Artykuł metodologiczny

Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

DOI:

10.3791/57073

⸱

11 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute for the Biology of Ageing, 2CECAD, University of Cologne, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomieszczenia laboratoryjne turkusowych ryb mogą być skalowane do hodowli i efektywnego hodowania tysięcy pojedynczych ryb w centralnym systemie filtracji wody, wykorzystując tę samą infrastrukturę, która jest używana w standardowych obiektach dla danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy listę ustandaryzowanych procedur, które pozwalają na efektywną hodowlę karpiów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój praktyk hodowlanych u niemodelowych ryb laboratoryjnych wykorzystywanych do celów eksperymentalnych przyniósł znaczne korzyści z ustanowienia referencyjnych systemów modeli ryb, takich jak danio pręgowany i medaka. W ostatnich latach pojawiająca się ryba – turkusowa karpia (Nothobranchius furzeri) – została zaadoptowana przez coraz większą liczbę grup badawczych w dziedzinie biologii starzenia się i ekologii. Gatunek ten, żyjący w niewoli od 4 do 8 miesięcy, jest najkrócej żyjącym kręgowcem hodowanym w niewoli i pozwala społeczności naukowej na przetestowanie – w krótkim czasie – eksperymentalnych interwencji, które mogą prowadzić do zmian w tempie starzenia się i średniej długości życia. Biorąc pod uwagę unikalną biologię tego gatunku, charakteryzującą się diapauzą embrionalną, gwałtownym dojrzewaniem płciowym, wyraźnym morfologicznym i behawioralnym dymorfizmem płciowym - oraz ich stosunkowo krótką długością dorosłego życia - pilnie potrzebne są doraźne praktyki hodowlane. Protokół ten informuje o zestawie kluczowych środków hodowlanych, które umożliwiają optymalną opiekę laboratoryjną nad turkusowymi karpiami, umożliwiając społeczności naukowej przyjęcie tego gatunku jako potężnego modelu zwierząt laboratoryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę ich krótką długość życia i szybki cykl życia, turkusowe karpiówki szybko rosną jako obiecujący nowy organizm modelowy w biologii1,2,3. Gatunek ten charakteryzuje się unikalnym cyklem życiowym teleostu, składającym się z diapauzy embrionalnej, szybkiego dojrzewania płciowego i przedłużonego etapu życia poreprodukcyjnego4,5. Ostatnie prace przyczyniły się do wyjaśnienia biologii tego gatunku zarówno w niewoli, jak i na wolności6,7. Turkusowe karpiowate żyją w sezonowych zbiornikach słodkowodnych, które tworzą się w porze deszczowej na afrykańskiej sawannie w Zimbabwe i Mozambiku. W porze suchej zarodki przeżywają w suchym błocie przy braku wody dzięki odpornemu na stres etapowi życia zwanemu diapauzą.

Mapy genetyczne dla tego gatunku zostały wygenerowane8,9, a ostatnio ich genom został zsekwencjonowany i złożony10,11. Opracowano kilka wsobnych szczepów ryb laboratoryjnych, a transgeneza i edycja genomu za pomocą CRISPR/Cas9 stały się dostępne dla tego gatunku, de facto promując turkusową karpię jako konkurencyjny laboratoryjny organizm modelowy kręgowców12,13,14.

Chociaż protokół laboratoryjny został już opublikowany dla tego gatunku15, w obecnym protokole opracowujemy obszerną listę eksperymentalnych wytycznych laboratoryjnych, które są specjalnie ukierunkowane na badania nad starzeniem się i przeżywalnością. Niniejszy protokół umożliwia naukowcom zaznajomionym już z hodowlą danio pręgowanego i medaka zapoznanie się z hodowlą turkusowych ryb karpiowatych poprzez przyjęcie minimalnej liczby kluczowych zmian. Jednocześnie protokół ten zapewnia naukowcom bez wcześniejszego doświadczenia w hodowli ryb niezbędne narzędzia do wyhodowania kwitnącej kolonii turkusowych karpiów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ryby są hodowane w temperaturze 28 °C w systemie recyrkulacji wody (zobacz Parametry wody), z 10 - 20% dziennego usuwania wody. Zalecane są trzy różne rozmiary zbiorników: 0,8 l, 2,8 l i 9,5 l. Każdy zbiornik otrzymuje stały przepływ wody 2 ml/s.

1. Przygotowanie odczynników (nie zawarte w materiałach)

UWAGA: Afrykański turkusowy killifish (Nothobranchius furzeri) może być dostarczony z uznanego zasobu laboratoryjnego. Roczne zarodki odporne na wysuszenie karpiowatych mogą być wysyłane pocztą. Bardzo ważne jest, aby wysyłać zarodki w zakresie temperatur 8 - 30 °C.

