Method Article

Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

DOI:

10.3791/57044

⸱

January 31st, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego i analizy unaczynienia in vitro za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem open source, Analiza Kinetyczna Waskulogenezy. Protokół ten można zastosować do ilościowej oceny potencjału naczyniowego wielu typów komórek lub warunków eksperymentalnych, które modelują chorobę naczyniową.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Waskulogeneza to złożony proces, w którym śródbłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe ulegają tworzeniu naczyń de novo. Ilościowa ocena unaczynienia stała się centralnym odczytem funkcjonalności śródbłonkowych komórek progenitorowych, dlatego podjęto kilka prób ulepszenia modeli unaczynienia zarówno in vitro, jak i in vivo. Jednak standardowe metody mają ograniczony zakres, a pomiary statyczne nie są w stanie uchwycić wielu aspektów tego wysoce dynamicznego procesu. Dlatego celem opracowania tego nowatorskiego protokołu była ocena kinetyki waskulogenezy in vitro w celu ilościowego określenia tempa tworzenia i stabilizacji sieci, a także zapewnienia wglądu w potencjalne mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji naczyń krwionośnych. Zastosowanie tego protokołu wykazano na przykładzie komórek tworzących kolonie śródbłonka płodu (ECFC) narażonych na cukrzycę matki. Płodowe ECFC uzyskano z krwi pępowinowej pobranej po urodzeniu, wyhodowano i posiano w szkiełkach zawierających macierz błony podstawnej, gdzie uległy unaczynieniu. Obrazy całych studni szkiełka uzyskano za pomocą poklatkowej mikroskopii z kontrastem fazowym przez 15 godzin. Obrazy zostały przeanalizowane w celu uzyskania danych ilościowych za pomocą oprogramowania analitycznego o nazwie Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV). KAV wykorzystuje segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację do analizy komponentów sieci ze stosów obrazów kontrastu fazowego z wieloma punktami czasowymi w celu uzyskania dziesięciu parametrów (9 zmierzonych, 1 obliczony) struktury sieci, w tym: sieci zamknięte, obszary sieciowe, węzły, gałęzie, całkowita długość gałęzi, średnia długość gałęzi, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, struktury sieciowe i stosunek rozgałęzień do węzłów. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na zidentyfikowanie zmienionych wskaźników unaczynienia w ECFC uzyskanych z ciąż powikłanych cukrzycą. Technika ta ma jednak szerokie implikacje wykraczające poza zakres opisany w niniejszym dokumencie. Wdrożenie tego podejścia poprawi ocenę mechanistyczną i poprawi funkcjonalne odczyty waskulogenezy i innych biologicznie ważnych procesów rozgałęziania w wielu typach komórek lub stanach chorobowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórek progenitorowych śródbłonka do przechodzenia waskulogenezy, czyli tworzenia naczyń de novo, jest kluczowa w tworzeniu embrionalnej unaczynienia podczas rozwoju1. Dodatkowo, dalsze tworzenie naczyń krwionośnych i dojrzewanie wcześniej istniejących naczyń, które jest znane jako angiogeneza, jest również kluczowym procesem w rozwoju i życiu poporodowym, aby utrzymać przepływ krwi i homeostazę w całym ciele2. Każdy narząd w ciele jest zależny od układu naczyniowego w zakresie dostarczania tlenu i składników odżywczych oraz usuwania odpadów3. Jeśli homeostaza naczyń krwionośnych nie jest zachowana, tak że tworzenie i naprawa naczyń krwionośnych jest albo niewystarczająca, albo w nadmiarze, mogą wystąpić choroby naczyniowe4. Dlatego tworzenie i adaptacja naczyń krwionośnych są powszechnie badane, ponieważ są niezbędne w utrzymaniu zdrowia narządów i biorą udział w rozwoju wielu stanów patologicznych.

Ze względu na zwiększone zrozumienie udziału układu naczyniowego w rozwoju, jak również w manifestacji i progresji choroby, opracowano testy do modelowania waskulogenezy i angiogenezy in vitro i in vivo5,6,7. Modelowanie tworzenia naczyń polega na posiewaniu komórek naczyniowych, takich jak komórki śródbłonka, w macierzy błony podstawnej, która wspomaga organizację komórek i tworzenie sieci naczyń8,9,10. Zazwyczaj, po całonocnej inkubacji, obrazy sieci komórkowych są przechwytywane w jednym punkcie czasowym, co skutkuje niewielką liczbą obrazów do analizy11,12,13. W związku z tym podejścia analityczne zostały w dużej mierze opracowane i zoptymalizowane pod kątem ocen pojedynczych punktów czasowych10,14. Jednak analizy statyczne są po prostu niewystarczające do uchwycenia dynamicznego procesu formowania się naczyń i dostarczają ograniczonego wglądu w potencjalne mechanizmy związane z tym procesem. Chociaż zwiększenie częstotliwości obrazowania prawdopodobnie dostarczyłoby danych niezbędnych do identyfikacji kinetyki formacji, zastosowanie wcześniej opracowanych analiz do podejścia do obrazowania wielu punktów czasowych byłoby nieefektywne i pracochłonne14. Dodatkowo, pomimo rozwoju komercyjnie dostępnych analiz, opłata za obraz sprawia, że opcja ta jest zbyt kosztowna w przypadku badań kinetycznych, w których generowane są tysiące obrazów15. W związku z tym w tej dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na usprawnione i wydajne podejście do wychwytywania i ilościowego określania unaczynienia in vitro, w tym możliwość analizy dużych zestawów obrazów generowanych przez poklatkową mikroskopię żywych komórek.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano nowe podejście, którego celem było rozszerzenie obrazowania pojedynczego punktu czasowego, aby umożliwić dynamiczną ocenę waskulogenezy za pomocą obrazów pozyskiwanych co 15 minut16. Dzięki uchwyceniu wielu punktów czasowych w ciągu kilku godzin, podejście to zapewnia bardziej szczegółowy obraz procesu waskulogenezy, a także wgląd w potencjalne mechanizmy przyczyniające się do tworzenia i utrzymywania sieci naczyń krwionośnych. Oprócz poprawy częstotliwości i jakości pozyskiwania obrazów, podejście to obejmuje nowatorskie oprogramowanie w postaci wtyczki typu plug-in17. Oprogramowanie, określane jako Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV), jest usprawnioną aplikacją, która obejmuje przetwarzanie i analizę obrazów specjalnie dla dużych zestawów obrazów generowanych z akwizycji wielu punktów czasowych. KAV analizuje obrazy kontrastu fazowego poprzez segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację18. Dziesięć parametrów struktury sieci jest określanych ilościowo przez KAV, w tym: rozgałęzienia, sieci zamknięte, węzły, obszary sieci, struktury sieciowe, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, całkowita długość rozgałęzienia, średnia długość gałęzi i stosunek gałęzi do węzłów (patrz schemat w Rysunek 1)16. Zastosowanie podejścia KAV obejmuje nowy, obliczony fenotyp waskulogenezy in vitro, określany jako stosunek gałęzi do węzłów. Nasze ostatnie prace wykazały, że stosunek ten wskazuje na łączność sieciową i może być związany z innymi procesami komórkowymi zaangażowanymi w tworzenie sieci, takimi jak motility16.

