Artykuł metodologiczny

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/57080

⸱

29 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) histonu, takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja, są dynamicznie regulowane przez szereg enzymów, które dodają lub usuwają te znaczniki w odpowiedzi na sygnały odbierane przez komórkę. Te PTMS są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do regulacji procesów, takich jak kontrola ekspresji genów i naprawa DNA. Immunoprecypitacja chromatyny (chIP) jest instrumentalnym podejściem do analizowania obfitości i lokalizacji wielu histonów PTM w całym genomie w odpowiedzi na różne zaburzenia w komórce. W tym artykule opisano wszechstronną metodę wykonywania chIP potranslacyjnych zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Metoda ta polega na sieciowaniu białek i DNA za pomocą traktowania kultur drożdży formaldehydem, wytwarzaniu lizatów drożdży przez ubijanie kulek, solubilizacji fragmentów chromatyny przez nukleazę mikrokokkową oraz immunoprecypitacji kompleksów histon-DNA. DNA związane ze znakiem histonowym będącym przedmiotem zainteresowania jest oczyszczane i poddawane ilościowej analizie PCR w celu oceny jego wzbogacenia w wielu loci w całym genomie. Omówiono reprezentatywne eksperymenty badające lokalizację znaczników histonów H3K4me2 i H4K16ac w drożdżach typu dzikiego i zmutowanego w celu zademonstrowania analizy i interpretacji danych. Metoda ta jest odpowiednia dla różnych histonów PTM i może być wykonywana z różnymi zmutowanymi szczepami lub w obecności różnych stresów środowiskowych, co czyni ją doskonałym narzędziem do badania zmian dynamiki chromatyny w różnych warunkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczna modyfikacja potranslacyjna (PTM) histonów jest kluczowym mechanizmem regulacyjnym dla wielu procesów szablonowych DNA, w tym transkrypcji, replikacji i naprawy DNA1,2. Zdolność do określenia obfitości i precyzyjnej lokalizacji zmodyfikowanych histonów towarzyszących tym procesom ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich regulacji w różnych warunkach w komórce. Rozwój immunoprecypitacji chromatyny (chIP) jako metody w dużej mierze wynikał z badań biochemicznych interakcji białek z DNA, w szczególności metod in vitro z wykorzystaniem chemicznych środków sieciujących, w połączeniu z potrzebą oceny dynamicznej natury interakcji białko-DNA in vivo i w określonych regionach genomu3,4,5. Postęp w technologiach ilościowego PCR (qPCR) i sekwencjonowania rozszerzył również możliwości przeprowadzania eksperymentów chIP z porównaniami ilościowymi i w całych genomach, co czyni go potężnym narzędziem do analizowania interakcji DNA-białko na wielu poziomach.

Obecnie, chIP jest wymaganą metodą dla każdej grupy badawczej zainteresowanej regulacją genomu za pośrednictwem chromatyny, ponieważ nie ma porównywalnych metod bezpośredniego badania fizycznego powiązania między zmodyfikowanym histonem a konkretnym locus genomowym in vivo. Chociaż dostępne są warianty tej metody wykorzystujące sekwencjonowanie nowej generacji do mapowania modyfikacji histonów w całym genomie6,7, podejścia te mogą dotyczyć różnych kwestii naukowych, a ich skala, koszt i zasoby techniczne mogą być ograniczające dla niektórych grup badawczych. Ponadto ukierunkowany chIP-qPCR jest niezbędny do uzupełnienia tych podejść poprzez zapewnienie metod zarówno optymalizacji protokołu chIP przed sekwencjonowaniem, jak i walidacji wyników ze zbiorów danych epigenomicznych. Pojawiły się również podejścia oparte na spektrometrii mas do identyfikacji pełnego zestawu znaczników histonowych związanych z regionami genomu8,9,10,11, jednak podejścia te mają pewne ograniczenia dotyczące tego, które regiony genomu mogą być badane i wymagają wiedzy technicznej i oprzyrządowania, które nie będą dostępne dla wszystkich grup badawczych. Dlatego chIP pozostaje fundamentalną metodą analizy obfitości i rozkładu modyfikacji histonów w różnych warunkach dla wszystkich grup badawczych zainteresowanych epigenetyką, chromatyną i regulacją funkcji genomowych.