  1. Przygotować roztwór kwasu humusowego (wylęgowy), rozpuszczając 1 g/l kwasu humusowego w wodzie systemowej. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C do 10 tygodni.
  2. W celu przygotowania wzbogacenia HUFA Artemia należy codziennie dodawać wzbogacenie HUFA do wylęgarni krewetek solankowych w stężeniu 500 μl/l roztworu krewetek solankowych.
  3. Przygotować roztwór błękitu metylenowego, rozpuszczając 100 μl/l roztworu podstawowego błękitu metylenowego w uprzednio autoklawowanej wodzie systemowej. Ponieważ błękit metylenowy jest wrażliwy na światło, roztwór należy przechowywać w ciemnych butelkach lub przykryć folią. Sklep w RT.
  4. Przygotuj włókno kokosowe jako stały substrat do inkubacji zarodków. Alternatywnie należy użyć bibuły filtracyjnej (patrz punkt 1.5).
    1. Namocz włókno kokosowe w wodzie destylowanej. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C do 5 tygodni.
    2. W dniu transferu zarodków przygotuj szalkę Petriego z wilgotnym włóknem kokosowym.
    3. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 90 mm włóknem kokosowym pod wyciągiem i obok płomienia, aby zmniejszyć zanieczyszczenie drożdżami i bakteriami.
    4. Kompaktowe włókno kokosowe do wysokości 1 cm, ze sterylną tkanką. Usuń większość wilgoci z włókna kokosowego, dociskając ręcznik papierowy do wierzchu talerza, pozwalając papierowi wchłonąć nadmiar wody. Podgrzej metalową łyżkę nad płomieniem i dociśnij całą powierzchnię włókna kokosowego. Zapobiega to zanieczyszczeniu grzybami/bakteriami włókna kokosowego.
  5. Przygotować bibułę filtracyjną jako stały substrat do inkubacji zarodków.
    1. W dniu transferu zarodków należy umieścić 3 warstwy krążków z bibuły filtracyjnej, które pasują do 90-milimetrowej szalki Petriego. Dodaj 5 ml roztworu kwasu humusowego, aby utrzymać wilgotność.

2. Hodowla

  1. Hodowla turkusowych karpiów do utrzymania odmiany
    UWAGA: Zgodnie z tym protokołem dojrzałość płciową osiąga się w ~ 4 tygodnie po wykluciu, a szczyt płodności przypada na 7 - 9 tygodni. Należy zauważyć, że płodność zależy od częstotliwości karmienia i jakości pokarmu; Z tego względu zaleca się co najmniej dwa karmienia dziennie na zbiornik hodowlany w celu zwiększenia wydajności zarodków (patrz punkt 5.6).
    1. Ustaw zbiornik hodowlany o pojemności 9,5 l. Napełnij wodą systemową i dodaj jednego samca i dwie samice ryby.
    2. Ponieważ samce afrykańskich turkusowych karpiów wykazują dominację podczas krycia, co może prowadzić do nękania samic, wybierz samca o nieco mniejszym rozmiarze ciała niż samica, aby zmniejszyć stres godowy i zwiększyć wydajność reprodukcyjną. Ustaw 5-tygodniowe samce z 6/7-tygodniowymi samicami.
    3. Napełnij plastikowy pojemnik (10 x 10 x 5 cm) autoklawowanym piaskiem, osiągając ostateczną głębokość ~2 - 3 cm i umieść pojemnik na piasek na środku zbiornika hodowlanego.
    4. Pozwól turkusowym karpiom rozmnażać się w sposób ciągły i zbieraj zarodki raz w tygodniu w celu inkubacji zarodków.
      UWAGA: Stosowanie podłoża piaskowego stanowi wyzwanie dla scentralizowanych systemów filtracji i powinno zostać zastąpione alternatywnymi metodami w przyszłości. Możliwą alternatywą może być wykorzystanie zbiorników hodowlanych danio pręgowanego.
  2. Hodowla w celu transgenezy
    UWAGA: Zarodki do wykorzystania do wstrzyknięć muszą być zsynchronizowane w stadium jednokomórkowym, a to wymaga, aby zostały pobrane natychmiast po zapłodnieniu.
    1. Aby zebrać zarodki w stadium jednokomórkowym do wykorzystania do wstrzykiwania i generowania linii transgenicznych, należy założyć zbiornik hodowlany z jednym samcem i dwiema samicami ryb (tak samo jak w ppkt 2.1.).
    2. Dwa dni przed pobraniem zarodków należy odizolować samca w osobnym zbiorniku i utrzymywać go w kontakcie wzrokowym z dorosłymi samicami.
    3. W dniu zbioru dodaj samca i piaskownicę do zbiornika hodowlanego i pozwól im odrodzić się przez 2 godziny.