Chociaż waskulogeneza komórek tworzących kolonię śródbłonka płodu (ECFC) została oceniona w tych badaniach, to podejście do pozyskiwania i analizy obrazów może być łatwo zastosowane do oceny dowolnych typów komórek, które przechodzą waskulogenezę lub angiogenezę. Ponadto podejście to można wykorzystać do identyfikacji zmienionej funkcji naczyń krwionośnych wynikających z różnych stanów patologicznych, takich jak cukrzyca ciążowa, jak wykazano w tych badaniach. Co więcej, metodę tę można zaadaptować do oceny tworzenia i rozgałęziania się sieci, które są ważne dla innych procesów istotnych z biologicznego punktu widzenia. W związku z tym potencjalny wpływ zastosowania tego nowatorskiego podejścia do unikalnych systemów biologicznych nie został jeszcze określony.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

  1. Hodowla komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC)
    UWAGA: Próbki ecfc płodu użyte w tych eksperymentach zostały wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej i wyhodowane przez Angio BioCore (ABC) w Indiana University School of Medicine, jak wcześniej opisano6. Rutynowe fenotypowanie kontroli jakości przeprowadzono w obrębie ABC w celu potwierdzenia ekspresji antygenów śródbłonka zgodnie z wcześniejszym opisem19,20,21. Próbki użyte w eksperymentach były pasażowane minimalnie (2-3 razy). Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową przeprowadzono w kapturze do hodowli tkankowej. Wszystkie odczynniki, w tym płytki do hodowli tkankowych i roztwory, były sterylne.
    1. Dwa dni przed eksperymentem pokryj okrągłe płytki do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm 6 ml kolagenu typu 1 o stężeniu 0,05 mg/ml i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Kolagen typu 1 rozcieńcza się w podwójnie destylowanej wodzie zawierającej 20 nM kwas octowy do stężenia roboczego 0,05 mg/ml.
    2. Dzień przed eksperymentem trypsynizuj i ponownie plateruj ECFC na płytkach pokrytych kolagenem typu 1 w 1.1.1. (Patrz uwaga pod pkt 1.1).
    3. Aby wytrypsynizować ECFC, odessać pożywkę z posianych komórek i przemyć 7 ml PBS. Odessać PBS, a następnie dodać 2-3 ml 0,5% trypsyny i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Bezpośrednio po inkubacji z trypsyną dodać 3 ml EGM2 i pipetować w górę iw dół, aby usunąć wszystkie przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Odwirować wszystkie próbki o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1-2 ml EGM2. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i usunąć małą porcję (20-40 μl) do liczenia.
    7. Dodać równe części błękitu trypanowego do podwielokrotności komórki i odpipetować 10 μl do hemocytometru. Policz liczbę komórek w czterech podstawowych kwadrantach hemocytometru.
      UWAGA: Użyj obu stron hemocytometru do wszystkich zliczeń próbek, aby zwiększyć dokładność.
    8. Płytki do hodowli tkankowych pokrytych kolagenem, które zostały przygotowane w kroku 1.1.1, należy przemyć dwukrotnie 7 ml PBS. Po zaaspirowaniu drugiego przemywania PBS dodać do płytek 10 ml pożywki hodowlanej śródbłonka 2 (EGM2) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą do płytek.
    9. Korzystając z liczby komórek uzyskanej w kroku 1.1.7, oblicz objętość zawiesiny komórek wymaganą do pokrycia 4 x 105 komórek. Umieścić 4 x 105 ECFC na płytkach do hodowli tkankowych przygotowanych w kroku 1.1.8 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2) przez noc.
  2. Przed eksperymentem należy przechowywać zapasy w temperaturze 4 °C przez noc
    1. Przechowuj metalową płytkę o wymiarach 3 x 2 cale, szkiełko (przechowywać w opakowaniu do momentu otwarcia w kapturze), pudełko sterylnych końcówek o pojemności 20 mikrolitrów (μl) i matrycę (matrycę) membrany podstawnej.
      UWAGA: Matryca jest przechowywana w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania; zawsze rozmrażaj go w temperaturze 4 °C przez noc lub przez kilka godzin przed użyciem.
  3. Upewnij się, że na dyskach twardych komputera jest wystarczająca ilość miejsca na obrazy.
    UWAGA: Korzystając z konfiguracji opisanej w tym protokole, wymagane było około 60 gigabajtów (GB) miejsca na eksperyment (4 GB/studnię). Jednak szacunki dotyczące miejsca są oparte na konfiguracji sprzętowej i będą musiały zostać określone dla każdego systemu.

2. Protokół 1: Konfiguracja eksperymentalna: Przygotowanie slajdu

  1. Zbierz i przygotuj zapasy
    1. W dniu eksperymentu zbierz zapasy do powlekania komórek na szkiełku, w tym wiadro z lodem, mały pojemnik z suchym lodem, nożyczki i pipetę o pojemności 20 μl. Spryskaj wszystkie przedmioty 70% etanolem, wytrzyj do sucha ręcznikami papierowymi i umieść przedmioty w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
    2. Zbierz wszystkie zapasy przechowywane w temperaturze 4 °C (patrz krok 1.2), w tym metalową płytkę, pudełko z końcówkami, szkiełko i matrycę. Spryskaj pudełko z końcówkami 70% etanolem i umieść pudełko w pojemniku z suchym lodem.
      UWAGA: Wyjmuj matrycę z lodówki o temperaturze 4 °C tylko wtedy, gdy jest gotowa do użycia i zawsze trzymaj matrycę na lodzie.
    3. Spryskaj metalową płytkę 70% etanolem i zanurz ją w lodzie w pojemniku na lód. Otwórz opakowanie zawierające szkiełko i umieść szkiełko na metalowej płycie, aby było zimne.
  2. Załaduj matrycę na slajd
    1. Ustaw pipetę na 10 μl i wyjmij końcówkę z pudełka z zimną końcówką wraz z pipetą. Odetnij nożyczkami około 1 cm od końca końcówki.
      UWAGA: Wytnij prostopadle do końcówki, aby zredukować pęcherzyki w matrycy. Objętość pipety można ustawić na nieco większą niż 10 μl, aby uwzględnić przyklejanie się matrycy do wnętrza końcówki.
    2. Powoli wciągnij matrycę do końcówki pipety. Natychmiast umieść końcówkę pipety na środku studzienki. Delikatnie przyłóż końcówkę pipety do dna studzienki i powoli wypchnij matrycę.
      UWAGA: Nie należy przesadnie pipetować, ponieważ spowoduje to tworzenie się pęcherzyków. Jeśli utworzy się bąbel, natychmiast przebij go za pomocą małej końcówki.
    3. Zjeżdżalnia zawiera 15 pojedynczych studzienek. Powtórz poprzedni krok dla każdej studzienki. Użyj nowej końcówki pipety do każdego dołka, aby zachować spójność i zmniejszyć krzepnięcie matrycy wewnątrz końcówki.
    4. Po załadowaniu szkiełka wszystkimi studzienkami zawierającymi matrycę, należy wsunąć pokrywkę do końca na szkiełko i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aż matryca zastygnie.
      UWAGA: Nie pozwól, aby matryca wyschła. Dodać niewielką objętość (2-3 ml) PBS do nakrętki stożkowej probówki o pojemności 50 ml w pobliżu szkiełka w inkubatorze, aby zmniejszyć ryzyko wysuszenia matrycy.

