Method Article

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

DOI:

10.3791/57051

⸱

March 13th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy Zika, denga i chikungunya są przenoszone przez komary, powodując choroby o podobnych objawach dla pacjenta. Mają one jednak różne możliwości przenoszenia z pacjenta na pacjenta i wymagają bardzo różnych metod leczenia pacjentów. W związku z tym niedawne wybuchy epidemii wirusa Zika sprawiają, że pilne staje się opracowanie narzędzi, które szybko rozróżniają te wirusy u pacjentów i uwięzionych komarów, aby wybrać odpowiednie leczenie dla pacjentów oraz zrozumieć i zarządzać ich epidemiologią w czasie rzeczywistym.

Niestety, obecne testy diagnostyczne, w tym te, które otrzymały w 2016 roku zezwolenia na użycie w nagłych wypadkach i status szybkiej ścieżki, wykrywają wirusowe RNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), co wymaga oprzyrządowania, przeszkolonych użytkowników i znacznego przygotowania próbki. W związku z tym muszą być wysyłane do "zatwierdzonych" laboratoriów referencyjnych, co wymaga czasu. Rzeczywiście, w sierpniu 2016 r. Centrum Kontroli Chorób (CDC) prosiło kobiety w ciąży, które zostały ugryzione przez komara i rozwinęła się wysypka wskazująca na Zika, aby odczekały niedopuszczalne 2 do 4 tygodni, zanim dowiedzą się, czy są zarażone. Bardzo potrzebujemy testów, które mogą być wykonywane na miejscu, przy niewielkich zasobach i przez przeszkolony, ale niekoniecznie licencjonowany personel.

Ten film pokazuje test, który spełnia te wymagania, działając z moczem lub surowicą (dla pacjentów) lub zmiażdżonymi zwłokami komarów (do nadzoru środowiskowego), a wszystko to bez większego przygotowania próbki. Zwłoki komarów są rejestrowane na papierze zawierającym czwartorzędowe grupy amoniowe (papier Q), a następnie poddawane działaniu amoniaku w celu opanowania zagrożeń biologicznych. Są one następnie bezpośrednio, bez izolacji RNA, umieszczane w probówkach zawierających liofilizowane odczynniki, które nie wymagają łańcucha chłodzenia. Zmodyfikowana forma amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji z specyficznymi dla celu, fluorescencyjnie znakowanymi sondami przemieszczeniowymi, daje odczyt w ciągu 30 minut jako trójkolorowy sygnał fluorescencyjny. Jest to wizualizowane za pomocą ręcznego, zasilanego bateryjnie urządzenia z pomarańczowym filtrem. Zapobiega się przedostawaniu się do przodu za pomocą szczelnych probówek i stosowania termolabilnej glikozylazy DNA uracylu (UDG) w obecności dUTP w mieszaninie amplifikacyjnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje wirusowe przenoszone przez komary, w tym wirusy dengi, chikungunya i Zika rosną i wymagają natychmiastowych strategii zarządzania. Wirusy dengi i chikungunya są już endemiczne w wielu regionach tropikalnych, w których wirus Zika rozprzestrzenia się na półkuli zachodniej1. Wirus Zika, podobnie jak denga, należy do rodziny Flaviviridae i pochodzi z Afryki z jedną azjatycką i dwiema afrykańskimi liniami genetycznymi2. Mimo że identyfikacja wirusa Zika sięga 1947 roku, zakażenie wirusem Zika u ludzi było sporadyczne przez pół wieku, zanim pojawiło się na Pacyfiku i w obu Amerykach. Pierwszy zgłoszony wybuch gorączki Zika miał miejsce na wyspie Yap w Sfederowanych Stanach Mikronezji w 2007 roku, a następnie w Polinezji Francuskiej w 2013 i 2014 roku. Pierwsza poważna epidemia w obu Amerykach miała miejsce w 2015 roku w Brazylii.

