Artykuł metodologiczny

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

DOI:

10.3791/57087

⸱

6 marca 2018

 ,  ,  , 
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoszkielet, złożony z mikrofilamentów aktynowych, mikrotubul i włókien pośrednich (IF), odgrywa kluczową rolę w kontroli kształtu, polaryzacji i ruchliwości komórek. Organizacja sieci aktyny i mikrotubul została szeroko zbadana, ale organizacja IF nie jest jeszcze w pełni scharakteryzowana. Mogą mieć średnią średnicę 10 nm i tworzą sieć rozciągającą się w całej cytoplazmie komórki. Są one fizycznie związane z aktyną i mikrotubulami poprzez silniki molekularne i łączniki cytoszkieletu. Ten ścisły związek leży u podstaw mechanizmów regulacyjnych, które zapewniają skoordynowaną regulację trzech sieci cytoszkieletu wymaganych do większości funkcji komórek. Dlatego tak ważne jest, aby wizualizować same IF, a także razem z każdą z pozostałych sieci cytoszkieletu. Jednak sieci IF są niezwykle gęste w większości typów komórek, zwłaszcza w komórkach glejowych, co sprawia, że ich rozdzielczość jest bardzo trudna do osiągnięcia przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej (rozdzielczość boczna ~250 nm). Bezpośrednia mikroskopia rekonstrukcji optycznej STochastic (dSTORM) to technika pozwalająca na uzyskanie rozdzielczości poprzecznej o jeden rząd wielkości. Tutaj pokazujemy, że boczna rozdzielczość dSTORM jest wystarczająca do rozwiązania gęstej organizacji sieci IF, a w szczególności wiązek IF otaczających mikrotubule. Tak ścisły związek prawdopodobnie będzie uczestniczył w skoordynowanej regulacji tych dwóch sieci i może wyjaśniać, w jaki sposób wimentyna IF kształtuje i stabilizuje organizację mikrotubul, a także może wpływać na zależny od mikrotubul transport pęcherzykowy. Mówiąc bardziej ogólnie, pokazujemy, w jaki sposób obserwacja dwóch składników cytoszkieletu za pomocą dwukolorowej techniki dSTORM przynosi nowe spojrzenie na ich wzajemne oddziaływanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoplazmatyczne włókna pośrednie (IFs) to homo- lub heteropolimery o średnicy 10 nm z podzbioru białek IF specyficznych dla typu komórki. IF uczestniczą w szerokim zakresie funkcji komórkowych, takich jak ruchliwość komórek, proliferacja i reakcje na stres. Ich kluczową rolę podkreśla fakt, że ponad 90 chorób człowieka jest bezpośrednio spowodowanych mutacjami w białkach IF; na przykład zmiany w składzie IF towarzyszą wzrostowi i rozprzestrzenianiu się guza1,2,3. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że trzy systemy cytoszkieletu współpracują ze sobą, aby kontrolować funkcje komórkowe, takie jak polaryzacja, podział i migracja komórek2,3. Ponieważ istnieje ścisłe powiązanie między architekturą przestrzenną a funkcjami, ważne jest, aby uzyskać wgląd w strukturalną organizację IF z innymi włóknami i lepiej zrozumieć wzajemne oddziaływanie cytoszkieletu. ten artykuł zawiera protokół do wykonywania techniki super-rozdzielczości dwukolorowej dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy)4 oraz sposób jej wykorzystania do badania interakcji między IF a mikrotubulami w stałych, hodowanych komórkach w 2 wymiarach (2D).

