Tutaj prezentujemy protokół do analizy składu białkowego dużych natywnych kompleksów białko:białko i białko:kwasy nukleinowe z łyka rzepakowego (B. napus) przy użyciu metody elektroforezy 3D w żelu poliakrylamidowym (PAGE) łączącej niebieski natywny (BN) z dwoma denaturującymi PAGE, a następnie identyfikacją spektrometryczną mas.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pobieranie próbek łyka z wyższych roślin jest często pracochłonne i znacząco zależne od gatunku rośliny. Jednak badania proteomu w warunkach denaturacji można przeprowadzić na różnych gatunkach roślin. Natywne kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy z próbek łyka nie zostały jeszcze prawie przeanalizowane, chociaż mogą odgrywać ważną rolę w utrzymaniu tego wyspecjalizowanego przedziału lub w sygnalizacji na duże odległości. Duże zespoły molekularne można izolować za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy żelowej (BN-PAGE). Ich składniki białkowe mogą być oddzielone przez kolejny dodecylosiarczan sodu PAGE (SDS-PAGE). Jednak białka o podobnej masie cząsteczkowej komigrują, co może utrudniać identyfikację białek za pomocą spektrometrii mas. Połączenie BN-PAGE z dwoma różnymi etapami elektroforezy żelowej denaturacji, a mianowicie Tris-Tricine-urea i SDS-PAGE, umożliwia dodatkową separację białek w zależności od ich hydrofilowości/hydrofobowości, a tym samym zwiększa rozdzielczość i powodzenie identyfikacji białek. Pozwala nawet na rozróżnienie białek, które różnią się tylko modyfikacjami potranslacyjnymi. Ponadto niebieski natywny northern blot może być stosowany do identyfikacji składników RNA w kompleksach makromolekularnych. Pokazujemy, że nasz protokół jest odpowiedni do rozwikłania składników białkowych i RNA natywnych kompleksów białkowo-białko i rybonukleoproteiny (RNP) występujących w próbkach łyka. Połączenie niebieskiej natywnej PAGE z dwoma różnymi etapami denaturacji PAGE może pomóc w oddzieleniu różnych rodzajów dużych kompleksów białkowych, a także umożliwia zwiększoną szybkość identyfikacji ich składników za pomocą spektrometrii mas. Co więcej, protokół jest wystarczająco solidny, aby jednocześnie wykrywać potencjalnie związane kwasy nukleinowe w pojedynczych kompleksach białkowych.
Wprowadzenie
Długodystansowe kanały łyka są niezbędne do alokacji organicznych składników odżywczych w wyższych roślinach, ale są również zaangażowane w regulację wielu różnych procesów ważnych dla wzrostu i rozwoju, obrony przed patogenami i adaptacji do niekorzystnych warunków środowiskowych. Oprócz małych efektorów, takich jak jony, fitohormony lub same metabolity, makrocząsteczki, takie jak białka i RNA, pojawiły się ostatnio jako potencjalne sygnały.
Badania wykazały, że obciążenie białek łykiem jest zależne od wielkości i kontrolowane przez limit wykluczenia wielkości (SEL) jednostek porowo-plazmodowych łączących komórki towarzyszące (CC) i elementy sita (SE), które zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 10 do >67 kDa1,2,3. Jednak pomimo tych ograniczeń wielkości w systemie łyka znaleziono większe białka i kompleksy białkowe, co podważa ideę wykluczania rozmiaru4, a nawet sugerowano niespecyficzną utratę białek z CC do SE5.
Kompleksy wielobiałkowe oraz duże kompleksy rybonukleoproteinowe odgrywają kluczową rolę w biosyntezie i utrzymaniu integralności strukturalnej komórki6. Istnieją dowody na istnienie kompleksów białkowo-białkowo-białkowych i rybonukleoproteinowych w łyku4,7, ale do tej pory niewiele wiadomo o ich funkcji. W elementach sita łyka kompleksy białkowo-białko i RNP są zaangażowane w transport na duże odległości i/lub sygnalizację8,9. Aby rozwikłać funkcje translokowanych kompleksów, konieczne jest zbadanie ich składu w różnych warunkach środowiskowych lub stresowych. Aby to osiągnąć, natywne kompleksy muszą zostać odizolowane, a ich komponenty muszą zostać oddzielone z odpowiednią rozdzielczością.
Aby wyizolować z łyka kompleksy o dużej masie cząsteczkowej, najpierw konieczne jest uzyskanie próbek soków o wystarczającej jakości i ilości. Technika, którą można zastosować do pobierania próbek łyka, zależy od gatunku rośliny będącego przedmiotem zainteresowania. Istnieją trzy główne metody pozyskiwania soku z łyka 10: styl owadów11, wysięk ułatwiony przez EDTA12 i spontaniczny wysięk13.
Próbki łyka z Arabidopsis thaliana (A. thaliana), głównej rośliny modelowej w laboratoriach na całym świecie, mogą być uzyskane tylko przez wysięk wspomagany EDTA lub stylektomię mszyc14,15. Obie metody prowadzą do uzyskania albo silnie rozcieńczonego soku łyka, albo bardzo małych ilości próbki. Wysięk wspomagany przez EDTA jest również podatny na zanieczyszczenie i może nie reprezentować prawdziwego składu łyka16. Spontaniczny wysięk łyka jest ograniczony do gatunków roślin, takich jak dyniowate, łubin czy juka, gdzie odcięcie części rośliny prowadzi do spontanicznej emisji soku łyka, który można łatwo zebrać13,17,18,19. Niedawno ustaliliśmy, że rzepak oleisty (Brassica napus) jest odpowiednim systemem modelowym do analizy łyka, ponieważ jest bliskim krewnym A. thaliana i kilka mikrolitrów soku łyka można uzyskać z małych nacięć, które wykazały wysoką czystość4,8,20. Co więcej, sekwencja genomu B. napus została opublikowana w 2014 roku21.
Z wyjątkiem stylektomii mszyc, wszystkie opisane metody pobierania łyka obejmują uszkodzenie otaczającej tkanki w miejscu pobierania próbek, a skład soku z łyka może ulec zmianie w odpowiedzi na uraz. Dlatego tak ważne jest sprawdzenie jakości próbek łyka, niezależnie od zastosowanej metody pobierania próbek. Istnieją różne metody kontroli jakości pobranego soku łyka, np. poprzez oznaczanie aktywności RNazy22,23, RT-PCR ze starterami przeciwko Rubisco8,24, lub analiza składu cukru8.