Tutaj opisujemy metodę chIP przy użyciu modelu pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) do zbadania rozkładu histonów PTM w chromatynie. Podejście to opiera się na kilku podstawowych komponentach protokołów chIP opracowanych w drożdżach i stosowanych również w różnych systemach modelowych12,13. Interakcje między zmodyfikowanymi histonami a DNA w komórce są zachowywane przez sieciowanie formaldehydem. Po przygotowaniu lizatu fragmenty chromatyny są rozpuszczane na fragmenty o jednolitej wielkości przez trawienie nukleazą mikrokokową. Immunoprecypitacja zmodyfikowanych histonów jest przeprowadzana za pomocą komercyjnych lub laboratoryjnych przeciwciał, a wszelkie powiązane DNA są izolowane i analizowane w celu wzbogacenia w określone regiony genomu za pomocą qPCR (Rysunek 1). W przypadku wielu modyfikacji histonów ilość DNA uzyskana z tego protokołu jest wystarczająca do przetestowania ponad 25 różnych loci genomowych za pomocą qPCR.

Ta metoda chIP jest bardzo wszechstronna do monitorowania dystrybucji pojedynczej modyfikacji histonu w wielu zmutowanych szczepach lub warunkach środowiskowych, lub do testowania wielu modyfikacji histonów w komórkach typu dzikiego w wielu loci genomowych. Co więcej, wiele elementów protokołu można łatwo dostosować w celu optymalizacji wykrywania znaczników histonów o wysokiej lub niskiej obfitości. Wreszcie, wykonanie chIP zmodyfikowanych histonów w pączkujących drożdżach daje możliwość wykorzystania kluczowych kontroli swoistości przeciwciał, które są w dużej mierze niedostępne w innych systemach. Mianowicie, można wytworzyć szczepy drożdży, które przenoszą mutacje punktowe w resztach histonowych, które są przeznaczone do modyfikacji, a w niektórych przypadkach istnieje tylko jeden enzym, który katalizuje modyfikację określonej reszty histonowej (np. metylotransferazy lizyny histonowej). W związku z tym chIP można przeprowadzić zarówno w szczepach z mutacją histonów, jak i w szczepach delecyjnych enzymów, aby określić stopień, w jakim może wystąpić niespecyficzne wiązanie przeciwciała i generować wyniki fałszywie dodatnie. Ta kontrola jest szczególnie cenna dla nowo opracowanych przeciwciał i może być nawet wykorzystana do walidacji swoistości przeciwciał dla konserwatywnych modyfikacji histonów przed ich zastosowaniem w innych systemach. Podejście to uzupełnia inne metody badania swoistości przeciwciał, które rozróżniają różne stany modyfikacji (takie jak mono-, di- i trimetylacja), w tym sondowanie macierzy zmodyfikowanych peptydów i wykonywanie western blot histonów lub nukleosomów z określonymi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, chIP w pączkujących drożdżach jest potężną metodą oceny dynamiki histonów PTM w całym genomie i analizowania mechanizmów rządzących ich regulacją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wstępnie zwiąż przeciwciało z kulkami magnetycznymi

  1. Dobrze wymieszaj kulki magnetyczne białka A/G i przenieś 20 μl kulek magnetycznych na jedną próbkę immunoprecypitacji (IP) do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Do pipetowania kulek należy używać końcówek o szerokim otworze i niskiej retencji.
  2. Umieść rurkę z koralikami w stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki zebrały się z boku tuby. Usunąć supernatant.
  3. Umyj kulki 3 razy 1 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl).
  4. Dodaj 200 μl TBS do kulek i odpowiedniej ilości przeciwciała. Obracać z prędkością 8 obr./min przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W przypadku wielu przeciwciał histonowych PTM wystarczy 1-3 μg przeciwciała na IP. Zaleca się jednak eksperymenty z miareczkowaniem w celu określenia odpowiednich stężeń. Zalecane stężenia dobrze scharakteryzowanych, komercyjnych przeciwciał histonowych PTM są często dokładne i można je znaleźć w opublikowanych raportach lub literaturze dotyczącej produktów.
  5. Umieść koraliki w stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj je 1 ml TBS.
  6. Zawiesić kulki w 20 μl TBS na próbkę IP plus dodatkowe 5 μl (w przypadku błędu pipetowania) TBS.
    UWAGA: Koraliki można przechowywać krótkotrwale w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Hoduj komórki drożdży

  1. Zaszczepić 10 ml YPD (10% ekstraktu drożdżowego, 20% peptonu i 20% dekstrozy) pojedynczą kolonią odpowiedniego szczepu i hodować ją w temperaturze 30 °C przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
  2. Zmierzyć gęstość optyczną kultury drożdży przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć kulturę do OD600 = 0,2 w 100 ml YPD w nowej kolbie.
  3. Hodować komórki w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min, aż osiągną fazę środkową (OD600 = 0,6-0,8).