3. Hodowla zarodków

  1. Pobieranie zarodków
    UWAGA: Pobieranie zarodków odbywa się poprzez przesiewanie i pobieranie zarodków z piaskownicy. W normalnych warunkach każda piaskownica powinna zawierać od 30 do 200 zarodków.
    1. W dniu odbioru wyjmij pojemnik z piaskiem ze zbiornika hodowlanego. Opróżnij pojemnik z piaskiem do sitka (rozmiar szczepu ~0,9 mm) i spłucz wodą systemową. Można to zrobić nad dużym zbiornikiem, aby zebrać piasek do autoklawowania.
    2. Częściowo zanurz sitko w wodzie systemowej i delikatnie zamieszaj, pozwalając zarodkom zgrupować się w środku.
    3. Pobrać zarodki za pomocą pipety Pasteura o pojemności 10 ml.
    4. Przenieś zarodki na szalkę Petriego o średnicy 90 mm w ~40 ml wody systemowej.
    5. Zbadaj zarodki na szalce Petriego pod lekkim mikroskopem stereoskopowym i usuń te, które mają pękniętą kosmówkę i oznaki uszkodzenia.
    6. Przejdź bezpośrednio do Wybielanie zarodków.
      UWAGA: Zawsze używaj jednego sitka na szczep ryby, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu zarodków krzyżówką.
  2. Bielenie zarodków
    UWAGA: Wybielanie zarodków zapobiega zanieczyszczeniu podłoża inkubacyjnego przez mikroorganizmy obecne w akwariach.
    1. Przed wybielaniem należy użyć jednorazowej pipety Pasteura, aby usunąć wodę systemową z szalki Petriego zawierającej pobrane zarodki.
    2. Aby zapobiec niepożądanemu rozwojowi grzybów i bakterii, do pobranych zarodków należy dodać 50 ml świeżo przygotowanego H2O2(1% v/v w wodzie w autoklawizowanym systemie).
    3. Potrząsaj zarodkami przez 5 minut z małą prędkością w 90 mm szalkach Petriego w 50 ml roztworu.
    4. Usunąć roztwórH2O2za pomocą jednorazowej pipety Pasteura i myć zarodki trzykrotnie przez 5 minut 50 ml roztworu błękitu metylenowego. Usuń roztwór błękitu metylenowego.
    5. Dodać 50 mlH2O2(1% v/v w wodzie z autoklawizowanego systemu) do zarodków i wstrząsać przez 5 minut.
    6. Usunąć roztwórH2O2i przemyć trzykrotnie przez 5 minut 50 ml roztworu błękitu metylenowego.
    7. Inkubować zarodki w temperaturze 28 °C w celu zwiększenia synchronicznego rozwoju zarodków, przy maksymalnej gęstości 100 zarodków na 90 mm na szalce Petriego w 40 ml roztworu błękitu metylenowego.
      UWAGA: Nie przedłużać inkubacji zarodków w roztworze wybielającym. Może to spowodować uszkodzenie kosmówki jajowej i zwiększyć śmiertelność zarodków. Bielenie zarodków może spowodować poważne zmiany fizykochemiczne w kosmówce jaja, które mogą skutkować zmienioną fizjologią kosmówki i sukcesem wylęgowym.
  3. Inkubacja zarodków w błękitu metylenowo
    UWAGA: Inkubacja płynów w roztworze błękitu metylenowego zapobiega rozwojowi pasożytów i umożliwia wykrywanie martwych zarodków i niezapłodnionych jaj.
    1. Zbadaj inkubowane zarodki, usuwając wszelkie martwe zarodki (zabarwione na niebiesko błękitem metylenowym) z szalki Petriego, aby zapobiec skażeniu grzybiczemu i bakteryjnemu, które wpływają na przeżycie żywych, zdrowych zarodków.
    2. Usuń stary roztwór błękitu metylenowego i zastąp go świeżym roztworem.
    3. Przywrócić szalkę Petriego do inkubatora o temperaturze 28 °C (Rysunek 1A). W ciągu 7 - 10 dni upewnij się, że rozwinięte zarodki mają widoczne czarne oczy. Przenieś te zarodki do włókna kokosowego lub bibuły filtracyjnej z podłożem stałym (Rysunek 1B).
    4. Zatrzymaj nierozwinięte zarodki w błękicie metylenowo-metylenowym i codziennie monitoruj i przenieś na podłoże ze stałym substratem, gdy pojawią się czarne oczy.
    5. Kroki 3.3.1-3.3.3 należy powtarzać codziennie, aż zarodki będą miały widoczne podbite oczy.
      UWAGA: Stała ekspozycja zarodków na błękit metylenowy może wywołać długotrwałe zmiany w fizjologii dorosłych ryb.
  4. Transfer zarodków do bibuły filtracyjnej
    UWAGA: Turkusowe zarodki karpiów mogą rozwijać się na suchym podłożu, podsumowując warunki naturalne. Dodatkowo inkubacja zarodków w suchym stanie umożliwia naukowcom synchronizację zarodków i wyklucie ich tego samego dnia.
    1. Ponieważ rozwinięte zarodki będą miały widoczne podbite oczy w ciągu 7-10 dni, użyj jednorazowej pipety Pasteura lub cienkiej zakrzywionej pęsety, aby przenieść zarodki z roztworu błękitu metylenowego na wcześniej przygotowaną płytkę z bibuły filtracyjnej.
    2. Rozłóż zarodki w odległości ~5 mm od siebie za pomocą kleszczy, do 100 zarodków na płytce 90 mm (Rysunek 1B).
    3. Uszczelnij szalkę Petriego parafilmem.
    4. Inkubować zarodki w temperaturze 28 °C przez 2 - 3 tygodnie, aż w pełni rozwiną złote tęczówki i będą gotowe do wyklucia (Rysunek 1C).
      UWAGA: Nie należy przedłużać inkubacji zarodków gotowych do wylęgu dłużej niż 2 tygodnie, ponieważ ich żywotność zostanie drastycznie zmniejszona.
  5. Transfer zarodków do włókna kokosowego
    UWAGA: Autoklawowane, sterylne włókno kokosowe (lub organiczny mech torfowy) może być używane jako ważne alternatywne podłoże do inkubacji substratów stałych.
    1. Użyj jednorazowej pipety Pasteura lub cienkiej zakrzywionej pęsety, aby przenieść zarodki z roztworu błękitu metylenowego na gotową do użycia płytkę z włókna kokosowego.
    2. Rozłóż zarodki w odległości ~5 mm od siebie, do 100 zarodków na płytce 90 mm (Ryc. 1B).
    3. Uszczelnij szalkę Petriego parafilmem.
    4. Inkubować zarodki w temperaturze 28 °C przez 2 - 3 tygodnie, aż w pełni rozwiną złote tęczówki (np. w Rysunek 1C).
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania (do jednego roku) należy przenieść zarodki po 3 dniach od pobrania z roztworów błękitu metylenowego na płytkę z podłożem stałym w temperaturze 17 °C. Inkubować zarodki, aż pojawią się podbite oczy.