Wirusy Zika, chikungunya i denga są głównie przenoszone przez Aedes aegypti i Aedes albopictus. Wirus Zika ma jednak dodatkowe możliwości przenoszenia się z człowieka na człowieka, prawdopodobnie rozprzestrzeniając się poprzez kontakty seksualne, interakcje między matką a płodem oraz poprzez karmienie piersią3,4,5. Początkowo uważano, że gorączka Zika powoduje tylko łagodną chorobę. Jednak później powiązano go z zespołem Guillaina-Barrégo u dorosłych, małogłowiem u noworodków i przewlekłymi chorobami układu mięśniowo-szkieletowego, które mogą trwać od miesięcy do lat. Rozpoznanie choroby Zika może być trudne, ponieważ objawy zakażenia wirusem Zika są podobne do objawów innych wirusów przenoszonych przez komary6. Powszechne koinfekcje tymi wirusami sprawiają, że diagnostyka różnicowa jest jeszcze trudniejsza7,8. Dlatego szybkie i niezawodne wykrywanie kwasów nukleinowych wirusa Zika i innych wirusów jest potrzebne, aby zrozumieć epidemiologię w czasie rzeczywistym, zainicjować środki kontrolne i zapobiegawcze oraz zarządzać opieką nad pacjentem9.

Obecne testy diagnostyczne dla tych wirusów obejmują testy serologiczne, izolację wirusa, sekwencjonowanie wirusów i PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Standardowe metody serologiczne często są niewystarczająco czułe, a wyniki mogą być skomplikowane przez reaktywność krzyżową u pacjentów, którzy wcześniej byli zakażeni innymi flawiwirusami.

Dlatego testowanie kwasów nukleinowych pozostaje najbardziej niezawodnym sposobem wykrywania i różnicowania tych wirusów. Wykrywanie wirusa Zika i innych wirusów przenoszonych przez komary jest zwykle przeprowadzane za pomocą RT-PCR lub RT-PCR w czasie rzeczywistym w różnych płynach biologicznych, takich jak surowica, mocz, ślina, nasienie, mleko matki i płyn mózgowy10,11. Próbki moczu i śliny są generalnie preferowane w stosunku do krwi, ponieważ wykazują mniejsze hamowanie PCR, wyższe miano wirusa, obecność wirusa przez dłuższy czas oraz większą łatwość pobierania i obsługi12,13. Testy diagnostyczne oparte na RT-PCR obejmują jednak obszerne etapy przygotowania próbki i kosztowny sprzęt do cykli termicznych, co czyni je mniej optymalnymi dla miejsca opieki nad pacjentem.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) stała się potężną alternatywą dla RT-PCR ze względu na jej wysoką czułość i specyficzność14, tolerancję na substancje hamujące w próbkach biologicznych15, oraz działanie w pojedynczej temperaturze, co znacznie obniża złożoność testu i związane z tym koszty, dzięki czemu nadaje się do środowisk o niskich zasobach. RT-LAMP, jak to się klasycznie stosuje, składa się z sześciu starterów, które wiążą się z ośmioma odrębnymi regionami w docelowym RNA. Działa w stałych temperaturach od 60 °C do 70 °C i wykorzystuje odwrotną transkryptazę i polimerazę DNA o silnej aktywności wypierania nici.

Podczas początkowych etapów RT-LAMP, wewnętrzne startery do przodu i do tyłu (FIP i BIP, Rysunek 1A) wraz z zewnętrznymi starterami do przodu i do tyłu (F3 i B3) tworzą strukturę hantli, strukturę zalążkową wykładniczego wzmocnienia LAMP. Amplifikacja jest dodatkowo przyspieszana przez pętlowe startery do przodu i do tyłu (LF i LB), które są przeznaczone do wiązania jednoniciowych obszarów hantli i powodują tworzenie konkatenerów z wieloma powtarzającymi się pętlami16. Klasyczne testy LAMP oparte na zmętnieniu lub odczycie za pomocą barwników interkalujących DNA nie są w pełni odpowiednie do wykrywania wirusa Zika w miejscu opieki nad pacjentem, gdzie pożądany jest pewien poziom multipleksowania17,18,19. Multipleksowanie nie jest łatwe do uzyskania w tych systemach, ponieważ są one podatne na generowanie wyników fałszywie dodatnich z powodu amplifikacji poza celem.