3. Sieciowanie in vivo białek do DNA

  1. Gdy kultury osiągną środkową fazę logarytmiczną, dodaj 2,7 ml 37% formaldehydu bezpośrednio do pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 1% formaldehydu. Przenieść kolbę do wytrząsarki o temperaturze 25 °C (lub pokojowej) i wstrząsać nią z prędkością 50 obr./min przez 15 minut.
  2. Dodaj 5 ml 2,5 M glicyny do pożywki i kontynuuj wytrząsanie z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby ugasić formaldehyd.
  3. Przenieść komórki do butelek wirówkowych i wirować komórki w temperaturze 5800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dekantować supernatant.
    1. Umyj komórki, umieszczając je ponownie w 45 ml zimnego TBS i przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować probówkę o sile 2800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    2. Umyć komórki w 10 ml zimnego buforu do lizy chIP (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 1% nonidet oktylofenoksyetoksyetoksyetanol (NP-40), przechowywany w temperaturze 4 °C).
    3. Wirować komórki w temperaturze 2800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
      UWAGA: Komórki można zamrozić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.

4. Zrób lizaty drożdżowe

  1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu do lizy ChIP z 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i rozcieńczeniem 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy drożdżowej. Przenieść zawiesinę do probówki z nakrętką o pojemności 2,0 ml zawierającej 200 μl kulek szklanych.
  2. Przenieść komórki do urządzenia do ubijania kulek w celu szybkiego mieszania w temperaturze 4 °C i ubijać kulki 6 razy przez 30 s każde. Trzymaj komórki na lodzie przez co najmniej 1 minutę między każdym ubijaniem kulki.
  3. Przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówek ładujących żel. Odwirować lizat przy 15 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl buforu do wytrawiania MNazy (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, przechowywany w temperaturze 4 °C), delikatnie pipetując w górę i w dół.
  5. Dodać 2,5 μl MNazy do reakcji. Wymieszaj je delikatnie, odwracając 4-6 razy i natychmiast inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
    UWAGA: Warunki trawienia powinny być zoptymalizowane, gdy używany jest nowy zapas MNazy. Zobacz krok 10, aby zapoznać się z protokołem.
  6. Natychmiast umieść probówki na lodzie, aby zatrzymać reakcję i dodaj 5 μl 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM EDTA. Wymieszaj je delikatnie przez odwrócenie.
  7. Odwirować reakcję przy 15 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Rozpuszczalna (strawiona) chromatyna będzie znajdować się w supernatancie. Osad zawiera wszelkie niestrawione i nierozpuszczalne resztki komórek.

5. Immunoprecypitat (IP) Zmodyfikowane histony

  1. Określ stężenie białka w każdej frakcji chromatyny uwalnianej przez MNazę za pomocą testu Bradforda. Dodaj 1 ml odczynnika Bradford do każdej z 8 jednorazowych kuwet oraz 1 dodatkową kuwetę dla każdej próbki białka, która ma być testowana.
    1. Przygotować roztwór podstawowy 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
    2. Dodać odpowiednią objętość, aby osiągnąć następujące stężenia BSA w 1 ml odczynnika Bradford: 0 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/ml i 10 μg/ml. Dodać 2 μl frakcji chromatyny uwalnianej przez MNazę do dodatkowych kuwet.
    3. Przykryj górną część każdej kuwety małym kawałkiem parafilmu i odwróć kuwety 4-6 razy, aby dobrze wymieszać roztwór. Inkubować kuwety w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Za pomocą spektrofotometru światła widzialnego zmierzyć absorbancję przy 595 nm dla krzywej wzorcowej i próbek eksperymentalnych.
      Uwaga: Użyj kuwety bez BSA (0 μg/ml), aby wygasić spektrofotometr przed wykonaniem pierwszego pomiaru.
    5. Wykreślić krzywą wzorcową, używając wartości absorbancji dla różnych stężeń BSA na oprogramowaniu powiązanym ze spektrofotometrem lub oprogramowaniem arkusza kalkulacyjnego. Na podstawie krzywej wzorcowej i zastosowanego współczynnika rozcieńczenia (1:500) należy użyć wartości absorbancji do obliczenia stężenia białka dla każdej z próbek frakcji chromatyny.
  2. Dla każdego IP dodaj 50 μg całkowitego białka z frakcji chromatyny uwalnianej przez MNazę do buforu do lizy ChIP, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml.
    UWAGA: Jeśli ustawiasz więcej niż jeden IP na lizat, przygotuj główną mieszankę lizatu i buforu do lizy ChIP i podnieś 1 ml do poszczególnych probówek dla IP.
  3. Usunąć 100 μl z mieszanki IP w celu przetworzenia jako próbki wejściowej. Zamrażać próbkę wejściową w temperaturze -20 °C do etapu 7.1.
    UWAGA: Pozostałą próbkę chromatyny można również zamrozić w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby wykorzystać do kolejnego IP.
  4. Dodać 20 μl magnetycznych kulek białkowych A/G wstępnie związanych przeciwciałem do każdej próbki IP. Obracać próbkę z prędkością 8 obr./min przez 3 godziny (standardowo) lub przez noc (jeśli jest to preferowane) w temperaturze 4 °C.

