Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57077

⸱

24 maja 2018

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Streszczenie

Podczas patogennej infekcji Drosophila melanogaster, hemocyty odgrywają ważną rolę w odpowiedzi immunologicznej podczas całej infekcji. W związku z tym celem tego protokołu jest opracowanie metody wizualizacji inwazji patogenu w specyficznym przedziale immunologicznym much, a mianowicie hemocytach. Korzystając z przedstawionej tutaj metody, w ciągu 30 minut można uzyskać do 3 × 106 żywych hemocytów z 200 larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym w przypadku infekcji ex vivo. Alternatywnie, hemocyty mogą być zakażone in vivo poprzez wstrzyknięcie larw w 3.stadium rozwojowym, a następnie ekstrakcję hemocytów do 24 godzin po zakażeniu. Te zainfekowane komórki pierwotne zostały utrwalone, wybarwione i zobrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Następnie na podstawie obrazów wygenerowano reprezentacje 3D, aby ostatecznie pokazać inwazję patogenów. Dodatkowo można uzyskać wysokiej jakości RNA do qRT-PCR w celu wykrycia mRNA patogenu po zakażeniu, a z tych komórek można wyekstrahować wystarczającą ilość białka do analizy Western blot. Podsumowując, przedstawiamy metodę definitywnego uzgadniania inwazji patogenu i potwierdzenia infekcji przy użyciu typów patogenów bakteryjnych i wirusowych oraz skuteczną metodę ekstrakcji hemocytów w celu uzyskania wystarczającej ilości żywych hemocytów z larw Drosophila do eksperymentów z infekcjami ex vivo i in vivo.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster to dobrze znany organizm modelowy do badania odporności wrodzonej1. Podczas wrodzonej odpowiedzi immunologicznej hemocyty odgrywają ważną rolę w odpowiedzi na prowokację patogenem. Hemocyty mają kluczowe znaczenie dla hermetyzacji pasożytów, a także pełnią ważną funkcję w zwalczaniu patogenu poprzez działanie fagocytarne podczas infekcji grzybiczych, wirusowych i bakteryjnych2,3.

Aby jak najlepiej zrozumieć wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na patogenną infekcję bakteryjną, ważne jest wizualizację, w jaki sposób patogen atakuje komórki gospodarza podczas infekcji. Ta wizualizacja przyczynia się do zrozumienia mechanizmu inwazji. Wraz ze szczegółami dotyczącymi lokalizacji wewnątrzkomórkowej patogenu i odpowiedzi komórkowej, dane te mogą dostarczyć wskazówek na temat odpowiedzi gospodarza na infekcję i organelli komórkowych, z którymi mikrob wchodzi w interakcje. W związku z tym rekonstrukcja modelu 3D po obrazowaniu za pomocą mikroskopii może być pomocna w określeniu dokładnej lokalizacji patogenów w komórkach gospodarza. W tym badaniu zobrazowaliśmy inwazję Coxiella burnetii (C. burnetii), czynnika wywołującego gorączkę Q, chorobę odzwierzęcą, która stanowi poważne zagrożenie zarówno dla zdrowia ludzi, jak i zwierząt, do pierwotnych hemocytów Drosophila. Niedawno wykazano, że Drosophila są podatne na szczep klonu 4 C. burnetii na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 Nine Mile phase II (NMII) i że szczep ten jest w stanie replikować się w Drosophila4, co wskazuje, że Drosophila może być wykorzystana jako organizm modelowy do badania patogenezy C. burnetii.

Poprzednie badania wykorzystywały hemocyty do badania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Hemocyty zostały użyte do obserwacji morfologicznych5,6,7, analiza morfometryczna2,8, analiza fagocytozy2,3, qRT-PCR2,9, immunoprecypitacja10,11, analiza immunofluorescencyjna10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10,11 oraz immunohistochemistry9,14. Chociaż komórki Drosophila S2 są również dostępne do różnych eksperymentów in vitro, nieśmiertelność i potencjalna wcześniej istniejąca infekcja wirusowa zmieniają ich zachowanie15,16. Wykorzystanie komórek pierwotnych w przeciwieństwie do unieśmiertelnionej linii komórkowej, takiej jak komórki S2, pozwala na badanie wrodzonych funkcji immunologicznych w systemie bardziej reprezentatywnym dla całego organizmu. Ponadto zakażenie hemocytów in vivo, przed ekstrakcją, pozwala komórkom na interakcję z innymi białkami i tkankami gospodarza, co ma przewagę nad ekstrakcją hemocytów przed zakażeniem ex vivo. Zastosowano wiele różnych metod, aby uzyskać wystarczającą liczbę hemocytów w krótkim czasie, aby utrzymać hemocyty przy życiu8,17,18,19.

