywotność lasera.
8. Kliknij Ścieżkę światła w zakładce Akwizycja i ustaw niezbędne filtry i lustra do eksperymentu.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano system oparty na filtrze z głównym dichroicznym rozdzielaczem wiązki (np. HFT 488/543) oddzielającym światło wzbudzenia i emisji. Przez zwierciadło odbijające światło jest kierowane do wtórnego rozdzielacza wiązki dichroicznej (np. NFT 545) w celu dalszego rozdzielenia światła emitowanego z próbki na dwa kanały.
9. Ustaw filtry pasmowo-przepustowe (np. BP 505-530 dla sygnału kalceiny i BP 560-615 dla sygnału kompleksu EthD-1/DNA), które transmitują tylko określony zakres długości fal i przypisują sygnał kalceiny do kanału 2, a sygnał kompleksu EthD-1/DNA do kanału 3.
10. Zaznacz pole Z-Stacks, aby ustawić górny i dolny limit objętości mikroskopijnej. Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić na ekranie podgląd na żywo odpowiedniej warstwy. Przesuń ostrość w górę lub w dół, aby znaleźć powierzchnię PCLS z ostrym sygnałem.
11. Kliknij podsekcję Kanały i zaznacz pole Pokaż wszystko. Zablokuj stół, naciskając przycisk odpowiedniego kanału pod obrazem na żywo i aktywuj kolor kanału.
    UWAGA: Niebieski kolor na obrazie na żywo będzie oznaczał, że nie ma sygnału, podczas gdy wysoki sygnał pojawi się na biało, a prześwietlony sygnał pojawi się na czerwono.
12. Ustaw otwór dla czerwonego kanału EthD-1 na 1 jednostkę Airy, aby uzyskać najlepszy kompromis między wydajnością zbierania światła a sekcją optyczną i odpowiednio dostosuj kanał kalceiny. Zwiększ wykrywany sygnał wzmocnienia tak, aby na obrazie na żywo był biały, ale nie czerwony z aktywowaną tabelą blokowania kolorów kanałów.
    UWAGA: Wzmocnienie główne nie powinno przekraczać 600 jednostek.
13. Zwiększ lub zmniejsz przesunięcie cyfrowe, aby dostosować tło tak, aby pojawiało się na niebiesko na obrazie na żywo z aktywowaną tabelą blokowania kolorów kanałów.
14. Kliknij zakładkę Z-Stack w obszarze Akwizycja wielowymiarowa i użyj fokusu, aby przejść do interesującej Cię warstwy z. Naciśnij przycisk Ustaw pierwszy, aby zapisać tę pozycję do późniejszego pobrania. Powoli przesuwaj ostrość w górę lub w dół, aż zostanie osiągnięty zakres 30 μm, a następnie naciśnij przycisk Ustaw ostatni, aby zapisać.
15. Kliknij ponownie na Na żywo, aby dezaktywować obraz na żywo i naciśnij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć obrazowanie.
    UWAGA: Żywotną tkankę wykrywa się poprzez fluorescencję polianionowego barwnika kalceiny. Martwe komórki są rozróżniane przez złożone tworzenie EthD-1 i kwasów nukleinowych.

8. Renderowanie obrazu

Uwaga: Należy wziąć pod uwagę zalecenia komputerowe oprogramowania do renderowania obrazów, ponieważ ten program wymaga odpowiedniego sprzętu.

1. Załaduj plik LSM uzyskany w wyniku mikroskopowego barwienia żywotności PCLS (patrz sekcja 7) do oprogramowania do renderowania obrazu. Zapisz go jako plik .ims przed kontynuowaniem. Ustaw wszystkie parametry w kontrolce tkankowej i zastosuj je do wszystkich obrazów. Dalsze zmiany nie są dozwolone.
2. Użyj przycisku Objętość do rekonstrukcji powierzchni żywej tkanki (barwienie kalceiny) (Rysunek uzupełniający 1A) i przycisku Plamki do martwych jąder komórkowych (Rysunek uzupełniający 1H). Podczas renderowania jednego kanału wyłącz drugi kanał w oknie regulacji wyświetlania.
3. Zacznij od odwzorowania objętości niezbędnej tkanki: ustaw kanał powierzchni, przetwórz cały obraz, ustaw współczynnik gładkości na 0,5 μm i użyj bezwzględnej intensywności jako progu (rysunek uzupełniający 1B, C). Naciśnij niebieską strzałkę do przodu.
4. Dostosuj bezwzględny próg intensywności zrekonstruowanej głośności; należy odjąć szum i intensywność tła. Nakładka powierzchni jest pokazana w kolorze szarym i należy sprawdzić dokładność pokrycia powierzchni (rysunek uzupełniający 1D). Po zakończeniu regulacji naciśnij niebieską strzałkę do przodu. W większości przypadków ten krok jest wymagany do obliczenia ustawień. Jeśli oprogramowanie nie jest w stanie obliczyć objętości, zwiększ współczynnik gładkości.
5. W ostatnim kroku wybierz filtr. Użyj filtra sferycznego (o wielkości około 10 μm) do renderowania powierzchni, aby odfiltrować makrofagi w przestrzeni pęcherzykowej (rysunek uzupełniający 1E). Naciśnij zielony przycisk do przodu.
6. Dostosuj optycznie obraz wyjściowy i eksportuj statystyki jako pliki .xls. Całkowita objętość (suma) zostanie wykorzystana do dalszej analizy (rysunek uzupełniający 1F, G). Zapisz ustawienia i wykorzystaj je do wszystkich dalszych analiz stosów z wykonanych tego samego dnia z tymi samymi ustawieniami cLSM (rysunek uzupełniający 1I).
7. Zrekonstruuj czerwony kanał (plamki) dla martwych jąder komórkowych. Losowo zmierz rozmiar kropki w skali μm w oknie przekroczenia; Rozmiar kropki wynosi około 5 μm. Zaznacz opcję Włącz i ustaw rozmiar kropki. Sprawdź, czy wszystkie kropki są zaznaczone, a każda kropka jest liczona tylko raz. W razie potrzeby skorygować ręcznie (rysunek uzupełniający 1B, H, J). Naciśnij niebieską strzałkę do przodu.
8. Naciśnij zielony przycisk do przodu, aby program obliczył/policzył całkowitą liczbę punktów zgodnie z ustawionymi parametrami i wyeksportował wynik jako .xls plik (rysunek uzupełniający 1K, L, M). Do graficznej lub statystycznej analizy obrazu należy ustawić liczbę obliczonych jąder martwych komórek w stosunku do objętości życiodajnej tkanki.