Aby poradzić sobie z tymi problemami, literatura dodaje dodatkowy komponent w postaci "sondy przemieszczającej pasmo" do klasycznej architektury RT-LAMP20,21,22. Każda sonda ma specyficzny dla sekwencji dwuniciowy obszar i jednoniciowy region zasysania. Sonda z obszarem jednoniciowym jest oznaczona fluoroforem 5', a sonda komplementarna jest modyfikowana za pomocą wygaszacza 3'-końca. W przypadku braku celu nie obserwuje się fluorescencji z powodu hybrydyzacji komplementarnych nici sondy, co zbliża do siebie fluorofor i wygaszacz. W obecności tarczy, jednoniciowa część sondy fluorescencyjnej wiąże się z jej dopełniaczem na tarczy, a następnie jest przedłużana przez nić wypierającą polimerazę. Dalsza ekspansja polimerazy przez startery odwrotne powoduje oddzielenie nici wygaszającej od jej komplementarnej nici znakowanej fluorescencyjnie, umożliwiając emisję fluorescencji (Rysunek 1B). Dzięki tej konstrukcji sygnał jest generowany po uformowaniu hantli, co zmniejsza ryzyko wystąpienia sygnałów fałszywie dodatnich.

Dwuniciowa część sondy wypierającej pasma może być dowolną sekwencją, a gdy stosuje się multipleksowanie, ta sama sekwencja może być używana z różnymi parami wygaszaczy fluoroforu. Dzięki tej architekturze skażone wirusem próbki moczu, surowicy lub komarów zgniecione na papierze były bezpośrednio wprowadzane do testu bez przygotowania próbki. Trójkolorowe odczyty fluorescencji widoczne dla ludzkiego oka zostały wygenerowane w ciągu 30 - 45 minut, a sygnały były wizualizowane przez wydrukowane w 3D pudełko obserwacyjne, które wykorzystuje niebieską diodę LED i pomarańczowy filtr. Liofilizacja odczynników RT-LAMP umożliwiła wdrożenie tego zestawu w celu obniżenia ustawień zasobów bez konieczności chłodzenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Komary były jedynymi zwierzętami bezpośrednio wykorzystanymi w tym badaniu. Procedury postępowania z kurczakami, których krew została użyta do karmienia zakażonych komarów, zostały zatwierdzone jako Protokół IACUC #201507682 przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Florydy.Badania nad rozprzestrzenianiem się wirusa i infekcją komarami przeprowadzono w placówce BSL-3 Laboratorium Entomologii Medycznej Florydy w Vero Beach, FL. Eksperymenty RT-LAMP przeprowadzono w laboratorium BSL-2 udostępnionym przez FfAME i Firebird Biomolecular Sciences LLC w Alachua, Fl.

1. Projektowanie starterów i sond do przemieszczania pasm

  1. Wyodrębnij sekwencje wirusa Denga 1 z bazy danych Broad Institute23; sekwencje dla Zika i chikungunya z NIAID Virus Pathogen Database and Analysis Resource24.
    1. Utwórz wiele wyrównań sekwencji (MSA) dla interesujących sekwencji za pomocą oprogramowania MUSCLE v3.8.3125. Wygenerowane MSA służą do wyszukiwania zestawów starterów LAMP w konserwatywnym regionie celu i unikania nieistotnych lub niezamierzonych celów, takich jak rozróżnienia między podtypami celu.
  2. Postępuj zgodnie z zasadami projektowania starterów LAMP opisanymi online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) i zezwól na stosowanie mieszanych zasad w starterach, aby pokryć dywergencję wirusa26. Aby uniknąć reaktywności krzyżowej zestawów starterów, porównaj wygenerowane startery LAMP z bazą danych wirusów NCBI RNA za pomocą NCBI BLAST27. Porównaj każdy zestaw, aby wyeliminować startery, które dimeryzowałyby w teście multipleksowanym, używając również NCBI BLAST.
  3. Przesiewaj dwuniciową część sondy wypierającej pasmo pod kątem dowolnej sekwencji genomu wirusa i sekwencji genomu komara. Zmodyfikuj 5'-końce sondy wiążącej cel za pomocą amidytu fluoresceiny (FAM), barwnika HEX i barwnika 5-karboksytetrametylorodaminy (TAMRA) odpowiednio dla Zika, chikungunya i Denga 1.
    1. Dołącz zestaw starterów kontroli pozytywnej do próbek moczu. Zaprojektuj startery LAMP do celowania w ludzkie mitochondrialne DNA. Oznacz sondę z przemieszczeniem pasma z TET na końcu 5'. Oznacz sondy wygaszające, które są częściowo komplementarne do każdej sondy znakowanej fluorescencyjnie, wyciszaczem (np. Iowa Black-FQ) na końcu 3' (Tabela 1).