W tym badaniu prezentujemy metodę ekstrakcji hemocytów z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym pod kątem patogennej infekcji mikrobiologicznej C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) lub Bezkręgowca opalizującego wirusa 6 (IIV6). Opisujemy metody leczenia zakażeń hemocytami zarówno in vivo, jak i ex vivo. Hemocyty zakażone in vivo i ex vivo zwizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej i wykorzystano do budowy modeli 3D inwazji C. burnetii. Dodatkowo, korzystając z protokołu ekstrakcji, hemocyty zakażone ex vivo wykorzystano do testów ekspresji genów i białek. W szczególności, aby zbadać zakres zakażenia IIV6 i Listerią, wyizolowano z komórek całkowite RNA lub białko do analizy qRT-PCR lub Western blot. Podsumowując, protokół zapewnia metody szybkiego zbierania dużej liczby hemocytów z larw w trzecim stadium rozwojowym oraz dowody na to, że hemocyty pierwotne, zakażone in vivo lub ex vivo, są odpowiednią platformą do badań nad infekcjami patogenami mikrobiologicznymi i odpowiednich analiz dalszych, takich jak mikroskopia, transkryptomika i proteomika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ex vivo zakażenie

  1. Podłoże i sprzęt
    1. W warunkach sterylnych przygotować świeże podłoże do izolacji hemocytów Drosophila (DHIM), zawierające 75% podłoża Schneidera dla Drosophila oraz 25% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), a następnie poddać je sterylizacji przez filtrowanie.
    2. Pod stereomikroskopem ułożyć 2-3 arkusze folii parafinowej o wymiarach 10 cm x 10 cm.
    3. Przygotować kapilarę szklaną. Ustawić podgrzewacz wyciągacza kapilar na 55% maksymalnej mocy. Wyciągnąć rurkę kapilarną do uzyskania ostrej końcówki o średnicy około 10 µm.
    4. Wypełnić kapilarę od tyłu olejem mineralnym.
    5. Zamocować wypełnioną kapilarę w nanoiniektorze (Rysunek 1A), a następnie otworzyć końcówkę kapilary z topionego szkła, odłamując ją pęsetą (Rysunek 1B). Średnica zewnętrzna końcówki powinna wynosić 100 µm, aby ułatwić pobieranie hemocytów.
    6. Wypchnąć z końcówki kapilary jak najwięcej oleju, a następnie wypełnić ją DHIM. Aby ułatwić wizualizację granicy między pobraną hemolimfą a olejem, pozostawić pęcherzyk powietrza między olejem a DHIM (Rysunek 1B').
  2. Ekstrakcja hemolimfy
    1. Ostrożnie pęsetą zebrać z wewnętrznej ścianki fiolek z pożywką larwy Drosophila w 3rd stadium rozwojowym i umieścić je w sitku o oczkach 100 µm (Rysunek 1C). Larwy w 3rd stadium występują od 3 do 6 dni po złożeniu zapłodnionych jaj przez dorosłą samicę.
      UWAGA: W tych eksperymentach zastosowano genotyp w1118;P{w+mC=Hml-GAL4.Δ}2,P{w+mC=UAS-2xEGFP}AH2, ponieważ hemocyty tych zwierząt wykazują ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP), co ułatwia identyfikację komórek pod mikroskopem.
    2. Wylać 5 mL sterylnej wody na larwy i potrząsać sitkiem przez 5 s. Położyć sitko na ręczniku technicznym, aby usunąć nadmiar wody (Rysunek 1C').
    3. Przenieść larwy do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 mL. Zanieczulić je gazem CO2 przez 5 s (Rysunek 1D).
    4. Umieścić larwy na folii parafinowej pod stereomikroskopem, stroną grzbietową do góry (Rysunek 2A).
    5. Lekko przyłożyć kapilarę szklaną do tylnej części ciała larwy, aby ją ustabilizować, a następnie rozciąć tylną część kutykuli za pomocą cienkiej pęsety z ostrymi końcami (Rysunek 2B).
