Artykuł metodologiczny

Systematyczna ocena dobrostanu myszy przed zabiegami ze względu na znieczulenie ogólne

DOI:

10.3791/57046

⸱

20 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 2Institute of Pharmacology and Toxicology, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 4Unit of Physiology, Pathophysiology and Experimental Endocrinology, Department of Biomedical Sciences, University of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokół oceny samopoczucia myszy podczas zabiegów z użyciem znieczulenia ogólnego. Przeanalizowano szereg parametrów behawioralnych wskazujących na poziom dobrostanu, a także metabolity glikokortykosteroidów. Protokół może służyć jako ogólna pomoc w oszacowaniu stopnia ciężkości w sposób naukowy, skoncentrowany na zwierzętach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z Zasadą 3R (Wymiana, Redukcja, Udoskonalenie) opracowaną przez Russela i Burcha, badania naukowe powinny wykorzystywać alternatywy dla eksperymentów na zwierzętach, gdy tylko jest to możliwe. W przypadku gdy nie ma alternatywy dla doświadczeń na zwierzętach, całkowita liczba wykorzystanych zwierząt laboratoryjnych powinna być minimalna potrzebna do uzyskania cennych danych. Ponadto należy zastosować odpowiednie środki udoskonalające, aby zminimalizować ból, cierpienie i dystres towarzyszące procedurze eksperymentalnej. Kategorie używane do klasyfikacji stopnia bólu, cierpienia i dystresu to brak powrotu do zdrowia, łagodny, umiarkowany lub ciężki (dyrektywa UE 2010/63). Aby określić, które kategorie mają zastosowanie w poszczególnych przypadkach, konieczne jest użycie narzędzi uzasadnionych naukowo.

Przedstawiony tutaj protokół oceny samopoczucia jest przeznaczony do zabiegów, podczas których stosuje się znieczulenie ogólne. Protokół koncentruje się na aktywności w klatce domowej, skali grymasu myszy i luksusowych zachowań, takich jak kopanie w ziemi i budowanie gniazda, jako wskaźnikach dobrego samopoczucia. Wykorzystuje również swobodny paradygmat eksploracyjny dla zachowań związanych z lękiem. Metabolity kortykosteronu w kale jako wskaźniki ostrego stresu są mierzone w ciągu 24-godzinnego okresu po znieczuleniu.

Protokół dostarcza naukowo solidnych informacji na temat samopoczucia myszy po znieczuleniu ogólnym. Ze względu na swoją prostotę, protokół można łatwo dostosować i zintegrować z planowanym badaniem. Chociaż nie zapewnia skali do klasyfikowania stresu w kategoriach zgodnie z dyrektywą UE 2010/63, może pomóc badaczom oszacować stopień powagi procedury przy użyciu naukowo uzasadnionych danych. Stanowi sposób na poprawę oceny dobrostanu w sposób naukowy, skoncentrowany na zwierzętach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dyrektywa UE 2010/631 stanowi, że zasada 3R (Wymiana, Redukcja, Udoskonalenie) opracowana przez Russela i Burcha2 ma być stosowana zawsze, gdy konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów na zwierzętach. Ostatecznym celem dyrektywy UE jest stopniowe wycofywanie wszelkich testów na zwierzętach, ale dyrektywa przyznaje, że na razie niektóre doświadczenia na zwierzętach są nadal potrzebne do prowadzenia badań, które będą chronić zdrowie ludzi i zwierząt. W związku z tym, jeżeli doświadczenie na zwierzętach nie może być zastąpione żadną alternatywną metodą, w celu uzyskania wiarygodnych wyników należy użyć jedynie minimalnej liczby zwierząt laboratoryjnych. Ponadto ilość bólu, cierpienia i dystresu towarzyszących procedurom eksperymentalnym powinna być zminimalizowana za pomocą odpowiednich środków udoskonalających. Dyrektywa UE 2010/63 stanowi, że dotkliwość procedury musi być prospektywnie sklasyfikowana jako brak powrotu do zdrowia, łagodna, umiarkowana lub ciężka1. Z uwagi na fakt, że klasyfikacja dotkliwości jest ustalana indywidualnie dla każdego przypadku, ważne jest, aby dysponować naukowo uzasadnionymi narzędziami do oszacowania dotkliwości danej procedury.