W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka technik super-rozdzielczości, a odkrycia były źródłem Nagrody Nobla w dziedzinie chemii w 2014 roku5. Wśród wszystkich tych technik znajdują się metody oparte na lokalizacji pojedynczych cząsteczek, takie jak PALM6 (Photo-Activated Localization Microscopy), która wykorzystuje fotoprzełączalne białka fluorescencyjne, STORM7 z parami fluoroforów lub dSTORM4 z konwencjonalnymi fluoroforami. Wszystkie te metody opierają się na tej samej zasadzie, która polega na (i) przełączeniu większości fluorescencyjnych reporterów w stan "wyłączony" (niefluorescencyjny), (ii) stochastycznej aktywacji ich podzbioru w stan fluorescencyjny w celu zlokalizowania ich pozycji przestrzennej z nanometrową dokładnością, oraz (iii) powtórzeniu tego procesu w celu aktywacji jak największej liczby podzbiorów fluoroforów. Ostateczny obraz jest rekonstruowany przy użyciu wszystkich lokalizacji aktywowanych cząsteczek, zapewniając rozdzielczość boczną do ~20-40 nm. Kilka skomercjalizowanych systemów optycznych umożliwiających PALM/STORM jest obecnie dostępnych dla biologów do rutynowych eksperymentów. W tym przypadku jeden z takich systemów został wykorzystany do zbadania powiązań strukturalnych mikrotubul i IF. Spośród wszystkich metod opartych na lokalizacji pojedynczych cząsteczek wybrano dwukolorową technikę dSTORM, ponieważ doskonale nadaje się do obserwacji bardzo cienkich obszarów blaszkowatych (<1 μm) przylegających komórek i może zapewnić znaczną poprawę rozdzielczości obrazu przy minimalnych nakładach czasu i pieniędzy. Rzeczywiście, dSTORM jest bardzo wygodną i wszechstronną techniką, która jest kompatybilna ze standardowymi barwnikami organicznymi rutynowo stosowanymi do barwienia komórek i immunofluorescencji.

Podczas gdy jednokolorowe obrazy dSTORM są stosunkowo łatwe do uzyskania za pomocą fluoroforu Alexa6478, dwukolorowe dSTORM wymaga optymalizacji warunków eksperymentalnych, aby dwa barwniki mogły prawidłowo migać w wybranym buforze, zwłaszcza gdy moc lasera jest ograniczona. Dostępne są już doskonałe artykuły na temat metod konfiguracji obrazowania wielokolorowego za pomocą dSTORM9,10,11,12,13, a te artykuły szczegółowo wyjaśniają możliwe źródła artefaktów i obniżonej rozdzielczości obrazu, a także sposób ich przezwyciężenia. W artykule opisano optymalne warunki eksperymentalne w zakresie utrwalania komórek, barwienia immunologicznego, przygotowania próbek, akwizycji obrazowej i rekonstrukcji obrazu w celu uzyskania obrazów gęstych cytoplazmatycznych sieci IF i mikrotubul w komórkach glejowych z dwukolorowym dSTORM. Krótko mówiąc, metoda ekstrakcji/utrwalania opisana w Chazeau et al12 została dostosowana do komórek glejowych i stosowana z etapem po utrwaleniu, zoptymalizowanym stężeniem przeciwciał, buforem STORM z 10 mM MEA opisanym w Dempsey9 et al., który okazał się optymalny dla konfiguracji eksperymentalnej i typu próbki.

Komórki glejowe głównie wyrażają trzy typy białek IF: wimentynę, gniazdynę i GFAP (kwaśne białko fibrylarne glejowe). Wykazano, że te trzy białka kopolimeryzują w astrocytach14. Wcześniej wykazaliśmy za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SR SIM), że te trzy białka IF można znaleźć w tym samym pojedynczym włóknie IF i że wykazują one podobny rozkład i dynamikę w komórkach glejowych 15. Ze względu na podobieństwa między trzema białkami IF, barwienie wimentyną zastosowano jako reporter dla całej sieci IF. Korzystając z dSTORM, udało nam się rozwiązać, w jaki sposób IF tworzą wiązki wzdłuż mikrotubul, co nie było możliwe przy użyciu technik mikroskopii ograniczonej dyfrakcją15. Obserwacje te mogą pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób IFs wimentyny mogą szablonować mikrotubule i regulować ich trajektorię wzrostu, promując utrzymanie osi polaryzacji podczas migracji komórek16. Obrazy o wysokiej rozdzielczości dostarczyły kluczowych informacji na temat wzajemnych interakcji dwóch podsystemów cytoszkieletu i dostarczyły informacji na temat związku między asocjacją przestrzenną a funkcją lokalną, która może być specyficzna dla typu komórki17. Ogólnie rzecz biorąc, dwukolorowy dSTORM może być używany do badania przesłuchów między elementami cytoszkieletu lub innymi typami organelli, pod warunkiem osiągnięcia dobrych warunków barwienia immunologicznego pod względem gęstości i swoistości. Technika ta będzie przydatna do lepszego scharakteryzowania zmian w cytoszkielecie obserwowanych podczas astrogleju i glejaka, najczęstszego i najbardziej złośliwego nowotworu ośrodkowego układu nerwowego, w którym ekspresja białek IF jest zmieniona 18,19,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych (Dzień 1, 30 min)

