Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego i analizy unaczynienia in vitro za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem open source, Analiza Kinetyczna Waskulogenezy. Protokół ten można zastosować do ilościowej oceny potencjału naczyniowego wielu typów komórek lub warunków eksperymentalnych, które modelują chorobę naczyniową.
Artykuł metodologiczny
Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Waskulogeneza to złożony proces, w którym śródbłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe ulegają tworzeniu naczyń de novo. Ilościowa ocena unaczynienia stała się centralnym odczytem funkcjonalności śródbłonkowych komórek progenitorowych, dlatego podjęto kilka prób ulepszenia modeli unaczynienia zarówno in vitro, jak i in vivo. Jednak standardowe metody mają ograniczony zakres, a pomiary statyczne nie są w stanie uchwycić wielu aspektów tego wysoce dynamicznego procesu. Dlatego celem opracowania tego nowatorskiego protokołu była ocena kinetyki waskulogenezy in vitro w celu ilościowego określenia tempa tworzenia i stabilizacji sieci, a także zapewnienia wglądu w potencjalne mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji naczyń krwionośnych. Zastosowanie tego protokołu wykazano na przykładzie komórek tworzących kolonie śródbłonka płodu (ECFC) narażonych na cukrzycę matki. Płodowe ECFC uzyskano z krwi pępowinowej pobranej po urodzeniu, wyhodowano i posiano w szkiełkach zawierających macierz błony podstawnej, gdzie uległy unaczynieniu. Obrazy całych studni szkiełka uzyskano za pomocą poklatkowej mikroskopii z kontrastem fazowym przez 15 godzin. Obrazy zostały przeanalizowane w celu uzyskania danych ilościowych za pomocą oprogramowania analitycznego o nazwie Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV). KAV wykorzystuje segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację do analizy komponentów sieci ze stosów obrazów kontrastu fazowego z wieloma punktami czasowymi w celu uzyskania dziesięciu parametrów (9 zmierzonych, 1 obliczony) struktury sieci, w tym: sieci zamknięte, obszary sieciowe, węzły, gałęzie, całkowita długość gałęzi, średnia długość gałęzi, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, struktury sieciowe i stosunek rozgałęzień do węzłów. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na zidentyfikowanie zmienionych wskaźników unaczynienia w ECFC uzyskanych z ciąż powikłanych cukrzycą. Technika ta ma jednak szerokie implikacje wykraczające poza zakres opisany w niniejszym dokumencie. Wdrożenie tego podejścia poprawi ocenę mechanistyczną i poprawi funkcjonalne odczyty waskulogenezy i innych biologicznie ważnych procesów rozgałęziania w wielu typach komórek lub stanach chorobowych.
Wprowadzenie
Zdolność komórek progenitorowych śródbłonka do przechodzenia waskulogenezy, czyli tworzenia naczyń de novo, jest kluczowa w tworzeniu embrionalnej unaczynienia podczas rozwoju1. Dodatkowo, dalsze tworzenie naczyń krwionośnych i dojrzewanie wcześniej istniejących naczyń, które jest znane jako angiogeneza, jest również kluczowym procesem w rozwoju i życiu poporodowym, aby utrzymać przepływ krwi i homeostazę w całym ciele2. Każdy narząd w ciele jest zależny od układu naczyniowego w zakresie dostarczania tlenu i składników odżywczych oraz usuwania odpadów3. Jeśli homeostaza naczyń krwionośnych nie jest zachowana, tak że tworzenie i naprawa naczyń krwionośnych jest albo niewystarczająca, albo w nadmiarze, mogą wystąpić choroby naczyniowe4. Dlatego tworzenie i adaptacja naczyń krwionośnych są powszechnie badane, ponieważ są niezbędne w utrzymaniu zdrowia narządów i biorą udział w rozwoju wielu stanów patologicznych.
Ze względu na zwiększone zrozumienie udziału układu naczyniowego w rozwoju, jak również w manifestacji i progresji choroby, opracowano testy do modelowania waskulogenezy i angiogenezy in vitro i in vivo5,6,7. Modelowanie tworzenia naczyń polega na posiewaniu komórek naczyniowych, takich jak komórki śródbłonka, w macierzy błony podstawnej, która wspomaga organizację komórek i tworzenie sieci naczyń8,9,10. Zazwyczaj, po całonocnej inkubacji, obrazy sieci komórkowych są przechwytywane w jednym punkcie czasowym, co skutkuje niewielką liczbą obrazów do analizy11,12,13. W związku z tym podejścia analityczne zostały w dużej mierze opracowane i zoptymalizowane pod kątem ocen pojedynczych punktów czasowych10,14. Jednak analizy statyczne są po prostu niewystarczające do uchwycenia dynamicznego procesu formowania się naczyń i dostarczają ograniczonego wglądu w potencjalne mechanizmy związane z tym procesem. Chociaż zwiększenie częstotliwości obrazowania prawdopodobnie dostarczyłoby danych niezbędnych do identyfikacji kinetyki formacji, zastosowanie wcześniej opracowanych analiz do podejścia do obrazowania wielu punktów czasowych byłoby nieefektywne i pracochłonne14. Dodatkowo, pomimo rozwoju komercyjnie dostępnych analiz, opłata za obraz sprawia, że opcja ta jest zbyt kosztowna w przypadku badań kinetycznych, w których generowane są tysiące obrazów15. W związku z tym w tej dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na usprawnione i wydajne podejście do wychwytywania i ilościowego określania unaczynienia in vitro, w tym możliwość analizy dużych zestawów obrazów generowanych przez poklatkową mikroskopię żywych komórek.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano nowe podejście, którego celem było rozszerzenie obrazowania pojedynczego punktu czasowego, aby umożliwić dynamiczną ocenę waskulogenezy za pomocą obrazów pozyskiwanych co 15 minut16. Dzięki uchwyceniu wielu punktów czasowych w ciągu kilku godzin, podejście to zapewnia bardziej szczegółowy obraz procesu waskulogenezy, a także wgląd w potencjalne mechanizmy przyczyniające się do tworzenia i utrzymywania sieci naczyń krwionośnych. Oprócz poprawy częstotliwości i jakości pozyskiwania obrazów, podejście to obejmuje nowatorskie oprogramowanie w postaci wtyczki typu plug-in17. Oprogramowanie, określane jako Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV), jest usprawnioną aplikacją, która obejmuje przetwarzanie i analizę obrazów specjalnie dla dużych zestawów obrazów generowanych z akwizycji wielu punktów czasowych. KAV analizuje obrazy kontrastu fazowego poprzez segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację18. Dziesięć parametrów struktury sieci jest określanych ilościowo przez KAV, w tym: rozgałęzienia, sieci zamknięte, węzły, obszary sieci, struktury sieciowe, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, całkowita długość rozgałęzienia, średnia długość gałęzi i stosunek gałęzi do węzłów (patrz schemat w Rysunek 1)16. Zastosowanie podejścia KAV obejmuje nowy, obliczony fenotyp waskulogenezy in vitro, określany jako stosunek gałęzi do węzłów. Nasze ostatnie prace wykazały, że stosunek ten wskazuje na łączność sieciową i może być związany z innymi procesami komórkowymi zaangażowanymi w tworzenie sieci, takimi jak motility16.