4. Wylęgowy turkusowy Killifish

UWAGA: Turkusowe zarodki karpiowatych mogą być z powodzeniem wykluwane w roztworze kwasu humusowego14.

  1. Za pomocą cienkiej zakrzywionej pęsety ostrożnie przenieś 50 - 100 rozwiniętych zarodków do pudełka wylęgowego wypełnionego roztworem kwasu humusowego w temperaturze 4 °C. Roztwór kwasu humusowego składa się z 1 g/l kwasu humusowego w wodzie systemowej. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C do 10 tygodni. Upewnij się, że wszystkie zarodki są całkowicie zanurzone. Roztwór kwasu humusowego musi być płytki, nie może być głębszy niż 2 cm.
    UWAGA: Niska temperatura roztworu kwasu humusowego poprawia wylęganie, a całkowite zanurzenie zarodków w roztworze umożliwia zsynchronizowane wylęganie.
  2. Umieścić skrzynkę wylęgową w inkubatorze wylęgowym o temperaturze 28 °C. Przykryj pudełko wylęgowe pokrywką. Aby zapewnić wystarczające napowietrzenie, podłącz skrzynkę wylęgową za pomocą rurki z dopływem powietrza.
    UWAGA: Niewystarczające napowietrzenie podczas inkubacji powoduje, że narybek nie jest w stanie napełnić pęcherza gazowego (fenotyp "suwaka brzusznego", patrz uwaga w sekcji 5.1)
  3. Od następnego dnia po wykluciu, w celu utrzymania odpowiedniej jakości wody w klatce wylęgowej, raz dziennie należy dodawać wodę z systemu autoklawowanego w proporcji 1:1, zachowując końcową głębokość 2 cm.
  4. Przenieś niewyklute zarodki z powrotem na stały substrat i spróbuj wykluć się tydzień później.
    UWAGA: Po wykluciu turkusowe karpiowate są łatwo zdolne do pobierania i spożywania żywego pokarmu. Aby uzyskać optymalny wzrost, narybek karmić dwa razy dziennie nadmiarem świeżo wyklutych krewetek solankowych (Artemia salina). Oznaką pełnego sytości są pomarańczowe odwłoki narybku po 10 - 15 minutach każdego karmienia. Nadmiar niezjedzonych i rozłożonych krewetek solankowych należy codziennie wysysać za pomocą pipety Pasteura.

5. Hodowla młodych i dorosłych ryb

  1. Po pięciu dniach od wyklucia przenieś młode osobniki do systemu recyrkulacji wody. Używając jednorazowych plastikowych pipet (lub plastikowej łyżki), ostrożnie przenieś pięć młodych osobników na zbiornik o pojemności 0,8 l wyposażony w sitko do smażenia 400 μm (Rysunek 2).
    UWAGA: Możliwe jest, że część młodych karpiowatych nie wypełni pęcherza gazowego, co spowoduje typowy fenotyp "suwaka brzucha", charakteryzujący się tym, że ryby nie osiągają odpowiedniej pływalności, zmuszając je do ciągłego pływania, powodując poważne wady rozwojowe u dorosłych ryb. Ryby te nie mogą być wykorzystywane do testów przetrwania ani do wydajnej hodowli i muszą być cenzurowane.
  2. Karm młode osobniki dwa razy dziennie świeżo wyklutymi krewetkami solankowymi w nadmiarze do 14 dni po wykluciu. Codziennie usuwaj zanieczyszczenia z dna każdego zbiornika.
  3. W wieku 14 dni przenieść młode ryby do zbiornika o pojemności 2,8 l wyposażonego w sito do smażenia o pojemności 850 μm. Od tego momentu oznacz każdy zbiornik identyfikatorem ryby, wskazując datę wylęgu, informacje o szczepie, płeć ryby i numer identyfikacyjny ryby (Rysunek 3). W przypadku testów przeżycia, od tego momentu należy indywidualnie trzymać każdą rybę w pojedynczych zbiornikach.
  4. Przez następne 7 dni karm młode osobniki dwa razy dziennie ~ 2 ml krewetek solankowych na rybę. Na tym etapie ryby można uzupełnić 1 - 3 żywymi robakami krwionośnymi (w przypadku, gdy larwy robaków krwionośnych są zbyt duże dla ryby, posiekaj je na mniejsze kawałki żyletką). Aby zapobiec pogorszeniu jakości wody, dwa razy w tygodniu należy wysysać niezjedzone jedzenie i dodatkowe odpady.
  5. Po 3 tygodniach od wyklucia usuń sitko narybku z tyłu zbiornika i zacznij karmić każdą rybę dwa razy dziennie ~ 2 ml krewetek solankowych i 0,5 ml robaka krwionośnego. Na tym etapie młode osobniki powinny osiągnąć 1 cm wielkości ciała i powinny być zdolne do spożycia pełnowymiarowego robaka krwionośnego.
  6. W wieku 4 tygodni karm każdą rybę dwa razy dziennie ~2 ml krewetek solankowych i 1 ml robaka krwionośnego. Samice mogą być trzymane razem w zagęszczeniu do 3 samic na zbiornik o pojemności 2,8 l.
  7. Na tym etapie upewnij się, że ryby osiągnęły pełną dojrzałość płciową. Sprawdź, czy u samców nie ma dużych płetw grzbietowych, odbytowych i ogonowych z oznakami ubarwienia oraz okrągłych brzuchów pełnych jaj u samic.
    UWAGA: Hodowla dorosłych ryb w indywidualnych zbiornikach do badań kohortowych przetrwania może negatywnie wpłynąć na zachowanie i zdrowie ryb. Jednak trzymanie grupowe w celu przeżycia badań kohortowych dodaje znaczące czynniki zakłócające ze względu na ustanowienie dominacji społecznej i terytoriów męskich, co prowadzi do ścisłych hierarchii społecznych.