  1. Umieść szklane szkiełka nakrywkowe 18 mm nº1.5H (170 μm +/- 5μm) na plastikowym stojaku.
  2. Umieść stojak w 100-mililitrowej zlewce wypełnionej acetonem i moczyć przez 5 minut.
  3. Przenieś stojak do zlewki o pojemności 100 ml wypełnionej absolutnym etanolem i moczyć przez 5 minut.
  4. Przenieść stojak do nowej zlewki o pojemności 100 ml wypełnionej absolutnym etanolem i umieścić zlewkę w myjce ultradźwiękowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej. Naciśnij "włącz" i odczekaj 10 minut.
  5. Umieść stojak pod okapem z przepływem laminarnym i pozwól szkiełkom nakrywkowym wyschnąć lub wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą przefiltrowanego przepływu powietrza.
  6. Umieść stojak z szkiełkami nakrywkowymi w urządzeniu do czyszczenia plazmowego. Włącz pompę próżniową, zamknij drzwiczki, odczekaj 3 minuty do wytworzenia podciśnienia i włącz plazmę na 1 minutę. Szkiełka nakrywkowe należy stosować wkrótce po czyszczeniu. Nie przechowuj ich.

2. Powlekanie komórek (Dzień 1, 20 min)

  1. Hoduj linię komórek glejowych U373 w minimalnym niezbędnym podłożu (MEM) z 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 1% nieistotnych aminokwasów na plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
  2. Umieść czyste szklane szkiełka nakrywkowe na 12-dołkowych płytkach pod okapem z przepływem laminarnym i dodaj 1 ml podgrzanego podłoża komórkowego do dołka.
  3. Pobrać naczynie zawierające komórki z inkubatora komórkowego (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Usuń pożywkę i dodaj 10 ml PBS.
  5. Usuń PBS i dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
  6. Umieść naczynie z powrotem w inkubatorze na 2-3 minuty.
  7. Dodać 10 ml ciepłego podłoża podgrzanego do temperatury 37 °C na szalkę i ponownie zawiesić komórki.
  8. Wysiewaj około 100 000 komórek na studzienkę (~150 μl komórek) w 12-dołkowych płytkach, które zawierają szkiełka nakrywkowe.
  9. Odczekaj co najmniej 6 godzin (lub noc), aby umożliwić rozprzestrzenianie się komórek.

3. Utrwalenie komórek (Dzień 2, 2h)

  1. Przygotuj bufor cytoszkieletu z 80 mM PIPES, 7 mM MgCl2, 1mM EGTA, 150 mM NaCl i dostosuj pH do 6,9.
  2. Umyj komórki raz za pomocą PBS.
  3. Usunąć PBS i delikatnie dodać 1 ml roztworu do ekstrakcji/utrwalania (0,25% aldehydu glutarowego, 0,3% Triton X-100 w buforze cytoszkieletu) podgrzanego w temperaturze 37 °C.
  4. Inkubować przez 60 s w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć roztwór i delikatnie dodać 1 ml na studzienkę podgrzanego i świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA (paraformaldehydu) rozcieńczonego w buforze cytoszkieletu.
    ostrożność: Używaj rękawic i pracuj pod kapturem chemicznym.
  6. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37°C na 10 minut.
  7. Usuń PFA i dodaj 3 ml PBS na studzienkę.
    nuta: Pracuj pod kapturem chemicznym w rękawiczkach i umieść PFA z recyklingu w specjalnym pojemniku.
  8. Umyć dwukrotnie PBS.
  9. Usunąć PBS i dodać świeżo przygotowany 10 mM roztwór NaBH4 rozcieńczony w PBS w celu stłumienia autofluorescencji pochodzącej z aldehydu glutarowego.
  10. Inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umieść przetworzony NaBH4 w specjalnym pojemniku.
  12. Umyć trzy razy po 5 minut za pomocą PBS.
  13. Usunąć PBS i dodać roztwór blokujący (5% roztwór BSA w PBS).
  14. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C).
    nuta: Bufor cytoszkieletu może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. Z PFA, NaBH4 i aldehydem glutarowym należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością (kaptur, rękawice i specjalne pojemniki do recyklingu). Roztwory należy delikatnie dodawać i usuwać, aby zachować integralność komórek. Ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek.

