Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Summary

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Abstract

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, są pierwszymi osobami reagującymi na stan zapalny lub uraz w ośrodkowym układzie nerwowym. Ostatnie badania wykazały, że mikroglej jest dynamiczny, zdolny do przyjmowania zarówno fenotypów prozapalnych, jak i przeciwzapalnych. Zarówno fenotypy M1 (prozapalne), jak i M2 (pronaprawcze) odgrywają ważną rolę w stanach neurozapalnych, takich jak okołoporodowe uszkodzenie mózgu, i wykazują różne funkcje w odpowiedzi na określone bodźce środowiskowe. Zauważono, że modulacja aktywacji mikrogleju zapewnia neuroprotekcję, co sugeruje, że mikroglej może mieć potencjał terapeutyczny w uszkodzeniu mózgu. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby lepiej zrozumieć rolę mikrogleju w chorobie, a ten protokół to ułatwia. Opisany poniżej protokół łączy proces wirowania w gradiencie gęstości w celu zmniejszenia resztek komórkowych z separacją magnetyczną, w wyniku czego uzyskuje się wysoce czystą próbkę pierwotnych komórek mikrogleju, które można wykorzystać do eksperymentów in vitro, bez konieczności hodowli przez 2-3 tygodnie. Ponadto etapy charakterystyki dostarczają solidnych danych funkcjonalnych na temat mikrogleju, pomagając w badaniach w lepszym zrozumieniu polaryzacji i torowania tych komórek, co ma silne implikacje w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Introduction

Uszkodzenia nabyte w okresie okołoporodowym w wyniku zapalenia, niedotlenienia-niedokrwienia i krwotoku mogą mieć szereg długoterminowych następstw. Uważa się, że złożona patofizjologia okołoporodowego uszkodzenia mózgu obejmuje stan zapalny i niedokrwienie, a w konsekwencji śmierć neuronów i aksonów¹. Wrodzona odpowiedź immunologiczna odgrywa ważną rolę w kaskadzie zdarzeń prowadzących do urazu².

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), są pierwszymi osobami reagującymi na uraz³. Mikroglej to plastikowe typy komórek, które mogą ....

Protocol

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt na Uniwersytecie Monash. Do uzyskania reprezentatywnych wyników wykorzystano zdrowe, nieleczone noworodki C57Bl6 / J P3-6 myszy.

1. Trawienie enzymatyczne

UWAGA: Ważne jest, aby wziąć pod uwagę bezpłodność podczas izolowania i hodowli komórek pierwotnych. Dbając o to, aby środowisko było tak sterylne, jak to tylko możliwe, wstępna sekcja i zbiór mysich mózgów można zakończyć poza okapem z przepływem laminarnym, a wszystkie kolejne etapy można wykonać w okapie z przepływem laminarnym.

1. Za pomocą sterylnych narzędzi poddaj mysz eutan....

Results

Korzystając z opisanych tutaj metod, można wyizolować czyste populacje mikrogleju i przygotować je do charakterystyki za pomocą analizy in vitro i FACS. Na początek można wykorzystać do 18 zwierząt w jednym uboju, z oczekiwaną wydajnością około 450 000 - 600 000 komórek mikrogleju. Kluczowe jest, aby najpierw potwierdzić czystość wyizolowanych komórek, a w tym celu przeprowadzono analizę FACS poprzez barwienie dwóch markerów CD45 i CD11b. Identyfikacja mikrogleju może okazać się .......

Discussion

Mikroglej ma zdolność działania zarówno pro-, jak i przeciwzapalnego, zmienianego przez bodźce środowiskowe. Wcześniejsze badania wykazały, że modulacja aktywacji mikrogleju może nadawać neuroprotekcję. Ich zdolność do zapewniania ochrony neuronom i naprawy uszkodzeń wymaga dalszych badań, aby pogłębić obecne zrozumienie tych złożonych komórek. Dlatego izolacja pierwotnego mikrogleju o wysokiej czystości jest ważną i użyteczną techniką. Jest to stosunkowo szybka metoda uzyskania wysoce czystego pierwotnego mikrogleju got.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, niska glukoza, pirogronian	Gibco	11885084
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)	Gibco	15240062
DNaza II stopnia z trzustki bydlęcej	Sigma-Aldrich	10104159001
Papaina z lateksu papai, buforowany roztwór wodny	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Zrównoważony roztwór soli Hanka (1X)	Gibco	14175-103
Zrównoważony roztwór soli Hanka (10X)	Mysz Gibco	14185052
EasySep CD11b Zestaw pozytywnej selekcji	StemCell Technologies	18770	Wariant
magnesu EasySepMagnes	EasySep StemCell Technologies	18000
EasySep	Buffer StemCell Technologies	20144
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Gibco	14040182
Trypsyna (2,5%) (10X)	Gibco	15090-046
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (Mysz BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL okrągłodenna probówka PP o wysokiej czystości, z zatrzaskiem, sterylny	Corning	352063
175cm² Kolba do hodowli komórkowych z kątową szyjką z nasadką odpowietrzającą	Corning	431080
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Dobrze poddane działaniu TC mikropłytki rozmiar 96 dołków, przezroczyste, polistyren, okrągłe dno	Corning	CLS3799
Paraformaldehyd (proszek, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Królik Anti-IBA1	Wako	01919741
Kozia Anty-Królicza IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Przeciwciała	Company	Numer katalogowy
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Roztwór jodku propodium	Miltenyi Biotech	130-093-233