2. Izolaty wirusa i próbki zakażonych komarów

  1. Należy stosować izolaty wirusa Zika (szczep Portoryko), wirusa Chikungunya (szczep La Réunion lub Brytyjskich Wysp Dziewiczych) i wirusa dengi serotypu-1 (szczep Key West). Określ miana wirusa za pomocą testu płytki nazębnej28 lub ilościowego RT-PCR29. Ekstrakcja wirusowych RNA za pomocą dostępnych w handlu zestawów do ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Tabela 2 przedstawia miana wirusa dla każdego izolatu wirusa użytego w tym badaniu.
  2. Zapoznaj się z artykułem opublikowanym przez Yaren et al., aby uzyskać szczegółowy protokół dotyczący zakażenia samic Ae. aegypti wirusami Zika i chikungunya20. W tabeli 2 przedstawiono miano wirusa w próbce komara zakażonej wirusem Zika.

3. RT-LAMP sprzężona z termolabilną glikozylazą DNA uracylu

  1. 10X przygotowanie mieszanki podkładowej.
    1. Przygotować 100 μM roztwór podstawowy każdego startera i sondy (patrz krok 1), dodając wodę wolną od nukleaz. Dobrze przemieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Dla 10X Mieszanka starterów dla każdego celu Zika, Denga 1 lub mitochondrialnego DNA, wymieszaj 16 μL FIP, 16 μL BIP, 2 μL F3, 2 μL B3, 5 μL LF, 2 μL LB, 3 μL sondy znakowanej fluorescencyjnie LB, 4 μL sondy wygaszającej, i 50 μl wody wolnej od nukleaz, co daje łącznie 100 μl objętości.
    3. W przypadku mieszanki 10X Primer dla Chikungunya wymieszaj 16 μl FIP, 16 μl BIP, 2 μl F3, 2 μl B3, 5 μl LB, 2 μL LF, 3 μl sondy znakowanej fluorescencyjnie LF, 4 μl sondy wygaszającej i 50 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać łącznie 100 μl objętości.
      UWAGA: Opisane powyżej stężenie sondy wykorzystuje 300 nM końcowej sondy fluorescencyjnej i 400 nM sondy wygaszającej. Alternatywnie, do analizy w czasie rzeczywistym można użyć sondy znakowanej fluorescencyjnie o długości fali 80 nM i sondy wygaszającej o długości fali 200 nM.
  2. Dodać 5 μL 10X mieszanki starterów (dla 3-plex dodać 5 μL każdej mieszanki starterów 10X), 5 μL 10X izotermicznego buforu amplifikacyjnego (1X skład buforowy: 20 mM bufor Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4, 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 μl mieszaniny dNTP (10 mM dATP, dCTP i dGTP; 5 mM dTTP i dUTP), 16 jednostek polimerazy DNA, 15 jednostek odwrotnej transkryptazy, 80 jednostek rekombinowanego inhibitora rybonukleazy, 2 jednostki termolabilnego UDG, 1-2 μl różnych ilości wirusowych RNA i woda, aby zwiększyć całkowitą objętość do 50 μl w probówce PCR o pojemności 0,25 ml (patrz Tabela materiałów).
  3. Na tym etapie należy uwzględnić testy kontroli ujemnej, zastępując objętość RNA wirusa wodą. Próbki inkubować w temperaturze od 45 do 68 °C przez 45 minut do 1 godziny, a następnie analizować, uruchamiając 5 μl każdej próbki na 2,5% żelu agarozowym w buforze 1X TBE zawierającym bromek etydyny (0,4 μg/ml). Użyj drabinki DNA o długości 25 pz lub 50 pz jako markera na żelu.
    UWAGA: Dodanie szablonu, który nie jest specyficzny dla celu, jest opcjonalne.
  4. Aby wykryć obecność patogennego RNA, należy przetestować każdy zestaw starterów i jego kontrolę bez matrycy, zmieniając temperaturę i/lub stężenie magnezu, ponieważ każdy zestaw starterów RT-LAMP został zaprojektowany do pracy w różnych temperaturach (od 65 °C do 68 °C) lub stężeniach magnezu (od 6 do 10 mM końcowych). Przygotuj eksperymenty w temperaturze pokojowej.

