Wpływ stosowania olejku eterycznego z tymianku na obciążenie mikrobiologiczne podczas suszenia mięsa

Podsumowanie

Mikroorganizmy, takie jak Escherichia coli, które zanieczyszczają produkty mięsne, powodują choroby przenoszone drogą pokarmową. Zastosowanie olejków eterycznych w procesie suszenia mięsa nie zostało dogłębnie zbadane. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę nakładania olejku eterycznego z tymianku na mięso podczas suszenia w celu zmniejszenia obciążenia mikrobiologicznego w suszonym mięsie.

Streszczenie

Mięso to wysokobiałkowy posiłek, który jest używany do przygotowania suszonego mięsa, popularnej przekąski spożywczej, gdzie ważna jest konserwacja i bezpieczeństwo. Aby zapewnić bezpieczeństwo żywności i przedłużyć okres przydatności do spożycia mięsa i produktów mięsnych, w celu kontroli i eliminacji bakterii przenoszonych przez żywność stosuje się syntetyczne lub naturalne konserwanty. Wzrosło zainteresowanie zastosowaniem naturalnych dodatków do żywności do mięsa. Mikroorganizmy, takie jak Escherichia coli, zanieczyszczają mięso i produkty mięsne, powodując choroby przenoszone drogą pokarmową. Dlatego konieczne jest usprawnienie procesu konserwacji mięsa. Jednak stosowanie olejków eterycznych podczas suszenia mięsa nie zostało dogłębnie zbadane. W związku z tym istnieje możliwość zwiększenia wartości suszonego mięsa i zmniejszenia ryzyka chorób przenoszonych drogą pokarmową poprzez stosowanie olejków eterycznych podczas procesu suszenia. W niniejszym protokole przedstawiamy nowatorską metodę aplikacji olejku eterycznego z tymianku (TEO) podczas suszenia mięsa, a konkretnie w postaci pary bezpośrednio w komorze suszącej. Do oceny używamy minimalnego stężenia hamującego (MIC) w celu wykrycia liczby szkodliwych bakterii w próbkach poddanych działaniu substancji w porównaniu z próbkami surowymi. Wstępne wyniki pokazują, że metoda ta jest realną i alternatywną alternatywą dla syntetycznych konserwantów oraz że znacznie zmniejsza obciążenie mikrobiologiczne suszonego mięsa.

Wprowadzenie

Suszenie jako tradycyjna metoda konserwacji żywności jest stosowana od czasów starożytnych. W dzisiejszych czasach rośnie zainteresowanie suszeniem jako skuteczną metodą konserwacji żywności^1,2,3. Służy do produkcji różnych specjalnie przetworzonych mięs. Jednym z najbardziej znanych jest suszone mięso.

Suszona, jedna z najstarszych metod konserwacji mięsa, opiera się na peklowaniu i suszeniu w celu obniżenia aktywności wody, a tym samym przedłużenia okresu przydatności do spożycia⁴. W dzisiejszych czasach suszone mięso jako konserwowane wędliny jest nadal bardzo popularne, gdzie bezpieczeństwo żywności, smak i konsystencja mają kluczowe znaczenie. Preparat Jerky może być stosowany do prawie każdego rodzaju mięsa, w tym wołowiny, wieprzowiny, drobiu lub dziczyzny⁵, i wymaga pokrojenia mięsa w chude paski i wysuszenia. Zazwyczaj marynowanie mięsa w roztworze peklującym lub wędzenie jest używane wraz z suszeniem, aby nadać suszonemu suszeniu charakterystyczny smak⁶.

Pomimo ogromnego zainteresowania suszeniem w celu prawdziwego konserwowania żywności, ryzyko wybuchu epidemii przez E. coli przez żywność ze słabo wysuszonego mięsa jest krytyczne i musi być kontrolowane. Istnieją badania donoszące o wybuchach zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność, szczególnie w przypadku E. coli O157:H7, przypisywanych nieodpowiedniemu przetwarzaniu ciepła podczas suszenia w domu. Podobne przypadki miały miejsce nawet w komercyjnie przygotowanych jerky^7,8,9. Levine i wsp. ¹⁰ zaproponował, że mikroorganizmy przenoszone przez żywność mogą przetrwać umiarkowane warunki suszenia (około 60 °C) stosowane przez komercyjnych producentów suszonego mięsa. Bakteria E. coli O157:H7 ogniska chorób przenoszonych drogą pokarmową w połowie lat 90. przypisywano mielonym suszonym produktom mięsnym^6,11. Co ciekawe, we wszystkich poprzednich przypadkach główne ryzyko są powodowane przez patogeny bakteryjne uznane za żywotne, ale niezdolne do hodowli (VBNC). Pod wpływem różnych stresów, takich jak zmiany temperatury lub głód, komórki E. coli mogą wejść w określony stan znany jako stan VBNC^12,13. Komórki VBNC mogą być następnie reanimowane z powrotem do komórek hodowlanych poprzez wystawienie na działanie odpowiednich warunków, a następnie stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego z powodu zanieczyszczenia przenoszonego przez żywność^14,15. Oznacza to, że jeśli mięso jest spożywane natychmiast po wysuszeniu produktu, jest bezpieczne. Jednak w przypadku nieodpowiedniego przechowywania, takiego jak zwiększona wilgotność, istnieje duże ryzyko reaktywacji patogenów i rozwoju drobnoustrojów.