3. Protokół 2: Powlekanie ECFC na matrycy

  1. Usunąć przylegające ECFC z płytek do hodowli tkankowych i zebrać w zawiesinie
    1. Pobrać płytki do hodowli tkankowych zawierające ECFC posiane poprzedniego dnia (patrz sekcja 1.1.9). Odessać pożywkę EGM2 i przemyć przylegające ECFC raz 7 ml PBS.
    2. Odessać PBS, dodać 2-3 ml trypsyny i inkubować przylegające komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Bezpośrednio po inkubacji dodać 3 ml EGM2 i pipetować w górę iw dół, aby usunąć wszystkie przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Czynności 3.1.1–3.1.3 należy powtarzać dla pozostałych trzech próbek ECFC, aż do momentu, gdy wszystkie cztery próbki komórkowe zostaną pobrane w zawiesinie.
  2. Przygotowanie miksów wzorcowych
    1. Odwirować wszystkie próbki o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1-2 ml EGM2.
    3. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i usunąć małą porcję (20-40 μl) do liczenia.
    4. Dodać równe części błękitu trypanowego do podwielokrotności komórki i odpipetować 10 μl do hemocytometru. Policz liczbę komórek w czterech podstawowych kwadrantach hemocytometru.
      UWAGA: Użyj obu stron hemocytometru do wszystkich zliczeń próbek, aby zwiększyć dokładność.
    5. Korzystając z powyższej liczby komórek, oblicz objętość każdej próbki komórki, która zawiera 1.4x104 komórki. Dokładnie wymieszać wszystkie zawiesiny komórek i podwielokrotność1,4 x 10 4 komórek do świeżej probówki, aby przygotować mieszankę wzorcową dla każdego warunku doświadczalnego. Dodać pożywkę EGM2 tak, aby końcowa objętość każdej mieszanki wzorcowej wynosiła 175 μl.
    6. Wymieszać każdą mieszankę wzorcową delikatnie pipetując i rozdzielić 50 μl mieszanki wzorcowej do indywidualnych studzienek na szkiełku.
      UWAGA: Wszystkie próbki są powlekane w trzech egzemplarzach, z mieszankami wzorcowymi obliczonymi dla 3,5 dołka, aby zapewnić wystarczającą objętość dla 3 dołków.
  3. Inkubacja szkiełka
    1. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C do momentu, gdy będzie można je przenieść do komory mikroskopu w celu obrazowania.
      UWAGA: Czas między posiewem a obrazowaniem powinien być jak najkrótszy, aby ograniczyć utratę danych we wczesnych stadiach waskulogenezy.

4. Protokół 3: Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu

UWAGA: W naszych badaniach, Protokoły 2 i 3 były prowadzone jednocześnie przez różne osoby. Jeżeli Protokoły 2 i 3 muszą być wypełnione przez tę samą osobę, Kroki 4.1 i 4.2 Protokołu 3 poniżej powinny zostać zakończone przed wszczęciem Protokołu 2 powyżej.

  1. Włącz mikroskop i komputer
    1. Na około jedną do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu włącz i podgrzej inkubator stage top do 37 °C, ustaw CO2 na 5% i ustaw wilgotność na 85%. Napełnij zbiornik wilgotności inkubatora, jeśli jest pusty.
    2. Umieść pustą szkiełko komorowe w jednej z dwóch otwartych pozycji i napełnij wodą destylowaną. Zabezpiecz termometr ze sprzężeniem zwrotnym do kontroli temperatury w komorze, jeśli jest dostępny.
      UWAGA: Jeśli termometr ze sprzężeniem zwrotnym jest dostępny, użyj tej "temperatury inkubatora", aby sprawdzić, czy komora jest zrównoważona.
    3. Włącz dmuchawę wtórną ustawioną na 39-42 °C, aby podgrzać szkiełka od dołu i zminimalizować kondensację.
    4. Dodaj drugi slajd jako pusty do momentu, gdy będzie można dodać slajd eksperymentalny. Ten slajd służy jako symbol zastępczy lokalizacji do konfiguracji ustawień akwizycji obrazu dla poszczególnych studzienek podczas instalacji.
    5. Dodaj wodę do zbiornika otaczającego studnie na drugim slajdzie, aby naśladować warunki panujące podczas eksperymentu z obrazowaniem. Woda otaczająca studnie umożliwia ocenę wilgotności podczas ustawiania mikroskopu i podgrzewania.
      UWAGA: Wstępna równowaga inkubatora i dmuchawy wtórnej ma kluczowe znaczenie dla utrzymania stabilnego środowiska hodowli. Większość sterowników komór z komórkami na żywo zapewnia informacje zwrotne w czasie rzeczywistym o temperaturze, CO2 i wilgotności w celu oceny gotowości systemu. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić, czy na szkiełku nie nagromadziła się wilgoć i nie doszło do nadmiernego wysuszenia zbiornika napełnionego w ppkt 4.1.5. Wilgotność może wymagać regulacji, jeśli w komorze występuje nadmierne wysuszenie lub kondensacja. Aby zwiększyć wilgotność, dodaj chusteczki zwilżone wodą destylowaną. Aby zmniejszyć kondensację, należy albo zmniejszyć ustawienie wilgotności zgodnie z regulacją w 4.1.1, albo, ponieważ kondensacja może być oznaką niskiej temperatury, sprawdzić ustawienia temperatury komory i położenie dmuchawy wtórnej.
  2. Skonfiguruj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu podczas równoważenia.
    UWAGA: Akwizycja obrazu jest konfigurowana za pomocą oprogramowania, które steruje sceną, migawką i kamerą. Wielowymiarowe narzędzie do konfiguracji to najprostszy sposób na skonfigurowanie oprogramowania. Co więcej, oprogramowanie będzie musiało mieć procedury autofokusa, aby zapewnić kontrolę ostrości przez cały czas trwania eksperymentu.
    1. Użyj oprogramowania, aby ustawić wiele pozycji stopni dla każdej studni. W przypadku tego protokołu wybierz środek studni.
    2. Skonfiguruj akwizycję obrazu w taki sposób, aby w każdej pozycji etapu obrazowana była cała studnia. Na przykład użyj skanowania kafelków z 10-20% nakładaniem się obrazu i około 5 x 5 polami, w zależności od kamery i końcowego powiększenia.
    3. Skonfiguruj upływ czasu dla obrazowania co 15 minut.
      UWAGA: Korzystając z konfiguracji opisanej w tym protokole, wszystkie 15 dołków szkiełka jest obrazowanych w odstępie 15 minut.
  3. Załaduj slajd eksperymentalny
    1. Po wyrównaniu komory inkubatora zastąpić ślepy szkiełko szkiełkiem doświadczalnym.
      UWAGA: Zrównoważona komora będzie miała stabilną temperaturę, CO2 i wilgotność przez co najmniej 20 minut. Gdy szkiełko doświadczalne jest gotowe, konieczne jest szybkie wykonanie kroków, aby zminimalizować "martwy czas" między posiewem a początkowym punktem czasowym uchwyconym przez mikroskop. Ponadto, aby ułatwić porównywanie eksperymentów obrazowych, czas ten powinien być spójny. W tych eksperymentach wykonanie wszystkich kroków opisanych w Protokole 3 Sekcja 4.3 wymagało około 30 minut.
    2. Zdejmij pokrywę suwaka i dodaj wodę do zbiornika otaczającego studzienki na zjeżdżalni.
      UWAGA: Pokrywka jest zdejmowana na czas eksperymentu obrazowego.
  4. Konfigurowanie końcowych ustawień akwizycji obrazu
    1. Umieść obiektyw CFI Plan Fluor DL 10X w odpowiedniej pozycji i wybierz pierścień fazowy Ph1 na kondensatorze. Po ustawieniu ostrości na pierwszym dołku wyreguluj diaskopijną ścieżkę światła dla oświetlenia Köhlera i skonfiguruj optykę fazową, sprawdzając wyrównanie pierścienia fazowego w kondensatorze z maską fazową obiektywu.
    2. Skonfiguruj czas naświetlania i dostosuj intensywność lampy do kontrastu fazowego, który zwykle wynosi mniej niż 500 ms.
    3. Przejdź przez każdą pozycję stage ustawioną w 4.2.1 i potwierdź, że środek studni jest wybrany, i wyreguluj go, jeśli to konieczne.
    4. W każdej pozycji etapu skup się na komórkach posianych w studzience i ustaw pozycję z pozycji stołu montażowego używaną do obrazowania w oprogramowaniu.
    5. Przetestuj mechanizm autofokusa w mikroskopie. Jeśli autofokus jest oparty na sprzęcie, upewnij się, że jest włączony i prawidłowo ustawiony dla wszystkich pozycji stage.
      UWAGA: Ponieważ próbka i stolik mogą dryfować pionowo podczas eksperymentu, ważne jest, aby oprogramowanie sprawdzało autofokus w każdej pozycji stage i w każdym punkcie czasowym, aby zapewnić wiarygodne obrazowanie w trakcie trwania eksperymentu. Jeśli to możliwe, jako punkt wyjścia dla kolejnej procedury autofokusa należy użyć pozycji autofokusa określonej w poprzednim punkcie czasu. W ten sposób można łatwo dostosować ciągły dryf
      6. .
    6. Zmniejsz lub zgaś światła w pomieszczeniu mikroskopu i rozpocznij eksperyment z obrazowaniem.