Chociaż waskulogeneza komórek tworzących kolonię śródbłonka płodu (ECFC) została oceniona w tych badaniach, to podejście do pozyskiwania i analizy obrazów może być łatwo zastosowane do oceny dowolnych typów komórek, które przechodzą waskulogenezę lub angiogenezę. Ponadto podejście to można wykorzystać do identyfikacji zmienionej funkcji naczyń krwionośnych wynikających z różnych stanów patologicznych, takich jak cukrzyca ciążowa, jak wykazano w tych badaniach. Co więcej, metodę tę można zaadaptować do oceny tworzenia i rozgałęziania się sieci, które są ważne dla innych procesów istotnych z biologicznego punktu widzenia. W związku z tym potencjalny wpływ zastosowania tego nowatorskiego podejścia do unikalnych systemów biologicznych nie został jeszcze określony.
Protokół
1. Przygotowania
- Hodowla komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC)
UWAGA: Próbki ecfc płodu użyte w tych eksperymentach zostały wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej i wyhodowane przez Angio BioCore (ABC) w Indiana University School of Medicine, jak wcześniej opisano6. Rutynowe fenotypowanie kontroli jakości przeprowadzono w obrębie ABC w celu potwierdzenia ekspresji antygenów śródbłonka zgodnie z wcześniejszym opisem19,20,21. Próbki użyte w eksperymentach były pasażowane minimalnie (2-3 razy). Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową przeprowadzono w kapturze do hodowli tkankowej. Wszystkie odczynniki, w tym płytki do hodowli tkankowych i roztwory, były sterylne.- Dwa dni przed eksperymentem pokryj okrągłe płytki do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm 6 ml kolagenu typu 1 o stężeniu 0,05 mg/ml i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
UWAGA: Kolagen typu 1 rozcieńcza się w podwójnie destylowanej wodzie zawierającej 20 nM kwas octowy do stężenia roboczego 0,05 mg/ml. - Dzień przed eksperymentem trypsynizuj i ponownie plateruj ECFC na płytkach pokrytych kolagenem typu 1 w 1.1.1. (Patrz uwaga pod pkt 1.1).
- Aby wytrypsynizować ECFC, odessać pożywkę z posianych komórek i przemyć 7 ml PBS. Odessać PBS, a następnie dodać 2-3 ml 0,5% trypsyny i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
- Bezpośrednio po inkubacji z trypsyną dodać 3 ml EGM2 i pipetować w górę iw dół, aby usunąć wszystkie przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować wszystkie próbki o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1-2 ml EGM2. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i usunąć małą porcję (20-40 μl) do liczenia.
- Dodać równe części błękitu trypanowego do podwielokrotności komórki i odpipetować 10 μl do hemocytometru. Policz liczbę komórek w czterech podstawowych kwadrantach hemocytometru.
UWAGA: Użyj obu stron hemocytometru do wszystkich zliczeń próbek, aby zwiększyć dokładność. - Płytki do hodowli tkankowych pokrytych kolagenem, które zostały przygotowane w kroku 1.1.1, należy przemyć dwukrotnie 7 ml PBS. Po zaaspirowaniu drugiego przemywania PBS dodać do płytek 10 ml pożywki hodowlanej śródbłonka 2 (EGM2) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą do płytek.
- Korzystając z liczby komórek uzyskanej w kroku 1.1.7, oblicz objętość zawiesiny komórek wymaganą do pokrycia 4 x 105 komórek. Umieścić 4 x 105 ECFC na płytkach do hodowli tkankowych przygotowanych w kroku 1.1.8 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2) przez noc.
- Dwa dni przed eksperymentem pokryj okrągłe płytki do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm 6 ml kolagenu typu 1 o stężeniu 0,05 mg/ml i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
- Przed eksperymentem należy przechowywać zapasy w temperaturze 4 °C przez noc
- Przechowuj metalową płytkę o wymiarach 3 x 2 cale, szkiełko (przechowywać w opakowaniu do momentu otwarcia w kapturze), pudełko sterylnych końcówek o pojemności 20 mikrolitrów (μl) i matrycę (matrycę) membrany podstawnej.
UWAGA: Matryca jest przechowywana w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania; zawsze rozmrażaj go w temperaturze 4 °C przez noc lub przez kilka godzin przed użyciem.
- Przechowuj metalową płytkę o wymiarach 3 x 2 cale, szkiełko (przechowywać w opakowaniu do momentu otwarcia w kapturze), pudełko sterylnych końcówek o pojemności 20 mikrolitrów (μl) i matrycę (matrycę) membrany podstawnej.
- Upewnij się, że na dyskach twardych komputera jest wystarczająca ilość miejsca na obrazy.
UWAGA: Korzystając z konfiguracji opisanej w tym protokole, wymagane było około 60 gigabajtów (GB) miejsca na eksperyment (4 GB/studnię). Jednak szacunki dotyczące miejsca są oparte na konfiguracji sprzętowej i będą musiały zostać określone dla każdego systemu.
2. Protokół 1: Konfiguracja eksperymentalna: Przygotowanie slajdu
- Zbierz i przygotuj zapasy
- W dniu eksperymentu zbierz zapasy do powlekania komórek na szkiełku, w tym wiadro z lodem, mały pojemnik z suchym lodem, nożyczki i pipetę o pojemności 20 μl. Spryskaj wszystkie przedmioty 70% etanolem, wytrzyj do sucha ręcznikami papierowymi i umieść przedmioty w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
- Zbierz wszystkie zapasy przechowywane w temperaturze 4 °C (patrz krok 1.2), w tym metalową płytkę, pudełko z końcówkami, szkiełko i matrycę. Spryskaj pudełko z końcówkami 70% etanolem i umieść pudełko w pojemniku z suchym lodem.
UWAGA: Wyjmuj matrycę z lodówki o temperaturze 4 °C tylko wtedy, gdy jest gotowa do użycia i zawsze trzymaj matrycę na lodzie. - Spryskaj metalową płytkę 70% etanolem i zanurz ją w lodzie w pojemniku na lód. Otwórz opakowanie zawierające szkiełko i umieść szkiełko na metalowej płycie, aby było zimne.
- Załaduj matrycę na slajd
- Ustaw pipetę na 10 μl i wyjmij końcówkę z pudełka z zimną końcówką wraz z pipetą. Odetnij nożyczkami około 1 cm od końca końcówki.
UWAGA: Wytnij prostopadle do końcówki, aby zredukować pęcherzyki w matrycy. Objętość pipety można ustawić na nieco większą niż 10 μl, aby uwzględnić przyklejanie się matrycy do wnętrza końcówki. - Powoli wciągnij matrycę do końcówki pipety. Natychmiast umieść końcówkę pipety na środku studzienki. Delikatnie przyłóż końcówkę pipety do dna studzienki i powoli wypchnij matrycę.
UWAGA: Nie należy przesadnie pipetować, ponieważ spowoduje to tworzenie się pęcherzyków. Jeśli utworzy się bąbel, natychmiast przebij go za pomocą małej końcówki. - Zjeżdżalnia zawiera 15 pojedynczych studzienek. Powtórz poprzedni krok dla każdej studzienki. Użyj nowej końcówki pipety do każdego dołka, aby zachować spójność i zmniejszyć krzepnięcie matrycy wewnątrz końcówki.