9. Pomiar cytokin i chemokin u ludzkich PCLS

Uwaga: Odpowiedź immunologiczna cytokin i chemokiny może być mierzona pozakomórkowo w supernatancie hodowli i wewnątrzkomórkowo w lizatach tkankowych po czasie inkubacji. Test ELISA mierzy się w duplikatach na 96-dołkowej płytce ze 100 μl/basenik.

1. Przygotuj 1% roztwór detergentu, mieszając 5 ml detergentu z 495 ml roztworu buforowego. Roztwór może być przechowywany w RT przez kilka miesięcy.
2. Wymieszać 1% roztwór detergentu z inhibitorem proteazy (PI) w stosunku 1:500. Wymagana ilość zależy od płytki hodowlanej; na przykład użyj 500 μl/dołek na płytkę 24-dołkową. W jednym dołku wymieszaj 1 μl PI z 499 μl roztworu detergentu.
3. Przygotować probówki z 1 μl roztworu PI i zebrać 500 μl supernatantu do hodowli w tych probówkach. Natychmiast zastąpić pożywkę w płytce 24-dołkowej roztworem detergentu o objętości 500 μl zawierającym PI, jak przygotowano w kroku 9.2. Lizować tkanki przez 1 godzinę, umieszczając 24-dołkową płytkę w temperaturze 4 °C. Odpipetować lizat tkankowy do nowej probówki i przechowywać te probówki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
   UWAGA: Protokół ELISA w dużym stopniu zależy od producenta i należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Standardowy protokół ELISA jest opisany poniżej.
4. Wykonaj test ELISA, aby zmierzyć poziom cytokin w supernatancie lub lizacie zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zmierzyć IL-1α i TNF-α, pokryj 96-dołkową płytkę, pipetując 100 μl przeciwciała wychwytującego (w celu rozcieńczenia postępuj zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować bufor do przemywania przez rozpuszczenie tabletki buforowej do przemywania w 1 l wodzie wodorodestylowanej. Usunąć przeciwciało wychwytujące i odpipetować 400 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Wymień ten wolumin trzy razy. Zablokować płytkę, dodając roztwór blokujący (np. 1% BSA w roztworze buforowym, zgodnie z instrukcją producenta). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
   UWAGA: Standardowe, dostępne na rynku testy ELISA wymagają 2 x 100 μl supernatantu tkankowego lub lizatu. Próbki należy rozmrozić raz i tuż przed użyciem. W zależności od czułości testu i uwolnionej cytokiny, próbki muszą być rozcieńczone przed pomiarami. W związku z tym rozcieńczyć próbkę w odczynniku dostarczonym przez test.
6. Usunąć roztwór blokujący i dodać rozcieńczone próbki do krzywej wzorcowej (w celu rozcieńczenia postępować zgodnie z instrukcjami producenta) oraz 100 μl supernatantu tkankowego lub 100 μl lizatu tkankowego w duplikatach pobranych w kroku 9.3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Wyjąć próbki i odpipetować 400 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Wymień ten wolumin trzy razy. Odpipetować 100 μl biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego (do rozcieńczenia postępować zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć przeciwciało i odpipetować 400 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Wymień ten wolumin trzy razy. Dodać 100 μl/basenik streptawidyny znakowanej HRP (w celu rozcieńczenia postępować zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (sprawdź instrukcje producenta).
9. Usunąć streptawidynę i odpipetować 400 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Wymień ten wolumin trzy razy.
10. Dodać 100 μl substratu (zalecanego przez producenta) i inkubować przez 20 minut w ciemności (sprawdź instrukcję producenta).
    UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na światło. Unikaj ekspozycji podłoża i płyty na światło.
11. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl roztworu zatrzymującego (1 M H₂SO₄). Zmierzyć absorpcję każdej studzienki przy 450 nm (odniesienie: 570 nm) za pomocą czytnika mikropłytek. Odjąć absorpcję przy 570 nm od 450 nm.
    UWAGA: Kontrole tkanek niepoddanych działaniu substancji i/lub nośników służą jako kontrole ujemne. Aby wywołać odpowiedź immunologiczną w tkance płucnej, należy zastosować odpowiednią stymulację (np. 100 ng/ml lipopolisacharydu (LPS)) jako kontrolę pozytywną. Inkubować dwie studzienki z dwoma PLCS na studzienkę z 100 ng/ml LPS w pożywce hodowlanej, na przykład przez 24 godziny, i zebrać supernatant i lizat tkankowy zgodnie z opisem w kroku 9.3.
    UWAGA: Wyniki pomiarów są akceptowane, jeśli absorpcja najwyższej normy jest równa lub wyższa niż 1,0; W przeciwnym razie pomiar należy powtórzyć. Krzywa standardowa powinna być zgodna z sigmoidalną krzywą dawka-odpowiedź.
12. Stężenia cytokin (pg) oznaczone metodą ELISA w kroku 9.11 są normalizowane do całkowitej zawartości białka oznaczonej w lizacie tkankowym każdej próbki (patrz punkt 10).

10. Pomiar całkowitej zawartości białka w ludzkich PCLS

Uwaga: PCLS muszą być poddane lizie, aby zmierzyć całkowite stężenie białka. Na tym etapie stosuje się lizaty tkankowe z kroku 9.3. Test przeprowadza się na płaskiej 96-dołkowej płytce z 25 μl/basenik lizatu tkankowego, pipetowanym w dwóch egzemplarzach.