4. RT-LAMP wykorzystujący wirusowy mocz z dodatkiem RNA

  1. Przetestuj startery RT-LAMP w różnych końcowych stężeniach moczu (0%, 10%, 20% i 50%) w 50 μl całkowitej objętości reakcji. Aby uzyskać 10% końcowe stężenie moczu, dodaj 1 μl wirusowego RNA do 5 μl moczu. Aby uzyskać 20% końcowe stężenie moczu, dodaj 1 μl wirusowego RNA do 10 μl moczu. Aby uzyskać 50% końcowe stężenie moczu, dodaj 1 μl wirusowego RNA do 25 μl moczu.
  2. Do monitorowania RT-LAMP w czasie rzeczywistym w 10% moczu należy użyć przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym (patrz Tabela materiałów) z różnymi filtrami fluoroforowymi.
    1. Aby odczytać sygnały fluorescencyjne z amplikonów znakowanych FAM dla Zika, użyj filtra w zakresie od 483 do 533 nm; dla amplikonów znakowanych HEX dla chikungunya użyj filtra w zakresie od 523 do 568 nm; dla amplikonów znakowanych TAMRA dla Dengi 1 użyj filtra w zakresie od 558 do 610 nm; a dla amplikonów znakowanych TET dla mitochondrialnego DNA użyj filtra w zakresie od 523 do 568 nm.
      UWAGA: FAM ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 495 nm i 520 nm. HEX ma maksima wzbudzenia i emisji wynoszące odpowiednio 538 nm i 555 nm. TAMRA ma maksima wzbudzenia i emisji wynoszące odpowiednio 559 nm i 583 nm. TET ma maksima wzbudzenia i emisji wynoszące odpowiednio 522 nm i 539 nm.
  3. Użyć 96-dołkowych płytek i uszczelnić płytkę przezroczystym arkuszem z tworzywa sztucznego, a następnie inkubować próbki w temperaturze 65–68 °C przez 60–90 minut i rejestrować fluorescencję co 30 s za pomocą cyklera świetlnego. Początkowo użyj 80 nM sond znakowanych fluorescencyjnie, a następnie przetestuj 300 nM sond znakowanych fluorescencyjnie.
    1. Określ granicę wykrywalności dla każdego celu, dodając seryjnie rozcieńczone wirusowe RNA w końcowym stężeniu moczu wynoszącym 10%.
      UWAGA: Użyj RT-LAMP w czasie rzeczywistym, aby określić optymalną temperaturę, stężenie magnezu, fluorescencyjnie znakowane stężenie sondy i czas reakcji.
  4. Aby zobrazować fluorescencję generowaną przez sondy z przemieszczonymi pasmami za pomocą oka, użyj niebieskiego źródła światła LED z cyklera światła ze wzbudzeniem przy 470 nm (każde pudełko do elektroforezy żelowej z wbudowanym źródłem niebieskiego światła będzie działać, patrz tabela materiałów) i nagraj obraz kamerą telefonu komórkowego w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Użyj sond znakowanych fluorescencyjnie 300 nM, gdy potrzebna jest wizualizacja wszystkich trzech kolorów na oko za pomocą niebieskiej diody LED.