Arkusze wyników zaproponowane przez Mortona i Griffitha3 są niezbędnym narzędziem do wykrywania wszelkich odchyleń od normalnego stanu, w tym negatywnego wpływu na samopoczucie4. Arkusze wyników służą do retrospektywnego określenia bólu, cierpienia i dystresu spowodowanego eksperymentem i skupienia się na widocznych zmianach w stanie fizycznym danego zwierzęcia (np. masa ciała, sierść, chód). Chociaż załącznik VIII do dyrektywy UE 2010/63 zawiera przykłady każdej kategorii dotkliwości, badaczom nadal brakuje narzędzi do oszacowania stopnia dotkliwości danej procedury na podstawie danych naukowych opartych na podstawach naukowych.

Brak wskaźników wskazujących na negatywne samopoczucie nie jest jedynym sposobem na określenie stanu zwierzęcia; obecność wskaźników wskazujących na pozytywne samopoczucie jest również ważna5,6,7,8. Na przykład zwierzęta wykazują luksusowe zachowania, takie jak kopanie w ziemi i budowanie gniazda, tylko wtedy, gdy wszystkie ich podstawowe potrzeby są zaspokojone. Jeśli dobre samopoczucie jest zmniejszone, zachowania luksusowe są pierwszymi, które spadają5,7. Protokoły, które mają być stosowane w ocenie dobrostanu, powinny zawierać wskaźniki wskazujące na stan fizyczny, fizjologiczny/biochemiczny i psychologiczny zwierząt w celu oceny ich dobrostanu w sposób szczegółowy i kompleksowy9.

W kontekście udoskonalenia, opracowano protokół, który spełnia te wymagania i ocenia wpływ procedury obejmującej znieczulenie ogólne na samopoczucie myszy10. Jednocześnie celem było zminimalizowanie dodatkowego stresu, aby umożliwić łatwą integrację protokołu z danym eksperymentem. Protokół uwzględnia zachowanie związane z kopaniem, zachowanie w klatce domowej, takie jak aktywność, przyjmowanie pokarmu i gniazdowanie, oraz zachowanie związane z lękiem. Ponadto obejmuje Skalę Skrzywienia Myszy (MGS) oraz nieinwazyjną analizę metabolitów kortykosteronu w kale. Protokół ma na celu ułatwienie oceny dobrostanu w sposób naukowy i skoncentrowany na zwierzętach oraz dostarczenie informacji na temat dobrostanu, które wspierają klasyfikację stopnia nasilenia. Oprócz arkuszy punktacji może dostarczyć przydatnych informacji do klasyfikacji ciężkości procedury. Ponieważ protokół jest łatwy do przeprowadzenia i nie wymaga rozbudowanego sprzętu, można go zintegrować z trwającym eksperymentem bez wpływu na wyniki badania. Należy zauważyć, że wytyczne Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)11 mają być przestrzegane we wszystkich badaniach obejmujących eksperymenty na zwierzętach, w celu poprawy projektowania, analizy i raportowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt i zostało zatwierdzone przez berliński Urząd Państwowy ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", numer zezwolenia: G0053/15).