1. Przygotuj 7-punktowy wzorzec BSA o stężeniach BSA 2 000 μg/ml, 1 500 μg/ml, 1 000 μg/ml, 750 μg/ml, 500 μg/mL, 250 μg/ml i 125 μg/ml. Nałożyć 25 μl w dwóch egzemplarzach dla każdego wzorca i użyć 25 μl roztworu buforowego jako ślepej próby na płytce 96-dołkowej (użyć płytki z pokrywką płytki).
2. Odpipetować 25 μl lizatów (patrz krok 9.3) z każdej studzienki w dwóch egzemplarzach na płytkę 96-dołkową. W sumie wymagane jest 50 μl każdej studzienki. Przygotować odczynnik roboczy roztworu BCA, rozcieńczając odczynnik BCA B w stosunku 1:50 w odczynniku BCA A. Na płytkę 96-dołkową należy użyć 400 μl odczynnika B i 20 000 μl odczynnika A.
3. Ostrożnie odpipetować 200 μl odczynnika roboczego do każdej studzienki, unikając pęcherzyków powietrza. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej (150 obr./min) na 30 s, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie lizatów i odczynnika roboczego, a następnie załóż osłonę płytki na płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Zmierzyć absorpcję każdej studzienki przy 540 - 590 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
   UWAGA: Wyniki pomiarów są akceptowane, jeśli absorpcja najwyższego standardu BSA jest równa lub wyższa niż 0,8; W przeciwnym razie pomiar należy powtórzyć. Krzywa standardowa powinna być zgodna z sigmoidalną krzywą dawka-odpowiedź.
4. Do analizy należy obliczyć krzywą standardową za pomocą 4-parametrowego równania Marquardta po odjęciu ślepej próby. Obliczyć stężenia białek w nieznanych próbkach, korzystając z standardowego dopasowania krzywej.

Wyniki

W zastosowanej metodzie badawczej przygotowano ludzkie PCLS i poddano je działaniu pięciu stężeń substancji przemysłowych w celu oceny chemicznie indukowanych efektów immunomodulacyjnych w materiale płucnym człowieka. Tkanka płucna była eksponowana w warunkach zanurzenia w stałej kulturze przez 24 h. Toksyczność oceniano poprzez pomiar uwalnianej LDH, aktywności mitochondrialnej oraz mikroskopowe barwienie żywotności. Dodatkowo zmierzono całkowistą zawartość białka do normalizacji oraz poziom cytokin prozapalnych. Gdzie było to możliwe, wartości stężeń hamujących (IC) 75 obliczano za pomocą nieliniowego dopasowania krzywej sigmoidalnej. W celu walidacji każdej serii pomiarów wykorzystano dodatnie substancje referencyjne: detergent do oceny cytotoksyczności oraz LPS do oceny wrodzonej odpowiedzi cytokinowej. Logarytmicznie przekształcone wartości IC75 [µM] (log IC50) wykorzystano jako stężenia „drażniące” w kolejnych pomiarach uwalniania cytokin.

Rysunek 1 oraz Rysunek 2 przedstawiają procedurę pobierania materiału z ludzkiego płuca oraz przykładowe barwienie H&E ludzkich PCLS. Należy przestrzegać rutynowych procedur higienicznych, aby uniknąć negatywnego wpływu na zdrowie i zapewnić bezpieczeństwo personelowi pracującemu z materiałem ludzkiego płuca. Technika ta wymaga przeszkolenia i praktyki personelu. Do oceny stanu patologicznego materiału ludzkiego płuca niezbędni są doświadczeni patolodzy, potrafiący rozróżnić poszczególne regiony (płaty górne/dolne oraz obszary podplewralne w stosunku do bardziej centralnych) oraz obszary chorobowo zmienione od zdrowych. Wygenerowane ludzkie PCLS powinny zostać wykorzystane do przygotowania cienkich przekrojów barwionych H&E, które mogą zostać ponownie ocenione przez patologa. Procedura ta pomaga użytkownikom zdobyć doświadczenie w rozróżnianiu różnych obszarów chorobowych i lokalizacji w obrębie płuc.

Rysunek 3 przedstawia wyniki pomiarów aktywności LDH i WST-1 w ludzkich PCLS po 24 h inkubacji z SLS. Kontrola z nieprzetraktowanym medium bez SLS, pokazana przy 0 µg/mL SLS, stanowi istotną kontrolę jakości. Wartości dla LDH powinny być poniżej 20% w porównaniu z tkanką lizowaną detergentem, a dla testu WST-1 powinny wynosić >0,7 jednostek absorbancji. Kontrole jakości te służą również jako wskaźniki niewystarczającej żywotności tkanki. Jako kontrola pozytywna musi zostać uwzględniona reaktywność tkanki ludzkiej na roztwór detergentu jako skuteczną substancję toksyczną. Powinno to skutkować wzrostem o 300 - 500% (>2,0 jednostek absorbancji) poziomu LDH w porównaniu z nieprzetraktowaną tkanką oraz wartościami <0,1 jednostek absorbancji w teście WST-1. SLS spowodował zależną od dawki redukcję żywotności komórek, co objawiło się wzrostem LDH oraz spadkiem aktywności metabolicznej w teście WST-1 przy stężeniach >87 µg/mL. Do danych dopasowano sigmoidowy model zależności dawka-odpowiedź, co umożliwia obliczenie wartości IC75 lub IC50. Wartości te mogą następnie posłużyć do wyboru stężeń do oznaczania poziomów cytokin i chemokin: przy stężeniach silnie toksycznych zazwyczaj nie wykrywa się cytokin i chemokin lub są one obecne w niewielkiej ilości. Dlatego zaleca się stosowanie stężeń nietoksycznych lub tylko lekko toksycznych (IC75). Należy tutaj zauważyć, że oczekiwany wzrost aktywności LDH w nadsączu hodowli komórkowej jest często pod wpływem zastosowanej substancji²¹. Często dochodzi do interferencji między substancją a aktywnością enzymu, co prowadzi do błędnej interpretacji wyników, jeśli test LDH byłby jedynym zastosowanym testem cytotoksyczności. W związku z tym ważne i konieczne jest przeprowadzenie kilku testów cytotoksyczności w celu uzyskania wiarygodnych i poprawnych wyników. Ponadto należy wspomnieć, że czułość testów LDH i WST-1 jest wysoce porównywalna.

