Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Streszczenie

Automatyczne urządzenie do krystalizacji to opatentowana technika¹ specjalnie opracowana do monitorowania eksperymentów z krystalizacją białek w celu precyzyjnego manewrowania zarodkowaniem i wzrostem kryształów w kierunku pożądanych rozmiarów kryształów białka. Kontrolowana krystalizacja opiera się na badaniu próbki za pomocą dynamicznego rozpraszania światła in situ (DLS), podczas gdy wszystkie zmiany wizualne w kropli są monitorowane online za pomocą mikroskopu sprzężonego z kamerą CCD, umożliwiając w ten sposób pełne badanie kropli białka na wszystkich etapach krystalizacji. Wykorzystanie pomiarów DLS in situ w całym eksperymencie pozwala na precyzyjną identyfikację wysoce przesyconego roztworu białkowego przechodzącego w nową fazę – powstawanie jąder krystalicznych. Identyfikując etap zarodkowania białka, krystalizację można zoptymalizować od dużych kryształów białka do produkcji mikrokryształów białek. Protokół eksperymentalny przedstawia interaktywne podejście do krystalizacji oparte na precyzyjnych zautomatyzowanych krokach, takich jak dodawanie środka strącającego, parowanie wody w celu wywołania wysokiego przesycenia oraz rozcieńczenie próbki w celu spowolnienia indukowanego jednorodnego zarodkowania lub odwrócenia przemian fazowych.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich kilku lat, rozwój mikro- i nanokryształów białek przyciągnął uwagę społeczności krystalografii białek, szczególnie dzięki ciągłemu rozwojowi seryjnej krystalografii femtosekundowej (SFX). Ze względu na błyskotliwość nowatorskich źródeł promieniowania rentgenowskiego i w oparciu o uzyskane do tej pory pomyślne wyniki, produkcja mikro- i nanokryształów białek stała się bardzo ważna, co stwarza duże zapotrzebowanie na otrzymywanie takich krystalicznych zawiesin^2,3. Ze względu na mały zakres rozmiarów kryształów wymagany do zbierania danych za pomocą laserów na swobodnych elektronach (XFEL) oraz ograniczoną dostępność eksperymentalnego czasu wiązki, niezbędna jest charakterystyka próbki przed zebraniem danych. Najpowszechniejszymi technikami charakteryzowania mikro- lub nanokrystalicznych zawiesin białek są do tej pory mikroskopia elektronowa i dyfrakcja proszków rentgenowskich.

Do tej pory kilka podejść zostało zaadaptowanych z powszechnie stosowanych metod krystalizacji w celu wytworzenia dużych ilości kryształów białkowych o wymiarach w małym zakresie mikrometrów. Metoda wsadowa jest stosowana do szybkiego mieszania roztworów białek o wysokim stężeniu i strącaczy, zmuszając w ten sposób roztwór próbki do fazy silnie przesyconej, w której może preferować nanokrystalizację⁴. Inne metody obejmują kruszenie dużych kryształów białka w celu utworzenia zawiesiny krystalicznej, która może służyć jako nanokrystaliczne zawiesiny do wykorzystania do zbierania danych⁵. Jednak wyniki mogą czasami powodować pogorszenie jakości dyfrakcji, ponieważ uszkodzone kryształy mają niższy porządek wewnętrzny. Alternatywą jest również nanokrystalizacja oparta na swobodnej dyfuzji międzyfazowej, w której roztwór białka dodaje się w małych ilościach do wysoce stężonego roztworu strącającego³. Jednak spośród wszystkich technik, najbardziej efektywnymi metodami wydają się być krystalizacja wsadowa i bardziej innowacyjne techniki manipulacyjne wykorzystujące metody dyfuzji parowej w siedzących kroplach⁶.