UWAGA: Głównym celem tego protokołu było zbadanie wpływu powtarzanego znieczulenia na metabolity glikokortykosteroidów. Przeprowadzono obliczenia wielkości próby w celu określenia liczby zwierząt, które mają być wykorzystane: n ≥ 2 × (s/μ1- μ2)2 × (zα + zβ)2. μ1- μ2 to różnica między średnimi populacji, przy których oblicza się moc, a wielkością próby (α = 5%, β = 80%); zα = 1,96 i zβ = 0,84 są kwantylami standardowego rozkładu normalnego. Rysunek 1 ilustruje linię czasową tego protokołu. Jeżeli parametr protokołu wykazuje różnicę w stosunku do poziomu kontroli, zwierzę powinno być ściśle monitorowane, a parametr powinien być ponownie mierzony po upływie odpowiedniego okresu. Na przykład, jeśli zachowanie związane z lękiem jest nasilone, zachowanie to powinno być ponownie przetestowane tydzień później, aby pomóc określić okres do pełnego wyzdrowienia. Punkty czasowe i okresy określone w niniejszym protokole mogą być dostosowane do stosowania z innymi procedurami. Przy zmianie punktów czasowych należy zachować okresy przyzwyczajenia zgodnie z opisem w protokole. W celu ograniczenia czynników, które mogą wpływać na zachowanie myszy, testy wymagające większej manipulacji powinny być przeprowadzane po testach, które nie zaburzają normalnego zachowania myszy. Rysunek 2 podsumowuje wszystkie testy protokołu za pomocą podsumowującego arkusza punktacji. Rysunek 3 przedstawia uproszczone skale oceny dobrego samopoczucia, które dają przegląd tego, jak interpretować wyniki testu.

1. Przyzwyczajenie myszy do obchodzenia się z nimi przez eksperymentatora

  1. Pozwól myszom przyzwyczaić się do obiektu dla zwierząt przez co najmniej 2 tygodnie po ich pozyskaniu z innego obiektu lub sprzedawcy.
  2. Myszy trzymane w grupach i utrzymywane w standardowych warunkach (temperatura pokojowa 22 ± 2 °C; wilgotność względna 55 ± 10%) w cyklu światło: ciemność trwającym 12:12 h.
  3. Zapewnij wszystkim grupom tunel i bawełniane gniazda jako standardowe urozmaicenie, a także zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.
  4. Przyzwyczaj wszystkie myszy do obsługi tunelu i/lub kubka co najmniej tydzień przed badaniem12.
    UWAGA: Chwytanie myszy za ogon może wywoływać stres lub niepokój, co z kolei wpływa na samopoczucie, a także ma wpływ na wyniki tego protokołu12.

2. Przygotowanie sali do testów behawioralnych i aparatury

UWAGA: Zapewnij osobne pomieszczenie do testowania, najlepiej w pobliżu pomieszczenia, w którym trzymane są zwierzęta. Myszy należy przetransportować w ich domowych klatkach do pomieszczenia testowego co najmniej 60 minut przed przeprowadzeniem zabiegu. Jeśli to możliwe, wszystkie testy tego protokołu należy przeprowadzić w tym samym pomieszczeniu testowym, w którym przeprowadzana jest procedura.

  1. Przygotuj klatkę obserwacyjną, aby przetestować zachowanie podczas kopania8 i zrobić zdjęcia do wykorzystania w MGS13 (Rysunek 4).
    1. Użyj szklanego pudełka o powierzchni podłogi około 220 mm × 290 mm i wysokości 390 mm.
    2. Przykryj podłogę tego pudełka około 0,5 cm materiału pościelowego.
    3. Rozrzuć garść zużytego materiału pościelowego z domowej klatki na wierzchu nowego materiału pościelowego, aby zmniejszyć stres spowodowany nowym środowiskiem.
    4. Zapewnij jedzenie, takie samo jak to, które jest zwykle dostarczane jako dieta, oraz wodę.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, używaj butelek z wodą, ponieważ myszy mogą napełniać miski z wodą materiałem pościelowym.
  2. Przygotuj klatkę (typ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) na 24-godzinny okres obserwacji, dla której myszy są trzymane indywidualnie (Rysunek 5).
    UWAGA: Aby zminimalizować czas przebywania poszczególnych osób, należy zebrać dane dotyczące zachowań związanych z budową gniazd, aktywności klatki domowej, spożycia pokarmu i metabolitów kortykosteronu w kale (FCM) w tym okresie.
    1. Umieść nowy materiał ściółkowy w klatce (na głębokość około 0,5 cm) i rozsyp garść zużytego materiału ściółkowego bez kału z klatki domowej na wierzchu nowego materiału, aby zmniejszyć stres.
    2. Zapewnij znormalizowane kwadratowe gniazdo bawełniane o określonej wadze, wyłącznie jako wzbogacenie środowiska (patrz tabela materiałów)14.
      UWAGA: Gniazda komercyjne mogą różnić się wagą. W związku z tym zmodyfikowaliśmy wagę gniazda opisanego przez Deacona i użyliśmy 2,0 g zamiast 2,7 g14.
    3. Zamontuj czujnik podczerwieni na górze klatki, gdy używasz czujnika podczerwieni do pomiaru aktywności klatki domowej (patrz tabela materiałów).
    4. Dostarczaj jedzenie, tego samego rodzaju, które jest zwykle dostarczane jako dieta, i wodę ad libitum.