5. Protokół 4: Przetwarzanie obrazów i analiza kinetyczna waskulogenezy (KAV)

  1. Zapisuj obrazy z poszczególnych punktów czasowych jako stos obrazów dla każdego dołka
    UWAGA: Większość programów do przechwytywania obrazów może eksportować wielostronicowe pliki TIFF (stosy) szeregów czasowych. KAV jest przeznaczony do pracy z zestawami danych, które mogą zawierać wiele punktów czasowych. W ten sposób analiza odbywa się na całym stosie obrazów dla danej pozycji etapu. W razie potrzeby oprogramowanie do przetwarzania obrazów może importować pojedyncze obrazy z każdego punktu czasowego w celu zrekonstruowania stosu obrazów.
  2. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu na komputerze
  3. Dodaj KAV do oprogramowania do przetwarzania obrazu
    1. Przeciągnij plik KAV z folderu na szary pasek u dołu okna oprogramowania. Kliknij "Zapisz", aby dodać oprogramowanie do listy.
  4. Otwieranie stosu obrazów, który ma zostać przeanalizowany
    1. Kliknij "Plik", a następnie "Otwórz" w menu rozwijanym w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przeciągnij plik obrazu na szary pasek, jak w kroku 5.3.1.
    2. Konwertuj obrazy na 8-bitowe, klikając "Obraz", "Typ", "8-bitowy".
  5. Tworzenie obszaru zainteresowania (ROI)
    1. Otwórz Menedżera ROI, klikając "Analizuj" na pasku narzędzi. Następnie wybierz "Narzędzia", a następnie "Menedżer ROI".
    2. Utwórz nowy zwrot z inwestycji, klikając narzędzia wyboru okręgu lub prostokąta na pasku narzędzi i rysując żądany obszar zaznaczenia na obrazie. Kliknij "Dodaj" w oknie menedżera ROI, aby zapisać ten kształt.
      UWAGA: Wcześniej utworzony ROI można otworzyć, przeciągając zapisane ROI (spakowany folder) na pasek "Przeciągnij i upuść", aby otworzyć go w Menedżerze.
    3. Kliknij etykietę ROI wymienioną w Menedżerze ROI, aby wyświetlić ją na image.
      UWAGA: Jeśli ROI nie pojawi się na obrazie, utwórz drugi ROI (dowolny rozmiar/kształt) i dodaj go do menedżera. Gdy oba ROI pojawią się na liście, klikaj tam iz powrotem między nimi, a żądany ROI pojawi się na obrazie.
    4. W razie potrzeby wyrównaj zwrot z inwestycji. Gdy zwrot z inwestycji znajdzie się na obrazie w żądanym miejscu, przejdź do Menu i kliknij "Edytuj", a następnie "Wyczyść na zewnątrz". Spowoduje to usunięcie danych obrazu poza ROI (przydatne w przypadku kształtów innych niż prostokątne) dla każdego obrazu w stosie.
      UWAGA: Możesz także kliknąć "Obraz" i "Przytnij", jeśli używasz prostokątnego ROI.
  6. Uruchamianie oprogramowania KAV
    1. Kliknij "Wtyczki" na pasku menu.
    2. Wybierz wtyczkę "Analizuj sieć". Spowoduje to otwarcie okna z opcjami zmiany ustawień we wtyczce.
    3. Zmień metodę progowania za pomocą strzałki listy rozwijanej.
    4. Po wybraniu wszystkich odpowiednich ustawień kliknij "OK", aby rozpocząć przetwarzanie oprogramowania.
      UWAGA: Odpowiednie ustawienia są określane poprzez wizualizację odwzorowań szkieletu i maski generowanych przez KAV, które wskazują na dokładność oprogramowania do identyfikacji i rozróżniania komórek i sieci od tła na obrazie kontrastu fazowego.
  7. Zapisywanie danych wygenerowanych w formacie KAV
    1. Gdy wtyczka zakończy analizę, na ekranie pojawią się dwa okna, w tym tabela danych z wartościami liczbowymi i stos połączonych obrazów przedstawiających odwzorowania szkieletu i maski.
    2. Zapisz wartości liczbowe, przechodząc do lewego górnego rogu tabeli danych i klikając "Edytuj", a następnie "Kopiuj" lub "Wytnij", aby wkleić wartości do arkusza kalkulacyjnego Excel.
    3. Kliknij na połączony obraz szkieletu i maski. Zapisz połączony stos obrazów szkieletu/maski jako plik TIFF (Tagged Image File Format), klikając "Plik", "Zapisz jako", "TIFF".
    4. Zapisz przycięty stos obrazów z kontrastem fazowym (utworzony przy użyciu ROI), klikając "Plik", "Zapisz jako", "TIFF".
    5. Kliknij okno Menedżer ROI i wybierz ROI używany do przycinania obrazów. Kliknij "Więcej", a następnie "Zapisz", aby zapisać zwrot z inwestycji do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: Użycie tego samego zwrotu z inwestycji pomoże zachować spójność między analizami.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAV tworzy wizualne reprezentacje struktury sieci
Kontrast między ECFC a tłem matrycy na obrazach kontrastu fazowego umożliwia KAV identyfikację struktur specyficznych dla komórki. Sieci ECFC zidentyfikowane przez KAV są przedstawione obrazowo jako odwzorowania szkieletu i maski w celu zilustrowania struktur używanych przez oprogramowanie do kwantyfikacji (Rysunek 2A). Co ważne, jakościowa ocena odwzorowań szkieletu i maski umożliwia szybką identyfikację czułości i dokładności KAV, co może być przydatne w określaniu optymalnych ustawień progowych i interpretacji wyników analizy. Gdy jakość obrazów kontrastu fazowego jest wysoka i osiągany jest wystarczający kontrast, KAV dokładnie identyfikuje sieci ECFC, na co wskazuje podobieństwo między obrazem kontrastu fazowego a wersjami szkieletu i maski generowanymi przez KAV (Rysunek 2A i Wideo 1).