Można zastosować różne metody izolowania i rozdzielania kompleksów białkowych, w tym chromatografię wykluczania wielkości, ultrawirowanie gęstości sacharozy, czy filtrację próbek przez membrany z wyraźnymi granicami masy cząsteczkowej. Jednak te podejścia nie pozwalają na wysoką rozdzielczość. Technika zwana niebieską natywną stroną (BN-PAGE), po raz pierwszy opisana przez Schäggera i wsp. 25, jest lepszy pod względem rozdzielczości. Z powodzeniem wykorzystano go do określenia mas cząsteczkowych dużych natywnych kompleksów białkowych z różnych organelli lub z lizatów komórkowych oraz ich względnej liczebności26,27.
Aby dokładniej wyjaśnić złożony skład kompleksów białkowych, konieczne jest rozdzielenie poszczególnych składników w warunkach denaturacji, co prowadzi do całkowitego rozkładu składników kompleksu. Można to osiągnąć za pomocą drugiego wymiaru SDS-PAGE 28,29 lub, w celu uzyskania wyższej rozdzielczości, drugiego wymiaru ogniskowania izoelektrycznego (IEF), po którym następuje trzeci wymiar SDS-PAGE30 i późniejszej identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas.
W tym protokole opisujemy pobieranie próbek czystego soku z łyka z roślin B. napus oraz analizę kompleksów białkowych z takich próbek łyka przy użyciu elektroforetycznego podejścia 3D łączącego BN-PAGE z Tris-Tricine-urea-PAGE i SDS-PAGE. Oddzielone składniki kompleksu białkowego są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Ponadto wprowadzamy blue native northern blotting jako metodę pozwalającą na wykrywanie RNA w dużych kompleksach RNP 4, rozszerzając możliwości zastosowania tego podejścia.
Protokół
1. Pobieranie próbek i przygotowanie soku z łyka z roślin B. napus 4,8,20
- Do pobierania próbek soku z łyka należy używać dobrze nawodnionych 8-tygodniowych roślin B. napus, które wykazują tylko początkowe kwitnienie, aby zapobiec zanieczyszczeniu pyłkiem.
- Za pomocą igły podskórnej (Ø 0,8 mm) kilkakrotnie nakłuć łodygę kwiatostanu. Powtórz na kilku innych łodygach kwiatostanowych i na innych roślinach, aby uzyskać wystarczającą ilość soku z łyka (Rysunek 2a).
UWAGA: W przypadku złożonej analizy zaleca się rozpoczęcie od co najmniej 600 μl soku łyka. 4 do 5 roślin da od 200 do 700 μl soku łyko. - Zetrzyj pierwszą kroplę z uszkodzonych miejsc bibułą filtracyjną. Krople te zawierają głównie silnie zanieczyszczony materiał z otaczającej uszkodzonej tkanki i należy je wyrzucić.
- Zebrać następujące krople przez pipetowanie i przechowywać zebrany wysięk we wstępnie schłodzonej stożkowej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C, korzystając z systemu chłodzenia bez lodu.
- Kontynuuj zbieranie, aż nie będzie można zaobserwować dalszego tworzenia się kropli, ale nie dłużej niż 1 godzinę. Procedurę tę można powtórzyć po dwóch dniach bez znacznej utraty zebranego soku łyka.
UWAGA: Zebrany sok z łyka można natychmiast wykorzystać lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy. W celu przechowywania w temperaturze -80 °C należy zamrozić szokowo rurkę reakcyjną w ciekłym azocie. - Zagęścić próbkę łyka do około 1/6początkowej objętości za pomocą koncentratorów odśrodkowych o odciętej masie cząsteczkowej (MWCO) 10 000 daltonów (Da). Odwirować zagęszczoną próbkę w temperaturze 4 °C i o masie 20 000 x g przez co najmniej 15 minut w celu usunięcia cząstek pyłu.
UWAGA: Stężenie soku łyka nie prowadzi do znacznej utraty białek. - W przypadku późniejszej złożonej analizy przejdź do kroku 3.1.
2. Kontrola czystości soku łyka za pomocą odwrotnej transkryptazy PCR (RT-PCR) 4,8,20
- Wyizolować całkowity RNA z soku łyka przy użyciu standardowej metody ekstrakcji RNA dla materiału ciekłego (np. ekstrakcja trizolem lub fenolem i chloroformem, a następnie wytrącanie izopropanolu z fazy wodnej i etapy płukania etanolem zgodnie z protokołem producenta).
Uwaga: Chloroform fenolowy jest toksyczny. Pracuj pod maską z odpowiednimi środkami ochrony osobistej. Wyekstrahowany RNA może być przechowywany w etanolu w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy. - Usunąć zanieczyszczenie DNA przez trawienie za pomocą DNazy I (1 u/μg) przez 45 minut w temperaturze 37 °C i dezaktywować enzym przez dodanie EDTA do końcowego stężenia 5 mM i inkubować próbkę w temperaturze 75 °C przez 10 minut.
- Aby uzyskać czyste RNA, należy oczyścić i zagęścić próbkę w kolejnym etapie oczyszczania (np. przy użyciu zestawów do oczyszczania RNA, zgodnie z instrukcjami producenta).
- Wykonaj PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) w celu syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA przy użyciu 150 ng czystego RNA, zgodnie z opisem w protokole producenta.
UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. - Użyć 5 μl cDNA jako matrycy do standardowej reakcji PCR zgodnie ze specyfikacją producenta, w celu amplifikacji transkryptów specyficznych dla przedziału i sprawdzenia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Potwierdzić czystość próbek łyka, np. stosując startery do małej podjednostki rubisco, tioredoksyny h i białka okrywy pyłkowej (Rysunek 1b, Tabela 1).
3. Niebieska natywna strona 4,25,26,31
- Używaj samodzielnie nalewanych natywnych żeli gradientowych, jak opisano w innym miejscu27 lub komercyjnych żeli gradientowych Bis-Tris.
- Nałożyć na żel co najmniej trzy razy 20–30 μg zagęszczonej próbki białka na studzienkę. Uruchomić żel w temperaturze 4 °C i napięciu 150 V, używając ciemnoniebieskiego buforu katodowego B i buforu anodowego (Tabela 2), aż próbka przejdzie przez 1/3 żelu (ok. 20 do 30 minut, Rysunek 3a).