- Po załadowaniu szkiełka wszystkimi studzienkami zawierającymi matrycę, należy wsunąć pokrywkę do końca na szkiełko i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aż matryca zastygnie.
UWAGA: Nie pozwól, aby matryca wyschła. Dodać niewielką objętość (2-3 ml) PBS do nakrętki stożkowej probówki o pojemności 50 ml w pobliżu szkiełka w inkubatorze, aby zmniejszyć ryzyko wysuszenia matrycy.
- Ustaw pipetę na 10 μl i wyjmij końcówkę z pudełka z zimną końcówką wraz z pipetą. Odetnij nożyczkami około 1 cm od końca końcówki.
3. Protokół 2: Powlekanie ECFC na matrycy
- Usunąć przylegające ECFC z płytek do hodowli tkankowych i zebrać w zawiesinie
- Pobrać płytki do hodowli tkankowych zawierające ECFC posiane poprzedniego dnia (patrz sekcja 1.1.9). Odessać pożywkę EGM2 i przemyć przylegające ECFC raz 7 ml PBS.
- Odessać PBS, dodać 2-3 ml trypsyny i inkubować przylegające komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
- Bezpośrednio po inkubacji dodać 3 ml EGM2 i pipetować w górę iw dół, aby usunąć wszystkie przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Czynności 3.1.1–3.1.3 należy powtarzać dla pozostałych trzech próbek ECFC, aż do momentu, gdy wszystkie cztery próbki komórkowe zostaną pobrane w zawiesinie.
- Przygotowanie miksów wzorcowych
- Odwirować wszystkie próbki o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1-2 ml EGM2.
- Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i usunąć małą porcję (20-40 μl) do liczenia.
- Dodać równe części błękitu trypanowego do podwielokrotności komórki i odpipetować 10 μl do hemocytometru. Policz liczbę komórek w czterech podstawowych kwadrantach hemocytometru.
UWAGA: Użyj obu stron hemocytometru do wszystkich zliczeń próbek, aby zwiększyć dokładność. - Korzystając z powyższej liczby komórek, oblicz objętość każdej próbki komórki, która zawiera 1.4x104 komórki. Dokładnie wymieszać wszystkie zawiesiny komórek i podwielokrotność1,4 x 10 4 komórek do świeżej probówki, aby przygotować mieszankę wzorcową dla każdego warunku doświadczalnego. Dodać pożywkę EGM2 tak, aby końcowa objętość każdej mieszanki wzorcowej wynosiła 175 μl.
- Wymieszać każdą mieszankę wzorcową delikatnie pipetując i rozdzielić 50 μl mieszanki wzorcowej do indywidualnych studzienek na szkiełku.
UWAGA: Wszystkie próbki są powlekane w trzech egzemplarzach, z mieszankami wzorcowymi obliczonymi dla 3,5 dołka, aby zapewnić wystarczającą objętość dla 3 dołków.
- Inkubacja szkiełka
- Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C do momentu, gdy będzie można je przenieść do komory mikroskopu w celu obrazowania.
UWAGA: Czas między posiewem a obrazowaniem powinien być jak najkrótszy, aby ograniczyć utratę danych we wczesnych stadiach waskulogenezy.
- Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C do momentu, gdy będzie można je przenieść do komory mikroskopu w celu obrazowania.
4. Protokół 3: Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu
UWAGA: W naszych badaniach, Protokoły 2 i 3 były prowadzone jednocześnie przez różne osoby. Jeżeli Protokoły 2 i 3 muszą być wypełnione przez tę samą osobę, Kroki 4.1 i 4.2 Protokołu 3 poniżej powinny zostać zakończone przed wszczęciem Protokołu 2 powyżej.
- Włącz mikroskop i komputer
- Na około jedną do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu włącz i podgrzej inkubator stage top do 37 °C, ustaw CO2 na 5% i ustaw wilgotność na 85%. Napełnij zbiornik wilgotności inkubatora, jeśli jest pusty.
- Umieść pustą szkiełko komorowe w jednej z dwóch otwartych pozycji i napełnij wodą destylowaną. Zabezpiecz termometr ze sprzężeniem zwrotnym do kontroli temperatury w komorze, jeśli jest dostępny.
UWAGA: Jeśli termometr ze sprzężeniem zwrotnym jest dostępny, użyj tej "temperatury inkubatora", aby sprawdzić, czy komora jest zrównoważona. - Włącz dmuchawę wtórną ustawioną na 39-42 °C, aby podgrzać szkiełka od dołu i zminimalizować kondensację.
- Dodaj drugi slajd jako pusty do momentu, gdy będzie można dodać slajd eksperymentalny. Ten slajd służy jako symbol zastępczy lokalizacji do konfiguracji ustawień akwizycji obrazu dla poszczególnych studzienek podczas instalacji.
- Dodaj wodę do zbiornika otaczającego studnie na drugim slajdzie, aby naśladować warunki panujące podczas eksperymentu z obrazowaniem. Woda otaczająca studnie umożliwia ocenę wilgotności podczas ustawiania mikroskopu i podgrzewania.
UWAGA: Wstępna równowaga inkubatora i dmuchawy wtórnej ma kluczowe znaczenie dla utrzymania stabilnego środowiska hodowli. Większość sterowników komór z komórkami na żywo zapewnia informacje zwrotne w czasie rzeczywistym o temperaturze, CO2 i wilgotności w celu oceny gotowości systemu. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić, czy na szkiełku nie nagromadziła się wilgoć i nie doszło do nadmiernego wysuszenia zbiornika napełnionego w ppkt 4.1.5. Wilgotność może wymagać regulacji, jeśli w komorze występuje nadmierne wysuszenie lub kondensacja. Aby zwiększyć wilgotność, dodaj chusteczki zwilżone wodą destylowaną. Aby zmniejszyć kondensację, należy albo zmniejszyć ustawienie wilgotności zgodnie z regulacją w 4.1.1, albo, ponieważ kondensacja może być oznaką niskiej temperatury, sprawdzić ustawienia temperatury komory i położenie dmuchawy wtórnej.
- Skonfiguruj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu podczas równoważenia.
UWAGA: Akwizycja obrazu jest konfigurowana za pomocą oprogramowania, które steruje sceną, migawką i kamerą. Wielowymiarowe narzędzie do konfiguracji to najprostszy sposób na skonfigurowanie oprogramowania. Co więcej, oprogramowanie będzie musiało mieć procedury autofokusa, aby zapewnić kontrolę ostrości przez cały czas trwania eksperymentu.- Użyj oprogramowania, aby ustawić wiele pozycji stopni dla każdej studni. W przypadku tego protokołu wybierz środek studni.
- Skonfiguruj akwizycję obrazu w taki sposób, aby w każdej pozycji etapu obrazowana była cała studnia. Na przykład użyj skanowania kafelków z 10-20% nakładaniem się obrazu i około 5 x 5 polami, w zależności od kamery i końcowego powiększenia.
- Skonfiguruj upływ czasu dla obrazowania co 15 minut.
UWAGA: Korzystając z konfiguracji opisanej w tym protokole, wszystkie 15 dołków szkiełka jest obrazowanych w odstępie 15 minut.