3. Skala grymasu myszy

UWAGA: Zdjęcia do MGS są wykonywane w klatce obserwacyjnej w trzech punktach czasowych: (i) 2 dni przed zabiegiem, aby zarejestrować wyjściowe poziomy MGS, (ii) 30 minut po zabiegu, oraz (iii) 150 minut po zabiegu. Kiedy samopoczucie jest osłabione, wyniki MGS wzrastają. Jeśli po 150 minutach nadal obserwuje się zwiększone wyniki MGS, wykonaj dodatkowe zdjęcia na późniejszym etapie.

  1. Do fotografowania używaj aparatu o wysokiej rozdzielczości.
  2. Delikatnie przenieś mysz do klatki obserwacyjnej i pozwól myszy przyzwyczaić się do nowego środowiska przez co najmniej 30 minut.
  3. Wykonaj w sposób ciągły około 30 - 40 zdjęć dla każdego punktu czasowego w ciągu 1 - 2 minut.
  4. Posortuj wszystkie fotografie, zaznaczając ostre zdjęcia z przodu lub z boku i odrzucając rozmyte zdjęcia lub fotografie przedstawiające twarze myszy z innej perspektywy niż widok z przodu lub z boku.
  5. Losowo wybierz jedno zdjęcie z każdego punktu czasowego (tj. 2 dni przed zabiegiem, 30 minut po zabiegu i 150 minut po zabiegu) dla każdej myszy.
  6. Przytnij zdjęcia tak, aby wyświetlały tylko głowę myszy, tak aby pozycja ciała nie była widoczna13.
  7. Utwórz plik arkusza kalkulacyjnego z jednym arkuszem dla każdego zdjęcia i dodaj tabelę zawierającą pięć jednostek działania twarzy MGS do każdego arkusza.
    UWAGA: Plik zawiera zdjęcia bazowe, a także zdjęcia po zabiegu.
  8. Losowo uporządkuj kolejność arkuszy.
  9. Przedstaw plik na ekranie komputera trzem niezależnym osobom, które zostały wcześniej przeszkolone w korzystaniu z MGS opracowanego przez Langforda i wsp., i poproś ich, aby ocenili jednostki działania twarzy za pomocą 3-punktowej skali (0 = nieobecny, 1 = umiarkowanie obecny, 2 = oczywiście obecny).
    UWAGA: Punktacja opiera się na następujących parametrach13: Zaostrzenie oczodołu ("zwężenie obszaru oczodołu, z mocno zamkniętą powieką lub ściśnięciem oka"); wybrzuszenie nosa ("zaokrąglone przedłużenie skóry widoczne na grzbiecie nosa"); wybrzuszenie policzka ("wypukły wygląd mięśnia policzkowego"); pozycja uszu ("uszy rozsunięte i odchylone do tyłu od ich pozycji wyjściowej lub z pionowymi grzbietami, które tworzą się w wyniku cofnięcia końcówek uszu"); zmiana wąsów ("ruch wąsów od ich pozycji wyjściowej albo do tyłu, względem twarzy, albo do przodu, jakby stały na końcu; wąsy mogą się również zlepiać").
  10. Przeanalizuj wyniki w następujący sposób (na podstawie Langford i wsp.13).
    1. Uśrednij wszystkie jednostki działania twarzy dla każdego zdjęcia, aby wygenerować wynik MGS.
      UWAGA: Jeśli nie można było ocenić jednej z jednostek działania twarzy, należy uśrednić pozostałe jednostki działania twarzy.
    2. Odejmij średnią dla zdjęć bazowych od średniej dla zdjęć po procedurze, aby uzyskać wynik różnicy MGS dla każdej myszy.
    3. Test na różnice w wynikach różnic MGS między osobami (test nieparametryczny dla próbek powiązanych).
      UWAGA: Jeśli różnica jest znacząca (p < 0,05), określ, czy wyniki wszystkich fotografii, czy tylko wyniki kilku fotografii różnią się między osobami. Jeśli to ostatnie jest prawdą, należy powtórzyć punktację tych zdjęć. W przeciwnym razie osoby powinny powtórzyć szkolenie MGS, a następnie ponownie ocenić zdjęcia.
    4. Uśrednij wyniki różnic MGS uzyskane od różnych punktatorów dla każdej myszy, jeśli wyniki wszystkich osób nie różnią się znacząco.
    5. Użyj nieparametrycznego testu statystycznego, aby porównać wyniki różnic MGS uśrednione między badanymi grupami.