- UWAGA: W przypadku northern blotting wystarczy pojedynczy pas żelu, natomiast do analizy składu białek za pomocą 3D PAGE i spektrometrii mas zaleca się połączenie tego samego pasma z maksymalnie dziesięciu pasów żelowych w celu skoncentrowania mniej obfitych białek.
- Wstrzymać przebieg i wymienić ciemnoniebieski bufor katodowy B na jasnoniebieski bufor katodowy B/10 (Tabela 2) i kontynuować przebieg. Zakończ przebieg żelu, gdy niebieski front zacznie wymywać się z żelu (ok. 120 do 180 min, Rysunek 3a).
UWAGA: Gotowy niebieski żel natywny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień. Długotrwałe przechowywanie może prowadzić do powstawania pasm rozproszonych i należy tego unikać. Ciemnoniebieski bufor B może być ponownie użyty.
4. OPCJONALNIE: Wykrywanie RNA za pomocą niebieskiego natywnego północnego blottingu 4
- Wytnij wyraźne pasma lub użyj całego pasa żelu z niebieskiego natywnego żelu i przenieś je na nylonową membranę za pomocą półsuchego osuszania w temperaturze 3,5 mA/cm2 przez 60 minut i zaznacz górną i dolną granicę żelu ołówkiem na membranie (Rysunek 4a).
- Po osuszeniu umyj membranę wodą uzdatnioną przez DEPC i wysusz między dwiema bibułami filtracyjnymi.
- Wykonać sieciowanie UV bibułowanej membrany za pomocą 120 000 μJ/cm2 (85 s, jeśli używasz środka sieciującego w tabeli materiałów).
- Wstępnie zhybrydyzować membranę za pomocą 6 ml buforu hybrydyzacyjnego (komercyjnego lub własnej produkcji) przez 60 minut w temperaturze 68 °C w piecu do hybrydyzacji (Rysunek 4a).
- Dodać dodatkowy 1 ml buforu hybrydyzacyjnego zawierającego 4 μl sond 3'-biotynylowanych (100 nM).
- Inkubować membranę z sondą przez noc, schładzając piec z 68 °C do 37 °C.
- Przemyć membranę buforem zawierającym 2x SSC i 0,1% SDS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć niespecyficznie związane sondy.
Uwaga: SDS może powodować podrażnienia. Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny podczas pracy z roztworami zawierającymi karty charakterystyki i karty charakterystyki. - Przeprowadzić detekcję sond 3'-biotynylowanych na membranie, np. za pomocą koniugatu Streptawidyna-HRP i luminolu jako substratu peroksydazy chrzanowej (HRP), co daje czułą reakcję chemiluminescencyjną (Rysunek 4a).
5. Drugi wymiar: Tris-Tricine-mocznik PAGE 4,28
- Wyciąć pojedyncze pasma z niebieskiego natywnego żelu. Połącz pasma z próbek biegnących równoległymi pasami, aby uzyskać dalsze stężenie złożonych białek (Rysunek 5).
UWAGA: Wycięte pasma mogą być przechowywane w pojedynczych probówkach reakcyjnych do czasu dalszego użycia w temperaturze 4 °C. - Wlać 12 % żel Tris-Tricine-mocznik (grubość 1 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (szerokość x długość)). Przygotować 10 ml roztworu żelu A dla żelu rozdzielającego (Tabela 2), wlać między dwie szklane płytki i nałożyć na izopropanol. Usuń izopropanol po zakończeniu polimeryzacji i przenieś 4 ml roztworu żelu B (Tabela 2) dla żelu do układania na żel i włóż 10-dołkowy grzebień.
Uwaga: Niespolimeryzowany akryloamid może być neurotoksyczny, a TEMED jest szkodliwy w przypadku wdychania. Zawsze noś środki ochrony osobistej i pracuj pod maską. - Przenieś wycięte pasma żelu do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dodaj 1 ml buforu do próbek 2x SDS w celu zrównoważenia kawałków żelu (Rysunek 5, Tabela 2).
- Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie gotować w bloku grzewczym (95 °C) lub w kuchence mikrofalowej, a następnie ponownie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez kolejne 15 minut.
- Ułóż kilka zrównoważonych kawałków żelu reprezentujących ten sam kompleks w jednej kieszeni żelowej.
- Przeprowadzić elektroforezę przy użyciu anodowych i katodowych pracujących pod napięciem 150 V przez 45 do 60 minut i wyciąć cały pas żelowy.
- Inkubować przecięty pas przez 20 minut w kwaśnym buforze (100 mM Tris, 100 mM kwasu octowego) i równoważyć w 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 przez kolejne 20 minut (Rysunek 5).
6. Trzeci wymiar: SDS-PAGE 4,32
- Wlać 15 % żel separujący SDS zgodnie z Laemmli32 (grubość: 1,5 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (szerokość x długość)) (Tabela 2) i dodać cienką warstwę 4 % żelu do układania powyżej.
Uwaga: SDS, akryloamid i TEMED są toksyczne i szkodliwe. Pracuj pod maską i noś środki ochrony osobistej. - Przenieść zrównoważony pas żelu na żel SDS i pokryć żel 0,5% (w/w) agarozą w 1x buforze do pracy SDS uzupełnionym śladem błękitu bromofenolowego (Rysunek 5).
- Zagotuj bufor SDS z agarozą w kuchence mikrofalowej przed załadowaniem do żelu.
- W celu uruchomienia markera białkowego w celu oszacowania masy cząsteczkowej poszczególnych składników, włóż kawałek bibuły filtracyjnej na jeden koniec żelu, aż agaroza zestali się lub użyj specjalnego grzebienia zwykle używanego do żeli IPG.
- Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 60 minut i zabarwić żel koloidalnym barwnikiem Coomassie, barwnikiem srebrnym lub inną metodą barwienia odpowiednią do późniejszej analizy spektrometrii mas.
- Analizuj widoczne plamki białkowe za pomocą metod spektrometrii mas, takich jak matrycowa desorpcja/jonizacja laserowa w czasie przelotu (MALDI-TOF) lub spektrometria mas LC-MS/MS.
UWAGA: Zalecamy użycie koloidalnego barwienia Coomassie, jak już opisano33. W naszych rękach nawet mniej obfite białka mogą być wystarczająco wybarwione i umożliwiają analizę spektrometryczną mas z rozsądną jakością danych.