Ogólnie, dla krystalizacji białka musi zostać przekroczona bariera energetyczna, która wspiera zarodkowanie - pierwszy termodynamiczny krok w tworzeniu kryształów. Aby przesunąć roztwór białkowy ze stanu stabilnego termodynamicznie do przesycenia i ostatecznie wywołać przemianę fazową, niektóre zmienne związane z roztworem białkowym muszą zostać zmodyfikowane. Takimi zmiennymi są zwykle stężenie roztworu białkowego, zmiany środowiskowe (np. temperatura, wilgotność), charakterystyka rozpuszczalnika (np. pH, siła jonowa), stężenie i właściwości buforowe itp.^7,8 Przegląd parametrów próbki, które można zmienić, jest zwykle reprezentowany za pomocą wykresów fazowych, które pozwalają na różne sposoby prezentacji, takie jak wykresy rozpuszczalności, zarodkowanie diagramy fazowe, a nawet bardziej szczegółowe opisy, w których można uwzględnić diagramy trójwymiarowe lub bardziej złożone^8,9,10. Najbardziej atrakcyjne typy diagramów fazowych są zwykle dwuwymiarowe, gdzie główną zmienną jest stężenie białka w funkcji innego parametru, podczas gdy pozostałe parametry są utrzymywane na stałym poziomie^6,11. Po uformowaniu jednego lub kilku jąder większe kryształy mogą rosnąć, pobierając dodatkowe białko z roztworu objętościowego. Dążąc do produkcji mikro- i nanokryształów, takie konwencjonalne podejście do krystalizacji nie jest już możliwe ze względu na niewielką liczbę kryształów obecnych w roztworze. Zawiesiny nanokrystaliczne zwykle muszą być bogate w jednostki krystaliczne, dlatego szlak krystalizacji musi zostać ponownie dostosowany, tak aby w próbce występowały maksima zdarzeń zarodkowania. W związku z tym wymaga to zbadania nowych, do tej pory niezbadanych szlaków zarodkowania białek, które również nie są jeszcze w pełni poznane^12,13. Opierając się na wspomnianych wcześniej podstawach diagramu fazowego, klasyczna teoria została rozszerzona o nową hipotezę, w której zarodkowanie jest opisane jako mechanizm dwuetapowy: po pierwsze, następuje przejście do wyższego stężenia białka (gęsta faza ciekła), a po drugie, przejście od fazy gęsto bogatej do wyższego porządku wewnętrznego (jądra kryształów o architekturze sieciowej)^{14, 15,16}. Krystalizacja białek jest wrażliwa na wiele czynników, dlatego też, gdy receptury krystalizacji są dostosowywane tak, aby uzyskać kryształy o różnych rozmiarach, receptury nie zawsze mogą opierać się na wcześniejszej wiedzy. Konieczne jest uzyskanie nowych informacji dla każdego docelowego białka z osobna: dostosowanie składu buforu, czystości i stabilności próbki, dokładna wiedza na temat rozpuszczalności białek itp.

Dynamiczne rozpraszanie światła jest dziś dobrze znaną metodą analizy i optymalizacji procesów krystalizacji białek, ze względu na szeroki zakres rozmiarów cząstek, które można badać: od białek monomerycznych po nanokryształy i małe mikrokryształy. Metoda wykorzystuje fakt, że cząstki w roztworze podlegają ruchom Browna, a średnia prędkość tego ruchu zależy od wielkości cząstek, ich energii cieplnej oraz lepkości ośrodka i geometrii cząstek. Na początku ciekły ośrodek jest oświetlany przez spójne źródło światła za pomocą lasera. Światło rozproszone przez cząstki tworzy wzór interferencyjny. Ponieważ cząstki są w ciągłym ruchu, wzór interferencyjny również zmienia się trwale. Patrząc w określonym kierunku, można zaobserwować wahania intensywności. Fluktuacje te pokazują teraz ruch cząstek spowodowany ruchem Browna. Na podstawie zmierzonych fluktuacji intensywności obliczana jest funkcja autokorelacji (ACF). Analiza ACF da miarę rozkładu prędkości (a dokładniej współczynnika dyfuzji) cząstek i za pomocą równania Stokesa-Einsteina zostanie przekształcona w rozkład promienia cząstek¹⁷. Dodatkowe informacje związane z funkcjonalnością i zasadą działania DLS można znaleźć w różnych publikacjach i książkach^18,19.

Tutaj stosujemy i opisujemy unikalne urządzenie do automatycznej krystalizacji, XtalController900, ulepszoną wersję technologii XtalController⁶, precyzyjnie opracowane do monitorowania interaktywnych eksperymentów krystalizacji białek. Technika ta wykazuje duży potencjał w zakresie identyfikacji i śledzenia zdarzeń zarodkowania w czasie rzeczywistym, umożliwiając precyzyjne manewrowanie przez diagram faz krystalizacji. Celem tej konkretnej procedury krystalizacji jest optymalizacja krystalizacji białek w celu uzyskania wysokiej jakości mikro- i nanokryształów białkowych, które nadają się do zastosowań wykorzystujących mikroskoncentrowane synchrotronowe źródła promieniowania rentgenowskiego, dyfrakcję elektronów lub SFX.