4. Barwienie immunologiczne (Dzień 2, 5h)

  1. Przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych za pomocą antywimentyny i antytubuliny w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym.
  2. Umieść 100 μl kropli rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych na warstwie filmu parafinowego i umieść na nich szkiełka nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół.
  3. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 2 godziny. Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na 12-dołkowej płytce wypełnionej PBS. Płukać trzykrotnie przez 5 minut za każdym razem w PBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
  4. W międzyczasie przygotuj roztwór przeciwciał drugorzędowych, używając anty-mysiego Alexa647 i anty-szczurzego Alexa555 w rozcieńczeniu 1:1 000 w roztworze blokującym. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Postępuj jak w punkcie 4.2. ochrona komórek przed światłem.
  5. Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w 12-dołkowej płytce wypełnionej PBS. Płukać trzykrotnie przez 5 minut za każdym razem w PBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Usuń PBS i dodaj 0,5 ml PBS zmieszanego z 1 μl kulek tetraspeck 0,1 μm.
  6. Umieść studzienki na wytrząsarce orbitalnej na 30 minut. Spłucz PBS. Usunąć PBS i inkubować komórki przez 5 minut z 4% roztworem PFA w PBS. Spłucz trzykrotnie w PBS.
    nuta: Utrwalone komórki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w PBS w temperaturze 4°C. Barwienie immunologiczne powinno być wykonane w ostatniej chwili.

5. Przygotowanie próbki (Dzień 3, 5 min)

  1. Umieść porcje MEA (cysteamina, 1 M, pH 8,3), oksydazy glukozowej (100x, 50 mg/ml), katalazy (500x, 20 mg/ml) w koszyku na lód.
  2. Przygotuj 50 ml buforu Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) uzupełnionego 10% glukozy (100 mg/ml).
  3. Przygotuj 1,2 ml buforu do obrazowania tuż przed obrazowaniem z 10 mM MEA, 0,5 mg/ml (75 U/mL) oksydazy glukozowej, 40 μg/ml katalazy (80 - 200 U/mL) w buforze Tris-NaCl z 10% glukozą.
  4. Zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające oznakowane komórki na magnetycznym uchwycie próbki (np. komorze fazidu) i dodaj bufor do obrazowania, aby całkowicie wypełnić komorę. Załóż pokrywę i upewnij się, że między buforem obrazowania a pokrywą nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. Oczyścić spód próbki absolutnym etanolem i sprawdzić, czy nie ma wycieków. W razie potrzeby użyj smaru, aby prawidłowo uszczelnić uchwyt próbki.
    nuta: Przygotować 1 M zapas roztworu MEA (pH 8,3 dostosowany za pomocą HCl), zapas oksydazy glukozowej w stężeniu 50 mg/ml i zapas katalazy w stężeniu 20 mg/ml w wodzie, przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20°C przez okres do jednego miesiąca w przypadku MEA i roku w przypadku oksydazy glukozowej i katalazy. Nie zamrażaj ponownie podwielokrotności. Bufor Tris-NaCl należy wcześniej przygotować i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. Dodaj glukozę w dniu eksperymentu (krok 5.3).