6. Myj adresy IP i elute kompleksy histon-DNA

  1. Umieść probówki w stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki zebrały się z boku tuby. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Przemyj kulki kolejno 1 ml każdego z poniższych.
    1. Każde pranie wykonuj obracając z prędkością 8 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C, umieszczając kulki w stojaku magnetycznym, usuwając supernatant i dodając następny bufor: 2x - Bufor do lizy ChIP, 2x - Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, przechowywany w temperaturze 4 °C), 1x - Bufor do płukania LiCl/detergentu (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, przechowywany w temperaturze 4 °C), 1x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, przechowywany w temperaturze 4 °C) i 1x - TE.
    2. Przy ostatnim praniu TE przenieś kulki do nowej probówki, używając 0,5 ml TE, aby przenieść większość koralików, a następnie kolejne 0,5 ml TE, aby umyć probówkę i przenieść pozostałe kulki.
  2. Dodać 250 μl świeżo przygotowanego buforu elucyjnego ChIP (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Krótko rozprowadź roztwór. Obracać próbki z prędkością 8 obr./min przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym i zbierz koraliki. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki i unikać kulek.
    UWAGA: Eluat zawiera białka immunoprecypitowane i związane z nimi DNA.
  4. Dodaj kolejne 250 μl buforu elucyjnego ChIP do kulek. Obracać próbki z prędkością 8 obr./min przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie przenieść supernatant do probówki zawierającej pierwszą elucję. W razie potrzeby usuń mniejszą objętość (240 μl) dla wszystkich IP, aby uniknąć naruszenia kulek.

7. Odwrotne wiązania krzyżowe białko-DNA

  1. Rozmrozić próbki wejściowe i dodać 400 μl buforu elucyjnego ChIP do każdego wejścia.
  2. Do próbek wejściowych i IP dodaj 20 μl 5 M NaCl, 5 μl 20 mg/ml glikogenu i 12,5 μl 20 mg/ml proteinazy K. Dobrze wymieszaj, odwracając lub przesuwając probówki. Próbki należy inkubować przez noc w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.

8. Oczyść i zagęść DNA

  1. Dodaj 10 μl 10 mg/ml RNazy A do próbek wejściowych i IP. Próbki inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Do roztworu wodnego dodać 600 μl alkoholu feno-chlorofrom-izoamylowego (25:24:1 PCI) i dobrze wymieszać. Wiruj je w temperaturze 15 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Usuń warstwę wodną do nowej probówki. Dodaj 600 μl PCI i dobrze je wymieszaj. Wirować probówkę o masie 15 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki.
      UWAGA: Podczas pracy z PCI należy pracować pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Odpady płynne i stałe należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  3. Dodaj 0,1x objętość octanu sodu 3M i 1 ml zimnego 100% etanolu, aby wytrącić DNA. Odwróć probówkę 4-6 razy, aby dobrze wymieszać roztwór. Inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.
    1. Wirować probówkę o masie 15 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    2. Umyj granulat w 1 ml zimnego 70% etanolu. Wirować w temperaturze 15 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    3. Suszyć pelety na powietrzu w kapturze przez około 20 minut (do całkowitego wyschnięcia). Ponownie zawiesić próbki IP w 50 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić próbki wejściowe w 100 μl wody wolnej od nukleaz. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia qPCR.