Na Rysunku 4 obrazy mikroskopowe żywotności PCLS wykazują reakcję tkanki ludzkiej na detergent jako skuteczną substancję toksyczną. Wyniki te są bardzo przydatne do potwierdzenia innych danych dotyczących żywotności, jednak wymaga to zastosowania dodatkowego sprzętu. Efekty toksyczne ocenia się wizualnie poprzez porównanie tkanki wybarwionej kalceiną z jądrami komórkowymi wybarwionymi EthD-1. Losowo wybrane fragmenty w obrębie miąższu zazwyczaj dają porównywalne wyniki, natomiast należy unikać dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, ponieważ większe pustki mogą zaburzyć wyniki. Z naszego doświadczenia oraz przy zastosowaniu opisanych powyżej ustawień mikroskopu, średnia objętość tkanki kontrolnej wynosi od 1,5 x 10⁶ do 5 x 10⁶ µm³. Wartości te zależą od jakości materiału płucnego, jakości PCLS, a także od choroby dawcy tkanki płucnej. Pomimo że żywotność ludzkiej tkanki płuc różni się w zależności od dawcy, liczba martwych jąder komórkowych w stosunku do żywej tkanki nie powinna przekraczać 15% kontroli tkankowej. Jeśli jednak w kontroli tkankowej przeważają martwe jądra komórkowe, należy zrezygnować z eksperymentu.

Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące efektu immunomodulacyjnego HClPt i SLS na ludzką tkankę płucną. Cytokiny prozapalne IL-1α i TNF-α są biomarkerami stanu zapalnego, wskazującymi na rozpoczęcie procesów zapalnych po ekspozycji na substancje stymulujące. Obie cytokiny zmierzono za pomocą metody ELISA. Poziom zewnątrzkomórkowej IL-1α w ludzkich PCLS jest zazwyczaj niski, podczas gdy wewnątrzkomórkowa IL-1α osiąga poziomy 1,000 pg/mL i wyższe. Spadek poziomu wewnątrzkomórkowej IL-1α wskazuje na zachodzące procesy cytotoksyczne – co obserwuje się głównie po narażeniu ludzkich PCLS na działanie chemikaliów. W przypadku stymulacji tkanki LPS, który jest aktywatorem wrodzonego układu odpornościowego i tym samym stanowi pozytywną kontrolę badania, większość indukowanej IL-1α po 24 h może być wykryta jedynie wewnątrzkomórkowo. Z kolei wydzielanie TNF-α indukowane stymulacją LPS może być mierzone głównie w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zastosowanie odpowiedniej kontroli pozytywnej, takiej jak LPS, potwierdza poprawność metody. W zastosowanej metodzie badawczej ludzkie PCLS poddano działaniu trzech stężeń HClPt (32, 64 i 125 µg/mL) lub dwóch stężeń SLS (1 i 10 µg/mL) przez 24 h. Wydzielanie cytokin określono jako sumę cytokin zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, znormalizowaną do całkowitego stężenia białka, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 5. Warto tutaj wspomnieć, że metoda BCA jest powszechnie stosowana do oznaczania całkowitej zawartości białka, jednak odzwierciedla ona również indukowaną przez substancje cytotoksyczność. W związku z tym, przy bardzo toksycznych stężeniach całkowita zawartość białka nie może być wykorzystana do normalizacji danych dotyczących cytokin. Wydzielanie IL-1α wzrosło znacząco z 263 ± 38 pg/mg do 887 ± 216 pg/mg, a w przypadku TNF-α z 263 ± 38 pg/mg do 1,160 ± 286 pg/mg (Rysunek 5A, B). Ponadto przedstawiono wydzielanie IL-1α i TNF-α indukowane przez LPS w porównaniu z kontrolą tkanki niestymulowanej. Indukcja cytokin prozapalnych przez wzorce molekularne związane z patogenami, takie jak LPS, potwierdza poprawność metody i jest wysoce zalecana podczas pracy z ludzkimi PCLS w celu badania efektów immunomodulacyjnych. Więcej szczegółów na temat danych dotyczących HClPt i SLS można znaleźć w badaniu Lauensteina et al.²¹