Protokół

UWAGA: W całym protokole, system mikrodozowania używany do dodawania wody będzie określany jako Pompa0, podczas gdy system mikrodozowania używany do dodawania środka strącającego będzie nazywany Pompą1. Wyniki tego eksperymentu będą dalej omawiane i określane jako THM2_micro-kryształy.

1. Parametry i konfiguracja rozwiązania

1. Przefiltrować 16 ml roztworu winianu N (1,2 M) i 16 ml wody destylowanej za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm.
   UWAGA: Roztwór winianu jest roztworem strącającym do eksperymentu krystalizacji.
2. Napełnij butelki z środkiem strącającym i wodą 5 ml przefiltrowanych roztworów.
   UWAGA: Butelki mają maksymalną pojemność 5 ml.
3. Zamontuj butelki w uchwytach pompki komory doświadczalnej.
4. Ustaw parametry eksperymentalne w oknie oprogramowania na następujące wartości: temperatura w temperaturze 20 °C, wilgotność względna w temperaturze 20 i rozpuszczalnik w postaci wody.
   UWAGA: Rysunek 2 pokazuje okno wyświetlania, w którym użytkownik może wprowadzić poprawne wartości dla każdego parametru, takiego jak temperatura, wilgotność względna i rozpuszczalnik. Okno oprogramowania pokazuje również kilka dodatkowych parametrów, takich jak dodatki. Jest to ważne tylko w przypadku eksperymentów, w których dodatki są obecne w roztworze strącającym.
5. Otwórz przednie drzwiczki komory doświadczalnej i wyjmij nośnik szkiełka nakrywkowego.
6. Umieść czyste i silikonowane szkiełko nakrywkowe na nośniku i umieść je z powrotem w urządzeniu.
   UWAGA: Szkiełko nakrywkowe ma rozmiar 2,2 cm.
7. Zamknąć komorę doświadczalną w celu zabezpieczenia warunków środowiskowych z kroku 1.4.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Regulacja systemów mikrodozowania

Włącz Pump0, korzystając z głównych charakterystyk pompy w Rysunek 3 i utwórz strumień wody.

1. UWAGA: Trajektoria strumienia wody jest tworzona na podstawie niektórych charakterystyk pompy, które można regulować. Rysunek 3 pokazuje główne charakterystyki pompy i optymalne wartości, które powinny być użyte w tym eksperymencie.
2. Wyreguluj pozycję celowania strumienia wody w kierunku środka szkiełka nakrywkowego, ręcznie naciskając odpowiednią regulacyjną. Wyłączyć pompę0.
3. Włącz pompę1 i utwórz strumień cieczy, tak jak wcześniej w kroku 2.1. Dostosuj pozycję strumienia Pompa1 w kierunku pozycji ustalonej dla Pompy0. Wyłączyć pompę1.
4. Wymień zużyte szkiełko nakrywkowe na nowe i czyste do eksperymentu z krystalizacją.
   UWAGA: Miękkie chusteczki są zwykle zalecane do czyszczenia nowego szkiełka nakrywkowego z resztek kurzu przed użyciem w eksperymencie krystalizacji.

3. Ustawianie kropli taumatyny w komorze doświadczalnej

1. Utwórz nowy plik eksperymentalny przy użyciu pakietu oprogramowania. Wprowadzić następujące informacje do pliku doświadczalnego: białko (taumatyna z Thaumatococcus daniellii), stężenie białka (14 mg/ml), substancja strącająca (Winian Na) i stężenie środka strącającego (1,2 M).
   UWAGA: Informacje te posłużą do automatycznych obliczeń stężenia strącania i białka podczas eksperymentu krystalizacji.
2. Załaduj nowy plik eksperymentu, aby aktywować wszystkie informacje z kroku 3.1.
3. Zaznacz położenie kropli białka, dodając małą kroplę wody za pomocą Pump0.
   UWAGA: Celem jest stworzenie małej kropli wody, która posłuży jako punkt orientacyjny, na którym zostanie umieszczona próbka białka.
4. Naciśnij przycisk Tara, aby ustawić masę podaną przez mikrowagę na zero.
   UWAGA: Spowoduje to usunięcie ciężaru szkiełka nakrywkowego i dodatkowego ciężaru dodanego przez mały punkt orientacyjny wody utworzony w kroku 3.3.
5. Otwórz górną pokrywę komory doświadczalnej i odpipetuj 8 μl roztworu taumatyny na punkcie orientacyjnym wody.
6. Zarejestruj nową kroplę taumatyny, postępując zgodnie z kolejnymi poleceniami.
   1. Naciśnij przycisk Nowe upuszczanie, aby przypisać warunki początkowe z pliku eksperymentalnego.
   2. Naciśnij przycisk Const, aby skompensować naturalne parowanie wody z kropli.
7. Sprawdź za pomocą kamery CCD, czy Pump0 celuje w kroplę białka. Dostosuj położenie Pompa0, jeśli strumień wody jest skierowany na zewnątrz kropli.
   UWAGA: Od tego momentu kropla białka będzie miała stałą wagę, dzięki automatycznemu dodawaniu wody, które kompensuje naturalne parowanie wody z kropelki białka. Masa kropelki białka, a także inne parametry, takie jak temperatura i wilgotność względna, mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym za pomocą okna wyświetlacza. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.