6. Karmienie

Uwaga: Turkusowe karpiówki laboratoryjne mogą być karmione kombinacją młodych krewetek solankowych (Artemia salina nauplii) i robaków krwistych (larwy Chironomus spp.). Turkusowy narybek karpiów jest karmiony wyłącznie młodymi krewetkami solankowymi. Młode i dorosłe ryby są karmione dwa razy dziennie zarówno krewetkami solankowymi, jak i robakami krwistymi (Rysunek 2). Idealnie byłoby, gdyby ryby można było karmić wiele razy dziennie, przekraczając 2 karmienia wskazane w tym protokole.

  1. Hodowla krewetek solankowych
    1. Dodać 10 l wody z odwróconej osmozy (RO) i 350 g czerwonej soli morskiej do wylęgarni krewetek solankowych i rozpuścić przez napowietrzanie za pomocą rurki napowietrzającej.
    2. Wzbogać kulturę o 5 ml wysoko nienasyconych kwasów tłuszczowych (HUFA).
    3. Do roztworu wylęgowego dodać 20 g cyst krewetek solankowych. Sprawdź, czy cysty krewetek solankowych nie unoszą się na powierzchni wody i zapewnij prawidłowe natlenienie i cyrkulację kultury.
      UWAGA: Dzienne porcje suchych cyst krewetek solankowych można przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Po południu następnego dnia należy dostarczyć do kultury kolejną porcję 5 ml HUFA.
  2. Zbiór wyklętych krewetek solankowych
    UWAGA: Po ~36 h od wyjścia z hodowli krewetki solankowe są gotowe do zbioru (faza instar II).
    1. Zbierz 5 l kultury do pojemnika za pomocą kranu na dnie włanika i odstaw na 10 minut.
    2. Po 10 minutach usuń skorupki krewetek solankowych (kolor brązowy) z górnej części pojemnika o pojemności 5 litrów i przefiltruj wyklute krewetki solankowe (kolor pomarańczowy) przez siatkę. Zwróć uwagę, aby wykluczyć osad znajdujący się na dnie pojemnika, ponieważ zawiera on niewyklute jaja i martwe krewetki solankowe.
    3. Wyklute krewetki solankowe opłukać wodą RO do pojemnika o pojemności 2 litrów i odstawić na 10 minut.
    4. Po 10 minutach ponownie przefiltruj krewetki solankowe przez siatkę i zbierz w 2 litrach wody RO.
    5. Powtarzaj poprzednie trzy kroki, aż roztwór krewetek solankowych będzie wolny od niewylężonych cyst i skorupek krewetek solankowych.
    6. Krewetki solankowe przenieść z pojemnika o pojemności 2 litrów do wyciskanych butelek do karmienia.
      UWAGA: Hodowla krewetek solankowych jest dość wytrzymała i niezawodna. Jednak, aby uniknąć niedoboru krewetek solankowych w przypadku nieudanego wylęgu, można użyć mniejszych (500 ml) zapasowych wylęgarni.
  3. Konfigurowanie zapasowego włakownika
    1. Rozpuść 17,5 g czerwonej soli morskiej w 500 ml wody RO przez napowietrzanie.
    2. Wzbogać kulturę o 500 μl HUFA.
    3. Dodaj 2 g cyst krewetek solankowych.
    4. Po 18 - 24 godzinach ponownie dostarczyć do kultury 500 μl HUFA.
      UWAGA: Krewetki solankowe są gotowe do zbioru po ~24 godzinach.
  4. Przygotowanie żywego robaka krwiopochodnego
    1. Bezpośrednio przed karmieniem przefiltruj odpowiednią ilość robaka krwionośnego przez sitko za pomocą wody RO.
      UWAGA: Żywy robak krwionośny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 - 10 dni.
    2. Wypłucz robaka krwi niewielką ilością wody RO do plastikowego pojemnika.
    3. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura (bez wąskiej końcówki) nabierz mieszaninę robaków krwionośnych do karmienia.
      UWAGA: Karmienie laboratoryjnych kolonii karpiów żywym pokarmem z niekontrolowanych źródeł zwiększa ryzyko zewnętrznych zanieczyszczeń pasożytami i potencjalnie chorobotwórczymi społecznościami drobnoustrojów. W przyszłości należy opracować doraźną sterylną paszę dla ryb.

7. Genotypowanie szczepu laboratoryjnego Killifish

UWAGA: Aby rozróżnić turkusowe szczepy killifish, jak również określić płeć w obrębie każdego szczepu, można użyć specyficznych markerów genetycznych (mikrosatelitarnych)9 (Tabela 1).