Alternatywnie, jeśli obrazy kontrastu fazowego nie mają wysokiego kontrastu i/lub występują artefakty obrazowania, takie jak siatka, dokładność wykrywania sieci jest zmniejszona, a wyniki stają się niejednoznaczne (Rysunek 2B). Dodatkowo, tworzenie się pęcherzyków powietrza w pożywkach komórkowych może również zaciemniać dokładność wykrywania (Rysunek 2). Jednak problemy z jakością obrazu często można przezwyciężyć poprzez wybór różnych metod progowania zawartych w oprogramowaniu KAV. Na przykład obraz kontrastu fazowego w Rysunek 2B został przeanalizowany przy użyciu identycznych ustawień przetwarzania obrazu, z wyjątkiem metody progowania. Z wersji Szkieletu i Maski wynika, że progowanie Otsu skutkowało dokładniejszym wykrywaniem sieci ECFC pokazanych na obrazie kontrastu fazowego (Rysunek 2B). Dlatego jakość obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i znaczących wyników w tym teście. Jednak różne metody progowania zawarte w interfejsie użytkownika KAV umożliwiają dostosowanie analizy obrazu w oparciu o jakość obrazów wejściowych.

Mikroskopia poklatkowa identyfikuje jakościowe i ilościowe różnice w unaczynieniu ECFC po wewnątrzmacicznym narażeniu na cukrzycę ciążową
Ostatnio podejście analityczne KAV zastosowano do oceny funkcji ECFC płodu po ekspozycji na cukrzycę typu 2 (T2DM) u matki w macicy16. Za pomocą KAV zidentyfikowano zmienioną kinetykę unaczynienia u płodowych ECFC narażonych na cukrzycę typu 2. Jednak oprócz ekspozycji na cukrzycę typu 2, która występuje przez cały okres ciąży, cukrzyca ciążowa (GDM), czyli rozwój nietolerancji glukozy zwykle w trzecim trymestrze ciąży, również upośledza funkcję ECFC13. W związku z tym KAV zastosowano w celu określenia, czy ECFC narażone na GDM wykazują również zmienioną kinetykę tworzenia sieci ECFC. Faza 1 (0-5 godzin) i faza 2 (5+ h) oceniano za pomocą mikroskopii poklatkowej sprzężonej z analizą KAV (Rysunek 3). Reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym uzyskane na początku akwizycji obrazu (0,50 h) i w całym czasie (5,00 i 10,00 h) przedstawiają tworzenie się sieci ECFC w czterech próbkach badanych z jednego dnia eksperymentalnego (Rysunek 3 i Wideo 1). Pomimo równoważnego obciążenia komórek, co zaobserwowano na obrazach kontrastu fazowego po 0,50 godziny, różnice jakościowe w strukturze sieci są widoczne w punktach czasowych 5,00 i 10,00. ECFC z niepowikłanej ciąży (UC) tworzą złożoną i skomplikowaną sieć 5 godzin po posiewie, podobnie jak w naszych poprzednio opublikowanych danych16. I odwrotnie, ECFC z próbki GDM 1 (GDM1) tworzą bardzo niewiele struktur sieciowych, które nie są ze sobą połączone. Wzorzec ten nie znajduje jednak odzwierciedlenia we wszystkich próbkach ECFC uzyskanych z ciąż w ciąży z cukrzycą ciążową, co wskazuje na niejednorodność między próbkami. Próbki GDM2 i GDM3 wykazują większe tworzenie sieci w porównaniu z GDM1, chociaż wzorce połączeń wydają się zmienione w porównaniu z próbką UC. Co ważne, KAV mierzy kilka elementów strukturalnych sieci ECFC, aby zidentyfikować zarówno oczywiste, jak i subtelne fenotypy.

Oprócz generowania szkieletowych i maskujących wersji struktury sieci, KAV określa ilościowo dziesięć wskaźników struktury sieci, w tym liczbę indywidualnych struktur sieciowych, węzłów, węzłów potrójnie rozgałęzionych, węzłów czterorozgałęzionych, rozgałęzień, całkowitej długości gałęzi, średniej długości gałęzi, stosunku gałęzi do węzłów, całkowitej liczby zamkniętych sieci i obszaru sieci16. KAV kompiluje dane dla każdej próbki w jedną tabelę wartości dla wszystkich obrazów przebiegu czasu. Tabela 1 zawiera reprezentatywne dane surowe z jednego badania obrazowego dla jednej próbki ECFC. Parametry struktury sieci mierzone za pomocą KAV są uporządkowane w kolumny, a dane dla obrazów sekwencyjnych uzyskanych w czasie są uporządkowane w wierszach. Na przykład w naszych badaniach obraz 1 uzyskano 30 minut po poszyciu, a kolejne obrazy były zbierane co 15 minut. Surowe wartości generowane przez KAV mogą być następnie przedstawiane na wykresach lub dalej analizowane przy użyciu bardziej złożonych podejść statystycznych16.

Pięć wykresów przedstawiających średnie wartości struktury sieci z trzech oddzielnych eksperymentów pokazano dla pojedynczej nieskomplikowanej próbki (UC) i trzech próbek GDM (Rysunek 4). Próbka UC w tych eksperymentach działała podobnie do wcześniej analizowanych próbek UC 16. Wcześniej stwierdzono, że unaczynienie ECFC in vitro jest dwufazowe, składa się z fazy 1 (0 - 5 godzin) i fazy 2 (5 - 10 godzin)16. Wzorzec ten jest spójny w obecnych badaniach, o czym świadczy wykres przedstawiający dane sieci zamkniętej (Rysunek 4). Próbka UC utworzyła większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu ze wszystkimi trzema próbkami GDM. Co ciekawe, trzy z czterech próbek wydają się mieć podobny czas do maksymalnej liczby zamkniętych sieci, który występuje między 2,5 a 3 godzinami. Jednak próbka GDM2 była wolniejsza w osiąganiu maksymalnych zamkniętych sieci, co nastąpiło 5 godzin po posiewze. I pomimo tego, że próbka GDM2 tworzy mniej maksymalnych sieci w porównaniu z próbką UC, sieci, które tworzy, były utrzymywane podobnie jak próbka UC w czasie. I odwrotnie, GDM1 i GDM3, które utworzyły mniej sieci w porównaniu z próbką UC, również wykazywały ogólne zmniejszenie liczby sieci w czasie. Ogólnie rzecz biorąc, z wykresu przedstawiającego liczbę sieci zamkniętych wynika, że wszystkie próbki ECFC wykazywały dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, jednak tempo powstawania i maksymalna liczba osiągniętych sieci różnią się w zależności od próby.

Obszar sieci reprezentuje średni obszar w zamkniętych sieciach utworzonych przez ECFC. W związku z tym im większy numer sieci zamkniętej, tym mniejsze obszary sieci. Wzorzec ten znajduje odzwierciedlenie w wykresach obszarów sieci, gdzie próbka UC, która utworzyła większą liczbę sieci zamkniętych, miała mniejsze obszary sieci w czasie w porównaniu z trzema próbkami GDM (Rysunek 4). GDM2, który wolniej osiągał maksymalne zamknięte sieci, początkowo wykazywał dużą powierzchnię sieci, jednak obszar ten ustabilizował się z czasem, a było to najbardziej zbliżone do próbki UC po 15 godzinach. Z biegiem czasu średnia powierzchnia sieci we wszystkich próbkach zwiększyła się z powodu destabilizacji sieci. Jednak niektóre próbki, takie jak GDM1 i GDM3, wykazywały szybszy wzrost powierzchni sieci, co prawdopodobnie wskazuje na zmniejszoną stabilność w porównaniu z innymi próbkami wykazującymi bardziej stopniowy wzrost.

ECFC narażone na GDM wykazują zmniejszoną stabilność sieci
Stosunek gałęzi do węzłów jest nowym fenotypem obliczonym przez KAV i zidentyfikowanym w naszych poprzednich badaniach, co wskazuje na łączność sieciową16. W obecnym badaniu próba UC miała niski stosunek, co oznaczało wysoki poziom łączności sieciowej, który utrzymywał się w czasie (Rysunek 4). I odwrotnie, trzy próbki GDM miały wyższy stosunek rozgałęzień do węzłów, szczególnie w fazie 2 tworzenia sieci. Obserwacja ta wskazuje na zmniejszoną łączność i destabilizację struktur sieciowych.