4. Pomiary DLS in situ

1. Włącz laser DLS i umieść wiązkę laserową w kropli białka ręcznie za pomocą regulacyjnych.
2. Wprowadź następujące parametry DLS: czas pomiaru (60 s), czas oczekiwania między dwoma pomiarami (10 s) oraz liczbę pomiarów (300).
   UWAGA: Pierwsze 30 pomiarów posłuży jako pomiary referencyjne do kontroli stabilności białka. Pozostałe pomiary posłużą jako pełne badanie kropelki białka podczas całkowitego czasu trwania procesu krystalizacji.
3. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć pomiary DLS. Sprawdź jakość próbki, wybierając jedną z reprezentacji graficznych DLS.
   UWAGA: Próbka powinna wykazywać wysoki stopień monodyspersyjności, bez żadnych agregatów w roztworze. Wyniki DLS mogą być wyświetlane i odczytywane jako: rozkład promienia, histogram promienia, wykres promienia, podsumowanie pomiarów lub jako przegląd intensywności zliczania.

5. Etap odparowywania próbki

1. Wprowadź warunki dla etapu parowania w tabeli harmonogramu, korzystając z danych pokazanych w tabeli 1.
   UWAGA: Znak "-" wprowadzony w kolumnie "Molarność/Procent" w drugim wierszu oznacza utratę wody z kropelki białka, podczas gdy wartość "25" oznacza, że objętość kropli ulegnie zmniejszeniu o 25%. Oznacza to, że stężenie białka w kropelce wzrośnie o 25%.
2. Aktywuj etap odparowywania próbki, naciskając przycisk Autom. Naciśnij przycisk Stop, gdy etap odparowywania próbki zostanie zakończony.
3. Aktywuj przycisk Const, aby utrzymać stałą kroplę po zatrzymaniu parowania próbki.

6. Etap dodawania środka strącającego

1. Wprowadź warunki dla etapu dodawania strącacza w tabeli harmonogramu pokazanej w Rysunek 4, korzystając z danych podanych w tabeli 2.
   UWAGA: Pierwszy wiersz tabeli reprezentuje etap kalibracji, podczas którego oprogramowanie oblicza naturalną szybkość parowania kropelki białka na podstawie ilości środka strącającego, który należy dodać do kropli białka. Oprogramowanie ekstrapoluje tę wartość i automatycznie dostosowuje częstotliwość wystrzeliwania dla Pump0, aby automatycznie skompensować parowanie wody na następnym etapie dodawania środka strącającego.
2. Aktywuj etap dodawania środka strącającego, naciskając przycisk Autom.
   UWAGA: Dodawanie środka strącającego jest procesem zautomatyzowanym, zgodnie z danymi wejściowymi z tabeli harmonogramu.

7. Śledzenie ewolucji kropli krystalizacji w czasie

1. Sprawdź wygląd kryształów taumatyny za pomocą kamery CCD.
2. Sprawdź rozkład wielkości cząstek, korzystając z reprezentacji graficznych DLS.
3. Sprawdź ewolucję masy i parametry eksperymentalne za pomocą okna wyświetlacza.
   UWAGA: Gdy roztwór winianu Na-winianu osiągnie stężenie 0,74 M w kropli białka, kropla staje się bogata w mikrokryształy taumatyny, jak widać na Rysunek 7.