    6. Pozwolić hemolimfie wypłynąć na folię parafinową (Rysunek 2C).
    7. Stworzyć na folii parafinowej zbiornik z hemolimfą zawierającą hemocyty z 20-50 larw jednocześnie.
    8. Pobrać złączoną hemolimfę za pomocą kapilary szklanej w nanoiniektorze (Rysunek 2D).
      UWAGA: Powinno to być około 10-20 µL hemolimfy.
    9. Wprowadzić hemolimfę do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 mL zawierającej 500 µL DHIM (Rysunek 2E).
    10. Powtórzyć kroki od 1.2.4) do 1.2.9) dla każdej partii larw.
  3. Zliczanie liczby hemocytów.
    1. Napipetkować 5 µL 0,4% roztworu błękitu trypanowego do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 0,6 mL w celu zabarwienia martwych komórek. Delikatnie wymieszać DHIM i hemocyty w probówce 1,5 mL za pomocą pipety, a następnie przenieść 5 µL DHIM z hemocytami do probówki mikrocentryfużowej 0,6 mL i delikatnie wymieszać.
    2. Napipetkować 10 µL komórek z mieszaniny błękitu trypanowego i hemocytów w stosunku 1:1 do komory licznej (hemocytometru).
    3. Policzyć liczbę żywych hemocytów, które nie zostały zabarwione błękitem trypanowym, w każdym z 4 pól narożnych hemocytometru i obliczyć stężenie hemocytów na mililitr za pomocą wzoru:
      figure-protocol-1
      gdzie X to stężenie żywych hemocytów na mililitr; a, b, c i d to liczba żywych komórek (ustalona na podstawie wykluczenia błękitu trypanowego) w każdym z 4 policzonych pól w hemocytometrze. Dzielenie przez 2 całkowitej liczby policzonych komórek wynika z rozcieńczenia komórek błękitem trypanowym w stosunku 1:1. Komórki zabarwione błękitem trypanowym uznaje się za martwe.
  4. Zakażenia ex vivo
    1. Ustalić liczbę studzienek do zasiania komórek na podstawie punktów czasowych i powtórzeń biologicznych wymaganych dla każdego eksperymentu. Do oczyszczania RNA i białek po zakażeniu pożądane jest 5,0×104 hemocytów.
    2. Obliczyć objętość zapasu patogenu do rozcieńczenia w DHIM w celu zakażenia, korzystając z poniższego wzoru:
      figure-protocol-2
      gdzie Multiplicity of infection (MOI) to pożądana liczba wirusów lub bakterii na komórkę.
      UWAGA: Stosowane MOI zależy od konkretnego eksperymentu i przeprowadzanych analiz. W tym przypadku zastosowano 10 ekwiwalentów genomowych (GE)/komórkę C. burnetii, 10 CFU/komórkę Listeria lub 1 TCID50/komórkę IIV6.
    3. Przygotować 500 µL podłoża z patogenem dla każdej studzienki płytki 24-dołkowej, dodając odpowiednią objętość DHIM do objętości wirusa lub bakterii w probówce.
    4. Umieścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm (grubość nr 1) w studzience płytki 24-dołkowej.
    5. Rozdzielić DHIM z hemocytami do studzienek płytki 24-dołkowej.
    6. Dodać 500 µL podłoża z patogenem do hemocytów w studzience.
    7. Wirować płytkę przy 1 000 x g przez 5 min.
    8. Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 28 °C. Co 15 min delikatnie przechylać płytkę ręcznie od tyłu do przodu, a następnie od lewej do prawej przez 5 s.
    9. Po 1 h etapu inwazji/przyczepiania (krok 1.4.8), delikatnie odpipetkować podłoże z patogenem i wypłukać hemocyty świeżym DHIM, a następnie ponownie wypełnić studziankę 500 µL świeżego DHIM.
    10. Inkubować zakażone hemocyty przez wymagany czas. W tych eksperymentach hemocyty zakażone C. burnetii lub IIV6 inkubowano przez 24 h, a hemocyty zakażone Listeria inkubowano przez 1, 2 lub 4 h.

