Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

19.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57065

⸱

16 lutego 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Streszczenie

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, są pierwszymi osobami reagującymi na stan zapalny lub uraz w ośrodkowym układzie nerwowym. Ostatnie badania wykazały, że mikroglej jest dynamiczny, zdolny do przyjmowania zarówno fenotypów prozapalnych, jak i przeciwzapalnych. Zarówno fenotypy M1 (prozapalne), jak i M2 (pronaprawcze) odgrywają ważną rolę w stanach neurozapalnych, takich jak okołoporodowe uszkodzenie mózgu, i wykazują różne funkcje w odpowiedzi na określone bodźce środowiskowe. Zauważono, że modulacja aktywacji mikrogleju zapewnia neuroprotekcję, co sugeruje, że mikroglej może mieć potencjał terapeutyczny w uszkodzeniu mózgu. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby lepiej zrozumieć rolę mikrogleju w chorobie, a ten protokół to ułatwia. Opisany poniżej protokół łączy proces wirowania w gradiencie gęstości w celu zmniejszenia resztek komórkowych z separacją magnetyczną, w wyniku czego uzyskuje się wysoce czystą próbkę pierwotnych komórek mikrogleju, które można wykorzystać do eksperymentów in vitro, bez konieczności hodowli przez 2-3 tygodnie. Ponadto etapy charakterystyki dostarczają solidnych danych funkcjonalnych na temat mikrogleju, pomagając w badaniach w lepszym zrozumieniu polaryzacji i torowania tych komórek, co ma silne implikacje w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Uszkodzenia nabyte w okresie okołoporodowym w wyniku zapalenia, niedotlenienia-niedokrwienia i krwotoku mogą mieć szereg długoterminowych następstw. Uważa się, że złożona patofizjologia okołoporodowego uszkodzenia mózgu obejmuje stan zapalny i niedokrwienie, a w konsekwencji śmierć neuronów i aksonów1. Wrodzona odpowiedź immunologiczna odgrywa ważną rolę w kaskadzie zdarzeń prowadzących do urazu2.

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), są pierwszymi osobami reagującymi na uraz3. Mikroglej to plastikowe typy komórek, które mogą być zarówno ochronne, jak i toksyczne, w zależności od środowiska4. Biorą udział w chemotaksji, fagocytozie, prezentacji antygenów i produkcji cytokin i reaktywnych form tlenu4,5. Starzejące się mikroglej stale bada otoczenie i jest aktywowany przez obecność obcej lub szkodliwej substancji4. Aktywacja prowadzi do odpowiedzi prozapalnej, krytycznej w ochronie OUN4. Te "prozapalne" mikroglej fenotypu M1 są przede wszystkim zaangażowane w prezentację antygenu i śmierć patogenów4. Pomimo kluczowej roli odpowiedzi zapalnej w neuroprotekcji, niekontrolowany lub przedłużający się stan zapalny może być szkodliwy i prowadzić do uszkodzenia neuronów4. Jednak pod wpływem pewnych bodźców środowiskowych mikroglej może wykazywać fenotyp przeciwzapalny. Te pro-naprawcze mikroglej M2 odgrywają kluczową rolę w gojeniu i gojeniu się ran6, uwalniając szereg cytokin i innych rozpuszczalnych mediatorów, które obniżają stan zapalny, zwiększają fagocytozę i wspomagają naprawę4,7. Rola mikrogleju jest różnorodna i obejmuje m.in. stymulowanie różnicowania oligodendrocytów podczas remielinizacji8, ochronę neuronów podczas niedoboru tlenu i glukozy w modelach udarów9 oraz promowanie wzrostu neurytów w modelach urazów rdzenia kręgowego10.

Badanie tych komórek glejowych stanowi ważny aspekt w zrozumieniu i manipulowaniu reakcją na zapalenie nerwów. Opisany protokół pozwala na dalsze badania potencjału terapeutycznego modulacji mikrogleju w zaburzeniach neurozapalnych.