5. RT-LAMP o wykrywaniu komarów zakażonych wirusem Zika przy użyciu technologii Q-Paper

  1. Przygotować czwartorzędową bibułę filtracyjną modyfikowaną amoniem (papier Q), zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami z niewielkimi modyfikacjami30.
    1. Zanurzyć 1 g kółek z celulozowej bibuły filtracyjnej (patrz tabela materiałów) o średnicy 3,5 cm w 50 ml 1,8% wodnego roztworu NaOH na 15 minut w celu aktywacji.
    2. Zebrać aktywowane krążki papierowe przez filtrację próżniową, a następnie zanurzyć je w 40 ml wodnego roztworu chlorku (2,3-epoksypropylo)trimetyloamoniowego (0,28 g) na noc w temperaturze pokojowej><. UWAGA: Stosunek masowy chlorku (2,3-epoksypropylo) trimetyloamoniowego do bibuły filtracyjnej należy zachować na poziomie 0,28 do 1.
    3. Zebrać powstały papier kationowy przez filtrację próżniową i zneutralizować 50 ml 1% kwasu octowego.
    4. Umyj papier trzykrotnie etanolem i wysusz na powietrzu pod kapturem ze stałym przepływem powietrza.
  2. Pokrój arkusze papieru Q na małe prostokąty (3 mm x 4 mm) za pomocą dziurkacza lub nożyczek. Zmiażdż samice komarów Ae. aegypti potencjalnie zarażone wirusem Zika na każdym papierze za pomocą mikro tłuczka.
  3. Do każdej bibułki dodać 20 μl 1 M wodnego roztworu amoniaku (pH ≈ 12) i odczekać 5 minut. Następnie umyj każdą bibułę raz 20 μl 50% EtOH i raz 20 μl wody wolnej od nukleaz. Suszyć papier na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 przez około 1 godz.
    UWAGA: W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc do momentu użycia.
  4. Za pomocą pęsety umieść każdy papier w 100 μl mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP i inkubuj w temperaturze 65-68 °C przez 45 minut. Upewnij się, że papier jest całkowicie zanurzony w roztworze; nie powinien on unosić się na wodzie. Odczyt i zapis fluorescencji powstającej przez wirusa Zika za pomocą niebieskiego źródła światła LED i pomarańczowego lub żółtego filtra.

6. Liofilizacja odczynników RT-LAMP na 100 μL objętości reakcyjnej

  1. Przygotować mieszaninę startera 10X LAMP zgodnie z sekcją 3.1 i przygotować mieszaninę dNTP zawierającą dUTP zgodnie z sekcją 3.2. Mieszaninę podkładu i dNTP przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Przygotować 10 ml buforu do dializy enzymatycznej w celu usunięcia glicerolu, mieszając 100 μl 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 μl 1 M KCl, 2 μl 0,5 M EDTA, 100 μl 10% Triton X-100, 100 μl 0,1 M DTT i 9,198 ml wody wolnej od nukleaz. Przechowywać bufor do dializy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że przefiltrowałeś (filtry 0,2 mikrona) wszystkie roztwory odczynników buforowych przed użyciem i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    1. Stosować membranę ultrafiltracyjną o wartości granicznej 10 kDa (patrz Tabela materiałów). Umieścić 350 μl buforu dializacyjnego, 4 μl 32 jednostek polimerazy DNA, 2 μl 30 jednostek odwrotnej transkryptazy i 2 μl 80 jednostek inhibitora RNazy w membranie ultrafiltracyjnej i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać kolejne 350 μl buforu dializacyjnego do membrany ultrafiltracyjnej i wirować (14 000 x g) przez kolejne 5 minut. Opróżnij probówkę zbiorczą i powtórz ten krok, a następnie odwiruj (14 000 x g) przez 3 min.
    3. W celu elucji odwróć membranę i umieść w nowej probówce zbiorczej. Wirować z prędkością 1 000 x g przez 2 minuty. Zmierzyć objętość elucji; jeśli jest mniejsza niż 8 μl, zwiększyć objętość do 8 μl, dodając bufor do dializy. Przechowywać elucję w temperaturze 4 °C i natychmiast przejść do następnego etapu.
      UWAGA: Ten protokół dotyczy liofilizacji z pojedynczą probówką, ale należy przygotować co najmniej 10 probówek reakcyjnych na raz, używając tej samej membrany ultrafiltracyjnej i używając tej samej ilości buforu do dializy.
  3. Wymieszaj 10 μl startera 10X LAMP jeśli singleplex (dla 3-plex, dodaj 10 μl każdej mieszanki starterów 10X), 14 μl mieszaniny dNTP, 8 μl dializowanej mieszanki enzymatycznej, 2 μl 2 jednostki termolabilnego UDG i 66 μl wody wolnej od nukleaz (dla 3-plex, użyj 46 μl) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml i pozostaw pokrywkę otwartą. Zamiast tego dodaj kolejną pokrywkę przebitą igłą, aby umożliwić ucieczkę pary.
  4. Natychmiast zamrozić probówki w temperaturze -80 °C przez 2 godziny i liofilizować probówkę przez 4 godziny. Przykryj komorę liofilizacji folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Po wysuszeniu odczynników zdejmij przebite wieczka, zamknij oryginalną pokrywę i przechowuj probówki z liofilizowanymi odczynnikami w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: W razie potrzeby odczynniki mogą być liofilizowane przez noc.