Oprócz metod suszenia i marynowania, istnieje duże zapotrzebowanie ze strony konsumentów na stosowanie naturalnych produktów jako alternatywy dla dodatków w celu poprawy jakości żywności^16,17. Szczególnym zainteresowaniem cieszyło się zastosowanie naturalnych dodatków do żywności w mięsie zamiast klasycznych syntetycznych konserwantów^18,19,20,21. Mimo że brakuje wystarczających dowodów eksperymentalnych na stosowanie olejków eterycznych podczas suszenia mięsa, wczesne badania w tej dziedzinie już wykazują pozytywne wyniki^22,23.

Od średniowiecza ludzie uznają związki olejków eterycznych (EOC) za ich właściwości przeciwbakteryjne, owadobójcze i przeciwpasożytnicze^24,25,26. Obecnie EOC należą do jednej z najważniejszych grup bioaktywnych związków naturalnych. Wśród różnych EOC tymol jest jednym z najbardziej znanych. Składa się w ponad 85% z TEO²³. Ten fenol zapobiega degradacji mikrobiologicznej i chemicznej po dodaniu do żywności. Dodatkowo jego właściwości antybakteryjne mogą ulec poprawie w połączeniu z innymi naturalnymi konserwantami^{2,27,28,29,30}. Obecnie tymianek (Thymus vulgaris), zioło należące do rodziny Lamiaceae, zostało uznane za środek aromatyzujący, a także bardzo skuteczny środek konserwujący mięso³¹. Badanie przeprowadzone przez García-Díez i wsp. ³⁰ na produktach mięsnych stwierdziło, że TEO wykazuje szerszy wzorzec hamowania przeciwko patogenom przenoszonym przez żywność w porównaniu z innymi olejkami eterycznymi. W związku z tym istnieje możliwość zwiększenia wartości suszonego mięsa i zmniejszenia ryzyka chorób przenoszonych drogą pokarmową poprzez stosowanie olejków eterycznych podczas procesu suszenia.

W tym protokole prezentujemy nowatorską metodę stosowania TEO podczas suszenia mięsa, a konkretnie użycie go w formie pary bezpośrednio w komorze suszenia. Do oceny używamy MIC do określenia braku bakterii chorobotwórczych w próbkach poddanych działaniu substancji w porównaniu z surowymi. Wstępne wyniki pokazują, że metoda ta jest wysoce skuteczną alternatywą dla syntetycznych konserwantów i znacznie zmniejsza obciążenie mikrobiologiczne suszonego mięsa.

Protokół

1. Przygotowanie mięsa

1. Zdobądź krótki polędwica wołowa (świeża wołowina z biceps femoris) z lokalnej rzeźni i przenieś ją do laboratorium.
   UWAGA: Zaleca się transport schabu wołowego w temperaturze otoczenia (20 - 25 °C), przez okres nie dłuższy niż 20 minut w hermetycznie zamkniętym worku.
2. Aby wysterylizować zewnętrzną powierzchnię mięśnia wołowego, w laminarnej komorze bezpieczeństwa umyj mięsień, spryskując go 70% (v/v) etanolem przez 10 sekund za pomocą wyciskanej butelki o pojemności 500 ml. Zastosuj 0,025 g etanolu na 1^cm2 powierzchni mięśni.
3. Usunąć zewnętrzną powierzchnię mięsa w sposób aseptyczny za pomocą noża, aby uniknąć pozostawienia etanolu we wnętrzu mięśnia. Usuń około 3 mm wnętrza mięśnia, aby zachować jednorodność powierzchni mięśnia.
4. Zapakuj mięsień w plastikową, szczelnie zamkniętą torbę i przenieś do zamrażarki.
5. Przechowywać mięsień w temperaturze -18 °C przez 1 dzień. Następnie rozmrażać zamrożony mięsień w temperaturze 4 °C przez 6 h.
   UWAGA: Do rozmrożenia zaleca się przeniesienie mięśnia z zamrażarki do lodówki.
6. W laminarnej komorze bezpieczeństwa pokrój każdy mięsień na plastry o grubości 0,5 cm za pomocą noża do mięsa. Następnie nożem pokrój go na małe 5 × 2,5 cm² prostokątne próbki.
7. Zapakuj prostokątne próbki mięsa w plastikowe torby i przechowuj je w zamrażarce w temperaturze -18 °C do późniejszego wykorzystania.

