Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności zaburzeń
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nagromadzenie nieprawidłowo sfałdowanych białek jest kluczowe dla patologii w chorobie Huntingtona (HD) i wielu innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych. W szczególności, kluczową cechą patologiczną choroby Huntingtona jest nieprawidłowa akumulacja zmutowanego białka HTT (mHTT) w kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej i wewnątrzkomórkowe ciała inkluzyjne złożone z fragmentów i innych białek. Konwencjonalne metody pomiaru i zrozumienia udziału różnych form agregatów zawierających mHTT obejmują mikroskopię fluorescencyjną, analizę western blot i testy pułapek filtracyjnych.
Jednak większość z tych metod jest specyficzna dla konformacji, a zatem może nie rozwiązać pełnego stanu strumienia białka mHTT ze względu na złożoną naturę łącznej rozpuszczalności i rozdzielczości.
Do identyfikacji zagregowanych mHTT oraz różnych zmodyfikowanych form i kompleksów, separacja i solubilizacja agregatów i fragmentów komórkowych jest obowiązkowa. Tutaj opisujemy metodę izolacji i wizualizacji rozpuszczalnych mHTT, monomerów, oligomerów, fragmentów i nierozpuszczalnych gatunków mHTT o dużej masie cząsteczkowej (HMW). HMW mHTT śledzi postęp choroby, odpowiada odczytom zachowania myszy i jest korzystnie modulowany przez pewne interwencje terapeutyczne1. Podejście to może być stosowane w przypadku mózgu myszy, tkanek obwodowych i hodowli komórkowych, ale może być dostosowane do innych systemów modelowych lub kontekstów chorobowych.
Wprowadzenie
Zakłócenie sieci kontroli jakości białek, które zapewniają prawidłowe fałdowanie i degradację białek komórkowych, jest prawdopodobnie kluczowe dla patologii w chorobie Alzheimera (AD), chorobie Parkinsona (PD), chorobie Huntingtona (HD) i innych zaburzeniach związanych z "nieprawidłowym fałdowaniem białek"2,3. Szczegółowe zrozumienie komponentów sieci proteostazy i ich wkładu w patologię ma zatem kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Choroba Huntingtona jest spowodowana nieprawidłowym rozszerzaniem się powtórzeń CAG w obrębie genu HD, co skutkuje rozszerzonym odcinkiem pol....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie o etyce zwierząt - Eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem badań na zwierzętach przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, instytucji akredytowanej przez AAALAC. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
1. Przygotowanie do lizy
- Przygotować "rozpuszczalny" bufor do lizy (10 mM Tris pH 7,4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) i sterylny filtr przez filtr 0,22 μm.
- Aby uzyskać działa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rozdział rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych lizatów komórkowych po frakcjonowaniu można wykryć za pomocą analizy western i testów retardacji na filtrach (Rysunek 2). Przykładowo, komórki HEK293T zostały transfektowane przy użyciu odczynnika do transfekcji (np. lipofectamine 2000) cDNA kodującym ekson 1 HTT zawierający 97 powtórzeń glutaminy15 oraz następujący po nim region bogaty w poliprolinę, a następnie pozostawiono komór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przypadku powyższych protokołów potrzebne są pewne środki ostrożności, aby zapewnić spójne i ilościowe wyniki. Po pierwsze, mHTT w obu frakcjach będzie spontanicznie tworzyć agregaty w czasie po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania, szczególnie w wysokim stężeniu. W związku z tym bardzo ważne jest zamrożenie podwielokrotności preparatów białkowych i rozmrożenie tylko potrzebnej objętości przed uruchomieniem testu, jak opisano w powyższym protokole. Ponadto, jeśli frakcja nierozpuszczalna daje biały osad po rozmrożeni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH (RO1-NS090390). Chcielibyśmy również podziękować dr Joan Steffan za pomoc techniczną i dyskusję podczas opracowywania tego testu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylny filtr | Millipore | SCGP505RE | Zakrętka, sterylny filtr próżniowy |
| 1 ml Młynek do tkanek, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Test białka | Biorad | 5000111 | Porównywalny z testem Lowry'ego |
| Roztwór buforowy Tris 1M | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M roztwór | Teknova | S0251 | |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% roztwór SDS | Teknova | S0295 | |
| N-etylomaleimid | Sigma | E1271 | |
| Fluorek fenylometylosulfonu | Sigma | P7626 | utwórz 100mM roztwór podstawowy w 100% EtOH, przechowywać w 4° C |
| Ortowanadan sodu | Sigma | S6508 | Stwórz 0,5 M roztwór podstawowy w wodzie |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie |
| Aprotynina | Sigma | A1153 | Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie |
| Fluorek sodu | Sigma | S4504 | Utwórz 500 mM roztwór podstawowy w wodzie |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Użyj 1:1000 dla western blot, 1:500 dla testu opóźnienia filtra |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Użyj 1:1000 dla rozpuszczalnego western blot |
Bibliografia
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in dis....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