4. Zachowanie podczas kopania8,15,16

  1. Przygotuj nory, umieszczając 140 ± 2 g granulek żywności zwykle dostarczanych jako dieta w standardowej, nieprzezroczystej plastikowej butelce na wodę (250 ml, 150 mm długości, 55 mm średnicy, 45 mm średnicy szyjki butelki)8.
    UWAGA: Ponieważ myszy preferują szerokie rurki, można używać nor o średnicy 68 mm zgodnie z opisem w Deacon16.
  2. Umieść norę wypełnioną granulkami żywności w klatce domowej na 5 dni przed zabiegiem aklimatyzacji.
    UWAGA: Zwykły dozownik żywności w klatce nie powinien być opróżniany, ale powinien również pozostać wypełniony granulkami żywności, ponieważ myszy są do tego przyzwyczajone.
  3. Wykonaj test dwukrotnie, 2 dni przed zabiegiem (punkt odniesienia); wykonaj również ostatnie 30 minut po zabiegu.
    1. Pozwól myszy przyzwyczaić się przez co najmniej 30 minut do klatki obserwacyjnej, w której zostały zrobione zdjęcia do MGS.
    2. Umieść plastikową butelkę na wodę wypełnioną granulkami żywności równolegle do tylnej ściany klatki obserwacyjnej.
    3. Zważyć granulki pokarmu (g) pozostające w norze po 2 godzinach.
  4. Oblicz wagę granulek pokarmu usuniętych z nory przez myszy w stosunku do masy początkowej (%).

5. 24-godzinny okres obserwacji

UWAGA: Myszy są trzymane indywidualnie, jak opisano w 2.2. (Rysunek 5), przez okres 24 godzin, w celu zmierzenia spożycia pokarmu, aktywności w klatkach domowych, zachowań związanych z budowaniem gniazd i poziomów FCM. 24-godzinna obserwacja odbywa się dwukrotnie: (i) 2 dni przed zabiegiem dla poziomów wyjściowych, (ii) w dniu zabiegu.