Modulację aktywacji mikrogleju w kierunku roli neuroprotekcyjnej zaobserwowano w różnych warunkach11,12,13. W związku z tym pogłębienie obecnego zrozumienia i dalsze badania nad modulacją aktywacji mikrogleju mają kluczowe znaczenie, co wymaga zastosowania różnych modeli, w tym zarówno in vitro, jak i in vivo. Badania in vitro stanowią ważne narzędzie ze względu na ich większą skuteczność, niższe koszty i możliwość badania izolowanej populacji komórek.

Istnieje szereg protokołów opisanych w literaturze do izolacji mikrogleju z mysich mózgów, co jest wyzwaniem dla efektywnego wytworzenia próbki o wysokiej wydajności o dobrej żywotności i wysokiej czystości. Powszechnie stosowanymi metodami izolacji pierwotnego mikrogleju są separacja magnetyczna i długotrwałe wytrząsanie mieszanych kultur glejowych. Na podstawie osobistych doświadczeń stwierdzono, że kolumna magnetyczna była blokowana w wysokim stopniu przez szczątki komórkowe. W związku z tym zastosowano następujący protokół, który obejmuje początkowy etap wirowania w gradionym gradionym gęstości, po którym następuje separacja magnetyczna CD11b. Opisany poniżej protokół został zoptymalizowany w celu uzyskania próbki o wysokiej czystości w wystarczającej ilości. Jest to korzystne ze względu na wysoką czystość i krótki czas trwania - testy można wykonać w ciągu 2 dni bez konieczności hodowli przez 2-3 tygodnie. Protokół ten może być potencjalnie zaadaptowany do izolacji pierwotnych astrocytów mysich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt na Uniwersytecie Monash. Do uzyskania reprezentatywnych wyników wykorzystano zdrowe, nieleczone noworodki C57Bl6 / J P3-6 myszy.

1. Trawienie enzymatyczne

UWAGA: Ważne jest, aby wziąć pod uwagę bezpłodność podczas izolowania i hodowli komórek pierwotnych. Dbając o to, aby środowisko było tak sterylne, jak to tylko możliwe, wstępna sekcja i zbiór mysich mózgów można zakończyć poza okapem z przepływem laminarnym, a wszystkie kolejne etapy można wykonać w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Za pomocą sterylnych narzędzi poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, odetnij głowę zwierzęcia i spłucz 100% etanolem. Za pomocą małych sterylnych nożyczek wykonaj małe nacięcia po prawej i lewej stronie głowy. W tym wieku skóra łatwo się złuszcza. Używając końcówek zakrzywionych kleszczy, delikatnie przesuń tkankę w kierunku mównicy, aby odsłonić czaszkę, w tym Bregmę.
  2. Włóż końcówkę nożyczek w otwór kanału kręgowego i wykonaj boczne nacięcie kanału słuchowego. Wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego do Bregmy, delikatnie kierując końcówkę nożyczek do góry, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Włóż końcówkę nożyczek do Bregmy i wykonaj boczne nacięcia po prawej i lewej stronie głowy wzdłuż szwu koronalnego.
  3. Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg. Aby to zrobić, chwyć krawędzie czaszki odsłonięte przez boczne nacięcie i delikatnie pociągnij czaszkę na bok. Czaszka powinna łatwo się odklejać. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie zgarnij pod mózg, aby go usunąć.
  4. Umieść mózg w sterylnym pojemniku o pojemności 5 ml, przemyj 2-3 razy lodowatym środkiem myjącym (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o niskiej zawartości glukozy uzupełnionym 1% penicyliną-streptomycyną), około 5 ml pożywki na płukanie, w celu usunięcia krwi.
  5. Zawartość pojemnika o pojemności 5 ml umieścić w okapie z laminarnym przepływem powietrza na małej szalce Petriego (35 mm), spoczywającej na lodzie. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela lub sterylnych nożyczek usuń móżdżek i opuszkę węchową. Wykonaj cięcie w linii środkowej, aby oddzielić dwie półkule.
  6. Ostrożnie oderwij warstwę opony mózgowej cienkimi kleszkami, uważając, aby nie uszkodzić kory mózgowej. Zidentyfikuj warstwę oponową jako bardzo cienką warstwę komórek z czerwonym odcieniem na powierzchni mózgu, z widocznymi naczyniami krwionośnymi. Utrzymanie zimnego mózgu jest niezbędne do prawidłowego usuwania opon mózgowych. Jeśli warstwa opony mózgowej pęknie, kontynuuj odklejanie podartych fragmentów, aż zostanie całkowicie usunięta.
  7. Przenieś półkule na nową małą szalkę Petriego (na lodzie) i napełnij mediami myjącymi. Pokrój mózg na małe kawałki sterylnym ostrzem skalpela/nożyczkami.
    UWAGA: Powinny mieć rozmiar ~1mm2 i należy uważać, aby nie pokroić ich na zbyt małe kawałki, ponieważ może to zmniejszyć wydajność.
  8. Dodać 100 μl papainy (17 j./mg bulionu) i 150 μl DNazy I do pożywki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C
  9. Po strawieniu rozpleć tkankę za pomocą pipety P1000. Jeśli kawałki tkanki są zbyt duże, aby dostać się do pipety, rozważ użycie pary lub sterylnych nożyczek w celu poszerzenia końcówki pipety. Podczas tego procesu należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do podłoża, ponieważ może to zmniejszyć żywotność komórek.