- Załaduj slajd eksperymentalny
- Po wyrównaniu komory inkubatora zastąpić ślepy szkiełko szkiełkiem doświadczalnym.
UWAGA: Zrównoważona komora będzie miała stabilną temperaturę, CO2 i wilgotność przez co najmniej 20 minut. Gdy szkiełko doświadczalne jest gotowe, konieczne jest szybkie wykonanie kroków, aby zminimalizować "martwy czas" między posiewem a początkowym punktem czasowym uchwyconym przez mikroskop. Ponadto, aby ułatwić porównywanie eksperymentów obrazowych, czas ten powinien być spójny. W tych eksperymentach wykonanie wszystkich kroków opisanych w Protokole 3 Sekcja 4.3 wymagało około 30 minut. - Zdejmij pokrywę suwaka i dodaj wodę do zbiornika otaczającego studzienki na zjeżdżalni.
UWAGA: Pokrywka jest zdejmowana na czas eksperymentu obrazowego.
- Po wyrównaniu komory inkubatora zastąpić ślepy szkiełko szkiełkiem doświadczalnym.
- Konfigurowanie końcowych ustawień akwizycji obrazu
- Umieść obiektyw CFI Plan Fluor DL 10X w odpowiedniej pozycji i wybierz pierścień fazowy Ph1 na kondensatorze. Po ustawieniu ostrości na pierwszym dołku wyreguluj diaskopijną ścieżkę światła dla oświetlenia Köhlera i skonfiguruj optykę fazową, sprawdzając wyrównanie pierścienia fazowego w kondensatorze z maską fazową obiektywu.
- Skonfiguruj czas naświetlania i dostosuj intensywność lampy do kontrastu fazowego, który zwykle wynosi mniej niż 500 ms.
- Przejdź przez każdą pozycję stage ustawioną w 4.2.1 i potwierdź, że środek studni jest wybrany, i wyreguluj go, jeśli to konieczne.
- W każdej pozycji etapu skup się na komórkach posianych w studzience i ustaw pozycję z pozycji stołu montażowego używaną do obrazowania w oprogramowaniu.
- Przetestuj mechanizm autofokusa w mikroskopie. Jeśli autofokus jest oparty na sprzęcie, upewnij się, że jest włączony i prawidłowo ustawiony dla wszystkich pozycji stage.
UWAGA: Ponieważ próbka i stolik mogą dryfować pionowo podczas eksperymentu, ważne jest, aby oprogramowanie sprawdzało autofokus w każdej pozycji stage i w każdym punkcie czasowym, aby zapewnić wiarygodne obrazowanie w trakcie trwania eksperymentu. Jeśli to możliwe, jako punkt wyjścia dla kolejnej procedury autofokusa należy użyć pozycji autofokusa określonej w poprzednim punkcie czasu. W ten sposób można łatwo dostosować ciągły dryf .
- Zmniejsz lub zgaś światła w pomieszczeniu mikroskopu i rozpocznij eksperyment z obrazowaniem.
5. Protokół 4: Przetwarzanie obrazów i analiza kinetyczna waskulogenezy (KAV)
- Zapisuj obrazy z poszczególnych punktów czasowych jako stos obrazów dla każdego dołka
UWAGA: Większość programów do przechwytywania obrazów może eksportować wielostronicowe pliki TIFF (stosy) szeregów czasowych. KAV jest przeznaczony do pracy z zestawami danych, które mogą zawierać wiele punktów czasowych. W ten sposób analiza odbywa się na całym stosie obrazów dla danej pozycji etapu. W razie potrzeby oprogramowanie do przetwarzania obrazów może importować pojedyncze obrazy z każdego punktu czasowego w celu zrekonstruowania stosu obrazów. - Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu na komputerze
- Dodaj KAV do oprogramowania do przetwarzania obrazu
- Przeciągnij plik KAV z folderu na szary pasek u dołu okna oprogramowania. Kliknij "Zapisz", aby dodać oprogramowanie do listy.
- Otwieranie stosu obrazów, który ma zostać przeanalizowany
- Kliknij "Plik", a następnie "Otwórz" w menu rozwijanym w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przeciągnij plik obrazu na szary pasek, jak w kroku 5.3.1.
- Konwertuj obrazy na 8-bitowe, klikając "Obraz", "Typ", "8-bitowy".
- Tworzenie obszaru zainteresowania (ROI)
- Otwórz Menedżera ROI, klikając "Analizuj" na pasku narzędzi. Następnie wybierz "Narzędzia", a następnie "Menedżer ROI".
- Utwórz nowy zwrot z inwestycji, klikając narzędzia wyboru okręgu lub prostokąta na pasku narzędzi i rysując żądany obszar zaznaczenia na obrazie. Kliknij "Dodaj" w oknie menedżera ROI, aby zapisać ten kształt.
UWAGA: Wcześniej utworzony ROI można otworzyć, przeciągając zapisane ROI (spakowany folder) na pasek "Przeciągnij i upuść", aby otworzyć go w Menedżerze. - Kliknij etykietę ROI wymienioną w Menedżerze ROI, aby wyświetlić ją na image.
UWAGA: Jeśli ROI nie pojawi się na obrazie, utwórz drugi ROI (dowolny rozmiar/kształt) i dodaj go do menedżera. Gdy oba ROI pojawią się na liście, klikaj tam iz powrotem między nimi, a żądany ROI pojawi się na obrazie. - W razie potrzeby wyrównaj zwrot z inwestycji. Gdy zwrot z inwestycji znajdzie się na obrazie w żądanym miejscu, przejdź do Menu i kliknij "Edytuj", a następnie "Wyczyść na zewnątrz". Spowoduje to usunięcie danych obrazu poza ROI (przydatne w przypadku kształtów innych niż prostokątne) dla każdego obrazu w stosie.
UWAGA: Możesz także kliknąć "Obraz" i "Przytnij", jeśli używasz prostokątnego ROI.
- Uruchamianie oprogramowania KAV
- Kliknij "Wtyczki" na pasku menu.
- Wybierz wtyczkę "Analizuj sieć". Spowoduje to otwarcie okna z opcjami zmiany ustawień we wtyczce.
- Zmień metodę progowania za pomocą strzałki listy rozwijanej.
- Po wybraniu wszystkich odpowiednich ustawień kliknij "OK", aby rozpocząć przetwarzanie oprogramowania.
UWAGA: Odpowiednie ustawienia są określane poprzez wizualizację odwzorowań szkieletu i maski generowanych przez KAV, które wskazują na dokładność oprogramowania do identyfikacji i rozróżniania komórek i sieci od tła na obrazie kontrastu fazowego.
- Zapisywanie danych wygenerowanych w formacie KAV
- Gdy wtyczka zakończy analizę, na ekranie pojawią się dwa okna, w tym tabela danych z wartościami liczbowymi i stos połączonych obrazów przedstawiających odwzorowania szkieletu i maski.
- Zapisz wartości liczbowe, przechodząc do lewego górnego rogu tabeli danych i klikając "Edytuj", a następnie "Kopiuj" lub "Wytnij", aby wkleić wartości do arkusza kalkulacyjnego Excel.
- Kliknij na połączony obraz szkieletu i maski. Zapisz połączony stos obrazów szkieletu/maski jako plik TIFF (Tagged Image File Format), klikając "Plik", "Zapisz jako", "TIFF".