2. Przygotowanie standaryzowanej procedury inokulum i inokulacji w komorze bezpieczeństwa laminarnego

1. Przygotować standaryzowany inokulum (1,5 × 10⁸ jtk/ml) E. coli ATCC 25922 w celu zaszczepienia próbek mięsa.
   1. W celu przygotowania inokulum podstawowego, najpierw należy dozować liofilizowaną kulturę bakteryjną (dostarczoną przez dostawcę) do 15 ml wysterylizowanej probówki wstępnie wypełnionej 10 ml wysterylizowanego buforowanego bulionu Muellera Hintona (BMHB). Zawiesinę tę uprawiać przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
      1. Przygotuj bakteryjny roztwór podstawowy w następujący sposób: Weź około 0,1 - 0,2 ml zawiesiny bakteryjnej i rozcieńczyć do 20-mililitrowej fiolki zamkniętej gumowym korkiem z aluminiową nakrętką wstępnie napełnioną 15 ml wysterylizowanego BMHB. Zawiesinę tę uprawiać przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
      2. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do przygotowania standaryzowanego inokulum.
   2. Z roztworu podstawowego (patrz krok 2.1.1) E. coli pobrać około 0,1 - 0,2 ml zawiesiny bakteryjnej i rozcieńczyć w 15 ml plastikowej sterylizowanej probówce wstępnie wypełnionej 10 ml wysterylizowanego buforowanego bulionu Muellera Hintona (BMHB). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   3. W celu przygotowania standaryzowanego inokulum (1,5 × 10⁸ jtk/ml), dodać niewielkie ilości tej zawiesiny do 15-mililitrowej wysterylizowanej probówki wstępnie wypełnionej 10 ml wysterylizowanego BMHB.
   4. Dokładnie zwirować mieszaninę i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm za pomocą densytometru³².
   5. Powtarzaj kroki 2.1.3 - 2.1.4, aż OD wyrażona jako wartość McFarlanda wzrośnie o 0,5 w porównaniu z wartością czystego BMHB.
2. W celu przeprowadzenia procedury zaszczepiania należy umieścić prostokątne próbki mięsa w dwóch różnych foliach aluminiowych (20 cm x 30 cm), jednej dla próbek kontrolnych, a drugiej dla zaszczepionych próbek mięsa.
   1. Na drugiej folii aluminiowej zaszczepić surowe prostokątne próbki mięsa 800 μl zawiesiny bakterii wybranego szczepu (odpowiada to 1,2 × 10,8 jtk na próbkę mięsa) poprzez równomierne rozprowadzenie inokulum na powierzchni.
      1. Odpipetować 400 μl z jednej strony próbki i delikatnie rozprowadzić na powierzchni za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek. Pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Powtórzyć tę samą procedurę dla pozostałej części zawiesiny po drugiej stronie próbki.

3. Suszenie i aplikacja TEO

1. Przenieść obie folie aluminiowe zawierające prostokątne próbki mięsa z laminarnej komory bezpieczeństwa do suszarki: przykryć każdą folią aluminiową, a następnie umieścić próbki w suszarce.
2. Suszenie przeprowadzić w standardowej suszarce laboratoryjnej.
   UWAGA: Najpierw rozgrzej piekarnik do 55 °C. Ta procedura może trwać 20 minut.
   1. Suszyć próbki kontrolne przez 6 godzin w temperaturze 55 °C, przy wilgotności względnej powietrza suszącego w zakresie 30 - 45%.
      UWAGA: Wartości wilgotności względnej powietrza suszącego zmieniają się w czasie w zależności od szybkości parowania płynu z mięsa.
3. Oblicz objętość nałożonego TEO i wyraź stężenie olejku eterycznego jako objętość TEO na objętość suszarki (ml/l powietrza). Dla przykładu, dawka 1,5 ml TEO w 53 l (objętość suszarki) daje stężenie 0,028 mL/L powietrza. Aby określić MIC TEO dla E. coli, należy użyć dawek 1,5 ml (0,028 ml/l powietrza), 1 ml (0,019 mL/l powietrza) i 0,75 ml (0,014 ml/l powietrza).
4. Przed suszeniem, w celu zastosowania par TEO (z tymolem jako głównym związkiem 79%), należy namoczyć bibułę filtracyjną (12 cm x 20 cm) z dawką 1,5 ml TEO i umieścić w suszarce przed wentylatorem.
5. Próbki mięsa poddane działaniu TEO należy wysuszyć, stosując tę samą procedurę, co w przypadku próbek kontrolnych (etapy 3.1 i 3.2).
   UWAGA: Po zakończeniu procesu suszenia i usunięciu próbek włącz piekarnik na 3 godziny w temperaturze 80 °C i ustaw wskaźnik zaworu powietrza na 100% odpowietrznik w celu usunięcia pozostałości olejków eterycznych z piekarnika.