2. In vivo zakażanie

  1. Zakażanie
    1. Ogrzewać płytkę agarową z sokiem owocowym dla Drosophila w temperaturze pokojowej przez 15 min. Płytki przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem20.
      1. Dodać 30 g agaru do 700 mL wody i autoklawować przez 40 min.
      2. Rozpuścić 0,5 g metyloparabenu w 10 mL bezwodnego etanolu.
      3. Dodać roztwór metyloparabenu do 300 mL koncentratu soku owocowego.
      4. Szybko wymieszać koncentrat soku z autoklawowanym roztworem agaru i rozlać po 5 mL do szalek Petriego o wymiarach 10 × 35 mm.
      5. Po schłodzeniu płytek przez 15 min przechowywać je w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować larwy w 3rd stadium zgodnie z krokami 1.2.1) – 1.2.3).
    3. Nanieść pastę drożdżową na płytkę agarową. Wykonać w agarze płytki niewielkie nacięcie, do którego mogą migrować larwy, aby zapobiec ich wysychaniu (Rysunek 3A). Zamocować ostrze igły wolframowej o grubości 0,001 mm w pęsecie za pomocą folii parafinowej (Rysunek 3B, C).
    4. Pipetować 50 µL C. burnetii wykazującego ekspresję mCherry o wysokim mianie (5,95×109 GE/mL) na folię parafinową pod stereomikroskopem i umieścić larwy w kropli bakterii.
    5. Umieścić larwy w kropli bakterii. Nakłuć larwy igłą wolframową (Rysunek 3D). Przenieść larwy na płytkę agarową (Rysunek 3E).
    6. Przenieść pozostałe podłoże z patogenem na płytkę agarową i szczelnie zamknąć płytkę folią parafinową.
    7. Przechowywać larwy na płytce w wilgotnym powietrzu do pożądanego czasu po zakażeniu (Rysunek 3F). W tym eksperymencie larwy zakażone C. burnetii pozostają na płytce przez 24 h.
  2. Ekstrakcja hemolimfy i wysiew hemocytów
    1. Przygotować podłoże i sprzęt zgodnie z krokiem 1.1).
    2. Umieścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm (grubość nr 1) w studzience płytki 24-dołkowej. Pipetować 500 µL DHIM do studzienki.
    3. Wyekstrahować hemolimfę z zakażonych larw zgodnie z krokami 1.2.4) – 1.2.8).
    4. Wprowadzić hemolimfę do studzienki zgodnie z krokiem 2.2.2).
    5. Powtórzyć kroki 2.2.3) i 2.2.4) dla kolejnych partii larw.
    6. Wirować płytkę przy 1 000 x g przez 5 min.

