Artykuł metodologiczny

Hemisekcja boczna rdzenia kręgowego i asymetryczna ocena zachowania u dorosłych szczurów

21K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57126

⸱

24 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, 960th Hospital, Joint Logistics Support Force of PLA, 2Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, 3Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman Campbell Brain and Spine, Indiana University School of Medicine, 4Program in Medical Neuroscience, Paul and Carole Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 5Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital, Shandong University, 6Beijing Computing Center, Beijing Academy of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedury chirurgiczne mające na celu uzyskanie niezawodnej bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego (HX) na 9 poziomie klatki piersiowej u dorosłych szczurów oraz oceny neurobehawioralne przeznaczone do wykrywania asymetrycznych deficytów po takim jednostronnym urazie.

Streszczenie

Niekompletny uraz rdzenia kręgowego (SCI) często prowadzi do upośledzenia funkcji sensomotorycznych i jest klinicznie najczęstszym typem SCI. Ludzki zespół Browna-Séquarda jest powszechnym typem niepełnego SCI spowodowanego uszkodzeniem jednej połowy rdzenia kręgowego, co powoduje paraliż i utratę propriocepcji po tej samej (lub ipsilesionalnej) stronie co uraz, oraz utrata odczuwania bólu i temperatury po przeciwnej (lub przeciwstawnej) stronie. Odpowiednie metodologie wytwarzania bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego (HX) i oceny zaburzeń neurologicznych są niezbędne do stworzenia wiarygodnego modelu zwierzęcego zespołu Browna-Séquarda. Chociaż model hemisekcji bocznej odgrywa kluczową rolę w badaniach podstawowych i translacyjnych, brakuje ustandaryzowanych protokołów tworzenia takiej hemisekcji i oceny funkcji jednostronnej. Celem tego badania jest opisanie krok po kroku procedur mających na celu wytworzenie bocznego rdzenia kręgowego szczura na poziomie 9. kręgupiersiowego (T9). Następnie opisujemy połączoną skalę zachowania dla HX (CBS-HX), która zapewnia prostą i czułą ocenę asymetrycznej sprawności neurologicznej dla jednostronnego SCI. CBS-HX, w zakresie od 0 do 18, składa się z 4 indywidualnych ocen, które obejmują jednostronne wychodzenie kończyn tylnych (UHS), sprzęganie, umieszczanie kontaktów i chodzenie po siatce. W przypadku CBS-HX ipsilateralne i przeciwległe kończyny tylne są oceniane oddzielnie. Odkryliśmy, że po T9 HX tylna kończyna ipsilateralna wykazywała upośledzoną funkcję zachowania, podczas gdy przeciwległa kończyna tylna wykazywała znaczną regenerację. CBS-HX skutecznie rozróżniał funkcje behawioralne między ipsilateralnymi i przeciwległymi kończynami tylnymi i wykrywał czasowy postęp regeneracji ipsilateralnej kończyny tylnej. Komponenty CBS-HX mogą być analizowane oddzielnie lub w połączeniu z innymi pomiarami, gdy zajdzie taka potrzeba. Chociaż przedstawiliśmy tylko wizualne opisy procedur chirurgicznych i oceny behawioralne HX klatki piersiowej, zasada ta może być stosowana do innych niekompletnych SCI i na innych poziomach urazu.

Wprowadzenie

Niekompletne urazy rdzenia kręgowego (SCI) często prowadzą do poważnych i uporczywych zaburzeń funkcji sensomotorycznych i są klinicznie najczęstszym typem SCI1. Zespół Browna-Séquarda u ludzi jest spowodowany uszkodzeniem połowy rdzenia kręgowego, co skutkuje paraliżem i utratą propriocepcji po tej samej (lub ipsilesionalnej) stronie co uraz oraz utratą bólu i odczuwania temperatury po przeciwnej (lub przeciwnej) stronie2,3,4. Modele zwierzęce półkrwi bocznej kręgosłupa są szeroko stosowane do naśladowania ludzkiego zespołu Browna-Séquarda i zostały zgłoszone u szczurów5,6,7,8,9, opossums10 oraz monkeys7,11,12,13 przez różne laboratoria na różnych poziomach kręgosłupa. Nie opisano jednak szczegółowych wizualizacji procedur wykonywania standardowej hemisekcji bocznej. Zapewnienie procedur krok po kroku dla hemisekcji bocznej powinno zoptymalizować model i ułatwić porównywanie lub replikację wyników eksperymentalnych w badaniach podstawowych i translacyjnych.

Jednostronne SCI powoduje asymetryczne i nieproporcjonalne deficyty zachowania, które są trudne do zmierzenia przy użyciu konwencjonalnych ocen urazów symetrycznych. Odpowiednia metodologia oceny zaburzeń neurologicznych w przypadku jednostronnego SCI jest niezbędnym elementem opracowania jednostronnego modelu SCI. Pomimo kluczowej roli, jaką odgrywa jednostronny uraz kręgosłupa, brakuje ustandaryzowanych protokołów oceny deficytów sensomotorycznych u zwierząt z takim urazem. Skala oceny lokomotorycznej Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) jest najczęściej stosowaną miarą funkcji po SCI dla dorosłych szczurów 14, co daje półilościowy opis lokomocji jako całości. Nie mierzy jednak każdej kończyny tylnej niezależnie.