4. Analiza mikrobiologiczna

1. Przed inokulacją mięsa bakteriami należy zbadać próbki mięsa pod kątem zafałszowań. Pojawienie się szlamu i wykrycie wszelkich silnych i ostrych zapachów wskazuje na psucie się mięsa. Jeśli konsystencja jest śliska, bakterie mogły zacząć namnażać się na powierzchni mięsa.
2. Aby ocenić skuteczność inokulacji, należy przetestować surowe zaszczepione próbki na obecność E. coli ATCC 25922 i porównać je z nieinokulowanymi próbkami kontrolnymi przed procedurą suszenia. W tym celu:
   1. Umyć każdą próbkę mięsa (2 próbki kontrolne i 2 próbki inokulowane). Zawiesić każdą próbkę mięsa w wysterylizowanej kolbie z buforowaną wodą peptonową (8,5 g NaCl, 1 g peptonu, 5 tabletek soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i 1 g polisorbatu 80 w 1 l wody) w stosunku 1:10 (w/v) o pH w zakresie 7 - 7,3. Wstrząsać za pomocą wytrząsarki z prędkością 140 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Umyć natychmiast po zabiegu zaszczepiania.
   2. Oceń liczbę bakterii za pomocą dostosowanej procedury płytki z 6 × 6 kroplami, podsumowanej przez Chen, Nace i Irwin³³ na agarze z liczbą płytek (PCA) i agarze MacConkey (MCA).
      UWAGA: Metoda 6 × 6 kropli wykorzystuje metodę mikrorozcieńczania bulionu do przygotowania 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń badanej próbki za pomocą pipety wielokanałowej, co jest mniej pracochłonne i bardziej ekonomiczne w porównaniu z metodą konwencjonalną^33,34.
   3. Wyhodować 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki metodą 6 × 6 kropli w celu oceny E. coli.
      UWAGA: Szczególnie dla metody 6 × 6 kropli do uprawy należy użyć sześciu kropli 5 μL, z sześciu wybranych rozcieńczeń badanej próbki za pomocą wielokanałowej pipety. Na odpowiednio wysuszonych szalkach Petriego krople szybko wchłaniają się do agaru, a sadzenie tą metodą jest bardzo wygodne i łatwe do opanowania³⁴.
   4. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Po okresie hodowli ocenić liczbę kolonii E. coli na szalkach Petriego (jtk ^g-1 suszonego mięsa), jak opisano w sekcji 5.
3. Po wysuszeniu należy pobrać dwie zaszczepione wysuszone próbki i porównać je z dwiema wysuszonymi niezaszczepionymi próbkami kontrolnymi odpowiednio pod kątem żywotnej E. coli. W celu określenia obecności lub braku E. coli w tych czterechpróbkach, należy przeprowadzić proces wstępnego wzbogacania każdej próbki mięsa w następujący sposób:
   1. Zawiesić każdą próbkę mięsa w wysterylizowanej kolbie z buforowaną wodą peptonową (patrz krok 4.2.1) i wstrząsać za pomocą wytrząsarki z prędkością 140 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować każdą kolbę w temperaturze 37 °C przez 6 godzin w celu wstępnego wzbogacenia.
   2. W celu oceny i hodowli bakterii należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana w krokach 4.2.2 - 4.2.4.