  1. Pokarmu
    1. Waż myszy w regularnych odstępach czasu (np. 2 dni przed znieczuleniem, bezpośrednio przed znieczuleniem, 2 dni po znieczuleniu i co tydzień po znieczuleniu), aby ocenić wszelkie zmiany masy ciała (część arkusza wyników).
      UWAGA: Masa ciała jest wymagana do obliczenia spożycia pokarmu na gram masy ciała. Pobór wody może być również mierzony podczas 24-godzinnego okresu obserwacji. Jeśli spożycie pokarmu zostanie zmniejszone, samopoczucie może być osłabione.
    2. Określić początkową masę standardowej diety żywnościowej (w gramach) podanej w jednostce pokarmowej klatki (około 100 g).
    3. Określ wagę standardowej diety żywnościowej na koniec 24-godzinnego okresu obserwacji.
    4. Dokładnie przeskanuj stronę klatki pod jednostką spożywczą pod kątem rozlania żywności i dodaj wszelkie dodatkowe granulki żywności znalezione do masy granulek żywności pozostających w jednostce żywnościowej.
    5. Oblicz spożycie pokarmu na jednostkę masy ciała.
  2. Aktywność w klatce domowej
    UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczą korzystania z czujnika podczerwieni (patrz tabela materiałów), ale aktywność klatki domowej można również ocenić za pomocą alternatywnych programów. Odchylenie aktywności klatki domowej od poziomów kontrolnych (np. niedoczynność, nadpobudliwość) może być oznaką pogorszenia samopoczucia.
    1. Uruchom program.
    2. Wybierz interwał próbkowania wynoszący 1 minutę i czas akwizycji 24 godziny, co oznacza, że impulsy są rejestrowane co minutę przez 24 godziny
      UWAGA: Jeśli eksperymentator wejdzie do pokoju kilka razy po rozpoczęciu nagrywania, należy użyć tylko danych z okresów, kiedy myszy nie były niepokojone (tj. w okresie ciemności).
    3. Zsumuj 10-minutowe interwały impulsów.
    4. Oblicz obszar pod krzywą czasu (impulsy × min).
  3. Zachowanie podczas budowania gniazda
    UWAGA: Złożone i wysokie gniazda mogą służyć jako wskaźnik dobrego samopoczucia.
    1. Umieść kwadratowe gniazdo bawełniane (patrz Tabela materiałów) o określonej wadze (np. 2,0 g) na środku klatki.
    2. Oceń gniazdo w 5-punktowej skali (patrz poniżej) zgodnie z Deacon14 następnego ranka, około 2 godziny po zapaleniu światła. Zważ wszystkie nierozerwane kawałki gniazda, które stanowią co najmniej 5% początkowej masy gniazda. Oceń gniazda w następujący sposób14
      1. Przypisz wynik "1", jeśli 90% gniazda jest nienaruszone.
      2. Przypisz wynik "2", jeśli jest nienaruszony w 50 - 90%.
      3. Przypisz punktację "3", jeśli 50 - 90% gniazda jest rozdrobnione.
      4. Przypisz wynik "4", jeśli więcej niż 90% jest rozdrobnione, ale gniazdo jest płaskie, a mniej niż 50% jego obwodu jest wyższe niż wysokość ciała myszy zwiniętej w kłębek.
      5. Przyznaj wynik "5", jeśli więcej niż 90% gniazda jest rozdrobnione, a gniazdo jest wysokie, a więcej niż 50% jego obwodu jest wyższe niż wysokość ciała zwiniętej myszy.
  4. Metabolity kortykosteronu w kale
    UWAGA: Wzrost FCM powyżej poziomu kontrolnego odzwierciedla poziomy ostrego stresu w ciągu 24-godzinnego okresu postanestetycznego.
    1. Pod koniec 24-godzinnego okresu obserwacji zbierz wszystkie suche granulki kału z klatki za pomocą kleszczy i wyeliminuj mokre granulki zanieczyszczone moczem.
    2. Ekstrakt FCM według Palme i wsp.17, jak następuje.
      1. Suche próbki kału w temperaturze 60 - 70 °C.
      2. Homogenizuj próbki kału za pomocą moździerza.
      3. Wstrząsnąć podwielokrotnością 0,05 g z 1 ml 80% metanolu w probówce wirówkowej przez 30 minut na wielowirówce.
      4. Odwirować próbki o masie 2500 x g przez 15 minut.
      5. Odpipetować 0,5 ml supernatantu do innej probówki wirówkowej.
      6. Próbki kału (i ekstrakty) należy przechowywać w temperaturze co najmniej -18 °C.
      7. Analizuj FCM za pomocą testu immunoenzymatycznego 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one (EIA)18,19 lub innego w pełni zweryfikowanego EIA.
    3. Obliczyć procentową zmianę stężeń FCM w stosunku do wyjściowych stężeń FCM.