W tym badaniu opisujemy krok po kroku procedury mające na celu wytworzenie HX kręgosłupa gryzonia na dziewiątympoziomie kręgu piersiowego (T9). Wprowadzamy również połączoną skalę zachowania dla hemisekcji (CBS-HX), która obejmuje jednostronne kroczenie kończyn tylnych (UHS), sprzężenie, nawiązywanie kontaktu i ocenę chodzenia po siatce w celu oceny zaburzeń neurologicznych i powrotu do zdrowia po jednostronnym SCI. Mamy nadzieję, że model ten będzie użytecznym modelem do badania mechanizmów urazów i skuteczności terapeutycznej w przypadku jednostronnego SCI.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne i związane ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (National Research Council) oraz wytycznymi Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Ogólne rozważania

  1. W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice szczurów rasy Sprague-Dawley (SD) (o masie ciała 200 g, n=12). Przyzwyczaj zwierzęta do wszystkich środowisk testowych i zbierz dane wyjściowe dla wszystkich testów behawioralnych na tydzień przed zabiegiem chirurgicznym.
  2. Przeprowadź oceny behawioralne przez dwóch obserwatorów, którzy są ślepi na grupy eksperymentalne.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Wyczyść stół chirurgiczny 70% etanolem. Umieść wstępnie podgrzaną poduszkę grzewczą na stole operacyjnym. Przykryj obszar operacyjny sterylnym obłożeniem chirurgicznym. Umieść sterylną gazę, waciki i autoklawizowane narzędzia chirurgiczne na powierzchni serwety chirurgicznej.
  2. Włącz sterylizator mikrokulek do międzyoperacyjnej sterylizacji narzędzi chirurgicznych.
    UWAGA: Przykład narzędzi użytych w tym eksperymencie jest pokazany w Rysunek 1.
  3. Znieczulić szczura dootrzewnowym (i.p.) wstrzyknięciem ketaminy (87,7 mg/kg) i ksylazyny (12,3 mg/kg). Upewnij się, że właściwa płaszczyzna znieczulenia została osiągnięta przy braku reakcji na bodziec szczypania palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas operacji.
  4. Usuń włosy pokrywające kręgi piersiowe przez golenie (Rysunek 2A). Usuń ogoloną sierść za pomocą odkurzacza wyposażonego w filtr HEPA.
  5. Oczyść obszar operacyjny trzema naprzemiennymi peelingami na bazie jodu i etanolu.
  6. Przykryj zwierzę sterylną serwestracją z okienkiem nad proponowanym miejscem nacięcia (Rysunek 2B). Nuta; Na filmie serweta chirurgiczna została pominięta w celach demonstracyjnych.

3. Hemisekcja kręgosłupa

  1. Dotknij 13. żebra, które jest najniższym żebrem u szczura i pływającym żebrem, które nie łączy się z mostkiem. Podążaj za 13. żebrem grzbietowo, aby zidentyfikować jego połączenie z kręgiem T13, a następnie policz, aby zidentyfikować kręg T10.
  2. Użyj ostrza skalpela (#15, Rysunek 1), aby wykonać 3 - 4 cm nacięcie skóry w linii środkowej na plecach pokrywające 8-11 kręgowe wyrostki kolczyste.
  3. Pod mikroskopem chirurgicznym tępo wypreparuj i oddziel mięśnie przykręgosłupowe bocznie od wyrostków kolczystych w kierunku fasetek kręgów T9 i T10 po obu stronach, używając tego samego ostrza skalpela.
    UWAGA: Takie podejście ładnie rozdzieli tkankę, nie powodując krwotoku.
  4. Ustabilizuj kręgosłup za pomocą zmodyfikowanego uchwytu stabilizującego. Wykonaj szczelinę po obu stronach bocznej kości kręgowej. Wsuń ramiona ze stali nierdzewnej pod odsłonięte poprzeczne fasety procesu i dokręć, aby zapewnić stabilność.
  5. Użyj retraktora, aby cofnąć mięśnie z obszaru operacyjnego (Rysunek 2B) i odsłonić blaszki kręgowe T8-11 i wyrostki kolczyste (Rysunek 2C).
    UWAGA: Istnieje duża przerwa między wyrostkami kolczystymi T8 i T9, które są punktami orientacyjnymi do identyfikacji T9 (Rysunek 2C, widok grzbietowy). Z boku wyrostek kolczysty kręgu T9 jest skierowany doogonowo, wyrostek kolczysty T10 jest skierowany grzbietowo, a wyrostek kolczysty T11 jest skierowany rostralicznie; tak więc 3 wyrostki kolczyste tworzą piramidę, a wyrostek kolczysty T10 tworzy szczyt (Rysunek 2D, widok boczny).
  6. Wykonaj laminektomię grzbietową na kręgu T9 za pomocą rongeur. Odetnij wyrostek kolczysty T9 i usuń niewielką część blaszki w lewo do linii środkowej (Rysunek 3A, linia przerywana) i całą prawą część blaszki tak bocznie, jak to możliwe (Rysunek 3A, linia przerywana). W przypadku laminektomii delikatnie włóż rongeur pod blaszkę i odetnij mały kawałek kości na raz, aż pożądany obszar laminektomii zostanie zakończony (Rysunek 3B i Rysunek 3C).
  7. Pod mikroskopem chirurgicznym zidentyfikuj grzbietową linię środkową rdzenia kręgowego (Ryc. 3C). Wbij igłę (30 G) pionowo przez linię środkową do rdzenia kręgowego skośną stroną skierowaną w prawą stronę (Rysunek 4A).
    UWAGA: Igła powinna przebić się przez cały rdzeń kręgowy, aby dotrzeć do brzusznej ściany kanału kręgowego.
  8. Zatamuj krwawienie za pomocą małego kawałka sterylnej pianki żelowej.
  9. Włóż jedną końcówkę nożyczek do irydektomii/mikrochirurgii przez tor igły w linii środkowej, a drugą końcówkę wzdłuż bocznej powierzchni prawej półpępowiny, a następnie wykonaj pełne nacięcie na prawej półpępowince nożyczkami (Rysunek 4B).
    UWAGA: Użyj ostrych mikronożyczek do przecięcia rdzenia kręgowego, aby zminimalizować zmiany uciskowe rdzenia kręgowego podczas cięcia.
  10. Użyj bocznej krawędzi tej samej igły jako noża, aby przeciąć szczelinę zmiany, aby potwierdzić pełną prawą półsekcję. Sprawdź kompletność prawej hemisekcji, wizualizując dno kanału kręgowego za pomocą mikroskopu chirurgicznego (Rysunek 4C, widok przekrojowy; Rysunek 4D, widok z boku; Rysunek 4E, widok grzbietowy).
  11. Umieść mały kawałek gąbki żelatynowej na miejscu zmiany (Rysunek 4F). Użyj mieszanki cementowej i zbuduj wąski most nad gąbką i wyrostkami kolczystymi T8 i T10 (Rysunek 4G, H).
    UWAGA: Cel stosowania mostu cementowego jest dwojaki: 1) oddziela bliznę powstałą w miejscu urazu od reszty tkanki oraz 2) ułatwia wypreparowanie odcinka rdzenia kręgowego po uśmierceniu zwierząt.
  12. Zszyj warstwy mięśni i skóry osobno jedwabną nicią 4-0.
  13. Wstrzyknij podskórnie 0,9% sterylnego soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie. Wstrzykiwać środek przeciwbólowy Buprenorfinę (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/dobę podskórnie przez 2 dni. Wyciskać pęcherz moczowy 2-3 razy dziennie przez pierwszy tydzień i 1-2 razy w kolejnych tygodniach, aż do powrotu samoistnego opróżniania pęcherza.

4. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami

  1. Umieść zwierzę w jego pojedynczej klatce domowej. Na dnie klatki umieść wilgotną karmę lub żel dla gryzoni, aby wspomóc zdolność zwierzęcia do jedzenia/nawadniania. Umieść poduszkę grzewczą pod klatką podczas rekonwalescencji pooperacyjnej. Upewnij się, że poduszka grzewcza zakrywa tylko połowę dna klatki, aby uniknąć przegrzania.
  2. Wstrzyknij podskórnie 0,9% sterylnego soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie. Wstrzykiwać środek przeciwbólowy Buprenorfinę (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/dobę podskórnie przez 2 dni. Wyciskać pęcherz moczowy 2-3 razy dziennie przez pierwszy tydzień i 1-2 razy w kolejnych tygodniach, aż do powrotu samoistnego opróżniania pęcherza.

5. Oceń jednostronne etapowanie hemisekcji (UHS)

UWAGA: Test jednostronnego etapowania hemisekcji (UHS) jest bezpośrednim miernikiem zdolności zwierząt SCI do wykorzystania swoich kończyn tylnych na otwartym polu. Jak wspomniano w 1.1, zwierzęta były aklimatyzowane w otwartym środowisku polowym (średnica 42 cale) 15 dwa razy dziennie przez 7 dni. Test przeprowadza dwóch obserwatorów zaślepionych na grupy zwierząt. Zbierany będzie wynik UHS zarówno na początku badania (7 dni przed T9 HX), jak i punkty czasowe po urazie. Kroki oceny są opisane w następujący sposób.

  1. Umieść zwierzę na otwartym polu i badaj jego lokomocję przez 4 min.
    UWAGA: Podczas badania zwierzę może być zachęcane do aktywnego poruszania się.
  2. Korzystając z formularza podanego w tabeli 1, przypisz wartość 1 dla Tak i 0 dla Nie dla każdej kategorii zachowania, a następnie zsumuj łączną wartość, aby uzyskać ostateczny wynik UHS od 0 do 8,
    UWAGA: Zgodnie z tabelą 1 0: brak obserwowalnych ruchów kończyny tylnej; 1 – 4: izolowane ruchy 3 stawów kończyn tylnych (biodra, kolana i kostki); 5: zamiatanie bez podparcia ciężaru; 6: umieszczanie bez podparcia ciężarem; 7: umieszczanie z podparciem ciężaru; i 8: stąpanie z podparciem ciężaru.
  3. Zbieraj wyniki UHS zarówno na początku badania (7 dni przed T9 HX), jak i w punktach czasowych po kontuzji.
    UWAGA: Wyniki będą oceniane w różnych punktach czasowych po T9 HX.

6. Sprzężenie

  1. Przeanalizuj CPL (sprzęg chodu) z nagraniem wideo zwierzęcia chodzącego po wąskim pasie startowym lub zwykłym otwartym polu.
  2. W sekcji dotyczącej sprzęgania w tabeli 1 przypisz punkty 0 za "Nie", 1 za "Nieregularny/niezdarny" i 2 za "Normalny" dla każdej kategorii CPL.
    UWAGA: Test sprzęgania (CPL) ma na celu ocenę koordynacji naprzemiennych ruchów kończyn, w tym homologicznego CPL (kończyny przód-przód/tył-tył, Rysunek 5A), ukośną CPL (przednie lewe-tylne prawe lub przednie prawe-tylne lewe kończyny, Rysunek 5B) i homolateralne CPL (kończyny przód-tył po tej samej stronie, Rysunek 5C). Po T9 HX uwidaczniają się deficyty kończyny tylnej po stronie mięśniowej, co skutkuje naprzemiennością homologicznego CPL (Rysunek 5D), ukośnego CPL (Rysunek 5E) i homolateralnego CPL (Rysunek 5F).