2. Usuwanie resztek mieliny

  1. Pod okapem z przepływem laminarnym użyj sterylnego sprzętu, przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek 100 μm dla każdego mózgu. Zawartość szalki Petriego, zawierającej pożywkę trawiącą i kawałki mózgu, wylać na sitko. Przepchnąć kawałki mózgu za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml ruchem mielącym, aż nie będzie już widać tkanki. Po strawieniu tkanka mózgowa powinna łatwo się rozpadać.
  2. Ciągle myj filtr środkiem myjącym, uzupełniając sitko komórkowe przez cały czas trwania tego procesu. Spowoduje to przepłukanie wszelkich komórek uwięzionych w sitku.
    UWAGA: Należy to robić, dopóki w probówce nie będzie około ~15 ml. Ma to na celu zapewnienie, że sitko jest wystarczająco przepłukane i zmaksymalizuje ilość zebranych komórek.
  3. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie należy przygotować podłoże o gradiencie gęstości zgodnie z opisem.
    1. Przygotuj podstawowy izotoniczny perkol (SIP), który jest używanym podłożem o gradiencie gęstości. W tym celu należy dodać pożywkę o gradionym nachyleniu gęstości w stosunku 9:1 do 10x sterylnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).
    2. Przygotuj gradienty jako 30% SIP w DMEM i 70% SIP w 1x HBSS. Na przykład, aby przygotować 10 ml 30% SIP, dodaj 3 ml SIP do 7 ml DMEM.
  4. Odessać supernatant z probówek stożkowych i ponownie zawiesić osad komórkowy z 8 ml 30% SIP w DMEM. Przenieść całą objętość do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Podłożeć 70 % roztwór SIP. W tym celu napełnij pipetę transferową 70% SIP i ostrożnie przepchnij pipetę transferową na dno stożkowej rurki. Gdy końcówka znajdzie się blisko dna, delikatnie przeciśnij zawartość pipety transferowej.
    UWAGA: Rób to powoli, aby nie zakłócać działania interfejsu 30/70. Musi istnieć wyraźna linia oddzielająca te dwie warstwy.
  6. Odwirować warstwy SIP, w tym komórki, przy ciśnieniu 650 x g z hamulcem 0 i przyspieszeniem 4, przez 25 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Konieczne jest zakończenie wirowania przy wyłączonym hamulcu i umożliwienie wirówce powolnego zatrzymania się, ponieważ zastosowanie hamulca zakłóci interfazę i radykalnie zmniejszy gromadzenie się komórek między warstwami SIP.
  7. Zassać resztki komórkowe w górnej części probówki i usunąć około 4 ml pożywki z góry. Ułatwi to usunięcie komórek jednojądrzastych w następnym kroku. Używając pipety P1000, ostrożnie opuść końcówkę pipety w kierunku interfazy. Wyizolować komórki jednojądrzaste od granicy faz pożywki o gradiencie gęstości 30/70. Zebrać około 3 ml z mętnego interfejsu i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie rozcieńczyć mieszaninę 9 ml HBSS, aby ułatwić usunięcie pożywki o gradiencie gęstości.
  8. Odwirować rozcieńczoną pożywkę o gradiencie gęstości, zawierającą komórki jednojądrzaste w temperaturze 500 x g, przez 5 minut. Odsysać supernatant i ponownie zawiesić 1 ml pożywki wzrostowej (DMEM uzupełniony 10 % płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykami). Następnie wybarwić zawieszone komórki błękitem trypanowym i wykonać zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.

3. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie

UWAGA: Te kroki są zmodyfikowane w stosunku do protokołu producenta.

  1. Odwirować zebrane komórki jednojądrzaste przy masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia pożywki wzrostowej, ponieważ zakłóci to izolację magnetyczną. Stosując tę samą liczbę komórek uzyskaną w kroku 2.8, ponownie zawiesić w 1 x 108 komórek jądrzastych/ml w PBS (wolne od Ca++ i Mg++) zawierającej 2 % FBS i 1 mM EDTA, w zakresie objętości 0,1-2,5 ml.
  2. Dodać pełną objętość komórek jądrzastych w PBS z poprzedniego kroku do świeżej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml (12 x 75 mm) z polistyrenu. Dodać 50 μl odczynnika do znakowania CD11b PE na 1 ml próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
  3. Dodać 70 μl koktajlu selekcyjnego (połączenie przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD11b w PBS) na 1 ml próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
  4. Mieszaj cząstki magnetyczne, pipetując w górę i w dół więcej niż 5 razy. Dodać 50 μl/ml do próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Cząstki te tworzą następnie kompleks tetrameryczny z przeciwciałami i przyłączają się do kolumny magnetycznej.
  5. Jeśli całkowita objętość mieszaniny komórek jest mniejsza niż 2,5 ml, uzupełnić do tej objętości PBS (wolny od Ca++ i Mg++) zawierający 2 % FBS i 1 mM EDTA i wymieszać delikatnie pipetując 2-3 razy. Umieść probówkę (bez pokrywki) w magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Jednym ciągłym ruchem całkowicie odwróć magnes zawierający rurkę na 2-3 s, wylewając supernatant. Ustaw magnes w pozycji pionowej i wyjmij rurkę z magnesu. Przygotuj się do wypłukania pozostałych komórek z kolumny.
    UWAGA: Supernatant zawiera nieznakowane i niechciane komórki, które są usuwane przez odwrócenie probówki, gdy nadal znajduje się w magnesie. Probówka zawiera dołączone ogniwa Cd11b+.
  7. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.5 i 3.6 jeszcze dwa razy. Jeżeli próbka jest większa niż 1 ml, zaleca się dalsze powtórzenie kroków 3.5 i 3.6.
  8. Ponownie zawieś komórki w żądanym pożywce wzrostowej. Przepłucz również bok naczynia zbiorczego (np. probówkę o pojemności 15 ml), aby zebrać komórki z boków probówki i zmaksymalizować wydajność.

4. Weryfikacja czystości mikrogleju

UWAGA: Pierwotny mikroglej wyizolowany z 3 L (n = 5 zwierząt ogółem) został zweryfikowany za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) w celu określenia czystości dla reprezentatywnych wyników.