9. Ilościowy PCR (qPCR) do wykrywania wzbogaconych regionów genomu

  1. Przygotuj główną mieszankę qPCR dla każdego zestawu starterów. Jedna reakcja zawiera 5 μl mieszanki 2x qPCR, 0,25 μl 20 μM startera do przodu i 0,25 μL 20 μM startera odwrotnego.
    UWAGA: Prawidłowy projekt startera i testowanie dla eksperymentów qPCR są opisane w innym miejscu14,15,16.
  2. Wykonaj wzorcowe mieszanki DNA dla każdej próbki DNA. Jedna reakcja zawiera 0,5 μl DNA i 4,0 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Dodać 5,5 μl odpowiedniej mieszanki wzorcowej startera i 4,5 μl odpowiedniej mieszanki wzorcowej DNA do każdego dołka na 384-dołkowej płytce qPCR.
    Uwaga: Zacznij od dodania 5,5 μl mieszanki podkładowej do każdego dołka. Obracać płytkę o masie 200 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej przed dodaniem 4,5 μl mieszanki DNA.
  4. Przyklej uszczelkę do płytki i wiruj z prędkością 200 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  5. Wykonać qPCR przy użyciu systemu qPCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach: 95 °C przez 3 min; 40 cykli po 95 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s; krzywa topnienia 65 °C do 95 °C z przyrostami co 0,5 °C, 5 s.
  6. Dla każdej pary starterów oblicz procentowy wkład próbki IP w stosunku do 5% próbki wejściowej użytej w qPCR. Do wykonania obliczeń należy użyć środków technicznych potrójnych testów PCR.
    UWAGA: Jeśli zaobserwuje się znaczne różnice w potrójnych próbkach PCR, najlepiej jest powtórzyć qPCR z uwzględnieniem składu mieszanki głównej, błędów pipetowania i zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami na płytce 384-dołkowej.
    1. Dostosuj wartości Cq dla danych wejściowych do 100%, odejmując liczbę cykli reprezentujących współczynnik rozcieńczenia od surowych wartości Cq.
      UWAGA: Pięcioprocentowy wkład reprezentuje 20-krotny współczynnik rozcieńczenia, który wynosi 4,32 cykli (log2 20 = 4,32).
    2. Oblicz procentowy wkład jako 2^(wejście Cq - CqIP) pomnożone przez 100.