7. Nawiązywanie kontaktów

UWAGA: Test umiejscowienia kontaktu kończyn tylnych służy do oceny integracji motorycznej reakcji kończyn tylnych na bodźce proprioceptywne 16. Propriocepcję uważa się za nienaruszoną, jeśli zwierzę wychodzi tylną kończyną na powierzchnię po tym, jak tylna kończyna jest ściągnięta poniżej powierzchni.

  1. Trzymaj zwierzę w pozycji pionowej tak, aby obie tylne kończyny były dostępne do odpowiedzi na umieszczenie.
  2. Lekko przeczesać powierzchnię grzbietową kończyny tylnej do przodu w kierunku krawędzi powierzchni (np. stanowiska pracy dla zwierząt).
  3. Obserwuj ułożenie stopy na powierzchni i przypisz punktację umieszczenia kończyny tylnej. 0: brak umieszczenia; 1: umieszczenie.
    UWAGA: Powierzchnia grzbietowa jest stymulowana, a stopa następnie wyprostuje się i położy stopę na powierzchni, jeśli odruch jest nienaruszony. Formularz oceny znajduje się również w tabeli 1.

8. Chodzenie po siatce

UWAGA: Test chodzenia po siatce ocenia spontaniczne deficyty motoryczne i ruchy kończyn związane z precyzyjnym krokiem, koordynacją i dokładnym ułożeniem łap.

  1. Umieść szczura na podwyższonej siatce drucianej pokrytej tworzywem sztucznym (36 × 38 cm z otworami 3 cm2) i pozwól mu swobodnie przejść po platformie przez 30 stopni.
  2. Policz całkowitą liczbę kroków i liczbę błędnych kroków dla każdej kończyny. Nagrania wideo są wykonywane w celu potwierdzenia liczenia.
    UWAGA: Dwóch zaślepionych obserwatorów ocenia ułożenie łap kończyn przednich i tylnych podczas chodzenia zwierząt.
  3. Przypisz siatkę wyników chodu dla każdej kończyny tylnej w następujący sposób – 0: błędy w krokach większe niż 15; 1: błędy w krokach mniejsze lub równe 15; 2: błędy w krokach mniejsze lub równe 10; i 3: błędy w krokach mniejsze lub równe 5,
    UWAGA: Ocena punktowa opiera się na tabeli 1. Wyniki odcięcia są używane jako miary nasilenia deficytów motorycznych.

9. Perfuzja i przetwarzanie tkanek

  1. Po odpowiednim znieczuleniu podobnym do kroku 2.3, należy ostrożnie wykonać perfuzję zwierząt zgodnie z protokołem perfuzji przezsercowej 17.
  2. Wypreparuj i zbierz próbki rdzenia kręgowego, a następnie utrwal je w 4% PFA przez noc.
  3. Próbki można następnie przenieść do 30% roztworu sacharozy.
  4. Przeciąć rdzeń kręgowy w przekrojach poprzecznych i wybarwić wybrane odcinki markerem aksonowym SMI-31 i markerem astrocytarnym glejowym fibrylarnym białkiem kwaśnym (GFAP) zgodnie ze standardowymi procedurami18.

Wyniki

Opisane powyżej procedury chirurgiczne umożliwiają uzyskanie spójnego i powtarzalnego bocznego HX na poziomie T9. Po perfuzji i usunięciu skóry miejsce operacyjne na poziomie T9 można łatwo zidentyfikować po pozostałym szwie (Rysunek 6A). Dalsza dyssekcja pozwala na warstwowe odsłonięcie mostka cementowego (Rysunek 6B) oraz gąbki żelatynowej (Rysunek 6C). Następnie rdzeń kręgowy zostaje odsłonięty w otwartym kanale kręgowym i potwierdzana jest boczna hemisekcja po prawej stronie (Rysunek 4D). Poziom uszkodzenia można dodatkowo potwierdzić na podstawie jego powiązania z odsłoniętymi trzonami kręgów i żebrami (Rysunek 6D). Barwienie immunofluorescencyjne przekroju w centrum uszkodzenia wykazuje całkowitą utratę prawej połowy rdzenia oraz zachowanie lewej połowy rdzenia po przeciwnej stronie uszkodzenia. Przekrój z zabarwieniem na marker aksonalny SMI-31 oraz marker astrocytarny białko kwaśne włókienstwo glia (GFAP) (Rysunek 6E).