  1. Hodowla komórek w kolbie T-25 w pożywce wzrostowej zawierającej 10% FBS przez noc, wysiewanie w gęstości 1 - 2 x 106 komórek na kolbę.
  2. Przemyć komórki w kolbach T-25 PBS 3x przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pozostałe pożywki wzrostowe, które mogłyby zakłócać trypsynizację.
  3. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny, aby odłączyć komórki od kolb. Upewnić się, że objętość trypsyny jest wystarczająca do pokrycia całej powierzchni kolby. Po delikatnym zawirowaniu kolby w celu zapewnienia równomiernego pokrycia trypsyną, inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Ugasić proces trypsynizacji, dodając do kolby 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS.
  5. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający trypsynizowane komórki i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek.
  6. Usunąć supernatant zawierający pożywkę wzrostową i trypsynę i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforze FACS. Wykonaj liczenie komórek za pomocą błękitu trypanowego.
  7. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać blok receptora Fc, dodając 50 μl buforu FACS + 1 μl blokera FcR na 5 x 106 komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Blok receptora Fc jest krytycznym krokiem w procedurze barwienia, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu immunoglobulin z receptorami Fc w populacjach komórek odpornościowych. Blokada ta nie wpływa na dalsze wiązanie innych przeciwciał.
  8. Zakończyć proces blokowania, rozcieńczając go 500 μl buforem FACS. Następnie odwirować mieszaninę zawierającą komórki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Zawiesić w świeżym buforze FACS o pojemności 500 μl.
  10. Umieścić większość komórek (np. w przypadku ponownego zawieszenia komórek w 500 μl buforu FACS należy użyć 400 μl) w probówce na próbkę. Rozmieścić pozostałe komórki w probówkach kontrolnych i uzupełnić do 100 μl na probówkę kontrolną (np. w przypadku 6 probówek kontrolnych umieścić 16,67 μl w każdej probówce kontrolnej i uzupełnić buforem FACS 83,33 μl). Utwórz grupy (probówki kontrolne pogrubioną czcionką) jako niebarwione, barwione pojedynczo (CD45, CD11b), pojedyncze żywe/martwe plamy, FMO i probówki na próbki.
  11. Granulować komórki we wszystkich probówkach, odwirowując przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Wybarwić komórki w probówce 1 μl przeciwciała na 100 μl buforu FACS na 5 x 106 komórek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Użyj koktajlu przeciwciał o pojemności 50 μl, jeśli używane są mniej niż 2 x 106 komórek.
  13. Przemyć komórki buforem FACS o pojemności 500 μl. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforze FACS.
    UWAGA: Użyj ~100 μl, jeśli liczba komórek jest mniejsza niż 2 x 106.
  15. Korzystając z analizy cytometrii przepływowej, określ ilościowo komórki, które mająniski poziom CD45 i dodatni pod względem barwienia CD11b. Odsetek ten odpowiada izolowanemu pierwotnemu mikroglejowi.

5. Barwienie immunohistochemiczne pierwotnego mikrogleju

  1. Umieść komórki na 96-dołkowej płytce o gęstości 1 x 105 komórek z pożywką wzrostową i inkubuj przez noc.
  2. Usunąć supernatant i przemyć 3 razy PBS.
  3. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut. Usunąć PFA za pomocą pipety P1000, a następnie umyć je 3 razy za pomocą PBS + 0,1% Triton-X.
  4. Blok do niespecyficznego wiązania z 3% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować z królikiem Iba-1 (1:100) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie usuń mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych i przemyj 3 razy PBS.
  6. Inkubować z drugorzędowym koniugatem GFP przeciwko królikowi (1:200) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń mieszaninę przeciwciał drugorzędowych i przemyj 3 razy PBS.
  7. Zamontuj szkiełka za pomocą fluorescencyjnego nośnika montażowego i rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Kwantyfikacja mikrogleju za pomocą testu pHrodo

UWAGA: Test pHrodo pozwala na identyfikację poziomów fagocytozy w hodowanych komórkach. Po wychwycie przez endocytozę, internalizacja w bardziej kwaśnym środowisku zwiększa poziom fluorescencji koniugatów biocząstek. Poziomy fluorescencji można następnie określić ilościowo za pomocą FACS. Poniższe kroki są modyfikowane na podstawie protokołu producenta.