7. Testowanie liofilizowanych odczynników RT-LAMP na próbkach moczu i komarów zawierających wirusa Zika

  1. Użyj następujących elementów z zestawu (patrz Tabela materiałów) dla Zika: wydrukowane w 3D pudełko obserwacyjne z pomarańczowym filtrem (filtr długoprzepustowy, odcięty ~540 nm), 2 baterie AAA do pudełka obserwacyjnego, liofilizowane probówki reakcyjne oznaczone jako ZV do wykrywania Zika oraz bufor nawadniający 1,1X w zakręcanych probówkach 1,5 ml.
  2. Przygotuj 50 ml buforu do nawadniania 1,1X, mieszając 5,5 ml buforu do amplifikacji izotermicznej 10X, który jest dostarczany wraz z polimerazą DNA (patrz tabela materiałów), 3,3 ml 100 mM MgSO4, 110 μl 0,5 M DTT i 41,09 ml wody wolnej od nukleaz. Dobrze wymieszać, podaszkować 1 ml tego roztworu do 1,5 ml zakręcanych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Dodać 90 μl 1,1-krotnego buforu nawadniającego do każdej probówki reakcyjnej (0,5 ml). Upewnij się, że płyn wypełnił dno probówki zawierającej liofilizowane odczynniki (rozpuść je przez zmieszanie przez potrząsanie, a następnie krótko odwiruj (1,000 x g)). Dodać 10 μl próbki moczu wzbogaconej wirusowym RNA do probówek reakcyjnych (szczegóły patrz sekcja 4.1).
    1. W przypadku badania komarów należy dodać prostokąt z papieru Q zawierającego tusze komarów (przygotowane w krokach opisanych w sekcjach 5.2 i 5.3) wraz z 10 μl oczyszczonej wody zamiast próbek moczu.
      UWAGA: Alternatywnie dodaj 10 μl próbek śliny lub surowicy zamiast moczu. Jeśli próbki są ekstrahowane DNA lub RNA, dodać 2-5 μl próbki do ponownie uwodnionej mieszaniny i uzupełnić wodą wolną od nukleaz do 10 μl końcowej objętości próbki.
  4. Zamknąć pokrywę probówek reakcyjnych. Umieścić je w bloku grzewczym/łaźni (lub inkubatorze) nastawionym na 65-68 °C. Inkubować przez 30-45 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę. Po inkubacji wyjmij probówkę z ognia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu przyszłych testów, upewnij się, że probówki te pozostają zamknięte.
  5. Umieścić probówki reakcyjne w skrzynce obserwacyjnej; temperatura spadnie do temperatury otoczenia (najlepiej 25 °C). Włącz przełącznik z tyłu skrzynki obserwacyjnej. Obserwuj próbkę przez pomarańczowy filtr i uchwyć obraz za pomocą kamery telefonu komórkowego, która jest trzymana w odległości, w której obraz wypełnia 80% pola widzenia.
    UWAGA: Lepszą wizualizację uzyskuje się w warunkach słabego oświetlenia.
  6. Po zakończeniu wizualizacji wyłącz przełącznik. Przechowuj zamknięte rurki w ciemności, najlepiej w lodówce, jeśli potrzebna jest późniejsza wizualizacja.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowo, wydajność każdego startera RT-LAMP (Tabela 1) wraz z odpowiadającym mu substratem wirusowego RNA, jak również kontrolami negatywnymi, była oceniana za pomocą elektroforezy żelowej. Startery RT-LAMP zaprojektowano tak, aby były ukierunkowane na region NS5 (polimeraza RNA zależna od RNA) dla wirusów Zika i Denga 1 oraz region nsP2 (niestrukturalne białko P2) dla Chikungunya. Matryce były całkowitym RNA wyekstrahowanym z zapasów wirusa hodowanych w komórkach nerk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy przenoszone przez komary, w tym Zika, chikungunya i denga, zagrażają zdrowiu publicznemu, a niedawne wybuchy epidemii wirusa Zika podkreślają potrzebę tanich alternatyw wykrywania w miejscu opieki nad pacjentem w diagnostyce pacjentów, a także nadzoru nad komarami. Metody amplifikacji izotermicznej zostały opracowane jako przystępna cenowo alternatywa dla systemów opartych na PCR. W szczególności platformy oparte na RT-LAMP zostały zastosowane do wykrywania szerokiej gamy patogenów. Wykorzystanie platform izotermi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilku autorów i ich instytucji posiada własność intelektualną związaną z tym testem.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była częściowo wspierana przez FDOH-7ZK15 i NIAID 1R21AI128188-01. Badania przedstawione w tej publikacji były częściowo wspierane przez National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, a częściowo przez Biomedical Research Program Departamentu Zdrowia Florydy. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy NIH lub Departamentu Zdrowia Florydy. Firma Dynamic Combinatorial Chemistry LLC jest doceniana za wsparcie i wkład w ten projekt.