Wyniki
Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala na analizę kompleksów białko:białko, jak również białko:RNA w próbkach łyka z Brassica napus. Przebieg pracy jest zilustrowany w Rysunek 1. Jedną z głównych zalet B. napus w porównaniu z innymi organizmami modelowymi jest możliwość stosunkowo łatwego pobrania próbki łyka z małych nakłuć w łodydze kwiatostanu. Pozwala to na uzyskanie czystych próbek łyka w porównywalnie dużych ilościach. Podczas pobierania próbki łyka zawsze zaleca się sprawdzenie, czy nie ma zanieczyszczeń, na przykład za pomocą RT-PCR8. Reprezentatywny wynik uzyskany z czystej próbki łyka jest przedstawiony na Rysunek 2. W próbkach niezanieczyszczonego łyka powinno być widoczne prążki dla tioredoksyny h, natomiast nie powinien pojawić się żaden sygnał dla rubisco i białka okrywy pyłkowej. Mała podjednostka rubisco może służyć jako kontrola w próbkach z liści, łodyg kwiatostanów lub pyłku. Tioredoksyna h powinna być wykrywalna we wszystkich próbkach, ponieważ jej mRNA znaleziono w łyku różnych gatunków, podczas gdy transkrypt białka płaszcza pyłkowego powinien być widoczny tylko w próbkach pąków kwiatowych. Do zanieczyszczeń może dojść, gdy pobieranie próbek łyka odbywa się na roślinach w pełni kwitnących (białko okrywy pyłkowej) lub gdy pierwsze kropelki z nakłuć próbki łyka nie są prawidłowo usuwane (rubisco).
Przed BN-PAGE obowiązkowe jest zagęszczenie soku łyka. Stosując od 20 do 30 μg białka na studzienkę, co najmniej cztery główne prążki kompleksu białkowego stają się widoczne po BN-PAGE soku łyka B. napus, zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenia nie pozwalają na wyraźne rozdzielenie kompleksów (Rysunek 3). Zaleca się załadowanie kilku pasm żelowych reprezentujących ten sam kompleks do jednej kieszeni żelu drugiego wymiaru w celu dalszego zagęszczenia białek z każdego pojedynczego kompleksu do dalszego przetwarzania i późniejszej identyfikacji spektrometrii mas.
Aby zidentyfikować poszczególne składniki kompleksów makromolekularnych łyka, połączyliśmy początkowy BN-PAGE z drugim wymiarem Tris-Tricine-mocznik i trzecim wymiarem SDS-PAGE, aby uzyskać separację pojedynczych białek. W tym przypadku można zaobserwować separację o wysokiej rozdzielczości ze względu na różne zachowania związane z migracją białek w żelach mocznikowych i SDS-PAGE. Zazwyczaj białka należące do pojedynczego kompleksu będą widoczne jako ukośna linia w poprzek żelu. Białka powyżej tej linii mają zwiększoną hydrofobowość, podczas gdy białka poniżej linii reprezentują białka bardziej hydrofilowe28 (Rysunek 5, Rysunek 6).
Do scharakteryzowania kompleksów RNP użyliśmy części żelu BN-PAGE do przeprowadzenia północnego blottingu BN. Po osuszeniu całego pasa na membranie nylonowej i usieciowaniu promieniowaniem UV, RNA można zobrazować za pomocą sond specyficznych dla RNA, jak pokazano na Rysunek 4. Tutaj pokazano, że specyficzne tRNA jest obecne tylko w jednym określonym kompleksie. Składniki białkowe tego kompleksu wiążącego tRNA mogą być dalej badane przy użyciu opisanego powyżej podejścia żelowego 3D. Analizy spektrometryczne mas wykazały, że kompleks ten zawiera głównie ligazy tRNA, co potwierdza aktywność wiązania tRNA stwierdzoną przez BN northern blot.
Rysunek 1: Przebieg pracy analizy kompleksów rybonukleoproteinowych w soku łyko rzepaku. Po pobraniu próbek i przygotowaniu próbek łyka, BN-PAGE przeprowadza się w celu wydzielenia kompleksów natywnych. Takie żele BN-PAGE umożliwiają równoległą analizę kwasów nukleinowych metodą BN northern blot oraz identyfikację składników białkowych kompleksów za pomocą spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Pobieranie próbek i kontrola czystości soku łyka B. napus. Po nakłuciu łodygi kwiatostanu 8-10-tygodniowych roślin rzepaku za pomocą sterylnej igły podskórnej, wysięk zbiera się pipetą i przenosi do lodowatej probówki reakcyjnej (a) W celu potwierdzenia czystości próbek łyka przeprowadza się RT-PCR, amplifikując transkrypty tioredoksyny h, małej podjednostki rubisco i białka okrywy pyłkowej w próbkach specyficznych tkankowo (b) RT-PCR bez odwrotnej transkryptazy przeprowadzono jako kontrolę (-). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: BN-PAGE. Schematyczne przedstawienie niebieskiego natywnego PAGE ze skoncentrowanymi próbkami łyka B. napus. (a) Po załadowaniu gradientowego żelu białkowego 15-20 μl stężonego soku łyka, BN-PAGE przeprowadza się z 1x ciemnoniebieskim buforem katodowym B przy 150 V przez 20 - 30 minut w chłodni. Następnie bufor jest wymieniany na 1x jasnoniebieski bufor katodowy B/10 i PAGE jest kończony przy 150 V przez 120 - 180 minut, aż ciemnoniebieski front biegnący skończy się z żelu. Żele BN-PAGE mają cztery wyraźne prążki reprezentujące cztery różne kompleksy o dużej masie cząsteczkowej. (b) Zbyt małe (c) lub zbyt duże (d) białka łyka zmniejsza widoczność poszczególnych kompleksów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 4: BN northern blot. Schematyczne przedstawienie metody blottingu BN northern blot. (a) Pas BN-PAGE jest przenoszony na nylonową membranę za pomocą półsuchego blottingu. Po sieciowaniu UV i wstępnej hybrydyzacji, błona jest inkubowana za pomocą sond specyficznych dla RNA (tutaj sondy specyficznej dla tRNA metioniny), które są biotynylowane na końcu 3' w piecu hybrydyzacyjnym przez noc. Wolne sondy są usuwane przez etapy mycia, a wykrywanie RNA odbywa się za pomocą koniugatu streptawidyna-HRP i luminolu. Stosując to podejście, zaobserwowaliśmy, że kompleks IV z BN-PAGE zawiera tRNA metioniny. (b) Barwiony żel Coomassie i tRNA blot przypominają dwa różne pasy żelu biegnące równolegle, aby uniknąć różnic w migracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: STRONA 3D. Schematyczne przedstawienie podejścia 3D-PAGE. Kilka prążków z tego samego kompleksu wycina się z żelu BN-PAGE, inkubuje w buforze ładującym i przenosi do jednej studzienki drugiego wymiaru Tris-Tricine-urea-PAGE. Po elektroforezie wycina się całe pasy żelu, przemywa w buforze kwasu kwaśnego, wyrównuje i umieszcza na 15% żelu SDS-PAGE. Po trzecim wymiarze PAGE, oddzielone białka są barwione Coomassie i analizowane za pomocą spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki po 3D-PAGE. W obrębie pierwszego wymiaru BN-PAGE pojawiło się kilka kompleksów. Ich składniki białkowe mogą być dalej rozdzielane przez dwie kolejne denaturujące PAGE, co skutkuje ukośnym wzorem plamki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
| Sondy | kolejność |
| Tioredoksyna h | naprzód: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC rewers: ATGGCCTGAACATCGAACTC |
| Mały łańcuszek Rubisco | forward: TTCACCGGCTTGAAGTCATC rewers: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT |
| Pyłek białka płaszcza BRU77666 | naprzód: TCAGAACTGGAGCTTCAACG rewers: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG |
Tabela 1: Startery używane do kontroli czystości próbki łyka. Aby potwierdzić czystość próbki łyka, do amplifikacji cDNA można zastosować startery specyficzne dla małego łańcucha rubisco, tioredoksyny h i białka płaszcza pyłkowego.