  1. pobieranie próbek
    1. Trzymaj rybę bezpiecznie w siatce na wierzchu mokrej gąbki.
    2. Wymaz 2-3 łuski od ciała ryby od wieczka do płetwy ogonowej za pomocą bawełnianych wacików.
    3. Pobrać wagę z wacika i przenieść 2-3 wagi do probówki o pojemności 1 ml zawierającej roztwór NaOH (200 μl 0,5 mol/l NaOH, 1% β-merkaptoetanolu i 0,5% poliwinylopirolidonu).
    4. Obracaj probówki PCR przez 15 sekund, aby upewnić się, że łuski są całkowicie zanurzone w roztworze NaOH.
  2. Izolacja genomowego DNA
    1. Inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze 95 °C.
    2. Schłodzić w temperaturze pokojowej, zneutralizować próbkę w 1/10 objętości 1 M Tris-HCl, pH 8,0.
    3. Odwirowywać próbkę przez 5 minut z pełną prędkością.

8. Parametry wody

UWAGA: Hodowla organizmów, których przeznaczeniem jest fenotypowanie dorosłych, wymaga bardzo stabilnych warunków hodowli przez cały okres życia gatunku docelowego. Dlatego hodowla organizmów wodnych, takich jak turkusowe karpiaki, wymaga ścisłej kontroli parametrów wody. Recyrkulacja wody, z dodatkową czterostopniową filtracją wody, zapewnia solidną podstawę do uzyskania kontroli nad parametrami wody, zapewniając wszystkim zbiornikom te same warunki wodne w czasie. Zaleca się rozpuszczenie wody systemowej z wody z odwróconej osmozy (RO), dodanej z dostępną w handlu solą morską i wodorowęglanem sodu.

  1. Schemat systemu cyrkulacji wody: Po pierwsze, ścieki z akwariów przepływają przez metalowy filtr z cząstkami stałymi, który wychwytuje wszystkie niezjedzone resztki jedzenia i większe cząstki. Filtry metalowe są płukane trzy razy w tygodniu; Po drugie, po pierwszej filtracji mechanicznej woda jest transportowana w dużych studzienkach, a następnie pompowana do biofiltra, w którym bakterie przekształcają amoniak w azotyny i azotany; Po trzecie, z biofiltra woda jest pompowana do tulei filtracyjnych o średnicy 25 μm, które zatrzymują cząstki o drobniejszych rozmiarach. Wreszcie woda przepływa przez lampy ultrafioletowe (UV), które sterylizują wodę z bakterii i wirusów. Po wykonaniu tych czterech kroków przefiltrowana woda wraca do akwariów.
  2. Aby ograniczyć rozwój mikroorganizmów w zbiornikach, zapobiec gromadzeniu się azotanów i zmniejszyć ogólne zasolenie, codziennie usuwa się 10 - 20% wody systemowej.
  3. Utrzymywać stałą temperaturę wody na poziomie 28 °C, przy stałym pH wody w zakresie od 7,0 do 7,5.
  4. Chociaż karpiowate tolerują szeroki zakres zasolenia, aby uniknąć oodinozy, utrzymuj przewodność w zakresie 650 - 710 mikro-Siemensów. Trwający 12 godzin cykl światła i ciemności zapewnia zdrowie i produktywność kolonii.
    UWAGA: Killifish może tolerować przewodność wody do 1500 mikro-Siemensów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwa hodowla turkusowych ryb zabija skutkuje medianą przeżycia w zakresie od 12 do 18 tygodni w odmianie GRZ (np. Rysunek 4A). Różnice w medianie przeżycia zależą od diety, częstotliwości karmienia i warunków temperatury w pomieszczeniach inwentarskich. Zła hodowla skutkuje krzywymi przeżycia charakteryzującymi się zwiększoną wczesną śmiertelnością i powtarzającymi się, nagłymi spadkami przeżywalności w czasie, charakteryzującymi się kilkoma punktami przegięcia (Rysunek 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne etapy rozwoju zarodka z odpowiednim substratem do inkubacji. A) Świeżo pobrane zarodki, inkubowane w roztworze błękitu metylenowego w inkubatorze w temperaturze 28 °C. B) Zarodki gotowe do przeniesienia na stałe podłoże, bibułę filtracyjną lub włókno kokosowe. (C) Zarodki gotowe do wyklucia, posiadające typowe złote tęczówki. Podziałka jest równa 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Etapy rozwoju turkusowego karpia po wykluciu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywny identyfikator ryb dla ryb począwszy od etapu 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywna krzywa przeżywalności dla 70 samców turkusowych karpiów. (A) Typowa krzywa przeżywalności dla hodowanych w laboratorium turkusowych karpiów. (B) Porównanie krzywych przeżywalności uzyskanych od ryb hodowanych w optymalnych warunkach hodowli () i ubogiej (czerwony i niebieski). Przerywana czerwona linia pozioma wskazuje 50% przeżycia, przecinając krzywą przeżycia przy medianie długości życia (wskazanej na osi x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: szt. powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
idDo przodu elementarzOdwrócony podkładZakres rozmiarów (bp)
*NfuSU0007GGCTAAGCCTTGCTGACAGACAGGGAGCTGAAAACCTCAG166 - 214
*NfuSU0010CGCAGTCTGATCAAATCGTGTTGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC220 - 272
NfuSU0016CATGGCTAAACCGTGATGAAGAAGGACGCCAGCTATGAAG209 - 240
NfuSU0022AACACACAGCTCTCGTAAGGAGGTATTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTTRozdział 198 - 238
NfuSU0027TCCAGCTGAATCGGTAATGAAAACTCGAGGGTGCAATCTG164 - 226
NfuSU0049CTGGACAAAGTGCCAATCACCTCCCACAGTCCCAAAAACATod 196 do 197
NfuSU0050CCAGAATGAACAATACTCAGATCAAGCAGCTTAGTTTAATGATATCACACAATG252 - 295
NfuSU0060CTAGCCACTCCCCTGGTTTACCGTCACGATGTGCTGATAC216 - 248
NfuFLI0030CAGAAGCTAAAGGCCAGACGGGGAAACAATAGGGAACCAC174 - 205
*NfuFLI0091ACGCTGACTCTACCCAGTCCTGCCTGCTACTGACAATGWydawnictwo 355 - 373
*- markery determinacji płci