  1. Hodować komórki w kolbie T-25 w pożywce wzrostowej przez noc, wysiewając się w gęstości 1-2 x 106 komórek na kolbę. Przemyć komórki w kolbach T-25 z PBS 3 razy przez 5 minut.
  2. Odłącz komórki za pomocą 2 ml 0,25% trypsyny. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Ugasić proces trypsynizacji, dodając do kolby 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający pierwotny mikroglej w pożywce w stężeniu 106 komórek/ml.
    UWAGA: Alternatywnie, umieść komórki w 96-dołkowej płytce co najmniej dzień wcześniej i dąż do 1 x 105 żywych komórek na basenik w dniu, w którym ma być wykonany test.
  6. Umieść komórki w 96-dołkowej płytce w odległości 1 x 105 komórek/dołek, 100 μl na dołek. Kontrole płytkowe i studzienki doświadczalne w trzech egzemplarzach i pozostawić jedną pustą studzienkę na kontrolę pozytywną w celu odjęcia tła bez kontroli komórkowej.
  7. Dodaj 100 μl pożywki wzrostowej do studzienek pozostawionych pustych w celu odjęcia tła bez komórek.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku każdego innego testu in vitro, odpowiednie kontrole mają zasadnicze znaczenie dla dokładności odczytów. Oprócz kontroli bezkomórkowej (czytanie w tle) należy również uwzględnić studzienkę kontroli ujemnej (koniugat pHrodo dodany, ale umieszczony na lodzie).
  8. Przykryć płytkę i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze z 5 % CO2 w temperaturze 37 °C.
  9. Przygotuj studnie eksperymentalne, dodając stymulant i leczenie. Dodać kontrole nośników (tylko podłoża wzrostowe) do nieoczyszczonych studzienek.
    UWAGA: W celu uzyskania reprezentatywnych wyników zastosowano lipopolisacharyd 1 μg / ml [stymulant] i pożywkę kondycjonowaną ludzkimi komórkami nabłonka owodni (hAEC) [leczenie].
  10. Rozmrozić fiolkę ze sprzężonym barwnikiem, dodać 2 ml buforu wychwytowego i krótko odwirować. Przenieś zawartość probówki do czystej szklanej probówki i sonikuj przez 5 minut, aby zapewnić równomierne rozproszenie cząstek.
  11. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków mikropłytki i szybko zastąpić 100 μl zawiesiny barwnika. Przykryć i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
    UWAGA: Pamiętaj również o zabrudzeniu rurek sterujących.
  12. Korzystając z analizy cytometrii przepływowej, określ ilościowo komórki zabarwione dodatnio dla sprzężonych kulek pHrodo i obecnych jako procent (rodzica) aktywnie fagocytozującego mikrogleju.