6. Akwizycja obrazu (Dzień 3, ~1h na komórkę)

  1. Włączyć mikroskop. Włącz oprogramowanie do akwizycji i naciśnij Start system.
  2. Wybierz kartę Pozyskiwanie. Rozwiń narzędzie Imaging Setup (Konfiguracja obrazowania) w grupie narzędzi Setup Manager (Menedżer ustawień). Wybierz laserowy tryb akwizycji WF (szerokie pole). Wybierz obiektyw 100X NA 1.46. Wybierz tryb TIRF u-HP, który wykorzystuje kolimator do zmniejszenia pola widzenia i skoncentrowania energii lasera na mniejszym obszarze. Użyj soczewki optovar 1,6x, która daje rozmiar piksela 100 nm.
  3. Wybierz narzędzie Szeregi czasowe i ustaw upływ czasu z 50 000 klatek i 0,0 ms między klatkami. Rozwiń narzędzie Kanały w grupie narzędzi Parametr pozyskiwania i wybierz opcję "pokaż wszystko".
  4. Ustaw ścieżkę Alexa647: sprawdź linie laserowe 642 i 405 pod kątem wzbudzenia i zaakceptuj ich włączenie. Wybierz filtr emisji "655 LP" w ustawieniach obrazowania. Zmień nazwę na "647".
  5. Kliknij "+" w narzędziu Kanały, aby dodać kolejne przejście światła i wybierz tryb "przełącz ścieżkę co: klatka" w narzędziu Konfiguracja obrazowania. Sprawdź linie laserowe 561, 488 i 405 i zaakceptuj ich włączenie. Wybierz filtr emisji spalin "BP 570-650+LP750" i użyj obiektywu optovar 1.6x. Sprawdź, czy wybrany jest tryb TIRF-uHP. Zmień nazwę utworu na "555".
  6. Wybierz narzędzie Tryb akwizycji i ustaw rozmiar klatki na 200 x 200 pikseli. Wybierz narzędzie Urządzenia i strategia ostrości i ustaw definitywną ostrość na 1 000 klatek (jeśli istnieje system blokady ostrości).
  7. Nałóż olej na obiektyw i umieść próbkę. Wybierz kartę Lokalizuj i otwórz migawkę lampy fluorescencyjnej. Znajdź fokus i poszukaj komórki, którą chcesz zobrazować za pomocą okularu. Umieść go na środku pola view za pomocą joysticka.
  8. Wybierz kartę Pozyskiwanie, aby wrócić do trybu pozyskiwania. Wybierz ścieżkę "647", ustaw moc lasera 642 na 0.2%, ustaw moc lasera 405 na 0, ustaw czas naświetlania na 50 ms i wzmocnienie 50. Wybierz tryb Akwizycja ciągła, aby obserwować komórkę na ekranie. Dostosuj ostrość. Upewnij się, że w polu widzenia znajduje się co najmniej jeden koralik tetraplamki, zwiększ kontrast, aby je zobaczyć, jeśli to konieczne. Użyj trybu automatycznego skalowania dla wyświetlacza. Zrób szerokokątny obraz epifluorescencji sieci wimentyny, klikając snap i zapisz go. Aby sprawdzić natężenie oświetlenia TIRF, kliknij TIRF, dostosuj kąt oświetlenia i/lub kolimator, jeśli to konieczne, aby uzyskać jednorodne pole oświetlenia i zapisz je.
    UWAGA: Ważne jest, aby obrazy TIRF i epifluorescencyjne były wysokiej jakości przed rozpoczęciem akwizycji surowych danych. Nieciągłe, niejednorodnie znakowane filamenty spowodują słabą jakość obrazów dSTORM.
  9. Odznacz ścieżkę "647" i wybierz i zaznacz ścieżkę "555". Wykonaj obraz epifluorescencji sieci mikrotubul i zapisz go. Zrób zdjęcie TIRF i również je zapisz.
  10. Odznacz ścieżkę "555", wybierz i zaznacz ścieżkę "647", a następnie naciśnij Ciągły. Ustaw wzmocnienie na 0, a czas ekspozycji na 10 ms. Ustaw moc lasera 642 nm na 100%, aby przepompować większość barwników Alexa647 do stanu ciemnego (~2 kW/cm2). Gdy fluorofory zaczną migać, ustaw ekspozycję na 15 ms i zwiększ do 300. Wybierz tryb oświetlenia TIRF. Użyj trybu wskaźnika zasięgu bez automatycznego skalowania, aby sprawdzić, czy sygnały pojedynczej cząsteczki nie nasycają kamery (oznaczonej kolorem czerwonym). W takim przypadku zmniejszaj wzmocnienie, aż nasycenie zniknie. Koraliki Tetraspeck pozostaną nasycone na początku przejęcia. Naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać ciągłą obserwację komórki.