- Zapisz przycięty stos obrazów z kontrastem fazowym (utworzony przy użyciu ROI), klikając "Plik", "Zapisz jako", "TIFF".
- Kliknij okno Menedżer ROI i wybierz ROI używany do przycinania obrazów. Kliknij "Więcej", a następnie "Zapisz", aby zapisać zwrot z inwestycji do wykorzystania w przyszłości.
UWAGA: Użycie tego samego zwrotu z inwestycji pomoże zachować spójność między analizami.
Wyniki
KAV generuje wizualne reprezentacje struktury sieci
Kontrast pomiędzy ECFC a tłem macierzy na obrazach w kontraście fazowym umożliwia programowi KAV identyfikację struktur specyficznych dla komórek. Sieci ECFC zidentyfikowane przez KAV są przedstawione graficznie w formie szkieletu oraz maski, aby zilustrować struktury wykorzystywane przez oprogramowanie do kwantyfikacji (Rysunek 2A). Co istotne, jakościowa ocena reprezentacji szkieletu i maski pozwala na szybką weryfikację czułości i dokładności KAV, co może być pomocne przy ustalaniu optymalnych ustawień progowych oraz interpretacji wyników analizy. Gdy jakość obrazów w kontraście fazowym jest wysoka i osiągnięto wystarczający kontrast, KAV precyzyjnie identyfikuje sieci ECFC, o czym świadczy podobieństwo pomiędzy obrazem w kontraście fazowym a wygenerowanym przez KAV szkieletem i maską (Rysunek 2A oraz Wideo 1).
Alternatywnie, jeśli obrazy w kontraście fazowym nie charakteryzują się wysokim kontrastem i/lub występują artefakty obrazowania, takie jak prążkowanie, dokładność detekcji sieci ulega zmniejszeniu, a wyniki stają się niejednoznaczne (Rycina 2B). Ponadto powstanie pęcherzyków powietrza w pożywce komórkowej może również utrudniać dokładność detekcji (Rycina 2). Problemy z jakością obrazu można jednak często rozwiązać poprzez wybór innych metod progowania dostępnych w oprogramowaniu KAV. Na przykład obraz w kontraście fazowym na Rycynie 2B został przeanalizowany przy użyciu identycznych ustawień przetwarzania obrazu, z wyjątkiem metody progowania. Z wersji szkieletowej (Skeleton) i maski (Mask) wynika, że progowanie metodą Otsu doprowadziło do dokładniejszej detekcji sieci ECFC widocznych na obrazie w kontraście fazowym (Rycina 2B). Zatem jakość obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i znaczących wyników w tym teście. Niemniej jednak różne metody progowania zawarte w interfejsie użytkownika KAV umożliwiają dostosowanie analizy obrazu w zależności od jakości obrazów wejściowych.
Mikroskopia poklatkowa identyfikuje różnice jakościowe i ilościowe w waskulogenezie ECFC po płodowej ekspozycji na cukrzycę ciążową
Niedawno podejście analityczne KAV zostało zastosowane do oceny funkcji płodowych ECFC po ekspozycji na macierną cukrzycę typu 2 (T2DM) in utero16. Dzięki zastosowaniu KAV zidentyfikowano zmienioną kinetykę waskulogenezy w płodowych ECFC eksponowanych na T2DM. Jednakże, poza ekspozycją na T2DM, która występuje przez cały okres ciąży, cukrzyca ciążowa (GDM), czyli rozwój nietolerancji glukozy zazwyczaj w trzecim trymestrze ciąży, również upośledza funkcję ECFC13. W związku z tym zastosowano KAV, aby ustalić, czy ECFC eksponowane na GDM również wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci ECFC. Fazę 1 (0-5 h) i Fazę 2 (5+ h) oceniono za pomocą mikroskopii poklatkowej w połączeniu z analizą KAV (Rycina 3). Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym, pozyskane na początku akwizycji obrazu (0.50 h) oraz w trakcie przebiegu czasowego (5.00 i 10.00 h), przedstawiają tworzenie sieci ECFC w czterech próbkach badanych w jednym dniu eksperymentalnym (Rycina 3 oraz Wideo 1). Pomimo równoważnego zasiewu komórek, co zaobserwowano na obrazach w kontraście fazowym w 0.50 h, różnice jakościowe w strukturze sieci są widoczne w punktach czasowych 5.00 i 10.00 h. ECFC z niepowikłanej ciąży (UC) tworzą złożoną i gęstą sieć 5 godzin po wysianiu, co jest zgodne z naszymi wcześniej opublikowanymi danymi16. Przeciwnie, ECFC z próbki GDM 1 (GDM1) tworzą bardzo niewiele struktur sieciowych, które nie są ze sobą połączone. Wzór ten nie odzwierciedla jednak wszystkich próbek ECFC uzyskanych z ciąż z GDM, co wskazuje na heterogeniczność między próbkami. Próbki GDM2 i GDM3 wykazują większe tworzenie sieci w porównaniu z GDM1, choć wzorce łączności wydają się zmienione w stosunku do próbki UC. Co ważne, KAV mierzy kilka komponentów strukturalnych sieci ECFC, aby zidentyfikować zarówno oczywiste, jak i subtelne fenotypy.
Oprócz generowania obrazów szkieletowych i masek struktury sieci, KAV kwantyfikuje dziesięć parametrów struktury sieci, w tym liczbę poszczególnych struktur sieci, węzłów, węzłów trójdzielnych, węzłów czterodzielnych, odgałęzień, całkowitą długość odgałęzień, średnią długość odgałęzień, stosunek odgałęzień do węzłów, całkowitą liczbę sieci zamkniętych oraz powierzchnię sieci16. KAV kompiluje dane dla każdej próbki w jednej tabeli wartości dla wszystkich obrazów z przebiegu czasowego. Tabela 1 zawiera reprezentatywne surowe dane z jednego badania obrazowania dla jednej próbki ECFC. Parametry struktury sieci mierzone przez KAV są uporządkowane w kolumnach, a dane z kolejnych obrazów pozyskanych w czasie są uporządkowane w wierszach. Na przykład w naszych badaniach obraz 1 został uzyskany 30 min po wysianiu, a kolejne obrazy gromadzono co 15 min. Surowe wartości wygenerowane przez KAV mogą być następnie przedstawione na wykresach lub poddane dalszej analizie przy użyciu bardziej złożonych metod statystycznych16.