Wirus dengi 1 (szczep BOL-KW010) został udostępniony przez Biuro Laboratoriów Departamentu Zdrowia Florydy. Wirus Zika i azjatycka linia wirusa chikungunya zostały łaskawie dostarczone przez Centers for Disease Control and Prevention. Rodowód wirusa chikungunya z Oceanu Indyjskiego został udostępniony przez Roberta Tesha (Światowe Centrum Referencyjne ds. Pojawiających się Wirusów i Arbowirusów, za pośrednictwem Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston w Teksasie) do UF-FMEL. Dziękujemy S. Bellamy'emu, B. Eastmondowi, S. Ortizowi, D. Velezowi, K. Wigginsowi, R. Zimlerowi i K. Zirbelowi za pomoc w badaniach nad infekcjami. Dziękujemy również M. S. Kimowi za dostarczenie Q-paper.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SafeBlue Illuminator/ System do elektroforezy, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Elektroforeza żelowa
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Obrazowanie żelowe
LightCycler 480 Instrument II, 96-dołkowyRoche Applied Science05 015 278 001PCR w czasie rzeczywistym
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5 z membraną Ultracel-10Millipore SigmaUFC501096membrana ultrafiltraton do dializy
Eppendorf 5417C WirówkaMarshall ScientificEP-5417CWirówka
Myblock Mini DrybathBenchmark ScientificBSH200sucha kąpiel
FreeZone Plus 6 litrów Konsola kaskadowaliofilizacjiLabconco7934020
wszystkie próbki i sondyIDTniestandardowyRT-LAMP startery i sondy
zestaw dNTPBiolineBIO-39049
Deoksyurydynotrifosforan (dUTP)PromegaU1191
Bst  2.0 Ciepły start  Polimeraza DNANew England BiolabsM0538L
enzym WarmStart RTx Odwrotna transkryptazaNew England BiolabsM0380L
enzym RNaza, mysiNew England BiolabsM0314L
enzym Antarktyczny termolabilny UDGNew England BiolabsM0372Lenzym
50bp DNA Step LadderPromegaG4521
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, białaRoche Applied Science4729692001analizy RT-LAMP w czasie rzeczywistym
System Marker

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636(2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685(2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295(2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605(2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22(2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226(2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Isothermal AmplificationPoint of Care DiagnosticsRT LAMP AssayZika Virus DetectionChikungunya Virus DetectionDengue Virus DetectionQ Paper TreatmentFluorescent Probe ReadoutHandheld Observation DeviceThermolabile UDG Prevention

Related Articles