Rysunek 1: Procedura wypełniania materiału płucnego człowieka. Płuco człowieka jest przygotowywane bezpośrednio po resekcji. Płuco należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby zapewnić jednorodne wypełnienie agarozą i uniknąć jej gwałtownej polimeryzacji podczas procesu. Płuco ustawia się poziomo, z rozłożonymi płatami, aby uzyskać optymalny widok na główny oskrzele lub oskrzela (A i B to zbliżenia na oskrzele). Oskrzela są kaniulowane za pomocą elastycznej rurki silikonowej i mocowane klemami (C). Po procedurze wypełniania i polimeryzacji agarozy w tkance, przeszkoleni patolodzy tną płuco na plastry o grubości około 3 - 5 cm (D). Z tych plastrów, za pomocą wycinaka, przygotowuje się cylindryczne rdzenie tkankowe (Ø np. 8 mm) (E). Rdzenie te są cięte za pomocą kroicznika do tkanek na PCLS, które są natychmiast przenoszone do wypełnionych pożywką szalek Petriego w celu inkubacji w standardowych warunkach hodowli komórkowej (E). Po kilku etapach płukania PCLS są przenoszone do płytek hodowlanych (np. płytka 24-dołkowa z dwoma PCLS na dołek i 500 µL pożywki), aby usunąć pozostałości szczątków komórkowych i uwolnione mediatory komórkowe (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Ocena stanu zdrowotnego ludzkich PCLS za pomocą barwienia H&E. PCLS na tym obrazie, przygotowane od dawcy z guzem płuca, wykazują nienaruszoną tkankę płucną z miąższem pęcherzykowym, obwodowymi drogami oddechowymi (***) i naczyniami krwionośnymi (groty strzałek) w widoku ogólnym (A). Przy większym powiększeniu można zaobserwować drogi oddechowe z nienaruszonym rzęsistym nabłonkiem oddechowym (groty strzałek) (B), nienaruszoną strukturę pęcherzykową wyścieloną żyjącymi pneumocytami, w tym kapilarę z licznymi erytrocytami (groty strzałek) (C), przestrzenie pęcherzykowe zawierające makrofagi pęcherzykowe (immunohistochemia CD68) (D), a także naczynia krwionośne z nienaruszonym śródbłonkiem (immunohistochemia CD31) (E). Do przygotowania PCLS wykorzystano wyłącznie tkankę wolną od guza, dlatego nie widać makroskopowo zmienionych obszarów chorobowych. W przeciwieństwie do PCLS przygotowanych od dawców z innymi chorobami płuc, takimi jak rozedma czy włóknienie, struktura pęcherzykowa nie jest zaburzona, a PCLS jest jedynie lekko postrzępiona na zewnętrznej krawędzi, najprawdopodobniej w wyniku etapów preparatyki. Paski skali wskazują odpowiednio 1,000 µm (A) oraz 50 µm (B-E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Oznaczenie cytotoksyczności indukowanej przez SLS w ludzkich PCLS, mierzone poprzez wyciek enzymu LDH do pożywki hodowlanej (A) oraz utratę aktywności enzymów metabolicznych ocenianą za pomocą barwnika WST-1 (B). Ludzkie PCLS poddano działaniu zwiększających się stężeń SLS. Następnie do danych dopasowano sigmoidalny model zależności stężenie-odpowiedź, co pozwoliło na obliczenie wartości IC75 lub IC50 (stężenie hamujące przy 25% i 50% redukcji żywotności komórek) (ryciny po prawej). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 3 - 5. Absorbancję w teście LDH mierzono przy 492 nm (referencja przy 630 nm), a w teście WST-1 przy 450 nm (referencja przy 630 nm). Dane zostały zaadaptowane i zmodyfikowane z Lauenstein et al.²¹ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4: Reprezentatywne obrazy trójwymiarowego barwienia mikroskopowego i renderowania obrazu ludzkich PCLS. Kontrola żywej tkanki oraz reakcja tkanki na detergent, jako skuteczną substancję toksyczną, przedstawiono po zabarwieniu ludzkich PCLS kalceiną AM (żółty) i EthD-1 (czerwony). Serie obrazów (stacki) o grubości 30 µm wykonano przy użyciu obiektywu 10X (A) i zrenderowano (B). Pasek skali wskazuje 100 µm. Długości fal wzbudzenia 488 nm i 543 nm, filtry emisji BP 505-550 nm i LP 560 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Sekrecja IL-1α i TNF-α indukowana heksachloroplatynianem amonu (HClPt) w ludzkich PCLS po 24 h ekspozycji. PCLS poddano działaniu trzech stężeń (32 µg/mL, 64 µg/mL i 125 µg/mL) HClPt oraz dwóch różnych stężeń (1 µg/mL i 10 µg/mL) SLS. Poziom zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej IL-1α (A) oraz TNF-α (B) oznaczono metodą ELISA i znormalizowano do całkowitej zawartości białka. W celu potwierdzenia poprawności metody, jako punkt odniesienia dla uwalniania wewnątrzkomórkowej IL-1α (A) oraz zewnątrzkomórkowej TNF-α (B), znormalizowanych do całkowitej zawartości białka, przedstawiono LPS – pozytywny aktywator wrodzonego układu odpornościowego. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, *p <0.05 i ***p <0.001; HClPt i SLS: n = 9, IL-1α_LPS: n = 5, TNF-α_LPS: n = 4 w duplikatach technicznych (test Manna-Whitneya). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Lauenstein et al.²¹ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Szczegółowe przetwarzanie obliczeniowe obrazów barwienia żywotności mikroskopowej przy użyciu oprogramowania do renderowania. Procedura operacyjna krok po kroku dla analizy obrazów z przesłanych plików LSM w celu renderowania powierzchni żywej tkanki barwionej kalceiną (A-G, I) oraz detekcji punktowej jąder komórkowych barwionych homodimerem etydyny (H, J-M). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 2: Przegląd komputerowej analizy obrazów barwienia żywotności mikroskopowej tkanki płuc człowieka. Żywa tkanka (żółta) była analizowana za pomocą renderowania powierzchni (B-I), a jądra martwych komórek (czerwone) były wykrywane za pomocą detekcji punktowej (J-P). Do eksportu obrazu wykorzystano tryb migawkowy (Q). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Technika PCLS u ludzi jest dobrze znana w naszym laboratorium. Niniejsza praca zawiera opis tej techniki i jej zastosowania do badania toksyczności substancji w tkance płucnej ex vivo. Ogólnie rzecz biorąc, każde laboratorium stosujące tę technikę powinno dążyć do ustanowienia związanej z testem definicji zakresów ilościowych, oszacowania zmienności i kontroli jakości gwarantujących ważność eksperymentu. Możliwe standardowe procedury mogą polegać na przykład na powtórzeniu każdego punktu końcowego, np. testu cytotoksyczności, na co najmniej trzech dawcach biologicznych (indywidualne serie) z co najmniej dwoma do trzech kontrprób technicznych na próbkę, w tym pozytywnymi i ujemnymi odniesieniami. Personel laboratoryjny powinien być przeszkolony w celu zwiększenia spójności testu i zminimalizowania zmienności testu.