6. Swobodny paradygmat eksploracyjny

  1. Wyjmij klatkę domową ze stojaka i umieść ją na powierzchni stołu pod koniec 24-godzinnego okresu obserwacji.
  2. Umieść górną część klatki z kratką (bez jedzenia i butelek z wodą) w klatce pod kątem 45° do dłuższego boku klatki.
    UWAGA: Nie niszcz gniazda, które służy jako kryjówka dla myszy, ale umieść klatkę na górze po przekątnej nad gniazdem.
  3. Monitoruj lub nagrywaj myszy przez 10 minut z odległości około 1.5 m.
    1. Uruchom minutnik.
    2. Zanotuj wszystkie momenty, w których mysz wspina się na górę klatki (ze wszystkimi czterema łapami na górze klatki) lub opuszcza górę klatki (z jedną lub więcej łapami na podłodze klatki).
      UWAGA: Niektóre myszy mogą wspiąć się na górę klatki i opuścić ją, aby przejść wzdłuż krawędzi klatki. Niektóre myszy również chowają się na górze klatki. Traktuj te przypadki tak, jakby myszy nadal znajdowały się na górze klatki.
  4. Oceń parametry zgodnie z i wsp.20.
    1. Analizuj opóźnienie do pierwszej eksploracji (w sekundach).
    2. Analizuj liczbę eksploracji.
    3. Analizuj całkowity czas trwania (w sekundach) eksploracji.
      UWAGA: Duże opóźnienie do pierwszej eksploracji, mała liczba eksploracji i krótki całkowity czas trwania eksploracji mogą wskazywać na wyższy poziom lęku przed cechą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został pierwotnie opracowany do oceny samopoczucia myszy C57BL/6JRj po pojedynczym doświadczeniu znieczulenia izofluranem (jedna 45-minutowa sesja znieczulenia, n = 13 samic) lub powtórzonym znieczuleniem izofluranem (sześć 45-minutowych sesji znieczulenia z 3 - 4 dniami między sesjami znieczulenia, n = 13 samic) w porównaniu z samopoczuciem myszy kontrolnych (n = 6 samic)10, które nie otrzymały znieczulenia, ale zostały przebadane zgodnie z tymi samymi pomi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został pierwotnie opracowany w celu oceny samopoczucia myszy C57BL/6JRj, które otrzymały znieczulenie pojedyncze lub wielokrotne znieczulenie izofluranem. Wyniki potwierdzają, że testy luksusowych zachowań, a także inne miary (np. paradygmat swobodnej eksploracji, MGS, zakopywanie pokarmu) były czułymi metodami oceny dobrostanu. Powtarzające się znieczulenie izofluranem powodowało krótkoterminowe skutki dla zachowania związanego z lękiem przed cechą, MGS i zachowania związane z kopaniem. Co więcej, powt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania dla Sabine Jacobs za pomoc w pobraniu próbki, Edith Klobetz-Rassam za analizę FCM, PD Dr. med. wet. habil. Roswitha Merle za pomoc w analizie statystycznej oraz Wiebke Gentner za korektę rękopisu. Badanie jest częścią berlińsko-brandenburskiej platformy badawczej BB3R (www.bb3r.de) i zostało sfinansowane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (numer grantu: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluranCP-Pharma Handelsgesellschaft mbH1214
InfraMot - Moduły czujnikówTSE Systems302015-SENS
InfraMot - Jednostki sterująceTSE Systems302015-C/16
InfraMot - OprogramowanieTSE Systems302015-S
Nestlet NAncare - PlexxNES3600
Kamera EOS 350Dkanon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 2010 EU. Directive 2010/63/EU. Official Journal of the European Union. , L276/33-L276/29 (2010).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , London: Methuen. (1959).
  3. Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
  4. Bugnon, P., Heimann, M., Thallmair, M. What the literature tells us about score sheet design. Lab Anim. 50 (6), 414-417 (2016).
  5. Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiol Behav. 92 (3), 375-397 (2007).
  6. Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC Vet Res. 3, 16(2007).
  7. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. J Neurosci Methods. 234, 139-146 (2014).
  8. Jirkof, P., et al. Burrowing behavior as an indicator of post-laparotomy pain in mice. Front Behav Neurosci. 4, 165(2010).
  9. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 45 (1), 1-13 (2011).
  10. Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in C57BL/6JRj mice-Assessing the degree of distress. PLoS ONE. 12 (6), e0179588(2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412(2010).