10. Określ warunki trawienia MNazy (zalecane przed pierwszym pełnym eksperymentem chIP)

  1. Wykonaj kroki od 2.1 do 4.4 poprzedniego protokołu. Zwiększ skalę protokołu, aby wygenerować wystarczającą ilość lizatu dla wielu próbek trawienia MNazy w osadzie zawierającym chromatynę. W kroku 4.4 ponownie zawieś granulki w 1,25 ml buforu do wytrawiania MNazy. Porcjować próbki do 5 probówek, tak aby każda zawierała 250 μl osadu chromatyny zawieszonego w buforze do wytrawiania MNazy.
  2. Dodać 0, 1,5, 2,5 lub 5 μl MNazy do każdej probówki. Wymieszaj je delikatnie, odwracając 4-6 razy i natychmiast inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  3. Zatrzymaj reakcje, natychmiast umieszczając probówki na lodzie i dodając 5 μl 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. Delikatnie wymieszaj roztwór przez odwrócenie.
  4. Odwirować probówki o sile 15 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać SDS do 1% stężenia końcowego (25 μl 10% roztworu podstawowego) i NaHCO 3 do 0,1 M stężenia końcowego (25 μl 1M roztworu podstawowego) do próbek w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 20 μl 5M NaCl, 5 μl glikogenu i 12,5 μl 20 mg/ml proteinazy K do próbek w probówkach 1,5 ml. Inkubować je w temperaturze 65 °C przez noc.
  7. Dodać 10 μl 10 mg/ml RNazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Dodać 300 μl PCI do roztworu wodnego i dobrze je wymieszać. Wirować przy 15 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Usuń warstwę wodną do nowej probówki. Dodaj 300 μl PCI i dobrze wymieszaj. Wirować przy 15 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki.
  9. Dodaj 0,1x objętość 3 M octanu sodu (zwykle ~ 30 μL) i 1 ml zimnego 100% etanolu, aby wytrącić DNA. Odwróć rurkę 4-6 razy, aby dobrze wymieszać. Inkubować probówkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę lub -20 °C przez noc.
    1. Wirować probówkę o masie 15 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    2. Umyj granulki w 1 ml zimnego 70% etanolu. Wirować z prędkością 15 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu w kapturze przez około 20 minut (lub do całkowitego wyschnięcia). Zawiesić granulki w 30 μl wody wolnej od nukleaz
      4. .
  10. Dodaj barwnik ładujący DNA i nałóż 20 μl na 2% żel agarozowy, aby uwidocznić strawione DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z kluczowych elementów tego protokołu jest optymalizacja stężenia mikrokokowej nukleazy (MNazy) używanej do trawienia chromatyny na rozpuszczalne fragmenty, jak opisano w Kroku 10. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania danych o wysokiej rozdzielczości dotyczących rozkładu modyfikacji histonów w obszarach genomu będących przedmiotem zainteresowania. Należy przeprowadzić miareczkowanie MNazy w celu określenia najbardziej odpowiedniego stężenia w celu uzyskania przede wszystkim monon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj procedura pozwala na skuteczne odzyskanie DNA związanego ze zmodyfikowanymi histonami w komórkach drożdży poprzez immunoprecypitację. Następnie przeprowadza się qPCR przy użyciu starterów, które amplifikują obszary zainteresowania w celu określenia lokalnego wzbogacenia lub zubożenia określonych modyfikacji histonów. Pomimo tego, że została opracowana jako metoda prawie 20 lat temu, chIP pozostaje testem definiującym do badania statusu modyfikacji histonów w różnych regionach genomu i w różnych warunkach. C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować członkom Zielonego laboratorium za pomocne dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH R03AG052018 i R01GM124342 dla E.M.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekstrakt z drożdżyMiędzynarodowe Produkty Badawcze (RPI)Y20025-1000.0
PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
DekstrozaThermoScientificBP350-1
FormaldehydSigma-AldrichF8775
GlicynaFisher ScientificAC12007-0050
TrisAmresco0497-5KG
EDTASigma-AldrichE6758-500G
NaClThermoScientificBP358-10
Glikol 4-nonylofenylo-polietylenowySigma-Aldrich74385Odpowiednik NP-40
MgClThermoScientificS25533
CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
LiClThermoScientificAC413271000
Dodecylosiarczan soduAmrescoM107-1KG
Deoksycholan soduSigma-Aldrich30970-100G
Octan soduSigma-AldrichS2889
NaHCO3ThermoScientificS25533
PMSFSigma-AldrichP7626-5G
Koktajl inhibitorów proteazy drożdżowejVWR10190-076
25 Fenol:24 Chloroform:1 Alkohol izoamylowyVWR Life Science97064-824
EtanolSigma-AldrichE7023
Woda wolna od nukleazVWR100720-992
NukleazamikrokokowaWorthington BiochemicalLS004797
GlycogenThermoScientificR0561
Proteinaza KResearch Products International (RPI)P50220-0,1
RNaza A Sigma-AldrichR6513-50MG
  Odczynnik do testów BradfordThermoScientific23238
  Norma BSA 2 mg/mlThermoScientific23210
&alfa; H4EMD Milipory04-858
&alfa; H4K16acEMD MilliporeABE532
α H3Abcamab1791
i alfa; H3K4me2Motyw aktywny39142
  High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
Białkowe kulki magnetyczne A/GThermoScientific88803
stojak magnetyczny do probówek 1,5 mlFisher ScientificPI-21359
Koraliki szklane myte kwasemSigma-AldrichG8772
  Homogenizator mikroprobówekBenchmarkD1030
2,0 ml z nakrętką i pierścieniami uszczelniającymiSigma-AldrichZ763837-1000EA
Końcówki do ładowania żelemFisher Scientific07-200-288
KuwetyFisher Scientific50-476-476
ParafilmFisher Scientific13-374-10
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-432-22
384-dołkowa płytka do PCRFisher ScientificAB-1384W
  Żyratorowa wytrząsarka podłogowaNew Brunswick ScientificModel G10
SpektrofotometrThermoScientificND-2000c
  System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855485

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
  2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
  3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
  7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
  10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
  11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
  13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
  14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
  15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
  16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
  17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
  18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
  19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
  20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
  21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
  22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
  23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
  24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
  25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
  26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nukleaza mikrokokowailo ciowy PCRlizat dro d ysieciowanie formaldehydemkulki magnetyczneH3K4me2H4K16ac

Powiązane artykuły