Ogólnie rzecz biorąc, GDM1 utworzył mniej węzłów i rozgałęzień w porównaniu z innymi próbkami, przy czym redukcja utrzymała się w trakcie eksperymentu. GDM2 i GDM3 utworzyły i utrzymywały większą liczbę rozgałęzień w porównaniu z próbką UC, zwłaszcza w okresie 5-15 godzin. Liczba węzłów wykrytych w sieciach GDM2 i GDM3 była bardziej zbliżona do liczby węzłów w próbie UC, zwłaszcza w okresie 10-15 godzin. Większa liczba rozgałęzień, ale podobna liczba węzłów, może odpowiadać za zwiększony stosunek rozgałęzień do węzłów widoczny w późniejszych punktach czasowych w próbkach GDM. Co ważne, jednoczesne zmiany liczby gałęzi i węzłów mogą być trudne do zinterpretowania na osobnych wykresach. Jednak nowy stosunek gałęzi do węzłów umożliwia ocenę, w jaki sposób zmiany, w tym niewielkie zmiany trudne do wykrycia na poszczególnych wykresach, zarówno w liczbie gałęzi, jak i węzłów, skutkują zmianą łączności sieciowej.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający 10 parametrów określonych ilościowo za pomocą Analizy Kinetycznej Waskulogenezy (KAV). KAV określa ilościowo dziesięć różnych parametrów struktury sieci. Wszystkie parametry są oznaczone kolorami i obrysowane numerycznie na schemacie (1-10). Parametry obejmują liczbę rozgałęzień (zielony, 1), sieci zamknięte (niebieskie, 2) i węzłów (czerwone, 3), średnią powierzchnię sieci (pomarańczowy, 4), liczbę struktur sieciowych (, 5), węzły trójgałęziowe (żółty, 6) i węzły czterogałęziowe (fioletowe, 7), a także całkowitą (9) i średnią (10) długość rozgałęzienia oraz stosunek liczby rozgałęzień do liczby węzłów (10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza kinetyczna waskulogenezy (KAV) określa ilościowo strukturę sieci. (A) Szkieletowe i maskowe wersje struktur sieciowych zidentyfikowanych przez KAV za pomocą obrazów kontrastu fazowego zapewniają wizualną reprezentację struktur sieciowych zidentyfikowanych i określonych ilościowo przez KAV. Podziałka liniowa = 500 μm. (B) Reprezentatywny obraz z kontrastem fazowym sieci ECFC po 10 godzinach powlekania, który ma niski kontrast i ślady siatki po zszyciu poszczególnych obrazów. We wtyczce KAV można wybrać różne metody progowania, takie jak Średnia lub Otsu, aby poprawić dokładność pomiaru ilościowego, jeśli obrazy kontrastu fazowego mają niski kontrast lub jeśli występuje siatka. Odwzorowania szkieletu i maski obrazu kontrastu fazowego są wyświetlane zarówno dla metod progowania Średniej, jak i Otsu. Obrazy z kontrastem fazowym zostały wykonane przy użyciu obiektywu 10X. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wewnątrzmaciczne narażenie na GDM zmienia tworzenie sieci ECFC. Obrazy tworzenia się sieci ECFC rejestrowano w odstępach 15-minutowych przez 15 godzin za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego w odstępach co 5 godzin, począwszy od czasu posiewu (0,5 godziny), przedstawiono dla UC i trzech próbek GDM. Obrazy z kontrastem fazowym zostały wykonane przy użyciu obiektywu 10X. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: ECFC narażone na wewnątrzmaciczną GDM wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci. ECFC uzyskano w okresie ciąży niepowikłanej (WZJG,) oraz trzech ciąż powikłanych cukrzycą ciążową (GDM 1-3, kolor czerwony). Obrazy kontrastu fazowego były rejestrowane w odstępach 15-minutowych przez 15 godzin. Oprogramowanie do analizy kinetycznej waskulogenezy (KAV) określało ilościowo sieci zamknięte, obszary sieci, gałęzie, węzły i stosunek gałęzi do węzłów. Przedstawione dane reprezentują średni błąd standardowy ± średniej (SEM) z trzech oddzielnych eksperymentów dla każdej próby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Film 1: Wewnątrzmaciczne narażenie na GDM zmienia kinetykę tworzenia sieci ECFC. Obrazy tworzenia się sieci ECFC rejestrowano w odstępach 15-minutowych przez 15 godzin za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Obrazy kontrastu fazowego są wyświetlane dla UC i trzech próbek GDM w ciągu 15 godzin, począwszy od 0,5 godziny. Podziałka reprezentuje 500 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

obraz Łączna liczba sieci oddziałów Węzłów Trzyosobowe Czterokrotne Oddziałów Całkowita długość gałęzi* Średnia długość gałęzi* Stosunek gałęzi do węzłów Sieci zamknięte Obszar sieci** 1 Okręg wyborczy 382 TGL 290 szt. Rozdział 278 11 943 TGLI Numer katalogowy: 47210 124 Rozdział Godzina 3,25 9 480214 cyfra arabska Rozdział 284 345 szt. Okręg wyborczy 337 TGL 8 940 szt. Numer katalogowy: 50699 Rozdział 179 Wynik 2,72 16 264469 3 Rozdział 205 Okręg wyborczy 376 TGL Rozdział 366 TGL 9 Numery 910 szt. Numer katalogowy: 55728 272 Rozdział Godzina 2,42 27 Rozdział 27 150621 4 Rozdział 162 Rozdział 422 Okręg wyborczy 407 TGL 15 Okręg wyborczy 947 TGL Numer katalogowy: 59692 Okręg wyborczy 368 TGL Pytanie 2,24 Rozdział 40 Numer katalogowy: 98713 5 Rozdział 132 Rejon 454 441 szt. 12 Okręg wyborczy 967 TGL Numer katalogowy: 61923 Okręg wyborczy 469 TGL Pytanie 2.13 53 Rozdział 53 Numer telefonu 72951 6 122 Rozdział 122 Z numerem 435 Lokal mieszkalny 419 TGL 14 Okręg wyborczy 907 TGL Numer katalogowy: 62587 513 szt. Godzina 2.09 68 Rozdział Numer katalogowy: 56948 7 Rozdział 88 Lokal mieszkalny 429 TGL Z numerem 411 17 852 szt. Numer katalogowy: 63983 727 TGLI 1,99 pkt. 74 Rozdział 74 Numer katalogowy: 51429 8 68 Rozdział Z numerem 451 Z numerem 437 13 874 SZT. Numer katalogowy: 63960 Numery 941 1,94 pkt. 74 Rozdział 74 Numer katalogowy: 51780 9 93 Rozdział 93 Z numerem 437 Z numerem 417 Rozdział 18 Z numerem 905 Numer katalogowy: 60901 655 szt. Informacja o tym, że 2,07 TGL Rozdział 49 Numer katalogowy: 82919 10 126 Rozdział 126 Lokal mieszkalny 511 Z numerem 487 24 1075 szt. Numer katalogowy: 61981 Okręg wyborczy 492 TGL 2.1 37 116857 11 Rozdział 49 Okręg wyborczy 397 TGL Rozdział 384 12 737 TGLI Numer katalogowy: 61823 1262 SZT. 1,86 pkt. 79 Rozdział Numer katalogowy: 48805 12 Rozdział 81 Okręg wyborczy 376 TGL 364 Rozdział 10 751 szt. Numer katalogowy: 56817 Rozdział 701 cyfra arabska Rozdział 63 Numer katalogowy: 64431 13 Rozdział 98 Okręg wyborczy 509 TGL 482 TGL 26 Numer katalogowy 1028 TGL Numer katalogowy: 60799 620 szt. Pytanie 2,02 Rozdział 44 Numer katalogowy 98056 14 93 Rozdział 93 Z numerem 449 Z numerem 416 Rozdział 31 Z numeru 909 Numer katalogowy: 58282 627 szt. Pytanie 2,02 Rozdział 45 Numer katalogowy: 94081 *zaokrąglone do najbliższego mikrona, **zaokrąglone do najbliższego mikrona^2