5. Przejrzyj wyniki

1. Po zakończeniu inkubacji wyjmij szalki Petriego z inkubatora i przejrzyj wyniki w następujący sposób:
   1. Aby ocenić całkowitą liczbę kolonii, zbadaj płytki pod kątem obecności mezofilnych bakterii tlenowych na PCA (białe plamy) i typowych kolonii E. coli (od czerwonego do ciemnoróżowego) na MCA. Jeśli patogen jest nieobecny, oba agary nie wykazują wzrostu.
   2. Policz kolonie i określ ilość obecnych E. coli (jtk/^g-1 suszonego mięsa).
      UWAGA: Policz liczbę kolonii (N) w dwóch kolejnych rozcieńczeniach zawierających 30 lub mniej kolonii na kroplę (Rysunek 1). Liczbę N w jtk/^g-1 suszonego mięsa określa się w następujący sposób³⁵
      
      gdzie, C jest sumą kolonii na wszystkich policzonych kroplach, v jest objętością rozcieńczenia próbki użytej na kroplę (tutaj 0,05 ml), n₁ jest liczbą kropli użytych w pierwszym rozcieńczeniu, n₂ jest liczbą kropli użytych w drugim rozcieńczeniu, a d oznacza rozcieńczenie, z którego pobrano pierwsze zliczenia.
2. Aby przeanalizować dane mikrobiologiczne, przelicz liczbę kolonii na logarytm CFU ^g-1 i poddaj je analizie wariancji (ANOVA) dla głównych efektów leczenia³⁶.
   1. Wykonaj test Tukey Honest Significant Difference (Tukey HSD) dla wielu porównań średnich³⁶ i określ istotne różnice między zabiegami.

Wyniki

Najpierw opracowaliśmy tę metodę, używając olejku eterycznego z oregano (OEO) w celu zwiększenia bezpieczeństwa żywności i zwiększenia wartości suszonego mięsa. Ogólnie rzecz biorąc, poprzednie eksperymenty wykazały, że E. coli przechodzi w stan VBNC podczas suszenia jako strategia przetrwania. Świadczy o tym fakt, że po wysuszeniu nie było żadnych bakterii nadających się do hodowli finished²². W związku z tym konieczny był proces wstępnego wzbogacania prz...

Dyskusja

Wcześniejsze badania wykazały, że mikroorganizmy wywołujące choroby przenoszone przez żywność przeżywają suszenie¹⁰. Dlatego konieczne jest stosowanie konserwantów przed suszeniem, aby zapewnić bezpieczeństwo żywności. W tym badaniu skupiamy się na wykorzystaniu TEO. Powody są dwojakie: po pierwsze, istnieje duże zapotrzebowanie konsumentów na stosowanie produktów naturalnych jako alternatywnych dodatków w celu poprawy jakości żywności¹⁶; Po drugie, wcześniejsze badanie wyk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Krajalnica do mięsa	Kalorik	KP 3530	z Miami Gardens, FL, USA
Szafa bezpieczeństwa laminarnego	Faster s.r.l		z Włoch
Wyciśnięta butelka 500 ml	Merci	632 524 325 025	z CZ
Standardowa suszarka laboratoryjna UFE 400	Memmert	DE 66812464	z Niemiec
Inkubator	BT 120	N/A	z CZ
Lodówka i zamrażarka	Bosch	KGN34VW20G	firmy DE
Densytometr	Biosan	220 000 050 122	Łotwa; dostawca Merci, CZ
em>Escherichia coli ATCC 25922	Oxoid	CL7050	z CZ
Vortex	Chromservis	22008013	z CZ
Sterylizowane probówki plastikowe 15 ml	Gama	331 000 020 115	od CZ, dostawca Merci
20 ml fiolka do wstrzykiwań	Zdrowa fiolka	hvft169	z Chin
20 mm sterylny korek z gumy butylowej	Merci	22008013	z CZ
20 mm aluminiowa nakrętka	Zdrowa fiolka	N/A	z Chin
Olejek eteryczny z tymianku	Sigma Aldrich	W306509	z St Louis, MO, USA
Mueller Hinton Bulion	Oxoid	CM0337	od CZ
NaCl	Penta	16610-31000	z CZ
Peptone	Oxoid	LP0034	z CZ
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma Aldrich	P4417	z CZ
Polysorbate 80 (Tween 80)	Roth	T 13502	z DE, dostawca P-lab
Shaker SHO-1D	Verkon	DH. WSR04020	od CZ,  10 - 300 obr./min. 350 x 350 mm z platformą na kolby
Etanol 70%	Bioferm	N/A	od CZ
MacConkey Agar	Oxoid	CM007	od CZ
Liczba płytek Agar	Oxoid	CM0325	od CZ
Bibuła filtracyjna	Merci	480 622 080 040	od CZ
Kolby Erlenmeyera 250 ml	Simax	610 002 122 636	z CZ; dostawca Merci CZ
Pipeta wielokanałowa	Socorex	S852820	ze Szwajcarii; dostawca P lab, CZ
Płytka do mikromiareczkowania	Gamma	V400916	CZ
Pipeta mikrolitrowa 100-1000 μ L	Eppendorf	333 120 000 062	z Niemiec; dostawca Merci, CZ