Pod kątem neurobehawioralnym system CBS-HX jest w stanie wykryć asymetryczne deficyty w czasie po wykonaniu hemiseksii (HX) na poziomie T9. Po HX kończyna tylna po stronie ipsilateralnej utraciła zdolność do stawiania kroków, podczas gdy kończyna tylna po stronie kontralateralnej zachowała zdolność do chodzenia. Dla każdego pomiaru behawioralnego przeprowadzono 3 próby, a do kwantyfikacji i analizy wykorzystano średnią z tych 3 prób. Jako linię bazową przyjęto pomiary przedoperacyjne, które uznano za najdokładniejszą kontrolę w porównaniu z wykorzystaniem innych szczurów. Wyniki 4 poszczególnych pomiarów, tj. UHS, CPL, kontaktu stopy (contact placing) oraz chodzenia po kratce (grid walking), mogą być analizowane oddzielnie (Rycina 7A-D) lub mogą zostać połączone w złożony wskaźnik CBS-HX (Rycina 7E). Analizy dwuczynnikową ANOVA wykazały istotne różnice między stroną ipsilateralną a kontralateralną w przypadku UHS (F = 23,19, p < 0,01), sprzęgania (coupling) (F = 8,376, p < 0,01), kontaktu stopy (F = 17,672, p < 0,01), chodzenia po kratce (F = 19,261, p < 0,01) oraz CBS-HX (F = 20,897, p < 0,01). Rycina 7A przedstawia wyniki UHS po HX na poziomie T9. W ciągu pierwszych 3 dni po urazie szczury utraciły zdolność do stawiania kroków i otrzymały ocenę 0-2 dla kończyny tylnej po stronie uszkodzenia. Ruchy przypominające kroki zaczęły pojawiać się po stronie ipsilateralnej w 7-10 dniach po urazie, przy czym większość były to kroki grzbietowe. Do 28 dnia po HX T9 szczury mogły stawiać kroki podeszwowe przy niemal prawidłowej koordynacji, co przełożyło się na przypisaną ocenę UHS wynoszącą 8. Dla porównania, ruchy kończyny tylnej po stronie kontralateralnej były w mniejszym stopniu zakłócone, a ocena UHS spadła w ciągu pierwszych 5 dni po HX T9 i powróciła do poziomu bazowego po 10 dniu od urazu. W całkowitym teście CPL (obejmującym sprzęganie homolateralne, homologiczne i diagonalne) zarówno stabilność, jak i zdolność adaptacyjna koordynacji po HX T9 były wyraźnie zmniejszone (Rycina 7B). W dniach 1-5 po urazie zwierzęta po HX nie wykazywały oznak CPL. Z czasem pojawiło się CPL kończyny tylnej po stronie ipsilateralnej, często niezdarne, niestabilne i nieprawidłowo różniące się pod względem prędkości, siły i kierunku. Kontakt stopy (Rycina 7C) oraz chodzenie po kratce (Rycina 7D) kończyny tylnej po stronie ipsilateralnej również zostały zaburzone przez HX T9, szczególnie w ciągu pierwszych 5 dni po urazie, i zazwyczaj wracały do normy, gdy zwierzę zaczynało stawiać kroki podeszwowe. Złożony system CBS-HX obejmuje testy UHS, CPL, kontaktu stopy oraz chodzenia po kratce, z maksymalnym możliwym wynikiem 18 (Rycina 7E). Funkcja motoryczna kończyn tylnych po stronie ipsilateralnej wykazała spadek wyników CBS-HX po bocznej HX T9, co jest zgodne z deficytami obserwowanymi w ludzkim zespole Browna-Séquarda. Funkcja motoryczna kończyn tylnych po stronie ipsilateralnej wykazała spadek wyników CBS-HX od 1 dnia do 4 tygodni po bocznej HX T9 w porównaniu do kończyn tylnych po stronie kontralateralnej (Rycina 7E).

W ten sposób złożony system CBS-HX, łączący UHS, CPL, pozycjonowanie kontaktowe i chodzenie po kratce, może być wykorzystywany do oceny funkcji behawioralnych szczurów po bocznej kontuzji rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym, przy maksymalnej możliwej punktacji wynoszącej 18.

Schemat narzędzi chirurgicznych; skalpel, kleszczyki hemostatyczne, nożyczki, igła, pinceta, retraktory do chirurgii.
Rysunek 1. Narzędzia chirurgiczne użyte do wykonania prawostronnej hemisekcji na poziomie T9. Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.