8. Odzyskiwanie kropli krystalizacji

1. Posmaruj czysty standardowy talerz Terasaki olejem parafinowym.
   1. Dodaj 3 ml oleju parafinowego na talerz.
   2. Rozprowadź olej parafinowy na dołkach płytkowych, delikatnie przesuwając płytkę pod różnymi kątami, tak aby olej pokrył wszystkie 72 dołki płytki.
   3. Usuń nadmiar oleju parafinowego, wylewając olej, który unosi się na talerzu.
2. Naciśnij przycisk Stop, aby zakończyć eksperyment krystalizacji. Ostrożnie wyjąć nośnik próbki zawierający kroplę krystalizacji.
3. Za pomocą pipety umieścić objętość 2 μl podwielokrotności kropli krystalizacji w studzienkach płytki Terasaki.
   UWAGA: Odzyskując kroplę krystalizacji w płytce pod olejem, próbka może być okresowo sprawdzana pod kątem stabilności i wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu lub innych technik DLS, które działają ze standardowymi płytkami Terasaki.

Wyniki

Wyniki uzyskane przez pomiary DLS podczas eksperymentu krystalizacji pokazują szczegółową ewolucję promieni cząstek hydrodynamicznych, co skutkuje dwoma głównymi frakcjami rozkładu cząstek, które rozwijają się z czasem. W pierwszej części eksperymentu próbka była powoli odparowywana, w celu uzyskania wyższego stężenia białka. Jak pokazano w Rysunek 5B, spadek białka był skoncentrowany z 14 mg/ml do 19,5 mg/ml. W tym czasie, zgodnie ze wzorcem rozkładu promienia w Rysunek 5A, białko wykazuje zachowanie monomeryczne w roztworze o stałej wielkości cząstek około 2,5 nm. W miarę dalszego odparowywania próbki białko monomeryczne pozostaje stabilne w roztworze, bez żadnych oznak denaturacji lub agregacji próbki.

Dodawanie roztworu strącającego do kropli białka jest inicjowane natychmiast po odparowaniu próbki i podświetlone na szaro we wzorze rozkładu promienia i krzywych równowagi dla lepszej wizualizacji (Rysunek 5). Na podstawie obliczeń uzyskanych na podstawie masy próbki, wyróżniona frakcja cząstek jest przypisywana inicjacji zarodkowania kryształów, w wyniku czego uzyskuje się promień o wielkości około 200 - 400 nm. Zjawisko to (znane jako zarodkowanie) rozpoczyna się przy stężeniu strącającym 0,6 M w kropelce białka, w okresie około 66 minut od rozpoczęcia doświadczenia i około 23 minut w odniesieniu do rozpoczęcia dodawania środka strącającego. Wraz ze wzrostem stężenia środka strącającego rozkład promienia wykazuje szeroki rozkład cząstek w roztworze. W miarę jak formuje się więcej jąder, początkowe jednostki krystaliczne rosną w swoich rozmiarach, osiągając rozkład promienia między 800 - 1300 nm. Można wnioskować, że na tym etapie jądra kryształów nadal rosną, a frakcja białkowa stopniowo ubożeje, ponieważ cząsteczki białka są pobierane przez mikrokryształy. Ponieważ stężenie strącania w kropli białka powoli rośnie, tworzenie się mikrokryształów jest łatwe do zidentyfikowania po 75 minutach, kiedy rozkład promienia nadal rozwija się między 500 a 1500 nm. Ewolucję rozkładu promienia potwierdzają również obrazy z kamer CCD, na których mikrokryształy białek są widoczne przy stężeniu 0,7 M w roztworze (Rysunek 7). Gdy dodawanie środka strącającego jest zakończone, a spadek krystalizacji utrzymuje się na stałym poziomie, rozkład promienia wykazuje dominującą fazę między 1,000 a 3,000 nm, podczas gdy odsetek zdarzeń zarodkowania zmniejsza się z czasem. W tym momencie kropla krystalizacji jest w pełni nasycona mikrokryształami i w roztworze nie występują żadne dalsze zdarzenia zarodkowania.

Korzystając jako eksperymentalne dane zwrotne z mikrowagi, narysowano diagram faz krystalizacji dla pełnego zrozumienia procesu krystalizacji taumatyny. W Rysunek 6, eksperymentalny diagram fazowy pokazuje trzy niezależne eksperymenty krystalizacji, w których produkcja mikrokryształów thometyny T. danielli jest oznaczona jako THM_2 Mikrokryształy (Protokół). Dwa dodatkowe eksperymenty krystalizacji oznaczone THM_1 makrokryształy i THM_3 makrokryształy zostały wykorzystane jako dane wejściowe w celu uzyskania prawidłowego odwzorowania różnych obszarów na diagramie fazowym (np. rozpuszczalność lub obszar metastabilny). Ponieważ protokoły tych eksperymentów przebiegają różnymi ścieżkami krystalizacji, identyfikacja regionu zarodkowania staje się łatwiejsza, a tym samym dokładniejsza. Dla każdego eksperymentu ścieżka krystalizacji jest wyróżniona liczbami w kolejności, aby podkreślić różne podejścia i liczbę etapów krystalizacji, które zostały użyte do uzyskania określonego wyniku, podczas gdy szare strzałki reprezentują oszacowanie końcowego stężenia białka, gdy wzrost kryształów pobiera cząsteczki białka z roztworu w tworzeniu dobrze zdefiniowanych stabilnych kryształów białka.