Przedstawiono pięć wykresów obrazujących średnie wartości struktury sieci z trzech oddzielnych eksperymentów dla pojedynczej próbki kontrolnej (UC) oraz trzech próbek GDM (Rysunek 4). Próbka UC w tych eksperymentach zachowywała się podobnie do wcześniej analizowanych próbek UC16. Wcześniej zidentyfikowano, że waskulogeneza ECFC in vitro jest dwufazowa i składa się z Fazy 1 (0 - 5 h) oraz Fazy 2 (5 - 10 h)16. Wzorzec ten jest spójny w obecnych badaniach, co potwierdza wykres przedstawiający dane dotyczące zamkniętych sieci (Rysunek 4). Próbka UC utworzyła większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu do wszystkich trzech próbek GDM. Co ciekawe, trzy z czterech próbek wykazują podobny czas osiągnięcia maksymalnej liczby zamkniętych sieci, co następuje między 2,5 a 3 godzinami. Jednak w próbce GDM2 osiągnięcie maksymalnej liczby zamkniętych sieci nastąpiło wolniej, tj. 5 godzin po wysiewie. Ponadto, mimo że próbka GDM2 utworzyła mniej sieci maksymalnych w porównaniu do próbki UC, utworzone sieci były utrzymywane w czasie podobnie jak w próbce UC. Przeciwnie, w przypadku GDM1 i GDM3, które utworzyły mniej sieci w porównaniu do próbki UC, odnotowano również ogólny spadek liczby sieci w czasie. Podsumowując, z wykresu przedstawiającego liczbę zamkniętych sieci wynika, że wszystkie próbki ECFC wykazały dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, jednak tempo ich tworzenia oraz osiągnięta maksymalna liczba sieci różnią się w zależności od próbki.
Pole sieci reprezentuje średnią powierzchnię wewnątrz zamkniętych sieci utworzonych przez ECFCs. W związku z tym, im większa liczba zamkniętych sieci, tym mniejsze są obszary sieci. Wzorzec ten jest odzwierciedlony na wykresach pola sieci, gdzie próbka UC, która utworzyła większą liczbę zamkniętych sieci, wykazywała z czasem mniejsze obszary sieci w porównaniu do trzech próbek GDM (Rycina 4). Próbka GDM2, w której maksymalna liczba zamkniętych sieci została osiągnięta wolniej, wykazywała początkowo duże pole sieci, jednak z czasem obszar ten się ustabilizował, co było najbardziej zbliżone do próbki UC w 15. godzinie. Z biegiem czasu średnie pole sieci we wszystkich próbkach wzrosło z powodu destabilizacji sieci. Jednak niektóre próbki, takie jak GDM1 i GDM3, wykazały szybszy wzrost pola sieci, co prawdopodobnie wskazuje na mniejszą stabilność w porównaniu do pozostałych próbek, w których wzrost był bardziej stopniowy.
ECFCs eksponowane na GDM wykazują obniżoną stabilność sieci
Stosunek odgałęzień do węzłów jest nowym fenotypem obliczanym przez KAV i zidentyfikowanym w naszych poprzednich badaniach, który wskazuje na łączność sieci16. W niniejszym badaniu próbka UC wykazała niski stosunek, co reprezentowało wysoki poziom łączności sieci utrzymywany w czasie (Rysunek 4). Przeciwnie, trzy próbki GDM miały wyższy stosunek odgałęzień do węzłów, szczególnie w fazie 2 tworzenia sieci. Obserwacja ta świadczy o zmniejszonej łączności i destabilizacji struktur sieciowych.
Ogólnie GDM1 utworzyło mniej węzłów i odgałęzień w porównaniu z pozostałymi próbkami, a redukcja ta utrzymała się w trakcie trwania eksperymentu. GDM2 i GDM3 utworzyły i utrzymały większą liczbę odgałęzień w porównaniu z próbką UC, szczególnie między 5 a 15 h. Liczba węzłów wykrytych w sieciach GDM2 i GDM3 była bardziej zbliżona do liczby węzłów w próbce UC, zwłaszcza między 10 a 15 h. Większa liczba odgałęzień przy podobnej liczbie węzłów może wyjaśniać zwiększony stosunek liczby odgałęzień do węzłów, widoczny w późniejszych punktach czasowych w próbkach GDM. Co ważne, jednoczesne zmiany liczby odgałęzień i węzłów mogą być trudne do zinterpretowania na oddzielnych wykresach. Jednakże nowy stosunek liczby odgałęzień do węzłów oferuje sposób oceny tego, jak zmiany w liczbie zarówno odgałęzień, jak i węzłów – w tym niewielkie zmiany trudne do wykrycia na pojedynczych wykresach – wpływają na zmienioną łączność sieci.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający 10 parametrów określanych ilościowo za pomocą kinetycznej analizy waskulogenezy (KAV). Metoda KAV określa ilościowo dziesięć różnych parametrów struktury sieci. Wszystkie parametry są oznaczone kolorami i ponumerowane na schemacie (1-10). Parametry obejmują liczbę odgałęzień (zielony, 1), sieci zamkniętych (niebieski, 2) i węzłów (czerwony, 3), średnią powierzchnię sieci (pomarańczowy, 4), liczbę struktur sieciowych (czarny, 5), węzły trójdzielne (żółty, 6) i węzły czterodzielne (fioletowy, 7), a także całkowitą (9) i średnią (10) długość odgałęzień oraz stosunek liczby odgałęzień do liczby węzłów (10). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 2: Analiza kinetyczna waskulogenezy (KAV) ilościowo określa strukturę sieci. (A) Przedstawienia szkieletowe i maskowe struktur sieci zidentyfikowanych przez KAV na obrazach w kontraście fazowym stanowią wizualizację struktur sieci wykrytych i zmierzonych za pomocą KAV. Pasek skali = 500 µm. (B) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym sieci ECFC 10 h po wysianiu, charakteryzujący się niskim kontrastem i widocznymi liniami siatki powstałymi w wyniku łączenia pojedynczych obrazów. W celu poprawy dokładności pomiarów, w przypadku niskiego kontrastu obrazów fazowych lub wystąpienia artefaktów siatki, wtyczka KAV umożliwia wybór różnych metod progowania, takich jak metoda średniej (Mean) lub metoda Otsu. Przedstawiono szkielety i maski obrazu w kontraście fazowym dla obu metod progowania (Mean oraz Otsu). Obrazy w kontraście fazowym wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wewnątrzmaciczna ekspozycja na GDM zmienia tworzenie sieci ECFC. Obrazy tworzenia sieci ECFC rejestrowano w odstępach 15 min przez 15 h za pomocą mikroskopii kontrastowej. Reprezentatywne obrazy kontrastowe w odstępach 5 h, zaczynając od momentu wysiewu (0,5 h), przedstawiono dla UC oraz trzech próbek GDM. Obrazy kontrastowe wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: ECFC narażone na wewnątrzmaciczny GDM wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci. ECFC pobrano z ciąży niepowikłanej (UC, kolor czarny) oraz z trzech ciąż powikłanych cukrzycą ciążową (GDM 1-3, kolor czerwony). Obrazy w kontraście fazowym rejestrowano w odstępach 15 min przez 15 h. Oprogramowanie Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV) służyło do ilościowego oznaczania zamkniętych sieci, obszarów sieci, odgałęzień, węzłów oraz stosunku odgałęzień do węzłów. Przedstawione dane obrazują średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) z trzech oddzielnych eksperymentów dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wideo 1: Wewnątrzmaciczna ekspozycja na GDM zmienia kinetykę tworzenia sieci ECFC. Obrazy tworzenia sieci ECFC rejestrowano co 15 min przez 15 h za pomocą mikroskopii kontrastowej. Przedstawiono obrazy kontrastowe dla grupy UC oraz trzech próbek GDM w czasie 15 h, zaczynając od 0,5 h. Pasek skali reprezentuje 500 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)
| Obraz | Całkowite sieci rozgałęzień | Węzły | Triplety | Czwórki | Gałęzie | Całkowita długość rozgałęzień* | Średnia długość gałęzi* | Stosunek liczby odgałęzień do liczby węzłów | Sieci zamknięte | Obszar sieciowy** |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| *zaokrąglono do najbliższego mikrona, **zaokrąglono do najbliższego mikrona^2 | ||||||||||
Tabela 1: Reprezentatywne surowe dane z jednego badania obrazowania dla jednej próbki ECFC.