Tabela 1: Reprezentatywne surowe dane z jednego badania obrazowego dla jednej próbki ECFC.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAV umożliwia ocenę dużych zbiorów danych z wieloma punktami czasowymi
Tradycyjnie, kwantyfikacja unaczynienia in vitro składała się z jednego lub kilku pomiarów punktu czasowego. To statyczne podejście jest po prostu niewystarczające do uchwycenia i ilościowego określenia dynamicznego i złożonego procesu. W związku z tym opracowano tę nowatorską metodę, aby umożliwić skuteczną analizę kinetyki tworzenia sieci w celu uzyskania wglądu w potencjalne mechanizmy molekularne zaangażowane w dynamiczny proces waskulogenezy. Wydajność i automatyzacja są ważnymi elementami w rozwoju nowatorskich technik generowania i analizowania dużych ilości danych obrazowych. KAV został opracowany specjalnie do analizy dużych stosów obrazów składających się z setek obrazów w celu skrócenia czasu i pracy wymaganego do wyciągnięcia biologicznie znaczących wniosków z zestawów danych poklatkowych. Co ważne, KAV przeprowadza przetwarzanie obrazów i generowanie danych w ciągu kilku sekund w przypadku małych (mniej niż 100 obrazów) stosów obrazów i minut w przypadku większych (powyżej 100 obrazów) stosów obrazów, co skutkuje niezrównaną wydajnością. Dodatkowo, organizacja danych w arkuszach kalkulacyjnych według czasu i mierzonych parametrów umożliwia szybkie generowanie prezentacji graficznej i analizy statystycznej.

Wyzwania związane z skutecznym zastosowaniem tego podejścia
Chociaż test ten obejmuje ulepszenia zarówno w zakresie akwizycji, jak i analizy obrazu, pewne wyzwania mogą utrudnić pomyślne wdrożenie. Cztery główne przeszkody to stabilność wilgotności, precyzja czasu od galwanizacji do akwizycji obrazu, niezawodność oprogramowania i sprzętu oraz zarządzanie dużymi zestawami danych generowanych dla każdego eksperymentu. Stabilne obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin może być wyzwaniem. W szczególności wymagane jest odpowiednie i stałe nawilżanie komór obrazowania. W tym teście stosuje się szkiełka do angiogenezy, które są przeznaczone do równoległego wykonywania testów angiogenezy opartych na matrycy. Ich niewielka objętość, około 50 μl, sprawia, że parowanie i kondensacja są istotne w przypadku przedłużonych warunków hodowli. Aby zwalczyć ten eksperymentalny problem, konieczne jest użycie inkubatora, który reguluje wilgotność. Jednak może być również konieczne rozszerzenie tej regulacji, jeśli z czasem dojdzie do nadmiernego wysuszenia komory obrazowania. Odkryliśmy, że najprostszym podejściem do zwiększenia wilgotności jest zwiększenie powierzchni wody w komorze. Aby osiągnąć ten cel, nasz protokół sugeruje następujące trzy źródła wody: drugą zjeżdżalnię komorową wypełnioną wodą, w której mierzona jest również temperatura inkubatora, wodę w obszarze otaczającym studnie na zjeżdżalniach oraz zwilżoną bibułę filtracyjną lub chusteczki. I odwrotnie, kondensacja występuje, gdy temperatura powietrza w pomieszczeniu schładza dno zjeżdżalni, a wilgoć wewnątrz komory skrapla się na zjeżdżalniach i studzienkach. To powikłanie może prowadzić do rozcieńczenia podłoża komórkowego i efektu soczewkowania, który zakłóca kontrast fazowy. W badaniach tych kondensacja została zminimalizowana poprzez zastosowanie ogrzanego powietrza (39-42 °C) na dnie szkiełka.

Kluczową kwestią w każdym badaniu poklatkowym jest spójność między rozpoczęciem eksperymentu a obrazowaniem. Czas, w którym rozpoczyna się obrazowanie, ma kluczowe znaczenie dla interpretacji dalszych zdarzeń. Aby zapewnić precyzję czasową tego testu, czas między początkowym posiewem a pierwszym zobrazowanym punktem czasowym powinien być ściśle kontrolowany. W praktyce ten "martwy czas" można zminimalizować, ale co ważniejsze, musi on być spójny, aby umożliwić porównywanie eksperymentów w różnych dniach. Na przykład w tym protokole spodziewamy się czasu martwego wynoszącego około 30 minut. Może to być ułatwione dzięki bliskości urządzeń do przygotowania i obrazowania eksperymentalnego.

To, co na pierwszy rzut oka może wydawać się prozaicznymi szczegółami, jest ważne dla stabilności oprogramowania, sprzętu i zarządzania danymi. Oprogramowanie i powiązane sterowniki sprzętowe, środowisko sieciowe i automatyczne aktualizacje oprogramowania mają wpływ na stabilność oprogramowania. Warto przetestować ten protokół w "próbie na sucho", aby zidentyfikować wąskie gardła i potencjalne źródła problemów w akwizycji obrazu; Na przykład sprawdź, czy nie ma zawodnej konfiguracji Live Cell, niezawodności sceny, migawki i kamery oraz instytucjonalnych zasad informatycznych dotyczących automatycznych aktualizacji systemu operacyjnego i oprogramowania.

Zarządzanie danymi jest stałym problemem każdego eksperymentu obrazowego, który generuje setki lub tysiące obrazów. Na szczęście komercyjne oprogramowanie często sprawdza dostępne miejsce przed rozpoczęciem eksperymentu z obrazowaniem. Jednak test ten obejmuje również przetwarzanie i analizę obrazu po przechwyceniu, co może zwiększyć obciążenie miejsca na dysku twardym i zakłócać eksperymenty obrazowe, jeśli dostępna przestrzeń jest ograniczona. Co więcej, nie można zagwarantować bezpieczeństwa i stabilności komputera, nawet w przypadku rozwiązań sprzętowych, takich jak nadmiarowa tablica identycznych dysków. W związku z tym konieczna jest strategia zarządzania danymi w celu zapewnienia miejsca na dyskach twardych komputera na trwające eksperymenty oraz solidna zdalna archiwizacja, na przykład z wykorzystaniem instytucjonalnych zasobów archiwizacyjnych.