7. Kwantyfikacja apoptozy mikrogleju po zniewadze zapalnej

  1. Powtórz kroki 1-7 z sekcji "Weryfikacja czystości mikrogleju".
  2. Umieść większość komórek (np. jeśli zawiesiłeś komórki w 500 μl buforu FACS, użyj 400 μl) w probówce z próbką. Rozmieścić pozostałe komórki w probówkach kontrolnych i uzupełnić do 100 μl na probówkę kontrolną (np. w przypadku 6 probówek kontrolnych umieścić 16,67 μl w każdej probówce kontrolnej i uzupełnić buforem FACS 83,33 μl). Grupy (probówki kontrolne pogrubioną czcionką): Niebarwione, pojedyncze barwienia (AnnexinV, jodek propidyny), pojedyncze żywe/martwe barwienie, FMO, probówki z próbkami.
  3. Granulować komórki we wszystkich probówkach, odwirowując przy 500 x g przez 5 minut.
  4. Inkubować z 1 μl przeciwciała/100 μl buforu FACS/5 x 106 komórek przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Użyj 50 μl, jeśli mniej niż 2 x 106 komórek.
  5. Przemyć komórki, dodając 500 μl buforu FACS i odwirować przy 500 x g przez 5 minut.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforze FACS.
    UWAGA: ~ 100 μL, jeśli liczba komórek jest mniejsza niż 2 x 106.
  7. Określ ilościowo komórki w każdym kwadrancie (Q1: nekrotyczne, Q2: późna apoptoza, Q3: żywotne, Q4: wczesna apoptoza).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisane tutaj metody, można wyizolować czyste populacje mikrogleju, które będą gotowe do charakterystyki za pomocą analiz in vitro oraz FACS. Na początek, podczas jednej sesji uboju można wykorzystać do 18 zwierząt, przy oczekiwanej wydajności wynoszącej około 450,000 - 600,000 komórek mikrogleju. Kluczowe jest najpierw potwierdzenie czystości wyizolowanych komórek; w tym celu przeprowadzono analizę FACS poprzez barwienie na dwa markery: CD45 i CD11b. Identyfikacja mikro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroglej ma zdolność działania zarówno pro-, jak i przeciwzapalnego, zmienianego przez bodźce środowiskowe. Wcześniejsze badania wykazały, że modulacja aktywacji mikrogleju może nadawać neuroprotekcję. Ich zdolność do zapewniania ochrony neuronom i naprawy uszkodzeń wymaga dalszych badań, aby pogłębić obecne zrozumienie tych złożonych komórek. Dlatego izolacja pierwotnego mikrogleju o wysokiej czystości jest ważną i użyteczną techniką. Jest to stosunkowo szybka metoda uzyskania wysoce czystego pierwotnego mikrogleju got...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM, niska glukoza, pirogronianGibco11885084
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Gibco15240062
DNaza II stopnia z trzustki bydlęcejSigma-Aldrich10104159001
Papaina z lateksu papai, buforowany roztwór wodnySigma-AldrichP3125-100mg
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznieGibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
Zrównoważony roztwór soli Hanka (1X)Gibco14175-103
Zrównoważony roztwór soli Hanka (10X)Mysz Gibco14185052
EasySep CD11b Zestaw pozytywnej selekcjiStemCell Technologies18770Wariant
magnesu EasySepMagnesEasySep StemCell Technologies18000
EasySepBuffer StemCell Technologies20144
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoGibco14040182
Trypsyna (2,5%) (10X)Gibco15090-046
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (Mysz BD Fc Block™)BD Biosciences553141
Falcon 5mL okrągłodenna probówka PP o wysokiej czystości, z zatrzaskiem, sterylnyCorning352063
175cm² Kolba do hodowli komórkowych z kątową szyjką z nasadką odpowietrzającąCorning431080
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O127:B8Sigma-AldrichL5024
96 Dobrze poddane działaniu TC mikropłytki rozmiar 96 dołków, przezroczyste, polistyren, okrągłe dnoCorningCLS3799
Paraformaldehyd (proszek, 95%)Sigma-Aldrich158127
Triton-XSigma-AldrichX100
Królik Anti-IBA1Wako01919741 
Kozia Anty-Królicza IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS PrzeciwciałaCompanyNumer katalogowy
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ConjugateThermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
Roztwór jodku propodiumMiltenyi Biotech130-093-233

Bibliografia

  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387(2007).
  4. Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98(2014).
  5. Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
  6. Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864(2013).
  7. Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
  8. Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211(2013).
  9. Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063(2012).
  10. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435(2009).
  11. Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
  12. Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
  13. Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14(2008).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
  15. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
  16. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290(2016).
  17. Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46(2017).
  18. Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mikroglejuseparacja magnetycznagradient Percollliczenie komórekbarwienie błękitem trypanowymznakowanie CD11banaliza hemocytometrycznawarstwowanie Percoll
Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.