| i roztwory | Treść | komentarz | |
| ciemnoniebieski bufor katodowy B | 15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine 0,02% (w/v) Coomassie niebieski G250 | przepis zaczerpnięto z Fiala et al. 17 pH należy dostosować do 7,0 Bufor może być wykonany jako 10x kolba | |
| jasnoniebieski bufor katodowy B/10 | 15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine 0,002% (w/v) Coomassie niebieski G250 | Bufor można przygotować przez rozcieńczenie buforu katodowego B buforem katodowym bez Coomassie | |
| Bufor anodowy | 50 mM Bis-Tris pH 7,0 | Bufor może być przygotowany jako 10x roztwór podstawowy | |
| 2x bufor do pobierania próbek SDS | 125 mM Tris-HCl pH 6,8 4% SDS 20% glicerolu 0,2 mln naziemnej telewizji cyfrowej 0,02% (m/v) błękit bromofenolowy | ||
| Bufor transferowy 1x bufor TBE | 89 mM Tris pH 7,6 89 mM kwas borowy 2 mM EDTA | Bufor TBE może być wykonany i przechowywany w postaci zapasów 5x lub 10x. Ważne jest, aby używać wody dejonizowanej wolnej od RNaz. | |
| 2x bufor SSC | 300 mM NaCl 30 mM Na3cytrynian pH 7,0 | ||
| 3x bufor żelowy | 3 M Tris 1 M HCl 0,3% SDS Odczyn pH 8,45 | przepis zaczerpnięty z Schägger 19 | |
| Tris-Tricyna żel roztwór A | Dla 10 ml: 30% akrylamid-bisakryloamid (29:1) 3,34 ml 6 M Mocznik 3x bufor żelowy 3,34 mL 70% glicerol 1,4 ml dodać ddH2O do 10 ml 10% APS 40 μL TEMED 4 μL | Odważyć 6 M mocznika i dodać 3x bufor żelowy, roztwór akrylamidu i bisakryloamidu oraz 70% gycerolu. Podgrzać do 60 °C w łaźni wodnej w celu rozpuszczenia mocznika. Dodaj ddH2O do 10 ml, 10% APS i na koniec TEMED do polimeryzacji. | |
| Tris-Tricyna żel roztwór B | Dla 6 ml: 30% akrylamid-bisakryloamid (29:1) 0,8 ml 6 M Mocznik 3x bufor żelowy 1,5 ml dodać ddH2O do 6 ml 10 % APS 45 μL TEMED 4,5 μL | Odważyć 6 M mocznika i dodać 3x bufor żelowy i roztwór akrylamidu i bisakryloamidu. Podgrzać do 60 °C w łaźni wodnej w celu rozpuszczenia mocznika. Dodaj ddH2O do 10 ml, 10% APS i na koniec TEMED do polimeryzacji. | |
| 1x bufor biegowy Tris-Tricine (anoda) | 100 mM Tris 22,5 mM HCl pH 8,9 | przepis zaczerpnięty z Schägger 19 | |
| 1x bufor do pracy Tris-Tricine (katoda) | 100 mM Tris 100 mM Tricine 1% SDS Odczyn pH 8,25 | przepis zaczerpnięty z Schägger 19 | |
| Bufor kwasowy | 100 mM Tris 100 mM Kwas octowy | ||
| 4% żel do układania SDS | Dla 2 ml: ddH2O 1,4 ml 30% akrylamid-bisakryloamid (37,5:1) 0,33 ml 1 M Tris pH 6,8 0,25 mL 10% SDS 20 μL 10% APS 20 μL TEMED 2 μL | ||
| 15% żel separujący SDS | Dla 10 ml: ddH2O 2,3 ml 30% akrylamid-bisakryloamid (37,5:1) 5 ml 1,5 M Tris pH 8,8 2,5 mL 10% SDS 100 μL 10% APS 100 μL TEMED 4 μL | ||
| 1x bufor do biegania SDS | 25 mM Tris 192 mM glicyny 0,1% SDS | ||
| Roztwór do barwienia Coomassie | 5% (w/v) siarczan glinu-(14-18)-hydrat 10% (v/v) etanol (96%) 2% (v/v) kwas ortofosforowy (85%) 0,02% (w/v) Coomassie Błękit brylantowy G-250 | ||
| ULTRAhyb Ultraczuły bufor hybrydyzacyjny | Ambion, Technologie życiowe | ||
Tabela 2: Roztwory i receptury. Lista wszystkich i rozwiązań niezbędnych do analizy 3D-PAGE.