Przygotowanie do operacji kręgosłupa szczura; schemat przedstawiający kręgi T8-T1 w kontekście chirurgicznym.
Rysunek 2. Wycięcie chirurgiczneekspozycja. A) Zgolić owłosienie na plecach w obszarze nad miejscem operacyjnym. B) Odciągnąć mięśnie z pola operacyjnego za pomocą rozieracza. C) Odsłoń blaszki łukowe kręgów T8-1 i wyznacz poszczególne wyrostki kolczyste (strzałki). Należy zauważyć, że między wyrostkami kolczystymi T8 i T9 występuje szeroka przerwa, która stanowi punkt orientacyjny do identyfikacji kręgu T9. D) Rysunek schematyczny przedstawia widok boczny wyrostków kolczystych. Wyrostki kolczyste T9-1 tworzą piramidę, której wierzchołkiem jest wyrostek kolczysty T10. Ponownie wyraźnie widoczna jest szeroka przerwa między wyrostkami kolczystymi T8 i T9, która służy jako punkt orientacyjny do identyfikacji poziomu T9, na którym wykonuje się laminektomię. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Proces laminektomii kręgu T9; schemat (A, B) i wynik chirurgiczny (C); technika operacji kręgosłupa.
Rysunek 3. Laminektomia i odsłonięcie prawej połowy rdzenia kręgowego. A) Rysunek schematyczny przedstawia przekrój poprzeczny rdzenia kręgowego na poziomie kręgu T9. Linia przerywana wskazuje zakres laminektomii po każdej stronie. B) Rysunek schematyczny przedstawia usunięcie niewielkiej części blaszki łuku kręgu po stronie lewej oraz całego łuku kręgu po stronie prawej. Strzałka wskazuje grzbietową linię środkową rdzenia. C) Widok grzbietowy odsłoniętego rdzenia kręgowego. Należy zwrócić uwagę, że żyła grzbietowa znajdowała się pośrodku rdzenia kręgowego, dzieląc lewą i prawą połowę rdzenia. Prawa połowa rdzenia była całkowicie odsłonięta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat hemisekcji rdzenia kręgowego na poziomie T9, gąbka żelatynowa, aplikacja cementu, eksperyment chirurgiczny.
Rycina 4. Boczna hemisekcja. A-D) Rysunki schematyczne przedstawiają wprowadzenie igły w linii środkowej do rdzenia kręgowego (A), hemisekcja na poziomie T9 (B), pokrycie gąbką żelatynową i cementem (C) oraz widok boczny bocznej hemisekcji na poziomie T9 (D). Linie przerywane na rysunku C obrysowują usuniętą blaszkę łukową kręgu T9 oraz prawą połowę rdzenia kręgowego. E) Widok grzbietowy prawostronnej hemisekcji rdzenia kręgowego. F) Umieszczenie niewielkiego fragmentu gąbki żelatynowej nad miejscem hemisekcji. G-H) Most cementowy Simplex-P zbudowany nad gąbką oraz wyrostkami kolczystymi T8 i T10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat sprzężenia neuronalnego; homologiczny, diagonalny, homolateralny; prawidłowy, hemisekcja; badanie z zakresu neuronauki.
Rycina 5. Schematyczny rysunek sprzęgła (CPL) test. Test CPL służy do oceny koordynacji naprzemiennych ruchów kończyn, w tym A) homologiczne CPL (kończyny przednie-przednie/tylne-tylne), B) przekątny CPL (przednia lewa-tylna prawa/przednia prawa-tylna lewa kończyna) oraz C) homolateralny CPL (przednia i tylna kończyna po tej samej stronie). Po HX na poziomie T9 (czerwona ramka, D-F) widoczny stał się deficyt kończyny tylnej po stronie ipsilesjonalnej, a zwierzęta wykazały brak koordynacji w kończynach homologicznych (D), diagonalny (E), i homolateralny (F) CPL. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy gojenia uszkodzenia rdzenia kręgowego w mikroskopii, immunobarwienie GFAP/SMI31, skala 50 µm.
Rycina 6. Disekcja i histologia tkanek. Po perfuzji wycięto tkanki, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Przekroje poprzeczne poddano podwójnemu barwieniu immunofluorescencyjnemu na białko kwaśne włókien glejowych (GFAP, marker astrocytów) oraz SMI31 (marker aksonów). A) Odsłonięcie szwu jako punktu orientacyjnego dla miejsca urazu (żółta strzałka). B) Odsłonięcie cementu zębowego (żółta strzałka). C) Odsłonięcie gąbki żelatynowej (żółta strzałka). D) Zidentyfikuj przecięcie połowiczne rdzenia kręgowego po prawej stronie (żółta strzałka). E) Przekrój poprzeczny rdzenia kręgowego w centrum urazu, poddany immunobarwieniu z przeciwciałami przeciwko GFAP (kolor zielony) i SMI 31 (kolor czerwony). Widoczne jest całkowite przerwanie prawej połowy rdzenia oraz dobra zachowalność lewej połowy rdzenia. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy powrotu funkcji behawioralnych; jednostronna hemisekcja, ipsilateralny/kontralateralny, wynik vs. dni, diagram.
Rycina 7. Wyniki oceny neurobehawioralnej. Wykresy przedstawiają wyniki 5 pomiarów: A, wynik jednostronnej hemisekcji (UHS); B, sprzęganie (CPL); C, rozmieszczenie kontaktów; D, chodzenie po kratce i E, łączny wynik behawioralny (CBS) kończyn tylnych po stronie ipsilateralnej i kontralateralnej po przecięciu rdzenia kręgowego (HX) na poziomie T9. Dane przedstawiają średnią ± błąd standardowy średniej (s.e.m.). *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,01 między kończynami tylnymi po stronie ipsilateralnej i kontralateralnej (dwuczynnikowa analiza wariancji ANOVA, wielokrotny test porównawczy Tukeya, n = 12 szczurów/grupy). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa/zakres podpunktu punktowegoOpisWynik
Jednostronne stawianie kończyny tylnejObserwowalny niewielki ruch kończyn tylnychNie0
(UHS)Tak1
(0-8)Ruchomość stawu skokowegoNie0
Tak1
Ruchomość stawu kolanowegoNie0
Tak1
Ruchomość stawu biodrowegoNie0
Tak1
Zamiatanie (bez podparcia ciężaru ciała)Nie0
Tak1
Umieszczenie (bez podparcia ciężaru)Nie0
Tak1
Upołożenie (z odciążeniem)Nie0
Tak1
Krok po krokuNie0
Tak1
SprzęganieHomolateralnyNie0
(0-6)Nieregularny/niezgrabny1
Normalny2
HomologicznyNie0
Nieregularny/nieporęczny1
Normalny2
PrzekątnaNie0
Nieregularny/niezdarny1
Normalny2
Umieszczanie kontaktuNie0
(0-1)Tak1
Chód po kratcePominięte kroki>150
(0-3)≤151
≤102
≤53
Całkowity CBS-HX
(0-18)

Tabela 1: Łączne wyniki behawioralne dla hemisekcji (CBS-HX)