Punkty końcowe często stosowane do oceny immunomodulacyjnego wpływu substancji na tkankę płucną obejmują pomiary cytotoksyczności przy użyciu różnych testów (np. test LDH, test WST-1, test barwienia mikroskopowego), testy uwalniania cytokin, a także zmiany w profilu ekspresji i charakterystykę zmian w populacjach komórkowych za pomocą metod immunohistopatologicznych⁶. Ponadto istnieją techniki opisujące wizualizację komórek, takich jak płucne komórki dendrytyczne, w mysim PCLS²⁸ , które mogą być również przenoszone do ludzkiego PCLS i mogą w ten sposób zapewnić bardziej szczegółowy wgląd w skład komórkowy przed i po leczeniu przypuszczalnymi substancjami cytotoksycznymi.

Ten podstawowy protokół i technika przygotowania skrawków tkanki płucnej człowieka jest porównywalna z technikami, które zostały dobrze opisane w publikacjach²⁹. Krótko mówiąc, materiał narządowy pozyskuje się od pacjentów cierpiących na zagrażające życiu choroby przewlekłe, takie jak rak płuc, którzy muszą przejść operację w celu resekcji lub przeszczepu. Badania muszą zostać zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną. Wymagana jest świadoma pisemna zgoda pacjenta. Skonfigurowanie przepływu pracy między kliniką a laboratorium jest kwestią krytyczną i wymaga komunikacji oraz zdefiniowania interfejsów i infrastruktury między obiema lokalizacjami. Ludzki materiał płucny musi zostać przetworzony bezpośrednio po resekcji, aby zachować żywotność tkanki. Warto wspomnieć, że opisana tutaj technika dla ludzkiego PCLS może być stosowana zarówno do młodych, jak i starych płuc oraz do zdrowych i chorych płuc. Na przykład w Stanach Zjednoczonych możliwe jest pozyskanie płuc od zdrowych dawców narządów, którzy zginęli w wypadkach lub których narządy zostały odrzucone do przeszczepu.

Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest napompowanie dróg oddechowych i otaczającego miąższu roztworem agarozy. Ten krok jest konieczny do zestalenia bardzo miękkiej tkanki do późniejszej procedury krojenia. Jakość ludzkiego materiału płucnego, w oparciu o podłoże chorobowe, ma tutaj kluczowe znaczenie. Można wypełnić tylko płaty z nienaruszoną opłucną. Guzy w końcowym stadium w pobliżu oskrzeli czasami uniemożliwiają proces wypełniania. Przed nadmuchaniem materiału ludzkiego należy dokładnie sprawdzić temperaturę roztworu agarozy. Zbyt duża ilość krwi (lub innych płynów, wysięków) wewnątrz ludzkiej tkanki płucnej spowoduje niepożądane rozcieńczenie agarozy i wpłynie na proces polimeryzacji. Po nadmuchaniu tkanki płucnej i zżelowaniu agarozy na lodzie, płuca są cięte na odcinki o grubości od 200 do 300 μm. Konsystencja tkanki jest bardzo krytyczną kwestią. Jeśli tkanka jest zbyt miękka, krojenie równych odcinków jest trudne. Nawet jeśli dla każdego dawcy zostaną ustalone te same parametry mikrotomu, grubość plastrów między dawcami może się różnić ze względu na indywidualne warunki i zmiany podczas procesu napompowywania dla każdego płuca. Niejednorodne wypełnienie tkanki spowoduje różne grubości plastrów. Zamiast mierzyć i standaryzować grubość plastrów, pomiar całkowitej zawartości białka może być wykorzystany do pośredniego monitorowania grubości plastrów płuc. Kilka chorób w końcowym stadium utrudnia proces krojenia; Na przykład naczynia krwionośne są bardzo pogrubione w nadciśnieniu płucnym, a tkanka zwłóknieniowa może być tak sztywna, że cięcie cylindrów tkankowych jest prawie niemożliwe i konieczna jest bardzo częsta wymiana ostrza mikrotomu.

Po przygotowaniu ludzkich PCLS i intensywnych etapach mycia, które są niezbędne do usunięcia resztek komórkowych i uwolnionych enzymów, skrawki tkanek mogą być wykorzystane do eksperymentów²⁹. Ludzkie PCLS są hodowane w normalnych warunkach hodowli komórkowej i poddawane na przykład działaniu chemikaliów, leków lub lipopolisacharydów. Sporadyczne zakażenie PCLS spowodowane (nieznanymi) infekcjami stanowi szczególny problem w hodowli ludzkiego materiału płucnego. Posiewy tkankowe wykazujące zakażenia muszą zostać odrzucone, a sprzęt dokładnie zdezynfekowany. Przestrzenne oddzielenie miejsc laboratoryjnych wykorzystywanych do przygotowania z jednej strony, a hodowli z drugiej strony może pomóc w uniknięciu zakażeń krzyżowych. Jeśli chodzi o sprzęt, mikrotom może przeciekać, a poluzowane sześciokątne mogą prowadzić do uszkodzenia silnika i zatrzymania ruchu ostrza. Nie każda część krajalnicy jest wykonana ze stali nierdzewnej, więc utlenia się, jeśli nie zostanie wysuszona natychmiast po czyszczeniu. Aby przezwyciężyć problemy ze sprzętem, może być konieczne posiadanie co najmniej jednego urządzenia do tworzenia kopii zapasowych.

