Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności zaburzeń

Streszczenie

Nagromadzenie nieprawidłowo sfałdowanych białek jest kluczowe dla patologii w chorobie Huntingtona (HD) i wielu innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych. W szczególności, kluczową cechą patologiczną choroby Huntingtona jest nieprawidłowa akumulacja zmutowanego białka HTT (mHTT) w kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej i wewnątrzkomórkowe ciała inkluzyjne złożone z fragmentów i innych białek. Konwencjonalne metody pomiaru i zrozumienia udziału różnych form agregatów zawierających mHTT obejmują mikroskopię fluorescencyjną, analizę western blot i testy pułapek filtracyjnych.

Jednak większość z tych metod jest specyficzna dla konformacji, a zatem może nie rozwiązać pełnego stanu strumienia białka mHTT ze względu na złożoną naturę łącznej rozpuszczalności i rozdzielczości.

Do identyfikacji zagregowanych mHTT oraz różnych zmodyfikowanych form i kompleksów, separacja i solubilizacja agregatów i fragmentów komórkowych jest obowiązkowa. Tutaj opisujemy metodę izolacji i wizualizacji rozpuszczalnych mHTT, monomerów, oligomerów, fragmentów i nierozpuszczalnych gatunków mHTT o dużej masie cząsteczkowej (HMW). HMW mHTT śledzi postęp choroby, odpowiada odczytom zachowania myszy i jest korzystnie modulowany przez pewne interwencje terapeutyczne1. Podejście to może być stosowane w przypadku mózgu myszy, tkanek obwodowych i hodowli komórkowych, ale może być dostosowane do innych systemów modelowych lub kontekstów chorobowych.

Wprowadzenie

Zakłócenie sieci kontroli jakości białek, które zapewniają prawidłowe fałdowanie i degradację białek komórkowych, jest prawdopodobnie kluczowe dla patologii w chorobie Alzheimera (AD), chorobie Parkinsona (PD), chorobie Huntingtona (HD) i innych zaburzeniach związanych z "nieprawidłowym fałdowaniem białek"2,3. Szczegółowe zrozumienie komponentów sieci proteostazy i ich wkładu w patologię ma zatem kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Choroba Huntingtona jest spowodowana nieprawidłowym rozszerzaniem się powtórzeń CAG w obrębie genu HD, co skutkuje rozszerzonym odcinkiem poliglutaminy (polyQ) w białku huntingtyny (HTT)4. Stałą patologiczną cechą patogenezy HD jest wynikające z tego nieprawidłowe fałdowanie, akumulacja i agregacja HTT w obszarach mózgu i tkankach obwodowych, co wykazano, że zakłóca na kilka sposobów normalną homeostazę i funkcję komórek5,6. Podczas gdy HTT jest powszechnie eksprymowany, średnie neurony kolczaste w prążkowiu są selektywnie wrażliwe i najbardziej jawnie dotknięte zauważalnym zanikiem kory mózgowej związanym również z patogenezą HD.

Tworzenie agregatów HTT w mózgu pacjentów z HD i modelach zwierzęcych zazwyczaj służyło jako wskaźnik progresji choroby i dominująco-ujemnego przyrostu funkcji dla mHTT7. Chociaż dokładne mechanizmy, za pomocą których nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek mogą przyczyniać się do toksyczności indukowanej przez mHTT, pozostają niejasne, powstawanie tych inkluzji w mózgach pacjentów z HD i różnych modelach zwierzęcych jest cechą niezmienniczą i nieuniknioną. Inkluzje wydają się składać głównie z nagromadzonych fragmentów HTT zawierających N-końcowy ekspandowany polyQ, co wskazuje, że proteoliza i przetwarzanie pełnej długości HTT, a także alternatywne splicing8,9 mogą odgrywać ważną rolę w patogenezie HD. N-końcowe fragmenty HTT mogą stanowić patologiczną formę HTT, która może szybko agregować, nukleować i przyspieszać lub propagować proces agregacji10.

Jednak obecność tych inkluzji niekoniecznie koreluje z toksycznością wywołaną przez HTT lub śmiercią komórki11. Zaproponowano, aby HTT został poddany procesowi agregacji od rozpuszczalnego monomeru przez rozpuszczalne gatunki oligomeryczne i włókienka β-arkuszowe do nierozpuszczalnych agregatów i inkluzji12. Oddzielenie tych różnych gatunków białek za pomocą standardowych testów biochemicznych było wyzwaniem w tej dziedzinie ze względu na ich stabilność w buforze do lizy o niskiej zawartości detergentów i trudności w wizualizacji przy użyciu standardowych testów biochemicznych. W związku z tym względy metodologiczne mają kluczowe znaczenie dla wykrywania stopnia i wzorca skumulowanego i zagregowanego mHTT.

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza metody wizualizacji kilku produktów pośrednich HTT, w szczególności tworzenia nierozpuszczalnego gatunku HMW HTT, który wydaje się ściśle śledzić patogenezę HD i postęp choroby1,13,14. Zdolność do rozpoznawania i śledzenia wielu gatunków mHTT zapewnia naukowcom biochemiczne narzędzie do badania patogenezy choroby i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych poprzez ich modulację i wpływ na patogenezę choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie o etyce zwierząt - Eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem badań na zwierzętach przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, instytucji akredytowanej przez AAALAC. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.