Trzy eksperymenty z taumatyną przedstawione w Rysunek 6 pokazują różne warunki podczas wchodzenia w obszar zarodkowania, a co za tym idzie, różne końcowe wyniki krystalizacji, co widać na zdjęciach poniżej diagramu fazowego. W przypadku THM1 i THM3 roztwór białkowy przechodzi przez fazę zarodkowania i ponownie wchodzi do obszaru metastabilnego, gdzie spoczywa, aż uformują się kryształy. W związku z tym eksperymenty prowadzą do powstania dużych, dobrze zdefiniowanych kryształów otoczonych ługiem macierzystym. Jednak w przypadku eksperymentu przedstawionego w sekcji protokołu, THM2_micro-kryształy, ścieżka krystalizacji jest zgodna z określonym podejściem. W poprzedniej sekcji wspomnieliśmy, że aby próbka dała mikrokryształy, roztwór białka musi znajdować się głęboko w fazie zarodkowania, tak aby zdarzenia zarodkowania mogły powstawać z maksymalną szybkością. W przypadku kryształów THM2_micro stosunek stężenia białka do stężenia środka strącającego został dostosowany w taki sposób, że próbka nie tylko wchodzi do obszaru zarodkowania, ale jako środek strącający jest dalej dodawany do roztworu białka, a warunki nie przesuwają się do innego obszaru na schemacie fazowym, ale pozostają w stanie silnego przesycenia w obszarze zarodkowania. W rezultacie entropia roztworu drastycznie spada, ponieważ kropelka białka natychmiast nasyca się małymi krystalicznymi jednostkami.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie eksperymentu krystalizacji. Rysunek przedstawia przegląd komory doświadczalnej krystalizacji ze wszystkimi częściami technicznymi wymaganymi do przeprowadzenia eksperymentu automatycznej krystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Okno oprogramowania dla DLS i parametrów próbki, które są istotne dla eksperymentu krystalizacji. Parametry obejmują temperaturę, wilgotność względną, lepkość itp.

Rysunek 3: Okno sterowania oprogramowaniem dla systemów mikrodozowania biorących udział w eksperymencie krystalizacji. Cechy te pozwalają na dostosowanie określonych parametrów generowania kropel lub strumienia roztworu.

Rysunek 4: Okno oprogramowania dla tabeli harmonogramu opisującej etapy krystalizacji biorące udział w eksperymencie. Warunki początkowe kropli krystalizacji są również zintegrowane z tym oknem.

Rysunek 5. Przegląd produkcji mikrokryształów taumatyny T. daniellii. (A) Rozkład promieniowy wielkości cząstek w kropli białka podczas całego procesu krystalizacji. (B) Monitorowany przegląd parametrów doświadczalnych. Wykresy przedstawiają ewolucję w czasie masy kropli białka (krzywa) wraz z obliczonym stężeniem białka (czerwona krzywa) i stężeniem strącania (niebieska krzywa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Eksperymentalny diagram fazy krystalizacji taumatyny T. danielli wraz z wynikającymi wynikami. Wszystkie wykresy pochodzą z danych doświadczalnych, w oparciu o informacje zwrotne dostarczone przez mikrowagę. Liczby przypisane do każdego eksperymentu, które są widoczne w nawiasach, reprezentują kolejność i liczbę kroków wykonanych podczas protokołu krystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Zarejestrowana fotografia kryształów THM2_Micro (Protokół) pokazująca dużą liczbę mikrokryształów nasyconych roztworem. Zdjęcie wykonano po 4 godzinach (240 min) po ustawieniu kropli białka w komorze doświadczalnej w celu krystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Zarejestrowana fotografia THM_1 makrokryształów przedstawiająca kilka dużych kryształów taumatyny stabilnych w roztworze. Zdjęcie wykonano 20 godzin po ustawieniu kropli białka w komorze doświadczalnej w celu krystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Utrwalona fotografia dla THM_3 makrokryształów ukazująca różnej wielkości kryształy taumatyny w roztworze. Zdjęcie wykonano 20 godzin po ustawieniu kropli białka w komorze doświadczalnej w celu krystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. pkt. szt. szt.