szt. ) szt. ) szt. ) pkt. Rozdział ) pkt. do pkt. ) pkt. Rozdział ) pkt. szt. Rozdział ) pkt. Rozdział ) pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. szt. Rozdział ) pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. Rozdział ) pkt.| Nr spotu. | MW obs. [kDa] | Identyfikacja | organizm | Nr akcesyjny | MW [kDa] | Punktacja MASCOT | |
| CIV_1 | 130 | Przypuszczalna odporność na choroby białko At4g19050 | B. napus (B. napus | CDX78917 | 131,1 pkt. | Rozdział 110 | |
| CIV_2 | 130 | Przypuszczalna odporność na choroby białko At4g19050 | B. napus (B. napus | CDX78917 | 131,1 pkt. | Rozdział 89 | |
| CIV_3 | 100 | Szok cieplny 70 kDa białko 14-podobne | B. napus (B. napus | XP_013748865 | 89,9 | Rozdział 113 | |
| CIV_4 | 90 | Współczynnik wydłużenia eukariotycznego 2 Białko kontrolujące podział komórkowy 48 homolog A | B. napus B. napus (B. napus | CDX90241 CDY41316.1 | 89.5 89,5 | 111 Rozdział 197 | |
| CIV_5 | Rozdział 85 | Białko szoku cieplnego 90-2-podobne | B. rapa | XP_009132342 | 79,8 | 172 Rozdział 172 | |
| CIV_6 | Rozdział 80 | Treonina--ligaza tRNA Glicyna - ligaza tRNA | B. oleracea B. napus (B. napus | XP_013599115 CDY43195 | 81.5 80,8 | 110 Rozdział 88 | |
| CIV_7 | 70 | Białko szoku cieplnego 70 kDa Lizyna - ligaza podobna do tRNA | B. oleracea B. napus (B. napus | XP_013685267 XP_013747530 | 67.8 69,9 | 230 150 | |
| CIV_8 | 65 | Mirozynaza Asparaginian - ligaza tRNA 2 Asparagina - ligaza tRNA 1 | B. napus B. napus B. napus (B. napus | ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126 | 60.6 61.6 63,5 | 183 141 Rozdział 153 | |
| CIV_9 | 60 | Mirozynaza | B. napus (B. napus | ABQ42337 | 60,6 | Rozdział 164 | |
| CIV_10 | 55 | Adenozylohomocysteinaza 2-podobna | B. rapa | XP_009135865 | 53,1 | Rozdział 139 | |
| CIV_11 | 55 | Współczynnik wydłużenia 1-alpha 1-like | B. oleracea (B. oleracea) | XP_013586115 | 51,9 | 161 | |
| CIV_12 | 50 | Liaza cystynowa podobna do CORI3 | B. napus (B. napus | XP_013653143 | 48,1 | Rozdział 237 | |
| CIV_13 | Rozdział 44 | Liaza cystynowa podobna do CORI3 | B. rapa | XP_009108611 | 48,3 | Rozdział 213 | |
| CIV_14 | 38 Rozdział 38 | aldolaza fruktozo-bisfosforanowa | B. rapa | XP_009115993 | 38,4 | 226 | |
| CIV_15 | Rozdział 45 | Liaza cystynowa podobna do CORI3 | B. rapa | XP_009108611 | 48,3 | Rozdział 219 | |
| CIV_16 | Rozdział 45 | Liaza cystynowa CORI3 | B. rapa | CDY69765 | 46,9 | Rozdział 209 | |
| CIV_17 | 38 Rozdział 38 | aldolaza fruktozo-bisfosforanowa | B. rapa | XP_009115993 | 38,4 | 124 | |
| CIV_18 | Rozdział 18 | peptydylo-prolil cis-trans izomeraza CYP18-3-podobna | B. napus (B. napus | XP_009101932 | Rozdział 18,3 | Rozdział 128 | |
| CIV_19 | Rozdział 45 | Liaza cystynowa podobna do CORI3 | B. rapa | XP_009108611 | 48,3 | Rozdział 177 | |
Tabela 3: Zidentyfikowane składniki białkowe z kompleksu IV. Kilka ligaz tRNA i innych białek znaleziono w kompleksie wiążącym tRNA za pomocą analizy spektrometrii mas MALDI-TOF po 3D-PAGE.
Dyskusja
Łyko jest przedziałem o dużym zainteresowaniu, ponieważ stanowi główną drogę transportową dla fotoasymilatów, a także jest niezbędne do sygnalizacji na duże odległości między różnymi częściami rośliny 9,20,34,35. Oprócz małych cząsteczek, makrocząsteczki, takie jak białka i RNA, są zaangażowane w utrzymanie łyka i sygnalizację 4,7,8. Analiza składu łyka jest ograniczona ze względu na ograniczoną dostępność próbek łyka u większości gatunków roślin. Technika sztyftu owadziego jest szeroko stosowana, ale wymagająca doświadczalnie i daje bardzo małe ilości próbek łyka11. Jedną z łatwych technik stosowanych do pobierania próbek łyka jest wysięk wspomagany EDTA12. EDTA chelatuje jony dwuwartościowe, takie jak wapń, a tym samym zapobiega zamykaniu się płytek sitowych przez białka P i modzele. Jest łatwy w użyciu, ale jest podatny na zanieczyszczenie uszkodzonymi komórkami, a próbki są rozcieńczane. Zubożenie jonów dwuwartościowych przez EDTA może również prowadzić do rozpadu istniejących kompleksów. Pozwala jednak na pobieranie próbek z szerokiej gamy gatunków, w tym z rośliny modelowej A. thaliana15. Spontaniczny wysięk soku łyka występuje tylko u niewielkiej liczby gatunków roślin. Jest to metoda inwazyjna, która wiąże się ze znacznym uszkodzeniem tkanek roślinnych10. Niedawno ustaliliśmy, że B. napus jest gatunkiem modelowym do badania transportu długodystansowego 4,8,20. Tutaj sok z łyka można pobrać z małych nacięć, co zmniejsza skutki zranień i źródła zanieczyszczenia.