Dyskusja
KAV umożliwia ocenę dużych zbiorów danych z wieloma punktami czasowymi
Tradycyjnie, kwantyfikacja unaczynienia in vitro składała się z jednego lub kilku pomiarów punktu czasowego. To statyczne podejście jest po prostu niewystarczające do uchwycenia i ilościowego określenia dynamicznego i złożonego procesu. W związku z tym opracowano tę nowatorską metodę, aby umożliwić skuteczną analizę kinetyki tworzenia sieci w celu uzyskania wglądu w potencjalne mechanizmy molekularne zaangażowane w dynamiczny proces waskulogenezy. Wydajność i automatyzacja są ważnymi elementami w rozwoju nowatorskich technik generowania i analizowania dużych ilości danych obrazowych. KAV został opracowany specjalnie do analizy dużych stosów obrazów składających się z setek obrazów w celu skrócenia czasu i pracy wymaganego do wyciągnięcia biologicznie znaczących wniosków z zestawów danych poklatkowych. Co ważne, KAV przeprowadza przetwarzanie obrazów i generowanie danych w ciągu kilku sekund w przypadku małych (mniej niż 100 obrazów) stosów obrazów i minut w przypadku większych (powyżej 100 obrazów) stosów obrazów, co skutkuje niezrównaną wydajnością. Dodatkowo, organizacja danych w arkuszach kalkulacyjnych według czasu i mierzonych parametrów umożliwia szybkie generowanie prezentacji graficznej i analizy statystycznej.
Wyzwania związane z skutecznym zastosowaniem tego podejścia
Chociaż test ten obejmuje ulepszenia zarówno w zakresie akwizycji, jak i analizy obrazu, pewne wyzwania mogą utrudnić pomyślne wdrożenie. Cztery główne przeszkody to stabilność wilgotności, precyzja czasu od galwanizacji do akwizycji obrazu, niezawodność oprogramowania i sprzętu oraz zarządzanie dużymi zestawami danych generowanych dla każdego eksperymentu. Stabilne obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin może być wyzwaniem. W szczególności wymagane jest odpowiednie i stałe nawilżanie komór obrazowania. W tym teście stosuje się szkiełka do angiogenezy, które są przeznaczone do równoległego wykonywania testów angiogenezy opartych na matrycy. Ich niewielka objętość, około 50 μl, sprawia, że parowanie i kondensacja są istotne w przypadku przedłużonych warunków hodowli. Aby zwalczyć ten eksperymentalny problem, konieczne jest użycie inkubatora, który reguluje wilgotność. Jednak może być również konieczne rozszerzenie tej regulacji, jeśli z czasem dojdzie do nadmiernego wysuszenia komory obrazowania. Odkryliśmy, że najprostszym podejściem do zwiększenia wilgotności jest zwiększenie powierzchni wody w komorze. Aby osiągnąć ten cel, nasz protokół sugeruje następujące trzy źródła wody: drugą zjeżdżalnię komorową wypełnioną wodą, w której mierzona jest również temperatura inkubatora, wodę w obszarze otaczającym studnie na zjeżdżalniach oraz zwilżoną bibułę filtracyjną lub chusteczki. I odwrotnie, kondensacja występuje, gdy temperatura powietrza w pomieszczeniu schładza dno zjeżdżalni, a wilgoć wewnątrz komory skrapla się na zjeżdżalniach i studzienkach. To powikłanie może prowadzić do rozcieńczenia podłoża komórkowego i efektu soczewkowania, który zakłóca kontrast fazowy. W badaniach tych kondensacja została zminimalizowana poprzez zastosowanie ogrzanego powietrza (39-42 °C) na dnie szkiełka.
Kluczową kwestią w każdym badaniu poklatkowym jest spójność między rozpoczęciem eksperymentu a obrazowaniem. Czas, w którym rozpoczyna się obrazowanie, ma kluczowe znaczenie dla interpretacji dalszych zdarzeń. Aby zapewnić precyzję czasową tego testu, czas między początkowym posiewem a pierwszym zobrazowanym punktem czasowym powinien być ściśle kontrolowany. W praktyce ten "martwy czas" można zminimalizować, ale co ważniejsze, musi on być spójny, aby umożliwić porównywanie eksperymentów w różnych dniach. Na przykład w tym protokole spodziewamy się czasu martwego wynoszącego około 30 minut. Może to być ułatwione dzięki bliskości urządzeń do przygotowania i obrazowania eksperymentalnego.
To, co na pierwszy rzut oka może wydawać się prozaicznymi szczegółami, jest ważne dla stabilności oprogramowania, sprzętu i zarządzania danymi. Oprogramowanie i powiązane sterowniki sprzętowe, środowisko sieciowe i automatyczne aktualizacje oprogramowania mają wpływ na stabilność oprogramowania. Warto przetestować ten protokół w "próbie na sucho", aby zidentyfikować wąskie gardła i potencjalne źródła problemów w akwizycji obrazu; Na przykład sprawdź, czy nie ma zawodnej konfiguracji Live Cell, niezawodności sceny, migawki i kamery oraz instytucjonalnych zasad informatycznych dotyczących automatycznych aktualizacji systemu operacyjnego i oprogramowania.
Zarządzanie danymi jest stałym problemem każdego eksperymentu obrazowego, który generuje setki lub tysiące obrazów. Na szczęście komercyjne oprogramowanie często sprawdza dostępne miejsce przed rozpoczęciem eksperymentu z obrazowaniem. Jednak test ten obejmuje również przetwarzanie i analizę obrazu po przechwyceniu, co może zwiększyć obciążenie miejsca na dysku twardym i zakłócać eksperymenty obrazowe, jeśli dostępna przestrzeń jest ograniczona. Co więcej, nie można zagwarantować bezpieczeństwa i stabilności komputera, nawet w przypadku rozwiązań sprzętowych, takich jak nadmiarowa tablica identycznych dysków. W związku z tym konieczna jest strategia zarządzania danymi w celu zapewnienia miejsca na dyskach twardych komputera na trwające eksperymenty oraz solidna zdalna archiwizacja, na przykład z wykorzystaniem instytucjonalnych zasobów archiwizacyjnych.
Strategie maksymalizacji jakości obrazu
Chociaż zdolność KAV do dokładnego odróżniania ECFC od tła matrycy jest solidna, czułość testu zależy od jakości obrazu. Na przykład, jeśli obraz ma niski kontrast, oprogramowanie wykryje sieci komórkowe z mniejszą dokładnością (rysunek 2B). Na jakość kontrastu fazowego ma wpływ kilka czynników, w tym ustawienia mikroskopu używanego do akwizycji obrazu, ładowanie matrycy i pożywki zawiesinowej komórek podczas przygotowywania testu oraz utrzymanie poziomu pożywek w studzienkach przez cały okres obrazowania. Aby zoptymalizować kontrast fazowy dla tych testów, dokonano drobnych korekt wyrównania pierścienia fazowego w mikroskopie w celu poprawy kontrastu. Ponadto przygotowanie próbki zostało rygorystycznie przetestowane, aby zapewnić równomierne i spójne ładowanie nośników. Jeśli ilość matrycy i/lub mediów załadowanych do studzienek jest poniżej lub powyżej optymalnego zakresu, może powstać menisk prowadzący do zmiany kontrastu fazowego. Wreszcie, ze względu na małą objętość cieczy w studniach, bardzo ważne jest utrzymanie poziomu mediów poprzez zminimalizowanie parowania i kondensacji, jak wspomniano powyżej. Ogólnie rzecz biorąc, optymalizacja testów ma kluczowe znaczenie dla generowania wysokiej jakości obrazów kontrastowych do analizy.