We wcześniejszych publikacjach informowano, że agaroza jest wypłukiwana i usuwana podczas intensywnych etapów mycia po przygotowaniu. W rzeczywistości nie jest to możliwe, agarozy nie można usunąć. W celu całkowitego usunięcia agarozy należy ją ponownie stopić w wysokich temperaturach, co zniszczyłoby tkankę. Agaroza w pęcherzykach płucnych i drogach oddechowych nie koliduje z opisanymi punktami końcowymi. Na inne punkty końcowe może mieć wpływ obecność agarozy (patrz także ograniczenia). Należy podkreślić potrzebę przygotowania bardzo świeżych skrawków tkanek, ponieważ żywotność tkanek jest krytyczną kwestią w hodowli. Zwężenie oskrzeli nie jest prawidłowym parametrem żywotności. Zalecamy stosowanie co najmniej dwóch lub trzech niezależnych testów cytotoksyczności w celu sprawdzenia żywotności otaczającego miąższu; Trzeba to sprawdzić w każdym eksperymencie³⁰. Kontrole jakości w testach cytotoksyczności służą jako wskaźniki niewystarczającej żywotności tkanek. Dlatego zaleca się ocenę reakcji tkanki, na przykład, na skuteczną substancję toksyczną, taką jak detergent, we wszystkich testach cytotoksyczności. Na podstawie krzywych dawka-odpowiedź należy określić minimalne i maksymalne wartości absorpcji dla testów cytotoksyczności i spełnić je dla kolejnych doświadczeń. Dalsze modyfikacje protokołu zależą głównie od zastosowanych substancji chemicznych i punktów końcowych będących przedmiotem zainteresowania. Możliwość zastosowania nierozpuszczalnych lub wysoce reaktywnych substancji chemicznych jest ograniczona. Najwyższe stężenie rozpuszczalnika dla DMSO jest ograniczone do 1%. Można stosować wyższe stężenia, ale może to powodować wyraźne uwalnianie cytokin prozapalnych, takich jak IL-8. Z drugiej strony, zastosowany bodziec może być stosunkowo słaby. W takim przypadku ilość tkanki można zwiększyć z dwóch do czterech plasterków na dołek. Takie podejście ogranicza żywotność do 24 godzin.

Głównym ograniczeniem PCLS u ludzi jest to, że w Niemczech można je przygotować tylko z chorego ludzkiego materiału płucnego. Pacjenci, którzy przechodzą operację, są zwykle w wieku powyżej 50 lat, a 80% pacjentów cierpiących na raka płuc jest lub było palaczami. Leki przyjmowane przez pacjentów, takie jak glikokortykosteroidy, mogą również wpływać na wynik eksperymentów z wykorzystaniem tkanki ludzkiej. Dlatego ważne jest, aby: i) zweryfikować każdy eksperyment za pomocą pozytywnych referencji weryfikujących żywotność, funkcjonalność i wrażliwość pojedynczej tkanki oraz ii) przeprowadzić walidację krzyżową wyników przy użyciu zdrowej, niechorej tkanki płucnej w średnim wieku od zwierząt laboratoryjnych (naczelnych innych niż ludzie, takich jak cynomolgus i, jeśli to możliwe, myszy, szczur, świnka morska). Im lepszy wynik patologii chorej tkanki, tym lepsze wyniki eksperymentalne. Silnie chora tkanka prawie nie nadaje się do wykorzystania i bardzo często wykazuje ograniczoną żywotność, nieodpowiednio niski lub bardzo wysoki poziom cytokin, infekcje bakteryjne lub grzybicze oraz mniejsze zwężenie oskrzeli. Zmienność między dawcami jest wyższa w porównaniu z wynikami uzyskanymi od zwierząt laboratoryjnych, co odzwierciedla indywidualną zmienność ludzi. Nie jest to jednak ograniczenie w ogóle; Jak wspomniano powyżej, w innych krajach (np. w USA) możliwe jest uzyskanie zdrowych płuc od zmarłych dawców narządów, którym odmówiono przeszczepienia. Reakcja tkanki została dobrze opisana przez pierwsze do 48 godzin w eksperymentach z ostrym narażeniem. Żywotność i funkcjonalność tkanki zmniejsza się po wielu dniach hodowli lub po przechowywaniu w temperaturze -80 °C. Możliwe jest hodowanie ludzkiej tkanki płucnej przez okres do około 14 dni. W tym czasie utrzymuje się rentowność; Obserwuje się jednak wzrost zmienności, a także utratę funkcjonalności kilku populacji komórek, takich jak makrofagi, w tkance, co skutkuje ograniczonym uwalnianiem cytokin w odpowiedzi na mitogeny. Innym ograniczeniem dla niektórych punktów końcowych jest obecność agarozy w tkance, utrudniająca na przykład wyizolowanie wysokiej jakości i wystarczających ilości RNA³¹ lub przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do późniejszej cytometrii przepływowej i fenotypowania komórek. Możliwość uzyskania mechanistycznego wglądu w reakcje i funkcjonalność pojedynczych komórek jest zatem ograniczona.

Uważa się, że organotypowe modele tkankowe, takie jak ludzki PCLS, mają duży wpływ na badania podstawowe i niekliniczne. Ludzki materiał płucny ma skład biologiczny, który ściśle odzwierciedla normalną architekturę narządów. Zawiera na przykład mieszkaniowe komórki nabłonka wyrostka zębodołowego i oskrzeli, komórki mięśni gładkich, fibroblasty, komórki śródbłonka, włókna nerwowe i makrofagi. Tkanka jest żywotna, a komórki reagują na kilka bodźców. Włókna nerwowe, choć przecięte, mogą być lokalnie aktywowane, co prowadzi do końcowych reakcji odruchowych¹⁴. W związku z tym ten model ex vivo oferuje możliwość badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych komórek, odpowiedzi obronnych, sygnalizacji cytokin i indukcji markerów powierzchniowych komórek. Kilka ulepszeń w technice, hodowli i walidacji punktów końcowych pozwala na wykorzystanie ludzkiego PCLS w naukach translacyjnych. Przykładami przyszłych podejść są: i) walidacja nowych celów w tkance płucnej człowieka, ii) ocena odpowiedzi immunologicznej po narażeniu, na przykład na chemikalia, leki, nanocząsteczki itp., iii) suplementacja tkanki płucnej komórkami odpornościowymi, takimi jak limfocyty T, iv) identyfikacja i modyfikacja wzorców molekularnych, na przykład po narażeniu na substancje uczulające drogi oddechowe, substancje wywołujące chorobę lub związki czynne hamujące szlaki; ponadto, v) przebudowa dróg oddechowych i vi) regulacja neuronów³². Dziedzina naukowa jest zainteresowana tymi obecnymi i przyszłymi podejściami do PCLS. Ponadto istnieje wiele różnych rozwiązań, które pomogą udoskonalić technikę PCLS, takich jak kriokonserwacja²⁰ i rozciąganie tkanek³³ w celu naśladowania naturalnego ruchu tkanki podczas oddychania lub wentylacji mechanicznej.