3. Wizualizacja

  1. Fiksacja i barwienie
    1. Po osadzeniu hemocytów na okrągłym szkiełku nakrywce w studzience, delikatnie usuń medium z każdej studzienki.
    2. Delikatnie dodaj 200 µL 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki z osadzonymi hemocytami. Inkubuj hemocyty przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń 4% PFA i delikatnie dodaj 200 µL PBS zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki. Inkubuj hemocyty przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń PBS i delikatnie dodaj 200 µL 1× 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do każdej studzienki. Inkubuj hemocyty przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń roztwór DAPI i delikatnie dodaj PBS do każdej studzienki. Inkubuj hemocyty przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    6. Nanieś 10 µL medium montażowego zapobiegającego zanikaniu fluorescencji (antifade) na szklaną płytkę mikroskopową.
    7. Po usunięciu PBS z każdej studzienki, wyjmij szkiełko nakrywkę z płytki 24-dołkowej za pomocą pęsety z cienkimi końcami. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkę na medium montażowym na płytce szklanej, stroną z hemocytami do dołu.
    8. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w ciemności przez noc.
  2. Obrazowanie konfokalne
    1. Skonfiguruj mikroskop konfokalny do obrazowania trójkolorowego DAPI, EGFP i mCherry. Użyj następujących ustawień: wzbudzenie (ex) DAPI 405 nm, emisja (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Umieść próbkę w mikroskopie i ustaw ostrość, korzystając z obiektywu 63X o aperturze numerycznej (NA) 1,4. Zlokalizuj w polu widzenia pożądane hemocyty do obrazowania.
    3. Dostosuj moc lasera oraz wzmocnienie detektora, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję próbki. Sprawdź wiele płaszczyzn z, aby upewnić się, że poziom ekspozycji jest odpowiedni dla całej grubości próbki.
    4. Wyznacz górną i dolną pozycję na osi z dla całego hemocytu. Ustaw te pozycje jako punkt startowy i końcowy dla sekcjonowania wzdłuż osi z.
    5. Używaj zoomu skanującego wyłącznie do obrazowania obszaru zawierającego hemocyt. Często stosuje się 3-krotne powiększenie (3X).
    6. Zbierz serię obrazów w odpowiedniej rozdzielczości, np. 1024 x 1024 piksele w płaszczyźnie x-y oraz z odstępem 0,3 µm w wymiarze z.
  3. Rekonstrukcja modelu 3D
    ​UWAGA: Dostępne jest oprogramowanie open source, które wykonuje wiele funkcji opisanych poniżej w celu rekonstrukcji modelu 3D.
    1. Zaimportuj plik z serią obrazów z sekcjonowania z do oprogramowania powiązanego z mikroskopem konfokalnym do rekonstrukcji modelu 3D.
    2. Wybierz komórkę wykazującą ko-lokalizację jąder zabarwionych DAPI oraz C. burnetii wykazującego ekspresję mCherry w hemocycie wykazującym ekspresję EGFP. Przytnij serię obrazów tak, aby zawierała tylko jedną komórkę.
    3. Wybierz opcję 3D Viewer, która rekonstruuje model 3D przy użyciu wbudowanego algorytmu oprogramowania. Wybierz pożądany typ reprezentacji 3D spośród opcji Blend, Surface i Mixed. W tej metodzie hemocyty, jądra i C. burnetii są przedstawione za pomocą modeli powierzchniowych (surface models).
    4. Obserwuj zrekonstruowaną komórkę 3D z różnych pozycji widzenia, przytrzymując przycisk myszy i przeciągając kursor po ekranie. Dostosuj orientację komórki oraz położenie modelowanego źródła światła, aby zoptymalizować obraz. Dostępne są dodatkowe opcje takie jak Opacity (przezroczystość), Minimum and Maximum Threshold (próg minimalny i maksymalny), Specular (odblask), Ambient (światło otoczenia), Shineness (połysk) oraz Gamma w celu optymalizacji obrazu.
    5. Wykonaj przekroje przez model za pomocą poleceń clipping i sectioning, aby zwizualizować zawartość wnętrza hemocytu.