Stosując różne techniki pobierania próbek, w ostatnich latach badano proteom próbek łyka z różnych gatunków roślin 7,8,17,36,37,38,39. W tych badaniach proteomu białka zostały wyekstrahowane i wytrącone w warunkach denaturacji, a zatem nie pozwalają na wyciągnięcie wniosków na temat interakcji białko-białko i białko:kwas nukleinowy występujących w warunkach natywnych. Koimmunoprecypitacja (CoIP) i testy nakładkowe wykazały, że główny kompleks rybonukleoproteinowy może istnieć w soku łykowym z dyni40, ale nie wykazano, że jakiekolwiek kompleksy makromolekularne istnieją w warunkach natywnych w systemie łyka.
Niebieska natywna STRONA, wprowadzona przez Schäggera i wsp.26, w połączeniu z kolejnymi etapami elektroforezy żelowej o wysokiej rozdzielczości, umożliwiają oddzielenie poszczególnych składników dużych kompleksów białkowych. Korzystając z analiz 3D-PAGE natywnego wysięku łyka B. napus , mogliśmy ostatnio wykazać, że w próbkach łyka występuje kilka kompleksów białkowo-białko i RNP o wysokiej masie cząsteczkowej i są one aktywne enzymatycznie4. Alternatywne metody izolowania kompleksów białkowych, a także RNP, takie jak chromatografia wykluczania wielkości, mogą istnieć, ale zawodzą pod względem rozdzielczości w porównaniu z BN-PAGE. Ponadto, aby uzyskać rozsądną jakość separacji złożonej, matryce kolumn wykluczających rozmiar muszą być dostosowane do całkowitej badanej masy cząsteczkowej kompleksu. Analiza kompleksów o różnej wielkości będzie zatem wymagała różnych typów kolumn, co jest kosztowne i nie pozwala na tak dużą moc ogniskowania, jak BN-PAGE.
Krytyczne kroki analizy kompleksów z B. napus obejmują całkowitą ilość soku łyka użytego jako materiał wyjściowy. Niezbędne jest co najmniej 600 μl próbki łyka, którą można uzyskać z pięciu dobrze nawodnionych roślin. W przypadku 3D-PAGE i BN northern blot konieczne jest rozpoczęcie początkowego żelu BN od wystarczającej ilości próbek łyka. Aby to osiągnąć, próbki łyka są zagęszczane do momentu, gdy do każdej studzienki będzie można załadować od 20 do 30 μg białka i równolegle przeprowadza się co najmniej trzy porcje tej samej próbki. Zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenia zmniejszają wykrywalność kompleksów (ryc. 3). Próbki łyka należy zebrać do probówek reakcyjnych na lodzie i przechowywać w stanie zamrożonym do późniejszego wykorzystania, aby uniknąć degradacji i obrotu białek. Inhibitory proteazy znaleziono we wszystkich analizowanych proteomach łyka, ale również w pełni aktywny proteasom opisano w łyku B. napus4. Ponadto objętość i skład próbek łyka zależą od punktu czasowego pobierania próbek i warunków środowiskowych10. Dlatego należy zadbać o to, aby zbierać o tej samej porze dnia i w podobnych warunkach. Leczenie stresu (np. suszy) może zmniejszyć ilość łyka, które można zebrać. Aby zidentyfikować pojedyncze białka za pomocą spektrometrii mas, konieczne jest ograniczenie możliwych zanieczyszczeń keratyną poprzez noszenie rękawiczek przez cały czas. Keratyna prowadzi do dodatkowych sygnałów podczas analizy specyfikacji masy i utrudnia identyfikację białek. Uruchomienie BN-PAGE przy wyższym napięciu lub w temperaturze otoczenia może prowadzić do podgrzania żelu, co może skutkować demontażem delikatnych kompleksów.
Przedstawiony tutaj protokół jest odpowiedni do analizy kompleksów białko-białko. Pokazujemy również, że można go wykorzystać do równoległego wykrywania określonych RNA zawartych w kompleksach. Aby to osiągnąć, niedawno wprowadziliśmy protokół dla BN northern blotting4. RNA są podatne na degradację przez zanieczyszczenia RNAzą. Aby ograniczyć taką degradację, należy używać wody.
Do głównych ograniczeń przedstawionej metody należy oszacowanie masy cząsteczkowej kompleksów białkowych wydzielonych przez BN-PAGE, ponieważ zachowanie migracji zależy od wielkości, kształtu, a nawet od modyfikacji potranslacyjnych kompleksów31,41. Szacowanie wielkości kompleksów RNP jest jeszcze bardziej skomplikowane ze względu na wpływ kwasów nukleinowych na zachowanie migracji. Nie można również zapobiec temu, że kompleksy tej samej wielkości komigrują w jednym paśmie. Może to prowadzić do błędnego przewidywania złożonych kompozycji. W związku z tym konieczna może być weryfikacja zaobserwowanych interakcji za pomocą technik uzupełniających, np. za pomocą testów funkcjonalnych4. Również białka tylko słabo lub przejściowo związane z kompleksem makromolekularnym mogą zostać utracone w zastosowanym buforze BN. Aby tego uniknąć, próbki mogą być sieciowane, co może również prowadzić do artefaktów lub uniemożliwiać identyfikację białek, lub można zoptymalizować warunki buforowe.
W przeciwieństwie do klasycznego 2D-PAGE, połączenie mocznika i SDS-PAGE pozwala na separację według hydrofobowości i masy cząsteczkowej zamiast punktu izoelektrycznego (pI) i masy cząsteczkowej 28 i nie ogranicza separacji do białek o określonym zakresie pI. Podobnie jak w klasycznym 2D-PAGE, oddzielone białka są widoczne jako pojedyncze plamki, ale na ukośnej linii 4,28 (Figura 5, Figura 6). Więcej białek hydrofobowych pojawia się w miejscach powyżej tej przekątnej, podczas gdy więcej białek hydrofilowych znajduje się poniżej linii28. Stężenia poliakrylamidu zastosowane w tym protokole pozwolą dobrze oddzielić białka o masie od 25 do 80 kDa. Aby umożliwić oddzielenie mniejszych lub większych białek, stężenie poliakrylamidu może być zmieniane lub można zastosować żele gradientowe w trzecim wymiarze. Składniki kompleksu IV (ryc. 3) oddzielone za pomocą 3D-PAGE (ryc. 6) wycięto, trypsynę strawiono i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas. Doprowadziło to do zidentyfikowania kilku ligaz tRNA. Składniki pozostałych kompleksów zostały opublikowane w ostatnim czasie 4. Nasz 3D-PAGE umożliwił rozdzielenie różnych ligaz, a mianowicie ligaz asparaginianu, asparaginy, treoniny, lizyny i glicyny, o podobnej masie cząsteczkowej (Tabela 3). Korzystając z sondy specyficznej dla tRNA metioniny, byliśmy w stanie wykryć potencjalnie związane tRNA w kompleksie IV, ale jeśli w kompleksie znajdują się pełnowymiarowe tRNA lub fragmenty tRNA, nie można ich odróżnić od użytych sond. Aby sprawdzić, czy kwasy nukleinowe są rzeczywiście związane w kompleksie i nie migrują jednocześnie, próbki soku łyka trawionego przez proteazę mogą służyć jako odpowiednia kontrola migracji.