substancja	Molarność/Procent	Czas (s)
Woda	0	100
Woda	-25	2100
Woda	0	2100

Tabela 1: Automatyczne wprowadzanie harmonogramu dla etapu odparowywania próbki w produkcji mikrokryształów taumatyny.

szt. szt.

substancja	Molarność/Procent	Czas (s)
Woda	0	100
prec	0,8	Rok 1800
Woda	0	18000

Tabela 2: Automatyczne wprowadzanie harmonogramu dla etapu dodawania środka strącającego w produkcji mikrokryształów taumatyny.

Dyskusja

Urządzenie do krystalizacji przeznaczone jest do monitorowania i manipulowania kluczowymi parametrami podczas eksperymentu krystalizacji opartego na zmodyfikowanej metodzie dyfuzji parowej. Technika ta umożliwia monitorowanie i ocenę eksperymentu krystalizacji białka na wszystkich etapach, umożliwiając użytkownikowi uzyskanie precyzyjnej wiedzy i kontroli roztworu białkowego na całym diagramie faz krystalizacji, w oparciu o analizę zawiesiny próbki metodą DLS in situ .

Urządzenie do krystalizacji składa się z komory doświadczalnej (rysunek 1) połączonej z kamerą CCD, która umożliwia monitorowanie kropli krystalizacji w czasie rzeczywistym. Kamera przystosowana jest do pracy w mikroskopie wyposażonym w soczewki o różnym powiększeniu, zapewniające maksymalną rozdzielczość przestrzenną około 2,5 μm. Sercem komory doświadczalnej jest ultraczuła mikrowaga do śledzenia zmian masy próbki w czasie. Procedura krystalizacji odpowiada eksperymentowi dyfuzji pary w kropli siedzącej, w którym kroplę białka umieszcza się na silikonowanym szkiełku nakrywkowym, które umieszcza się na mikrowadze. Na podstawie zmian masy kropli, które są spowodowane dodawaniem środka strącającego, dodawaniem wody/dodatku lub parowaniem próbki, mikrowaga dostarcza precyzyjnych danych wejściowych do algorytmu do natychmiastowego obliczania stężenia białka i strącania w czasie. Ponadto ważne parametry krystalizacji, takie jak temperatura i wilgotność względna, są precyzyjnie monitorowane i kontrolowane.

W celu przeprowadzenia eksperymentu krystalizacji urządzenie wyposażone jest w dwa systemy mikrodozowania (bezdotykowe pompy piezoelektryczne), które działają w skali pikolitrowej do dodawania środka strącającego i wody. Dzięki pracy z tak małymi ilościami substancji gradienty stężeń i zjawisko konwekcji w kropelce białka są zminimalizowane. Główną rolą pomp piezoelektrycznych jest dodawanie środka strącającego lub wody, przy czym ta ostatnia jest na przykład wykorzystywana jako kompensacja naturalnego parowania kropelki białka. Systemy mikrodozowania mają zestaw funkcji, które mogą dyktować dodanie substancji. Do takich cech należą: częstotliwość powtarzania dodawania substancji, liczba kropel dodawanych na sekundę, szerokość i wysokość trajektorii strumienia substancji itp. Co więcej, położenie pomp można regulować ręcznie, co pozwala użytkownikowi na dokładne określenie pozycji dodawania substancji do kropli białka.

Unikalna, kontrolowana ze sprzężeniem zwrotnym manipulacja kroplą krystalizacji jest osiągana dzięki danym DLS in situ , które mogą pokazać możliwe zmiany w stanie oligomerycznym białka podczas całej procedury eksperymentalnej. Technika ta pozwala na ciągłą ocenę rozkładu wielkości cząstek w czasie, ujawniając w ten sposób nieznane mechanizmy związane z białkami. Sprzęt optyczny DLS jest umieszczony strategicznie poniżej obszaru szkiełka nakrywkowego, dzięki czemu detektor i wiązka laserowa przechodzą przez szkiełko nakrywkowe i dalej przez kropelkę białka w sposób in situ ; w związku z tym tylko zmiany w obrębie kropli są rejestrowane ze ścieżki DLS. Aby umożliwić łatwą obsługę, urządzenie posiada dwa otwory: przednie drzwiczki do optymalnego ustawienia szkiełka nakrywkowego oraz górną pokrywę, którą można zdjąć, dzięki czemu użytkownik może dostosować pozycję wtrysku systemów mikrodozowania, a także ustawić z dokładnością nową kroplę białka na szkiełku nakrywkowym.