Tabela 1: Startery genotypowania do identyfikacji szczepów.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół hodowli laboratoryjnej turkusowych karpiów, w tym pobieranie zarodków, inkubację, a także trzymanie, rozmnażanie i karmienie dorosłych ryb. Nasz protokół jest specjalnie skierowany do laboratoriów, które prowadzą badania skoncentrowane na dorosłych rybach, w szczególności do badań eksperymentalnych nad starzeniem się i długością życia. Turkusowe karpiowate mogą być hodowane na standardowym obiekcie danio pręgowanego; Jednak ważne aspekty hodowli karpiów różnią się od standardowej pielęgnacji danio pręgowanego16. Dostosowania te obejmują wczesne przejście z diety opartej wyłącznie na krewetkach solankowych do diety uzupełnionej bogatymi w białko robakami krwionośnymi, a także określone etapy inkubacji zarodków, składające się z etapu inkubacji płynnej i suchej.

Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują transport zarodków w zakresie temperatur 8 - 30 °C. W przypadku hodowli płodność zależy od częstotliwości karmienia i jakości pokarmu; Dlatego zalecamy co najmniej dwa karmienia dziennie na zbiornik hodowlany w celu zwiększenia wydajności zarodków (patrz punkt 5.6.). Podczas wybielania zarodków nie należy przedłużać inkubacji zarodków w roztworze wybielającym. Może to spowodować uszkodzenie kosmówki jajowej i zwiększoną śmiertelność zarodków. Podczas inkubacji zarodków z błękitem metylenowym nie należy przedłużać inkubacji zarodków gotowych do wylęgu dłużej niż 2 tygodnie, ponieważ ich żywotność zostanie drastycznie zmniejszona. W przypadku wylęgu turkusowych karpiów niska temperatura roztworu kwasu humusowego poprawia wylęganie, a całkowite zanurzenie zarodków w roztworze umożliwia zsynchronizowane wylęganie. Niewystarczające napowietrzenie podczas inkubacji powoduje, że narybek nie jest w stanie napełnić pęcherza gazowego (fenotyp "suwaka brzusznego", patrz uwagi w sekcji 5.1).

Ograniczenie protokołu hodowlanego obejmuje stosowanie podłoża piaskowego, które stanowi wyzwanie dla scentralizowanych systemów filtracji i powinno zostać zastąpione alternatywnymi metodami w przyszłości. Możliwą alternatywą może być wykorzystanie zbiorników hodowlanych danio pręgowanego. Bielenie zarodków może spowodować poważne zmiany fizykochemiczne w kosmówce jaja, które mogą skutkować zmienioną fizjologią kosmówki i sukcesem wylęgowym. Stała ekspozycja zarodków na błękit metylenowy może wywołać długotrwałe zmiany w fizjologii dorosłych ryb. Hodowla dorosłych ryb w indywidualnych zbiornikach w celu przeprowadzenia badań kohortowych dotyczących przetrwania może negatywnie wpłynąć na zachowanie i zdrowie ryb. Jednak trzymanie grupowe w celu przeżycia badań kohortowych dodaje znaczące czynniki zakłócające ze względu na ustanowienie dominacji społecznej i terytoriów męskich, co prowadzi do ścisłych hierarchii społecznych. Dlatego uważamy, że izolacja samców ryb do badań nad przeżywalnością jest rozsądnym kompromisem. Karmienie laboratoryjnych kolonii karpiów żywym pokarmem z niekontrolowanych źródeł zwiększa ryzyko zewnętrznych zanieczyszczeń pasożytami i potencjalnie chorobotwórczymi zbiorowiskami drobnoustrojów. W przyszłości należy opracować doraźną sterylną paszę dla ryb.