Wcześniej spekulowano, że translacja białek może zachodzić w rurkach sitowych łyka, ponieważ prawie większość składników całego rybosomu, a także czynniki wydłużające znaleziono w próbkach łyka 4,7. Nasze odkrycie tRNA i ligaz tRNA wydaje się potwierdzać tę tezę. Wykazano jednak, że fragmenty tRNA obecne w próbkach łyka z dyni są silnymi inhibitorami translacji42, a funkcjonalne rybosomy wydają się byćnieobecne4, co sugeruje, że translacja nie może mieć miejsca.
Reasumując, przedstawiony tutaj protokół pozwala na oddzielenie natywnych kompleksów białko-białko, a nawet RNP od próbek łyka oraz separację i identyfikację ich poszczególnych składników z wysoką rozdzielczością. Zastosowanie tej metody umożliwia odkrycie nowych kompleksów białkowych i RNP w próbkach łyka, a tym samym może wyjaśnić nowe funkcje w tym wysoce wyspecjalizowanym przedziale roślinnym.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Jennifer Deke i Urszuli Zarzeńskiej za ich naukowe wsparcie. Prace te zostały wsparte finansowo przez Grant Career Integration Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) Komisji Europejskiej w ramach 7. programu ramowego, grant LFF-GK06 "DELIGRAH" (Landesforschungsförderung Hamburg) oraz grant DFG (DFG KE 856_6-1) przyznany JK.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml probówki reakcyjne | Eppendorf | 30120086 | |
| grzebień 10-dołkowy do SDS PAGE, grubość 1 mm | BioRad | 1653359 | |
| 2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
| 30 % roztwór akryloamidu-bisakryloamidu (29:1) | roztwór BioRad | 1610156 | |
| 30 % roztwór akrylamidu i bisakryloamidu (37,5:1) | roztwór BioRad | ||
| 96 % etanolu | Carl Roth | P075 | |
| Kwas octowy | Carl Roth | 6755 | |
| Agaroza | Lonza | 50004 | |
| Hydrat siarczanu glinu (14-18) | AppliChem | 141101 | |
| Peroksodissiarczan amonu (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
| Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
| Kwas borowy | AppliChem | A2940 | |
| Błękit bromofenolowy | AppliChem | A2331 | |
| Koncentratory odśrodkowe np. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
| Zestaw modułu detekcji chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
| Bibuły chromatograficzne np. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
| CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
| Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
| Pirowęglan dietylu (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| DNase I | AppliChem | A3778 | |
| Etanol abs. | AppliChem | A3693 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
| System obrazowania żelowego np. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
| GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher | Scientific SM1331 | |
| Glycerol | AppliChem | 141339 | |
| Glycine | AppliChem | 131340 | |
| Blok grzewczy TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
| Piec do hybrydyzacji np. Inkubator do hybrydyzacji GFL 7601 | GFL | 7601 | |
| Igła podskórna (0,8 mm) | B | ||
| IPG, grubość 1 mm | BioRad | 1653367 | |
| Znakowanie RNA np. Biotyna 3'end Zestaw do znakowania DNA | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
| Natywny żel gradientowy np. Novex NativeSTRONA 4– 16% Bis-Tris żel | białkowy Invitrogen | BN1002BOX | |
| Membrana nylonowa e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
| Kwas ortofosforowy | Carl Roth | 6366.1 | |
| PageRuler wstępnie barwiona drabinka białkowa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Zasilacz do elektroforezy żelowej EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | dostępny w zestawie do |
| czyszczenia RNA | Qiagen | 74204 | |
| Półsuchy blot np. Fastblot 43B półsuchy Blot | Biometra | 846-015-100 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | AppliChem | 142363 | |
| Synteza cDNA np. Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA | RevertAid Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
| Tricine | AppliChem | A3954 | |
| Tris | AppliChem | A1086 | |
| Cytrynian trisodu dwuwodny | AppliChem | A3901 | |
| Odczynnik trizolowy | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| ULTRAhyb Ultraczuły bufor hybrydyzacyjny Thermo | Fisher Scientific | AM8670 | |
| Mocznik | AppliChem | A1360 | |
| UV Crosslinker np. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | firmy Fisher Scientific |
| Pionowy aparat do elektroforezy np. XCell SureLock Mini-Cell lub Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific lub BioRad | EI0001 lub 1658004 | |
| Wycieraczki np. KIMWIPES Delicate Wycieraczki zadaniowe | Kimberly-Clark | 34120 |
Bibliografia
- Kempers, R., van Bel, A. J. E. Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa. Planta. 201 (2), 195-201 (1997).
- Stadler, R., et al. Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots. Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).
- Ostendorp, A., et al. Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes. New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).
- Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts. Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).
- Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).
- Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function. Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).
- Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).
- Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. RNA as a long-distance information macromolecule in plants. Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).
- Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).
- Kennedy, J. S., Mittler, T. E. A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids. Nature. 171 (4351), 528(1953).
- King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents. Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).
- Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase. Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).
- Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding. Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).
- Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method. J Vis Exp. (80), e51111(2013).
- Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum). J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).
- Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L). BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).
- Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.). Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).
- Yoo, B., et al. A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).
- Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus. Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).
- Chalhoub, B., et al. Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome. Science. 345 (6199), 950-953 (2014).
- Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. Detection of several mRNA species in rice phloem sap. Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).
- Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).
- Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), e2164(2011).
- Rais, I., Karas, M., Schägger, H. Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification. Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).
- Schägger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions. Plant Methods. 1 (1), 11(2005).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules. New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).
- Hall, S. M., Baker, D. A. The chemical composition of Ricinus phloem exudate. Planta. 106 (2), 131-140 (1972).
- Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).
- Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).
- Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).
- Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).
- Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex. Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).
- Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).
- Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation. Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).
Przedruki i uprawnienia