1. Przygotowanie do lizy

  1. Przygotować "rozpuszczalny" bufor do lizy (10 mM Tris pH 7,4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) i sterylny filtr przez filtr 0,22 μm.
    1. Aby uzyskać działający "rozpuszczalny" bufor do lizy, odmierz N-etylomaleimid (NEM) i dokładnie rozpuść w 100 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) rozpuszczonego w 100% EtOH.
      UWAGA: Inhibitory buforu do lizy: (i) 20 mM N-etylomaleimidu (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM ortowananadu sodu (Na3VO4); (iv) 1 μg/ml leupeptyny; (v) 1 μg/ml aprotyniny; (vi) 20 mM fluorek sodu (NaF).
      UWAGA: Noś maskę na twarz podczas pracy z NEM przez cały czas trwania protokołu. Działający bufor do lizy musi być świeży, aby zapewnić aktywne inhibitory.
    2. W przypadku rozpuszczalnego buforu do lizy z inhibitorami proteazy należy dodać inhibitory w następującej kolejności: fluorek sodu (NaF), do objętości z buforem do lizy na zimno, ortowananadan sodu (Na3VO4), aprotynina i leupeptyna.
  2. W przypadku "nierozpuszczalnego" buforu do lizy uzupełnij do 4% SDS, dodając 500 μl 20% SDS do 2 ml "rozpuszczalnego" buforu do lizy. Pozostawić w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: SDS wytrąca się, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C; Utrzymuj to w temperaturze pokojowej. Końcowy skład buforu do lizy: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glicerolu; 4% SDS (tylko nierozpuszczalne).

2. Protokół frakcjonowania rozpuszczalnego/nierozpuszczalnego

UWAGA: Zobacz schemat Rysunek 1.

  1. Oznacz dwa zestawy probówek dla każdej próbki: "Rozpuszczalny" i "Nierozpuszczalny".
  2. Dodać X-μl lodowatego rozpuszczalnego buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy (patrz 1.1.1) do tkanki.
    UWAGA: X = objętość różni się w zależności od ilości tkanki; Patrz tabela 1.
  3. W przypadku tkanki mózgowej myszy (tj. prążkowia) zanurz powoli 30 razy w szklanym wykieliszku o pojemności 1 ml i odpipetuj do probówki oznaczonej jako "Nierozpuszczalne" (przechowywać na lodzie).
    UWAGA: Należy uważać, aby nie naruszyć powierzchni cieczy po rozpoczęciu zanurzania, ponieważ utworzą się pęcherzyki, które mogą spowodować niepełną homogenizację.
  4. W przypadku komórek (np. HeLa, HEK293T), przepłucz ogniwa raz zimnym, 1x PBS. Usunąć PBS i nałożyć minimalną objętość buforu do lizy na komórki i podnieść za pomocą skrobaka do komórek.
    UWAGA: W przypadku powyższych linii komórkowych komórki zostały posiane w proporcji 5 x 105 komórek na płytkę 6-dołkową i wyhodowane do prawie konfluencji. Jedna studzienka jest porównywalna z objętościami używanymi do prążkowia myszy.
  5. Przenieść homogenat lub lizat komórkowy do oznakowanych, "nierozpuszczalnych" probówek i lizować na lodzie 1 godzinę (Rozpocznij zegar po przetworzeniu ostatniej probówki).
    UWAGA: W przypadku lizatów komórkowych należy kilkakrotnie rozcierać, aby rozbić grudki komórek przed rozpoczęciem inkubacji. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Krótko pulsuj wirowo każdą próbkę przez 1 s w połowie lizy.
  6. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g przez 20 minut.
  7. Odzyskać supernatant jako frakcję "rozpuszczalną".
    1. Usuń pipetą, uważając, aby nie naruszyć warstwy granulek/mętnej warstwy, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie frakcji. Odpipetować frakcję rozpuszczalną do probówki z etykietą "Rozpuszczalne". Trzymaj na lodzie.
  8. Przepłukać osad 500 μl buforu do lizy (x2) i odwirować w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g przez 5 minut po każdym płukaniu; nie ma nic złego w tym, że część mętnej warstwy zostanie odpipetowana.
  9. Po końcowym umyciu usuń CAŁY pozostały bufor do płukania, pozostawiając tylko granulkę chusteczek.
    UWAGA: Od tego momentu nierozpuszczalne próbki należy teraz przechowywać w temperaturze pokojowej.
  10. Zawiesić osad za pomocą buforu do lizy X-μL uzupełnionego 4% SDS (objętość można regulować w zależności od wielkości osadu; patrz Tabela 1).
  11. Sonikuj każdą próbkę przez 30 s w temperaturze pokojowej za pomocą sonografu sonicznego (125 watów, 20 kHz, impuls, amplituda 40%, patrz tabela materiałów).
  12. Gotować próbki (gotowanie walcowania) przez 30 minut; Odwirować krótko (15 s) przy 6 000 x g, aby nie stracić żadnej próbki.
  13. Wykonać test białka DC (kompatybilny z detergentem) (patrz tabela materiałów) lub test białka Lowry'ego w celu zmierzenia stężenia białka (zalecane rozpoczęte rozcieńczenia 1/5 próbki w odpowiednim buforze do lizy dla hodowli komórkowej i 1/10 dla lizatów tkankowych).
    UWAGA: Stężenia białek będą musiały być odczytywane za pomocą testu DC lub Lowry'ego ze względu na wysokie stężenie detergentu.
  14. Porcjuj próbki na partie o objętości 50 μl, aby uniknąć problemów z zamrażaniem i rozmrażaniem.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać przed dalszą analizą biochemiczną, przechowując obie frakcje w temperaturze -20 °C.