Interaktywna metoda krystalizacji z wykorzystaniem wyżej wymienionego urządzenia jest niezawodną techniką produkcji kryształów białkowych o kontrolowanej wielkości. Chociaż obecnie dostępnych jest wiele metod krystalizacji, informacje wewnętrzne na temat samego mechanizmu krystalizacji nie są łatwo osiągalne. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie konwencjonalnych metod krystalizacji pozwala jedynie na ograniczoną kontrolę roztworu na schemacie faz krystalizacji, z niewielkimi możliwościami zmiany jego przebiegu po rozpoczęciu eksperymentu. Przeprowadzając eksperyment krystalizacji i stosując taką technologię automatycznej krystalizacji w połączeniu z DLS in situ , zdobywa się ogromną wiedzę na temat przejść na diagramie fazowym. Ogólnie rzecz biorąc, regiony powodujące amorficzny osad i indukcję jednorodnego zarodkowania są blisko siebie na diagramie fazowym. W związku z tym, manipulując przebiegiem kropli krystalizacji w oparciu o informacje w czasie rzeczywistym o jej rozkładzie cząstek, możliwe jest uniknięcie wytrącania się białka poprzez stopniowe dostosowywanie warunków krystalizacji w kierunku zarodkowania i tworzenia kryształów.

Obecnie wiele warunków krystalizacji obejmuje roztwory strącające, w których powszechnie występują pochodne glikolu polietylenowego (PEG). Takie związki mają zwykle wysoką lepkość, co może powodować trudności w pipetowaniu lub dozowaniu. W niniejszym studium przypadku systemy mikrodozowania, które są używane do dozowania środków strącających, mają bardzo cienkie kapilary, które umożliwiają dodawanie przyrostów pikolitrów. W związku z tym istnieją pewne ograniczenia w pracy z substancjami o dużej lepkości. W serii wcześniejszych eksperymentów system dał pozytywne wyniki przy użyciu następujących pochodnych PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Chociaż do tej pory testowano tylko wyżej wymienione roztwory, systemy mikrodozowania zawierają specjalny mechanizm podgrzewania, który można zastosować w celu zmniejszenia lepkości roztworu. Kolejnym czynnikiem są roztwory soli, które należy wziąć pod uwagę, gdy są stosowane jako środek strącający białka. Podczas pracy z wysoce skoncentrowanymi solami niewielka ilość może krystalizować na dyszy systemu mikrodozowania, powodując powierzchowne zablokowanie pompy mikrodozowania podczas dodawania środka strącającego; nawet wtedy, gdy w komorze doświadczalnej występuje bardzo wysoka wilgotność względna. Aby rozwiązać ten problem, eksperyment należy wstrzymać, aby można było usunąć sól z dyszy. Może to wymagać specjalnego traktowania i może powodować błędy w fazie dodawania środka strącającego.

Opierając się na cennych informacjach, które można uzyskać podczas przeprowadzania takich eksperymentów z automatyczną krystalizacją, technika ta może być również rozszerzona na badania badające aspekty chemii fizycznej krystalizacji białek. Szybkość reakcji zarodkowania i wzrostu kryształów to zjawiska kinetyczne, które można wyprowadzić i obliczyć na podstawie informacji o zależności od czasu przedstawionych w eksperymencie, takich jak temperatura, wzrost wielkości cząstek oraz stężenie białka i strącacza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taumatyna z Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	1002365940	Białko do protokołu
Bis-Tris 14880	Sigma-Aldrich	2302377	Bufor do roztworu białkowego
Di-Sodium twinian dwuwodny	AppliChem	A0451,0500	Środek strącający do roztworu białka
Sylikonizowane szkiełka nakrywkowe	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051203	Szkiełka nakrywkowe do krystalizacji
Filtr strzykawkowy	Starstedt	831826001	Filtr porów 0,2 i mikro; m
	Strzykawka Omnifix	4617207V	Luer Lock Solo 20 mL
Olej parafinowy	Sigma-Aldrich	2323842	Olej do powlekania płytki
Standardowa płytka Terakasi	Sigma-Aldrich	M5812270EA	Płytka do odzyskiwania kropli krystalizacji
Miękkie chusteczki	KIMTECH Science
XtalController900	Xtal-Concepts GmbH	Urządzenie do krystalizacji	XTC900