Oprócz jakości kontrastu fazowego, na wyniki testu mogą również wpływać inne czynniki, w tym zanieczyszczenie podłoża, niedoskonałości matrycy oraz cząstki lub zanieczyszczenia w matrycy lub pożywce. Zanieczyszczenie jest zagrożeniem związanym z tym testem, ponieważ obejmuje ono obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin w komorze mikroskopowej. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, matryca i zawiesiny komórek są ładowane na szkiełko w sterylnym kapturze. Ponadto każda próbka jest zwykle platerowana lub potrójna na potrzeby eksperymentu, aby zminimalizować ryzyko utraty danych z powodu nieprzewidzianych problemów, takich jak zanieczyszczenia lub cząstki zakłócające analizę.
Heterogeniczność próbek napędza potrzebę zwiększenia czułości testu
Heterogeniczność została zaobserwowana i opisana w poprzednich badaniach ECFC narażonych na GDM13. Spekuluje się, że wysoki poziom niejednorodności funkcji komórek obserwowany w tych próbkach można przypisać kilku czynnikom, w tym ciężkości choroby matki, czasowi trwania choroby i stylowi leczenia stosowanemu do regulacji poziomu glukozy we krwi. Co ważne, to analityczne podejście pozwala uchwycić dynamiczny zakres unaczynienia ECFC, dzięki czemu możliwe jest zidentyfikowanie różnic fenotypowych wynikających z niejednorodności funkcjonalnej w próbkach pochodzących z ciąż w ciąży z cukrzycą ciążową. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie pierwotnych próbek pacjentów, takich jak te użyte w tych badaniach, może wprowadzić większą zmienność w porównaniu z linią komórkową. Ponieważ większy nacisk kładzie się na badania translacyjne obejmujące wiele pierwotnych próbek zwierzęcych lub ludzkich o zmienności funkcjonalnej, czułość testu ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania i wyprowadzania biologicznie znaczących pomiarów i wniosków. W związku z tym rozwój podejść takich jak KAV poprawi ilość i jakość danych generowanych przez testy unaczynienia i angiogenezy in vitro , aby umożliwić bardziej wiarygodne obserwacje i wnioski. Co więcej, dane te ułatwią przyszłe badania podstawowych mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do zmiany waskulogenezy ECFC po wewnątrzmacicznym narażeniu na GDM.
Przyszłe zastosowania tego podejścia
Chociaż metoda ta została zastosowana do oceny unaczynienia ECFC płodu in vitro w tych badaniach, potencjalne zastosowania tego podejścia są liczne. Technikę tę można łatwo zastosować do badania dowolnej populacji komórek, która uczestniczy w procesach waskulogenezy lub angiogenezy. W szczególności można go wykorzystać do badania pojedynczych populacji komórek, jak wykazano w tym badaniu, ale można go również zastosować do systemów kohodowli. W przyszłości korzystne byłoby rozszerzenie tego podejścia poza dwuwymiarowy test in vitro w celu oceny modeli trójwymiarowych (3D). Chociaż obecna wersja KAV byłaby niewystarczająca do ilościowego określenia danych obrazowania 3D, podobnie zaprojektowane poklatkowe, wieloparametryczne podejście analityczne przeznaczone specjalnie dla modeli 3D lub in vivo dostarczyłoby informacji, czy obserwacje wykonane w dwuwymiarowym in vitro są reprezentatywne dla funkcji komórki w bardziej istotnych biologicznie warunkach.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. Davidowi Haasowi, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass i Emily Sims (Angio BioCore w Indiana University Simon Cancer Center) za doskonałą pomoc techniczną w pozyskiwaniu próbek ECFC. Autorzy dziękują również doktorom Maureen A. Harrington, Edwardowi F. Srourowi, Richardowi N. Dayowi, Mervinowi C. Yoderowi i Matthiasowi A. Claussowi (Indiana University School of Medicine) za dyskusję naukową, a także Janice Walls (Indiana University School of Medicine) za wsparcie administracyjne. Wszystkie obrazowania zostały wykonane w Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 i U10 HD063094) oraz Riley Children's Foundation. Dodatkowo, publikacja ta była możliwa dzięki częściowemu wsparciu ze strony Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Award # T32 HL007910.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytki do hodowli tkankowych 100 mm | Fisher | 353003 | |
| 15 ml probówki stożkowe | Fisher | 1495949B | |
| Angiogeneza 15-dołkowe mikropreparaty | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
| Surowica bydlęca płodu | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA Antymiocytarny, antybiotyk | Fisher | MT30004C1 | Dodano 5 ml na 500 ml butelki pożywki EGM2. |
| 0,5% trypsyny/0,53 nM EDTA w HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100 mg płynu, zakres stężeń 3-4 mg/mL. Rozcieńczyć w 20 nM kwasie octowym w ddH2O do użycia w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml. |
| Lodowaty kwas octowy | Fisher | A38-212 | Stosowany w roztworze kolagenu typu 1 w końcowym stężeniu 20 nM. |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
| Szkiełko komorowe | Ibidi | 80296 | Szkiełko to można napełnić wodą destylowaną, aby utrzymać wilgotność w komorze obrazowania. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x roztwór, pH 7,2 |
| Mikroskop Instrumenty firmy Nikon | MEA53100 i MEF55030 | Zmotoryzowany TiE, w tym pierścień fazowy Ph1 do kontrastu fazowego z obiektywnym | |
| Stage | Wcześniejsze instrumenty | ProScan II | Można stosować inne OKOlab i Nikon Elements Stopień kompatybilny z AR |
| Obiektyw | Instrumenty Nikon 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X | |
| Kamera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| Stage | Blower Precyzyjne sterowanie | Nie dotyczy | Ten produkt został wycofany, alternatywy obejmują Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W) firmy World Precision Instruments |
| Stage-top Inkubator | OKOLabs | H301 | BoldLine z dwupozycyjnym uchwytem na suwak |
| Komputer | Hewlett-Packard | Z620 lub równoważny | 4-rdzeniowy procesor Intel Xeon, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, karta graficzna nVidia Quadro |
| Oprogramowanie Nikon Elements | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition to wielowymiarowe narzędzie konfiguracyjne służące do konfiguracji oprogramowania Elements. |
| Oprogramowanie FIJI (ImageJ) | N/A | N/A | Bezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| Wtyczka KAV | Nie | Nie dotyczy Bezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
Bibliografia
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601(2012).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298(2011).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
- Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
- Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
- Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471(2014).
- Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
- Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
- Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
- WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
- Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
Przedruki i uprawnienia