  11. Rozwiń narzędzie do przetwarzania online i zaznacz opcję Przetwarzanie online PALM, aby zobrazować obraz STORM podczas akwizycji. Użyj następujących parametrów: 9 dla rozmiaru maski szczytowej (średnica 9 pikseli) i 6 dla intensywności piku do szumu. Parametry te określą cząsteczki, które są brane pod uwagę w procesie przetwarzania (wystarczająco jasne i nie nakładające się na siebie). W narzędziu PAL-Statistics wybierz Typ wykresu: histogram i Źródło histogramu: Precyzja. Naciśnij Rozpocznij pobieranie.
  12. Podczas akwizycji w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość (jeśli nie ma urządzenia blokującego ostrość). Dostosuj parametry (ekspozycja, moce lasera) i ostatecznie włącz linię lasera 405 nm (zaczynając od 0,001%), aby utrzymać średnią gęstość fluoroforów z minimalną odległością 1 μm między pojedynczymi cząsteczkami (> 9 pikseli 100 nm, rozmiar maski szczytowej) (Rysunek 1A-B). Jeśli gęstość cząsteczek jest nieco za wysoka, użyj trybu oświetlenia HILO (Highly Inclined and Laminated Optical sheet) zamiast TIRF. Zwiększy to moc lasera o 20%. Upewnij się, że szczyt precyzji lokalizacji na histogramie poniżej zrekonstruowanego obrazu jest wyśrodkowany wokół lub poniżej 10 nm.
    nuta: Zwykle liczba cząsteczek zmniejsza się z czasem, a moc lasera 405 nm jest odpowiednio powoli zwiększana. Celem jest maksymalne zmniejszenie precyzji lokalizacji (histogram wyświetlany poniżej obrazu o wysokiej rozdzielczości) przy wartości szczytowej poniżej 10 nm (Rysunek 1C). W razie potrzeby zwiększ kontrast obrazu PALM, jeśli w polu znajduje się zbyt wiele jasnych koralików.
  13. Naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać film, gdy osiągnięto więcej niż 106 lokalizacji (zwykle po 40 000 klatek). Ustaw lasery z powrotem na 0,2% (642 nm) i 0 (405 nm). Zapisz nieprzetworzone dane akwizycji STORM w formacie .czi. Odznacz ścieżkę "647" w narzędziu Kanały, a następnie wybierz i zaznacz ścieżkę "555".
  14. Ustaw czas ekspozycji na 25 ms i wzmocnienie na 0. Naciśnij przycisk Ciągły i ustaw lasery 488 i 561 na 100%, aby pompować barwniki Alexa555 do stanu ciemnego (~2 kW/cm2 każdy). Gdy fluorofory zaczną migać, ustaw wzmocnienie na 250, użyj trybu oświetlenia HILO i sprawdź, czy pojedyncze cząsteczki nie nasycają kamery trybem wskaźnika zasięgu. W takim przypadku zmniejsz wzmocnienie. Naciśnij przycisk Stop. Zmniejsza moc lasera 488 do 50%.
  15. Naciśnij Rozpocznij pobieranie. Podczas akwizycji stopniowo zwiększaj wzmocnienie, aby zawsze było na granicy nasycenia. Zwiększaj krok po kroku moc lasera 405 nm, aby utrzymać średnią gęstość pojedynczej cząsteczki w polu widzenia (patrz krok 6.18). Zmniejsz moc lasera 488 do 20-30%, gdy moc lasera 405 jest wyższa niż 15%. Następnie stopniowo zmniejszaj 488, jednocześnie zwiększając linię lasera 405, aby jak najszybciej mrugać cząsteczkami. Linia laserowa 488 sprzężona z laserem wzbudzającym 561 o maksymalnej intensywności zwiększa zarówno szybkość włączania, jak i wyłączania fluoroforów, podczas gdy linia laserowa 405 zwiększa tylko szybkość włączania.
  16. Przerwij akwizycję, gdy zostanie osiągniętych więcej niż 500 000 lokalizacji (po około 20 000 klatek) lub więcej, gdy nie ma już mrugających cząsteczek. Zapisz nieprzetworzone dane akwizycji STORM w formacie .czi.
    nuta: Zawsze zaczynaj od wyższej długości fali, aby uniknąć blaknięcia (lub aktywacji) innych kolorów. Ponieważ komora fazowa nie jest uszczelniona, możliwa jest regularna wymiana bufora obrazowania, np. w celu zbadania różnych warunków buforowania. Użycie linii laserowej 488 do wyczerpania barwników Alexa 555 jest konieczne tylko wtedy, gdy moc lasera 561 jest ograniczona (w przypadku laserów 100 mW).