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy krok po kroku procedury wytwarzania prostego, spójnego i powtarzalnego rdzeniowego HX T9 u dorosłych szczurów, który naśladuje zespół Browna-Séquarda u ludzi. Ponadto wprowadzamy łączony system oceny zachowania dla hemisekcji (CBS-HX), który jest czuły na ocenę asymetrycznego upośledzenia neurologicznego i postępu powrotu do zdrowia, mierzonego za pomocą kombinacji jednostronnego kroku kończyn tylnych (UHS), sprzęgania (CPL), nawiązywania kontaktu i chodzenia po siatce. Chociaż pokazujemy uraz na poziomie T9, procedura ta może być zastosowana do innych obszarów rdzenia kręgowego, w tym rdzenia szyjnego i lędźwiowego, w prosty i niewymagający sposób. Mamy nadzieję, że ten model, wraz z jednostronnymi ocenami behawioralnymi, będzie przydatny do badania mechanizmów urazów i skuteczności terapeutycznej dla takich typów SCI.

Ponieważ boczny model HX uszkadza tylko ipsilateralną połowę rdzenia, przeciwległa strona pępowiny jest w dużej mierze zachowana i może być używana jako kontrola wewnętrzna. Wiele ścieżek zstępujących i wstępujących jest rzutowanych jednostronnie, a hemisekcja boczna w wielu przypadkach powoduje uszkodzenie drogi aksonalnej po jednej stronie i zachowuje ten sam odcinek po drugiej stronie, co pozwala na porównanie reorganizacji i konsekwencji funkcjonalnych tych dróg u tego samego zwierzęcia. Ponadto wytworzenie bardziej zlokalizowanej zmiany może pozwolić na ukierunkowanie na określone szlaki. Na przykład zmiana brzuszna i brzuszno-boczna może wpływać na drogi siateczkowo-rdzeniowe i przedsionkowo-rdzeniowe. Zmiana grzbietowa lub grzbietowo-boczna może wpływać na drogi korowo-rdzeniowe i rubrordzeniowe. Model hemisekcji lub częściowego uszkodzenia może być również wykorzystany do badania anatomii i funkcji innych szlaków, takich jak szlaki propriordzeniowe, noradrenergiczne lub serotoninergiczne. W związku z tym model hemisekcji może być wyjątkowo wykorzystany do badania kompensacji przez aferenty czuciowe, ścieżki zstępujące i wewnętrzne obwody rdzeniowe. Model ten nadaje się również do badania mechanizmów odzyskiwania ruchu po HX.

Boczny HX prowadzi do oczywistych zaburzeń behawioralnych, które można ocenić w ramach paradygmatu zadań motorycznych (np. Treadscan lub Treadmill) dla automatycznej analizy chodu 19. Również przewodnictwo dróg aksonalnych po stronie przeciwnej do zmiany można zmierzyć za pomocą zapisów elektrofizjologicznych, a ocena ta daje możliwość ustalenia reorganizacji funkcjonalnej po różnych zabiegach. Co więcej, jednostronne wstrzyknięcia znaczników anatomicznych do neuronów określonej ścieżki umożliwiają wizualizację włókien krzyżujących się z linią pośrednią znakowanych następczo i ich połączenie z neuronami znakowanymi wstecznie 20,21,22,23,24,25.

Chociaż typowa operacja HX kręgosłupa trwa mniej niż 20 minut, wymaga pewnej praktyki, aby uzyskać precyzyjny i spójny HX. Po pierwsze, ważne jest, aby poziom rdzenia kręgowego HX był spójny u różnych zwierząt. Dlatego tak ważne jest, aby zidentyfikować odpowiedni segment kręgu do laminektomii. Po drugie, upewnij się, że HX jest kompletny. Aby wykonać kompletny HX, można użyć igły o rozmiarze 30 włożonej pionowo przez linię środkową, aby poprowadzić cięcie za pomocą mikronożyczek. Wkłucie igły pozwala również uniknąć uszkodzenia tylnych naczyń kręgosłupa lub nadmiernej zmiany rdzenia. Drugą funkcją igły o rozmiarze 30 jest to, że może ona służyć jako nóż do śledzenia cięcia, aby upewnić się, że nie ma niejasności zmiany. Po trzecie, umieszczenie żelatyny w miejscu zmiany chorobowej może zminimalizować wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego, a umieszczenie cementu na żelatynie i zmostkowanie blaszki kręgowej może wzmocnić stabilność kręgów rdzeniowych w miejscu zmiany i ułatwić gojenie się ran. Aby uniknąć zakłóceń sygnału przy stosowaniu zapisów elektrofizjologicznych, mięśnie, powięź i skórę powinny być zszyte warstwami nicią jedwabną 4-0. Wreszcie, należy dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować uszkodzenie przeciwległego rdzenia kręgowego. Należy przeprowadzić weryfikację histologiczną w celu potwierdzenia całkowitej półsekcji bocznej po jednej stronie i zachowania drugiej połowy pasma włóknistego po drugiej stronie (jak pokazano na rysunku 6E).