3. Western Blot i kwantyfikacja

  1. Wykonaj western blot, jak podano w innym miejscu1,13 rozcieńczając 30 μg próbki 1:1 w buforze ładującym (1,6x barwnik ładujący, 1x redukujący).
    UWAGA: 30 μg białka na frakcję jest wystarczające, ale można je dostosować w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości. Do frakcji nierozpuszczalnej należy stosować 3 - 8% żeli poliakrylamidowych Tris-Acetate. Do frakcji rozpuszczalnej zalecane są 4 - 12% żeli Bis-Tris.
  2. Gotować próbki (gotowanie walcowania) przez 5 minut. Krótko odwirować (15 s) przy 6 000 x g w celu pobrania próbki.
  3. Analizuj frakcje za pomocą SDS-PAGE i western blot, zgodnie z protokołem producenta dla próbek zredukowanych.
    UWAGA: Frakcja nierozpuszczalna najlepiej rozpuszcza się po przeniesieniu na membranę nitrocelulozową 0,45 μM. Do frakcji rozpuszczalnej można użyć nitrocelulozy 0,45 lub 0,2 μM, w zależności od wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania. W celu uzyskania najlepszego transferu materiałów HMW może być wymagana pewna optymalizacja.
  4. Błona barwiąca z barwieniem całych białek (np. MEMcode, patrz tabela materiałów) w celu wizualizacji efektywności ładowania białka.
    UWAGA: Western blot można analizować za pomocą średniej intensywności pikseli. Frakcje rozpuszczalne można znormalizować do białka gospodarstwa domowego, które najlepiej nadaje się do systemu eksperymentalnego. Frakcję nierozpuszczalną jako względną obfitość białka zweryfikowano za pomocą odwracalnego barwienia białek lub normalizacji histonu 3 na oddzielnym blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozdział rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych lizatów komórkowych po frakcjonowaniu można wykryć za pomocą analizy western i testów retardacji na filtrach (Rysunek 2). Przykładowo, komórki HEK293T zostały transfektowane przy użyciu odczynnika do transfekcji (np. lipofectamine 2000) cDNA kodującym ekson 1 HTT zawierający 97 powtórzeń glutaminy15 oraz następujący po nim region bogaty w poliprolinę, a następnie pozostawiono komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku powyższych protokołów potrzebne są pewne środki ostrożności, aby zapewnić spójne i ilościowe wyniki. Po pierwsze, mHTT w obu frakcjach będzie spontanicznie tworzyć agregaty w czasie po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania, szczególnie w wysokim stężeniu. W związku z tym bardzo ważne jest zamrożenie podwielokrotności preparatów białkowych i rozmrożenie tylko potrzebnej objętości przed uruchomieniem testu, jak opisano w powyższym protokole. Ponadto, jeśli frakcja nierozpuszczalna daje biały osad po rozmrożeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH (RO1-NS090390). Chcielibyśmy również podziękować dr Joan Steffan za pomoc techniczną i dyskusję podczas opracowywania tego testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylny filtrMilliporeSCGP505REZakrętka, sterylny filtr próżniowy
1 ml Młynek do tkanek, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModel Q125
DC Test białkaBiorad5000111Porównywalny z testem Lowry'ego
Roztwór buforowy Tris 1MAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M roztwórTeknovaS0251
GlicerolFisherBP229-1
20% roztwór SDSTeknovaS0295
N-etylomaleimidSigmaE1271
Fluorek fenylometylosulfonuSigmaP7626utwórz 100mM roztwór podstawowy w 100% EtOH, przechowywać w 4° C
Ortowanadan soduSigmaS6508Stwórz 0,5 M roztwór podstawowy w wodzie
LeupeptinSigmaL2884Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie
AprotyninaSigmaA1153Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie
Fluorek soduSigmaS4504Utwórz 500 mM roztwór podstawowy w wodzie
Anti-HTTMilliporeMAB5492Użyj 1:1000 dla western blot, 1:500 dla testu opóźnienia filtra
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Użyj 1:1000 dla rozpuszczalnego western blot

Bibliografia

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ko huntingtynyfrakcjonowanie bia ekrozdzia frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnejwysoka masa cz steczkowaanaliza Western BlotSDS PAGEoznaczanie ilo ci bia kalizaza kom rekwirowaniesonikacja

Powiązane artykuły