Przyszłe ulepszenia tego protokołu będą koncentrować się na kontrolowanej, nieżywej diecie, która nadal prowadzi do osiągnięcia dojrzałości płciowej w ciągu 3-4 tygodni. Podsumowując, nasz protokół zapewnia dostęp do turkusowej hodowli laboratoryjnej karpiów dla szerokiej społeczności naukowej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych i niefinansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alessandro Cellerino, Tyrone'owi Genade, Anne Brunet, Sabrinie Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrickowi Smithowi, Kai Matharowi i wszystkim członkom laboratorium Valenzano w Instytucie Biologii Starzenia im. Maxa Plancka za przyczynienie się do różnych aspektów obecnego protokołu hodowli karpiów na przestrzeni lat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór buforowy do kalibracji sondy pH=7,0RothA518.11L roztwór buforowy pH=7,0 do kalibracji elektrody pH systemu wodnego
Roztwór buforowy do kalibracji sondy pH=4,0RothP712.11L roztwór buforowy pH=4,0 do kalibracji elektrody pH systemu wodnego
Wzorzec przewodnościVWR83607.260500 mL Wzorzec przewodności 1,413 uS/cm do kalibracji układu wodnego Elektroda konduktometryczna
Easy Strips Test 6w1JBL2533900Paski testowe do oznaczania wartości chloru w wodzie systemowej
Test amoniakuJBL2536500Test do oznaczania zawartości amoniaku w wodzie systemowej Sól z
MorzaCzerwonego Wiadro22 kg
Wodorowęglan soduVWR27780.360
Kwas humusowySigma- Aldrich53680-50G
Nowa butelka HUFA ArtemiaZM Systems UK75g
Błękit metylenowyRothAE64.1
Roztwór nadtlenku wodoruSigma- Aldrich31642-1L30% (w/w)
Włókno kokosoweDragonZCS010
Papier WhatmanGE healthcare3030-690
Czysty etanolVWR20821.467100%
piasek kwarcowylokalny sklep zoologiczny
Jaja artemii Premium GradeSanders
Bloodwormlokalny dystrybutorPoseidon Aquakultur Niemcy
mieszanka roztworów dNTPsBiolabsN0447210mM
Taq DNA polimerazaInvitrogen18038-0425U/uL
PCR 10x BuforInvitrogen18038-042
MgCl2Invitrogen18038-04250mM
NaOHSigma- AldrichS8045-500g50mM
Tris-HCl, pH=8,0 roztwórSigma- AldrichT2694-1L1M
HCl 37%Sigma- AldrichH1758-500mL
AkwariumObjętość akwadryzacji: 0,8 l, 2,8 l, 9,5 l; wyposażony w przegrody, siatkę do smażenia i pokrywki
Wytrząsarka orbitalnaVWR89032-100model 5000
Inkubator mikrobiologicznyThermo Scientific, Heratherm50125882model IMC18; do przechowywania zarodków w fazie ciekłej, ustawione na t=27-28° C
Inkubator chłodzącyBinder9020-0209model KT115; dla zarodków do przechowywania w fazie stałej, ustawione na t=27-28° C
Inkubator wylęgowyThermo Scientific, Heratherm51028114model OGS180; dla wylęgu zarodków, ustawione na t=27-28° C
Mikroskop stereoskopowyLeicamodel M80
Hodowlane skrzynki do piasku/wylęguRoth1598.11000 ml
szalkaPetriego Sarstedt82.147392x16mm
50 ml Rurka stożkowaSarstedt62.547.254
15 ml Rurka stożkowaSarstedt62.554.002
Jednorazowa plastikowa pipeta PasteuraRothEA71.12 ml; W przypadku karmienia ryb z dżdżownicami lub selekcji zarodków odetnij końcówkę, aby otworzyć Pipeta serologiczna o średnicy 3-4 mm
Sarstedt86.1689.00150mL
StrzykawkaHenke Sass Wolf4100-000V010mL
Sitkorozdrobnienie < 1mm; do pobierania zarodków
PęsetaDumont0508-5/45-POtyp 5/45; do transferu zarodków
25 L Wylęgarnia krewetek solankowychAquaneeringZHBS25główny klujnik
500 ml Wylęgarnia krewetek solankowychJBL6106100model Artemio 1; zapasowy wylęgarnia
Siatki rybackie o wąskich oczkachJBL
Zlewka piaskowaVWRBURK7102-50005000mL
Zlewka do separacji krewetek solankowychVWRBURK7102-20002000mL
Plastikowa torba na zamek błyskawicznyRothP279.2do przechowywania martwych ryb
PipetboyIntegra155000model Pipetboy acu2
ParafilmP-LabP701605
Rura przewodząca powietrzewww.zajac.deAQ3804-6 mm średnica
1 L Butelka szklanaVWR215-1595
2 L Butelka szklanaVWR215-1596
500 ml Butelka do wyciskaniaRothK665.1do karmienia ryb krewetkami solankowymi
120-μ m sitko do krewetek solankowychFlorida Aqua FarmsBB-PC2do zbierania krewetek solankowych/ochotek
Wykończenie skarpet filtracyjnychAquaneeringMFVB025C25-μ m
Centralny systemAquaneering, Techniplast, Siedliska wodne, Aqua Schwarz
metalowe filtracji w pomieszczeniach dla ryb

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. Non-canonical aging model systems and why we need them. EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).
  2. Harel, I., Brunet, A. The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).
  3. Smith, P., et al. Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish. Elife. 6, (2017).
  4. Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).
  5. Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing. Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).
  6. Blazek, R., et al. Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient. Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).
  7. Terzibasi, E., et al. Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri. PLoS One. 3 (12), e3866(2008).
  8. Kirschner, J., et al. Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research. Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).
  9. Valenzano, D. R., et al. Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).
  10. Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
  11. Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
  12. Harel, I., et al. A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate. Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).
  13. Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging. G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).
  14. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  15. Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).
  16. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla laboratoryjnainkubacja embrion wprotok wykluwaniarecyrkulacja wodytesty prze ywalno cibadania nad starzeniemmodel kr gowcahodowla rybpozyskiwanie embrion w

Powiązane artykuły