  12. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  13. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  14. Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 1 (3), 1117-1119 (2006).
  15. Deacon, R. M., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12 (9), 2053-2057 (2001).
  16. Deacon, R. M. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat Protoc. 1 (1), 118-121 (2006).
  17. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M. F., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Wien Tierarz Monats. 100 (9-10), 238-246 (2013).
  18. Touma, C., Palme, R., Sachser, N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Horm Behav. 45 (1), 10-22 (2004).
  19. Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol. 130 (3), 267-278 (2003).
  20. Bert, B., Schmidt, N., Voigt, J. P., Fink, H., Rex, A. Evaluation of cage leaving behaviour in rats as a free choice paradigm. J Pharmacol Toxicol Methods. 68 (2), 240-249 (2013).
  21. Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol Ther. 46 (3), 321-340 (1990).
  22. Belzung, C., Berton, F. Further pharmacological validation of the BALB/c neophobia in the free exploratory paradigm as an animal model of trait anxiety. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 541-548 (1997).
  23. Finlayson, K., Lampe, J. F., Hintze, S., Wurbel, H., Melotti, L. Facial indicators of positive emotions in rats. PLoS ONE. 11 (11), e0166446(2016).
  24. Miller, A., Kitson, G., Skalkoyannis, B., Leach, M. The effect of isoflurane anaesthesia and buprenorphine on the mouse grimace scale and behaviour in CBA and DBA/2 mice. Appl Anim Behav Sci. 172, 58-62 (2015).
  25. Miller, A. L., Golledge, H. D., Leach, M. C. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS ONE. 11 (11), e0166652(2016).
  26. Deacon, R. Assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice. J Vis Exp. (59), e2607(2012).
  27. Felton, L. M., Cunningham, C., Rankine, E. L., Waters, S., Boche, D., Perry, V. H. MCP-1 and murine prion disease: separation of early behavioural dysfunction from overt clinical disease. Neurobiol Dis. 20 (2), 283-295 (2005).
  28. Deacon, R. M., Croucher, A., Rawlins, J. N. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behav Brain Res. 132 (2), 203-213 (2002).
  29. Filali, M., Lalonde, R., Rivest, S. Subchronic memantine administration on spatial learning, exploratory activity, and nest-building in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Neuropharmacology. 60 (6), 930-936 (2011).
  30. Guenther, K., Deacon, R. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur J Neurosci. 14 (2), 401-409 (2001).
  31. Deacon, R. M., Reisel, D., Perry, V. H., Nicholas, J., Rawlins, P. Hippocampal scrapie infection impairs operant DRL performance in mice. Behav Brain Res. 157 (1), 99-105 (2005).
  32. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  33. Atanasov, N. A., Sargent, J. L., Parmigiani, J. P., Palme, R., Diggs, H. E. Characterization of train-induced vibration and its effect on fecal corticosterone metabolites in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 737-744 (2015).
  34. Voigt, C. C., et al. Hormonal stress response of laboratory mice to conventional and minimally invasive bleeding techniques. Anim Welf. 22 (4), 449-455 (2013).
  35. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  36. Miyashita, T., et al. Social stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine. Biochem Biophys Res Commun. 349 (2), 775-780 (2006).
  37. Bains, R. S., et al. Analysis of individual mouse activity in group housed animals of different inbred strains using a novel automated home cage analysis system. Front Behav Neurosci. 10 (106), (2016).
  38. Saibaba, P., Sales, G. D., Stodulski, G., Hau, J. Behaviour of rats in their home cages: daytime variations and effects of routine husbandry procedures analysed by time sampling techniques. Lab Anim. 30 (1), 13-21 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mouse Well Being AssessmentGeneral Anesthesia ProceduresMouse Grimace ScaleBurrowing Behavior AnalysisNest Building BehaviorHome Cage Activity MonitoringFecal Corticosterone MetabolitesFree Exploratory ParadigmAnimal Welfare AssessmentEU Directive 2010 63

Powiązane artykuły