4. Zastosowanie w analizie genów i/lub białek

  1. Po zakażeniu IIV6 oraz Listeria, poddać komórki lizie w celu przeprowadzenia analizy qRT-PCR lub Western blot zgodnie z wcześniejszym opisem21 oraz zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Listę starterów do qRT-PCR oraz przeciwciał do analizy Western blot można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  2. Produkty PCR poddać analizie za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, zgodnie z wcześniejszym opisem22, aby upewnić się, że amplifikowany produkt ma odpowiednią długość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby pobrać żywe hemocyty do ex vivo infekcja, do 3×106 hemocyty wyekstrahowano z 200 Muszka owocówka 3rd larwy w stadium poczwieczki. W celu opracowania naszej metody przetestowano szereg różnych technik. Pojedyncza sekcja larwy trwała do 1,5 h, a metodą tą uzyskano średnio około 8000 komórek18z czego większość nie przeżyła do końca okresuy zbierania próbek. Następnie podjęto próbę pobrania hemolimfy zawierającej hemocyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób dochodzi do zakażenia komórek gospodarza, ważne jest wyjaśnienie lokalizacji patogenu w komórkach, zwłaszcza podczas eksperymentów na wcześniej nietestowanych kombinacjach patogenów i typów komórek4. Podczas gdy badanie kaskady odpowiedzi komórkowej po infekcji może wskazywać na produktywną inwazję patogenu, połączenie obrazowania i danych odpowiedzi komórkowej jest niezbędne do wykazania inwazji patogenu i infekcji. Podczas gdy doniesienia pokazujące obrazy 2D ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni doktorowi Robertowi Heinzenowi za dostarczenie zapasów Coxiella burnetii wykazującej ekspresję mCherry. Dziękujemy dr Luisowi Teixeirze za dostarczenie opalizującego wirusa bezkręgowców 6 oraz Bloomington Stock Center za dostarczenie stad much. Ten projekt został częściowo sfinansowany przez grant NIH R00 AI106963 (dla A.G.G.) i Washington State University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Schneider's Drosophila Medium Thermo Fisher Scientific (Gibco)217200241.1.1), 2.1.2)
Fetal byd' SerumGE Healthcare Life Sciences  (HyClone)SH30070.03HI1.1.1), 2.1.2)
Filtr (0.22 &mikro; L)RESTEK261581.1.1)
Sitko (100 &mikro; m)Greiner bio-one5420001.2.1), 2)
Mikroskop stereoskopowyAmscopeSM-1BSZ-L6W1.2), 2)
Szklana kapilaraFisher Scientific21-171-41.1), 1.2), 2)
Ściągacz kapilarnyNarishige International USA, Inc.PC-101.1.3)
Olej mineralnySnow River Products1.1.4)
NanowtryskiwaczDrummond Scientific Company3-000-2041.1), 1.2), 2.2)
KleszczeVWR82027-4021.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 aparatura do dostarczaniaGenesee Scientific59-122BC1.2), 2)
Trypan BlueThermo Fisher Scientific (Gibco)152500611.3)
HemocytometrHausser Scientific31001.3)
24-dołkowa płytkaGreiner bio-one6621601.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherryDr. Heinzen, R.1.4), 2.2)
Drosophila talerze soków owocowychCold Spring Harbor2.1)
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full Bioodczynniki Agar FisherBP1423-5002.1.1.1)
MetyloparabenAmresco0572-500G2.1.1.2)
Absolutny etanolFisher BioreagentsBP2818-5002.1.1.2)
Mrożony koncentrat 100% soku winogronowego Welch, 340 mlAmazonB0025UJVGM2.1.1.3)
Szalki Petriego, 10 x 35 mmFisher Scientific08-757-100A2.1.1.4)
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-545-801.4.4), 2.2.2)
Drożdże, suszone piekarze ActiveMP Biomedicals02101400012.1) Dodaj 2 części wody do 1 część drożdży (v/v)
Igła wolframowaFine Science Tools10130-202.1)
Kleszcze trzymająceVWRHS83132.1)
ParaformaldehydFisher ScientificFLO4042-5003.1.3)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-5003.1.3)
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP9706-1003.1.3)
4',6-diamidino-2-fenyloindolThermo Fisher Scientific622473.1.4)
Środek montażowy zapobiegający blaknięciuThermo Fisher ScientificP369303.1.6)
Konfokalny mikroskopLeicaTCS SP8-X z białym światłem3.2)
Oprogramowanie do rekonstrukcji obrazowania 3DLeicaLASX z modułemwizualizacji 3D3.3)
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-552-33.1.6)
Wirus opalizujący bezkręgowców 6 (IIV6)Dr. Teixeria, L.4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenesATCCszczep: 10403S4) Listeria monocytogenes szczep 10403S (Bishop i Hinrichs, 1987) był uprawiany w bulionie Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences) zawierającym 50 &mikro; g/ml streptomycyny w stężeniu 30 stopni C.
DNase IThermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015Degradacja gDNA
Zestaw do syntezy cDNABio-Rad1708891synteza cDNA
IIV6_193R_FIDTqRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
IDTqRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Zielony odczynnik qRT-PCRThermo Fisher ScientificK0251, K0252, K0253qRT-PCR
System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific4351107, oprogramowanie 7500 v2.0qRT-PCR
Przeciwciało anty-Listeria monocytogenesabcamab35132Western blot
Przeciwciało antyaktynowe wytwarzane u królikaSIGMA-ALDRICHA2066Western blot
IgG anty-królicze (H+L), koniugat HRPPromegaW4011Western blot
Protokoły skaningowy RpII_qRTPCR_rev

Bibliografia

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720(2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721(2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628(2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593(2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173(2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173(2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088(2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910(2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja hemocyt wlarwy Drosophilamikroskopia konfokalnarekonstrukcja modelu 3Dinfekcja ex vivoinfekcja in vivoinwazja patogen wanaliza Western blotanaliza qRT PCR

Powiązane artykuły