7. Rekonstrukcja obrazu (5 min)

  1. W narzędziu PAL-Drift użyj typu Korekcja oparta na modelu z automatycznymi segmentami o maksymalnym rozmiarze 8. Naciśnij przycisk Zastosuj kilka razy z rzędu, aż dryft zostanie skorygowany. Ta poprawka oparta na modelu stosuje algorytm oparty na analizie korelacji krzyżowej, który koryguje dryft.
  2. Korzystając z narzędzi PAL-Filter, popraw wygląd obrazu STORM, wybierając tylko te cząsteczki, które były najlepiej zlokalizowane. Na przykład ogranicz dokładność lokalizacji do 30 nm, a PSF do 120-180 nm.
  3. W narzędziu do renderowania PAL należy użyć rozdzielczości pikseli 5 lub 10 nm, a także trybu wyświetlania Gaussa ze współczynnikiem rozszerzalności 1 PSF. Wybierz opcję Renderuj zakres automatycznej dynamiki HR z wartością 95% i Renderuj zakres automatycznej dynamiki SWF z wartością 90%. Wybierz opcję Renderuj najlepszą jakość.
  4. Wybierz opcję PALM convert (Konwersja PALM) w menu PALM na karcie Processing (tryb przetwarzania końcowego). Naciśnij przycisk Wybierz, a następnie Zastosuj. Zapisz utworzony obraz w formacie. LSM (a nie .czi, bardzo ważne).
    nuta: Rekonstrukcję obrazu można wykonać natychmiast po akwizycji lub później przy użyciu trybu przetwarzania obrazu w oprogramowaniu do akwizycji. W trybie post-processingu off-line możliwa jest ponowna analiza stosów z różnymi wartościami parametrów (wielkość maski szczytowej, intensywność piku do szumu). Zawsze wybieraj opcję "odrzuć nakładające się cząsteczki", a nie "uśrednij przed lokalizacją".

8. Oszacowanie precyzji lokalizacji obrazu STORM (10 min)

  1. Otwórz dane RAW STORM i użyj karty Przetwarzanie obrazu. Wybierz metodę PALM, a następnie ponownie PALM. Naciśnij przycisk Select (Wybierz).
  2. Naciśnij Zastosuj, aby rozpocząć rekonstrukcję przy użyciu maski o rozmiarze piku 9 i intensywności szczytowej do szumu 6 (lub parametrów wybranych dla obrazu).
  3. Wybierz narzędzie Grafika prostokątna i narysuj prostokąt na surowym obrazie wokół pojedynczej cząsteczki znajdującej się na powierzchni szkła. Zwykle znajduje się tam kilka pojedynczych cząsteczek.
  4. Naciśnij ponownie Zastosuj, a analizowane będą tylko cząsteczki obecne w obszarze prostokąta.
  5. W narzędziu PAL-Statistics wybierz Typ wykresu: histogram i Źródło histogramu: pozycja X lub pozycja Y, aby wyświetlić histogramy pozycji.
  6. Zapisz tabelę z listą lokalizacji po lewej stronie pod obrazami.
  7. Korzystając z oprogramowania do analizy danych, utwórz histogramy pozycji X i Y (Rysunek 1D).
  8. Dopasuj rozkłady do wartości Gaussa i zapisz σ wartościX i σY. Precyzja lokalizacji σSMLM jest szacowana przez (σX*σY)^0.5.
  9. Powtórz krok 8.3-8.8 na jak największej liczbie cząsteczek i uśrednij σSMLM

9. Rejestracja kanału (5 min)

  1. Otwórz obraz STORM dla każdego koloru za pomocą oprogramowania Fiji (Image J).
  2. Wybierz narzędzie różdżki, aby zmierzyć położenie każdego koralika tetraspeck.
  3. Oblicz przesunięcia X i Y dla każdego ściegu i uśrednij je.
  4. Użyj polecenia "Tłumacz", aby przetłumaczyć drugi obraz z obliczonymi przesunięciami X i Y.
  5. Scal oba obrazy za pomocą polecenia Scal kanały.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do uzyskania reprezentatywnych wyników przedstawionych poniżej użyto mikroskopu wyposażonego w lasery półprzewodnikowe o długości fali 50 mW 405 nm i 100 mW 488, 561 i 642 nm, kamerę EMCCD 512x512, obiektyw alpha Plan Apo 100X/1.46 oraz filtry emisyjne Band Pass 570-650 / Long Pass 655

.