Strategie maksymalizacji jakości obrazu
Chociaż zdolność KAV do dokładnego odróżniania ECFC od tła matrycy jest solidna, czułość testu zależy od jakości obrazu. Na przykład, jeśli obraz ma niski kontrast, oprogramowanie wykryje sieci komórkowe z mniejszą dokładnością (rysunek 2B). Na jakość kontrastu fazowego ma wpływ kilka czynników, w tym ustawienia mikroskopu używanego do akwizycji obrazu, ładowanie matrycy i pożywki zawiesinowej komórek podczas przygotowywania testu oraz utrzymanie poziomu pożywek w studzienkach przez cały okres obrazowania. Aby zoptymalizować kontrast fazowy dla tych testów, dokonano drobnych korekt wyrównania pierścienia fazowego w mikroskopie w celu poprawy kontrastu. Ponadto przygotowanie próbki zostało rygorystycznie przetestowane, aby zapewnić równomierne i spójne ładowanie nośników. Jeśli ilość matrycy i/lub mediów załadowanych do studzienek jest poniżej lub powyżej optymalnego zakresu, może powstać menisk prowadzący do zmiany kontrastu fazowego. Wreszcie, ze względu na małą objętość cieczy w studniach, bardzo ważne jest utrzymanie poziomu mediów poprzez zminimalizowanie parowania i kondensacji, jak wspomniano powyżej. Ogólnie rzecz biorąc, optymalizacja testów ma kluczowe znaczenie dla generowania wysokiej jakości obrazów kontrastowych do analizy.

Oprócz jakości kontrastu fazowego, na wyniki testu mogą również wpływać inne czynniki, w tym zanieczyszczenie podłoża, niedoskonałości matrycy oraz cząstki lub zanieczyszczenia w matrycy lub pożywce. Zanieczyszczenie jest zagrożeniem związanym z tym testem, ponieważ obejmuje ono obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin w komorze mikroskopowej. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, matryca i zawiesiny komórek są ładowane na szkiełko w sterylnym kapturze. Ponadto każda próbka jest zwykle platerowana lub potrójna na potrzeby eksperymentu, aby zminimalizować ryzyko utraty danych z powodu nieprzewidzianych problemów, takich jak zanieczyszczenia lub cząstki zakłócające analizę.

Heterogeniczność próbek napędza potrzebę zwiększenia czułości testu
Heterogeniczność została zaobserwowana i opisana w poprzednich badaniach ECFC narażonych na GDM13. Spekuluje się, że wysoki poziom niejednorodności funkcji komórek obserwowany w tych próbkach można przypisać kilku czynnikom, w tym ciężkości choroby matki, czasowi trwania choroby i stylowi leczenia stosowanemu do regulacji poziomu glukozy we krwi. Co ważne, to analityczne podejście pozwala uchwycić dynamiczny zakres unaczynienia ECFC, dzięki czemu możliwe jest zidentyfikowanie różnic fenotypowych wynikających z niejednorodności funkcjonalnej w próbkach pochodzących z ciąż w ciąży z cukrzycą ciążową. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie pierwotnych próbek pacjentów, takich jak te użyte w tych badaniach, może wprowadzić większą zmienność w porównaniu z linią komórkową. Ponieważ większy nacisk kładzie się na badania translacyjne obejmujące wiele pierwotnych próbek zwierzęcych lub ludzkich o zmienności funkcjonalnej, czułość testu ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania i wyprowadzania biologicznie znaczących pomiarów i wniosków. W związku z tym rozwój podejść takich jak KAV poprawi ilość i jakość danych generowanych przez testy unaczynienia i angiogenezy in vitro , aby umożliwić bardziej wiarygodne obserwacje i wnioski. Co więcej, dane te ułatwią przyszłe badania podstawowych mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do zmiany waskulogenezy ECFC po wewnątrzmacicznym narażeniu na GDM.

Przyszłe zastosowania tego podejścia
Chociaż metoda ta została zastosowana do oceny unaczynienia ECFC płodu in vitro w tych badaniach, potencjalne zastosowania tego podejścia są liczne. Technikę tę można łatwo zastosować do badania dowolnej populacji komórek, która uczestniczy w procesach waskulogenezy lub angiogenezy. W szczególności można go wykorzystać do badania pojedynczych populacji komórek, jak wykazano w tym badaniu, ale można go również zastosować do systemów kohodowli. W przyszłości korzystne byłoby rozszerzenie tego podejścia poza dwuwymiarowy test in vitro w celu oceny modeli trójwymiarowych (3D). Chociaż obecna wersja KAV byłaby niewystarczająca do ilościowego określenia danych obrazowania 3D, podobnie zaprojektowane poklatkowe, wieloparametryczne podejście analityczne przeznaczone specjalnie dla modeli 3D lub in vivo dostarczyłoby informacji, czy obserwacje wykonane w dwuwymiarowym in vitro są reprezentatywne dla funkcji komórki w bardziej istotnych biologicznie warunkach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. Davidowi Haasowi, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass i Emily Sims (Angio BioCore w Indiana University Simon Cancer Center) za doskonałą pomoc techniczną w pozyskiwaniu próbek ECFC. Autorzy dziękują również doktorom Maureen A. Harrington, Edwardowi F. Srourowi, Richardowi N. Dayowi, Mervinowi C. Yoderowi i Matthiasowi A. Claussowi (Indiana University School of Medicine) za dyskusję naukową, a także Janice Walls (Indiana University School of Medicine) za wsparcie administracyjne. Wszystkie obrazowania zostały wykonane w Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 i U10 HD063094) oraz Riley Children's Foundation. Dodatkowo, publikacja ta była możliwa dzięki częściowemu wsparciu ze strony Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Award # T32 HL007910.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytki do hodowli tkankowych 100 mmFisher353003
15 ml probówki stożkoweFisher1495949B
Angiogeneza 15-dołkowe mikropreparatyIbidi81506
MatrigelFisher (Corning)354234
EGM2 MediumLonzaCC3162
Surowica bydlęca płoduAtlanta BiologicalsS11550
PSA Antymiocytarny, antybiotykFisherMT30004C1Dodano 5 ml na 500 ml butelki pożywki EGM2.
0,5% trypsyny/0,53 nM EDTA w HBSSFisher (Corning)MT25052CI
Type 1 CollagenFisher (Corning)354226100 mg płynu, zakres stężeń 3-4 mg/mL. Rozcieńczyć w 20 nM kwasie octowym w ddH2O do użycia w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml.
Lodowaty kwas octowyFisherA38-212Stosowany w roztworze kolagenu typu 1 w końcowym stężeniu 20 nM.
Kim WipesFisher06-666
Szkiełko komoroweIbidi80296Szkiełko to można napełnić wodą destylowaną, aby utrzymać wilgotność w komorze obrazowania.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher (Gibco)200120271x roztwór, pH 7,2
Mikroskop Instrumenty firmy NikonMEA53100 i MEF55030Zmotoryzowany TiE, w tym pierścień fazowy Ph1 do kontrastu fazowego z obiektywnym
StageWcześniejsze instrumentyProScan IIMożna stosować inne OKOlab i Nikon Elements Stopień kompatybilny z AR
ObiektywInstrumenty Nikon 93178CFI Plan Fluor DL 10X
KameraHamamatsuC11440-42UORCA Flash 4.0LT
StageBlower Precyzyjne sterowanieNie dotyczyTen produkt został wycofany, alternatywy obejmują Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W) firmy World Precision Instruments
Stage-top Inkubator OKOLabsH301BoldLine z dwupozycyjnym uchwytem na suwak
KomputerHewlett-PackardZ620 lub równoważny4-rdzeniowy procesor Intel Xeon, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, karta graficzna nVidia Quadro 
Oprogramowanie Nikon ElementsNikon InstrumentsAR v 4.20ND Acquisition to wielowymiarowe narzędzie konfiguracyjne służące do konfiguracji oprogramowania Elements.
Oprogramowanie FIJI (ImageJ)N/AN/ABezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
Wtyczka KAVNieNie dotyczy Bezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601(2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298(2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471(2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
  15. WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

VasculogenesisAngiogenesisEndothelial Colony Forming CellsTime lapse Phase Contrast MicroscopyKinetic Analysis of VasculogenesisImage SegmentationSkeletonizationNetwork FormationBasement Membrane MatrixGestational Diabetes Mellitus

Related Articles