Główną zaletą ludzkiego PCLS w porównaniu z innymi modelami 3D jest obecność komórek odpornościowych i włókien nerwowych. Eksperymenty można również przeprowadzać na myszach, szczurach i naczelnych, które są gatunkami zwierząt, które są nadal najczęściej używane w farmakologii i toksykologii. Złożoność ludzkiej tkanki płucnej umożliwia przenoszenie wyników z badań zwierzęcych na ludzkie oraz z badań in vitro na in vivo. W kontekście istniejących alternatywnych testów do identyfikacji substancji działających uczulająco na drogi oddechowe, ludzkie PCLS są bardzo złożone i nie pozwalają na wgląd w reakcje pojedynczych komórek. Jednak mikroskopia i cytometria przepływowa mogą dostarczyć informacji o reakcjach komórkowych, jeśli odpowiedni marker komórkowy zostanie użyty w połączeniu, na przykład, z apoptozą, martwicą lub markerami wewnątrzkomórkowymi. Opublikowano testy, które zostały zatwierdzone i zgłoszono, że były stosowane do identyfikacji substancji działających uczulająco na drogi oddechowe. Jednak postępy w stosowaniu PCLS ze wszystkimi ich zaletami w porównaniu z testami jednokomórkowymi wnoszą cenny wkład w tym sensie, że technika ta może być stosowana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, jak opisali Watson i wsp.³⁴ Opracowali oni wysokoprzepustowy test przesiewowy do przewidywania toksyczności dróg oddechowych u mysich kriokonserwowanych PCLS. Dzięki zminiaturyzowanemu 96-dołkowemu formatowi PCLS wykryli podobne odczyty w płynie do płukania myszy, dzięki czemu PCLS jest wykonalnym testem o wysokiej przepustowości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wąż silikonowy 3,0 x 5,0 mm	A. Hartenstein (Lipsk, Niemcy)	SS04
Strzykawka	Faust Lab Science (Klettgau, Niemcy)	9.410 050
Narzędzia do	rdzeniowania na zamówienie
(FEATHER)	pfm medical ag  (Kolonia, Niemcy)
Ostrza do przycinania (FEATHER)	pfm medical ag  (Kolonia, Niemcy)	205500000
Mikrotom: Krajalnica do tkanek	Alabama R& D (Bad Homburg, Niemcy)	303400-ADPT	Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Ostrze mikrotomowe	Wilkinson Sword (Solingen, Niemcy)	ENR-4027800011506
Naczynia do hodowli tkankowych	Sigma (Mü nchen, Niemcy)	Z666246-420EA
Filtr siatkowy do komórek (100 &mikro; m Nylon)	Becton Dickinson (Heidelberg, Niemcy)	BD352360
Pętla inokulacyjna	Copan Diagnostics (Murrieta, USA)
TPP Płytki do hodowli tkankowych 24wells	Sigma (Mü nchen, Niemcy)	Z707791-126EA
Cassette	Thermo Scientific (Schwerte, Niemcy)	1000957
Nunc MaxiSorp płaskodenny	Fisher Scientific GmbH (Hanower, Niemcy)	44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well	Thermo Scientific (Schwerte, Niemcy)	260836
Mikroskop konfokalny	Zeiss (Jena, Niemcy)		Konfokalny LSM Meta 510
Oprogramowanie do renderowania obrazu	Bitplane AG (Zü rich, Szwajcaria)		IMARIS 7.6
LSM Image Browser	Zeiss (Jena, Niemcy)
Multiwell-Reader	Tecan Group Ltd. (Mä nnedorf, Szwajcaria)	Czytnik płytek	Tecan infinite F200Pro
Wytrząsarka do płytek	Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Niemcy)	KM-2 Akku
BenchMark ULTRA	Ventana Medical Systems (Tucson, USA)		Zautomatyzowany system barwienia szkiełek IHC/ISH
Testy
Odczynnik do proliferacji komórek WST-1	Roche (Bazylea, Szwajcaria)	11644807001
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności (LDH)	Roche (Bazylea, Szwajcaria)	11644793001
Mikroskopowe barwienie witalności	Invitrogen (Carlsbad, USA)	L-3224	ŻYWY/MARTWY Zestaw do oznaczania żywotności/cytotoksyczności BCA
	Thermo Scientific (Schwerte, Niemcy)	23225
Zestaw do oznaczania ELISA	R & Systemy D	różne, np. DY210 (TNF-α) lub DY200 (IL-1α)	Zestaw DuoSet
Odczynniki
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma (Mü nchen, Niemcy)	A9414-100G
Zrównoważone mieszaniny i roztwory soli, hodowla komórkowa, klasyczne podłoża i sole, Earle' s Sole zrównoważone (EBSS)	Sigma (Mü nchen, Niemcy)	E2888-500ML
Penicylina i streptomycyna	Lonza (Verviers, Belgia)	17-602E
Dulbecco´ s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s Średnia mieszanka składników odżywczych F-12 Szynka (DMEM F-12)	Gibco (Darmstadt, Niemcy)	11039-047	Pożywka
hodowlana Dulbecco´ s Fosforan z Ca i Mg (DPBS)	Lonza (Verviers, Belgia)	BE17-513F	Roztwór buforowy
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma (Mü nchen, Niemcy)	A9647-500G
Detergent	Sigma (Saint Louis, USA)	X100-100ML	Triton X-100
Bufor do prania	Merck (Darmstadt, Niemcy)	524653	0.05% Animacja 20 w PBS

Rękojeść ostrza do przycinania na zamówienie 205530001CD176S01