Rysunek 1A przedstawia przykład gęstości cząsteczek i stosunku sygnału do szumu, które powinny być używane podczas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokole

Przedstawiamy tutaj protokół, który minimalizuje artefakty w obrazach dSTORM mikrotubul i IF w komórkach glejowych. Artefakty mogą powstawać na każdym etapie przygotowania i obrazowania próbki: utrwalanie, blokowanie, znakowanie immunologiczne, dryf podczas akwizycji, nieoptymalne warunki mrugania23. Poniżej wymieniamy najważniejsze kroki.

Czyszczenie szkiełek nakrywkowych jest ważnym krokiem w kie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mickaelowi Lelekowi, Orestisowi Faklarisowi i Nicolasowi Bourgowi za owocną dyskusję, Andreyowi Aristovowi i Elenie Rensen za pomoc w technice super-resolution oraz Shailaji Seetharaman za uważne przeczytanie rękopisu. Z wdzięcznością dziękujemy firmie UtechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech z Instytutu Pasteura (Paryż, Francja), a także sieci infrastruktury France-BioImaging wspieranej przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-10-INSB-04; Inwestycje dla przyszłości) oraz Région Ile-de-France (program Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) na wykorzystanie mikroskopu Elyra. Prace te były wspierane przez Ligue Contre le Cancer i Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-16-CE13-0019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Minimum Essential Podłoża (MEM)Gibco41090-028hodowla komórkowa
aminokwas endogennyGibco1140-050hodowla komórkowa 1/100e
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122hodowla komórkowa 1/100e
Fœ tal Surowica bydlęcaGibco10270-106hodowla komórkowa 1/10e
0,05 % Trypsyna-EDTA (1X)Gibco25300-054hodowla komórkowa
PBS 10xfischer scientific11540486
szkiełko nakrywkowe do hodowli komórkowych 18 mm n° 1,5HMarienfield/Dominic dutsher900556szkiełka nakrywkowe,
roztwór paraformaldehydu (PFA)SigmaF8775utrwalanie komórek
aldehyd glutarowySigmaG5882utrwalanie komórek
tryton X100SigmaT9284niejonowy środek powierzchniowo czynny. Służy do utrwalania komórek
borowodorek sodu (NaBH4)Sigma452904-25MLutrwalanie komórek
BSASigmaA7906pasywacja próbki 3% w PBS
Przeciwciało monoklonalne anty-wimentynowe (V9) wytwarzane u myszyPrzeciwciała pierwszorzędoweSigmaV6630
Szczura anty alfa tubulinaPrzeciwciała
pierwszorzędowe Biorad MCA77GKozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555Fisher naukowe10635923przeciwciała drugorzędowe
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysi IgG (H + L), Alexa Fluor 647Fisher naukowe10226162przeciwciała drugorzędowe
TetraSpeck Mikrosfery, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwonyKoraliki fluorescencyjneFisher scientificT7279
Komora magnetyczna ChamlideLive Cell InstrumentCM-B18-1magnetyczny uchwyt na próbkę, maksymalna objętość 1,2 ml
Cysteamina (MEA)Sigma30070dla buforu
oksydazy glukozowej z Aspergillus nigerSigmaG0543dla bufora
glukozasigmadla buforu mrugającego
katalaza z wątroby bydlęcejSigmaC9322dla buforu
Tris (trizma)SigmaT1503dla bufora
Stojak na szkiełka nakrywkowe Wash-N-DrySigmaZ688568
ParafilmMyjkafolii parafinowejP7793-1EA
Fisher scientific15-335-6
myjka plazmowaHarrick plazmaPDC-32G-2
, , , , , , ultradźwiękowa z Sigma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924(2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004(2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933(2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie dSTORMdwukolorowy STORMfilamenty vimentynysieci cytoszkieletoweprzygotowanie pr bekrekonstrukcja obrazumikroskopia fluorescencyjnamikroskopia supernowoczesna

Powiązane artykuły