Aby poprawić lokomocję po SCI, w poprzednich badaniach wykorzystano szeroki zakres strategii, w tym przeszczep komórek, regenerację aksonów 8,18,26,27 i rehabilitację opartą na aktywności 28,29,30. W międzyczasie ustanowiono kilka testów behawioralnych w celu oceny funkcjonalnej i badań przesiewowych w celu znalezienia najlepszych metod leczenia po SCI. Skala oceny lokomotorycznej BBB została opracowana do oceny lokomotorycznej symetrycznych urazów kręgosłupa, takich jak stłuczenie linii środkowej lub urazy przecięciowe, które dotyczą obustronnych kończyn tylnych 14,31. Niektóre parametry BBB, takie jak koordynacja i prześwit palców, są rejestrowane poprzez obserwację obu kończyn tylnych. Jeśli jedna tylna kończyna jest nienaruszona, a druga wykazuje deficyty, jak widać w asymetrycznych urazach, to nienaruszona tylna kończyna zakłóci wynik dotkniętej tylnej kończyny. Ponieważ punktacja BBB nie uwzględnia jednego wyniku kończyny tylnej od drugiej po jednostronnym urazie, nie jest idealna do oceny jednostronnych urazów rdzenia kręgowego. Jeśli jednak ruch stawu i podtrzymanie ciężaru ciała po każdej stronie są oceniane oddzielnie i nie są obliczane jako część BBB, wówczas nienaruszona kończyna tylna (podobnie jak w przypadku kontroli pozorowanej) nie zakłóci wyniku dotkniętej kończyny tylnej. Co więcej, nienaruszona strona nie wpłynie na ogólny wynik zwierzęcia, ponieważ nienaruszona tylna kończyna nie ma dramatycznych deficytów w ruchu stawów, podparciu ciężaru ciała lub chodzeniu.

Łączna ocena zachowania dla hemisekcji została zaprojektowana tak, aby była czułą i łatwą do przeprowadzenia oceną odzyskiwania behawioralnego w szczurzym modelu hemisekcji bocznej. Może być używany do oceny zachowań zarówno wczesnej, jak i późnej fazy zdrowienia. Wczesna faza następuje w ciągu 7-10 dni po urazie. W ciągu pierwszych 3-5 dni po HX ipsilateralna aktywność kończyn tylnych stale rosła i powinna być oceniana częściej, aby zarejestrować spontaniczne lub zależne od leczenia odzyskanie ruchów kończyn tylnych. Po 5-7 dniach od HX szczury zaczęły wykonywać zamaszyste ruchy kończyn tylnych bez podparcia ciężarem. Po 7-10 dniach szczury zazwyczaj zaczynały stać i stąpać. Podczas tej fazy należy zwrócić uwagę na wzór kroków. W późnej fazie (14-28 dni) ipsilateralna aktywność kończyn tylnych była stabilna i bliska normie.

Szczególną uwagę należy również zwrócić na zdolność sprzęgania (CPL). Test CPL (sprzęg chodu) można przeprowadzić za pomocą filmu (np. Treadscan/Catwalk) lub filmu filmowego podczas testu w terenie. Druga opcja zapewnia elastyczność, jeśli badacze nie mają dostępu do systemu analizy chodu. W przypadku obu sesji nagrywania wideo w tym teście wymagane jest co najmniej dwa kolejne przyłożenia dla każdej stopy. Do analizy dostępne są trzy parametry sprzężenia: sprzężenie homologiczne, homolateralne i ukośne (krok 6.2). Każde sprzęgło składa się ze stopy odniesienia i danej stopy. Weźmy na przykład sprzężenie homologiczne (przód, lewy, przedni, prawy lub tylny, lewy-tylny, prawy), jest to czas pierwszego przyłożenia danej stopy podzielony przez jeden cały czas kroku stopy odniesienia. Ponieważ lewa i prawa stopa powinny być przesunięte w fazie, idealne sprzężenie powinno wynosić 0,5. Tak samo jest w przypadku sprzężenia homolateralnego (lewy przedni-lewy tył lub prawy przedni-prawy tył). Jednak w przypadku sprzężenia ukośnego (lewy przód-prawy tył lub prawy przód-lewy tył) idealne sprzężenie powinno wynosić 0 lub 1, ponieważ obie stopy powinny być w fazie. W kroku 6.4 przypisujemy każdemu CPL punktację od 0 do 2. W szczegółach, wynik 0 oznacza, że dana stopa nie jest w stanie się poruszyć, aby zakończyć przyłożenie, stąd nie ma CPL; Wynik 1 oznacza nieregularny lub niezdarny CPL od momentu, gdy dana stopa kończy przyłożenie, ale nie w idealnym sprzężeniu; Wynik 2 oznacza idealne sprzężenie na poziomie 0,5. Trzy koncepcje parametrów sprzęgania są dobrze opisane w poprzednich publikacjach32,33. CPL można połączyć z ocenami nawiązywania kontaktów i chodzenia po siatce. Poszczególne elementy połączonego systemu oceny zachowań będą mniej lub bardziej skuteczne w różnych szczurzych modelach SCI. W przypadku CPL deficyty stały się w oczywisty sposób widoczne w tempie przemian i kompletności sekwencji. Proprioceptywne deficyty w ułożeniu kończyn tylnych mogą być wyraźnie ujawnione po jednostronnym HX. W naszym badaniu wszystkie szczury wykazywały deficyty w ułożeniu kończyn tylnych w ruchu ipsilesionalnym, podczas gdy w przypadku przeciwległych kończyn tylnych nie wykazywały żadnych deficytów. Test chodzenia po siatce należy rozważyć, gdy zakładanie kontaktów, które obejmuje drogi korowo-rdzeniowe, zaczyna wracać do zdrowia. Aby wykluczyć wszelkie możliwe problemy ze zmęczeniem, sekwencja testów behawioralnych może być losowa w każdym teście.

Podsumowując, przedstawiamy procedury krok po kroku, aby stworzyć powtarzalny model rdzenia kręgowego HX T9 u szczurów in vivo, który naśladuje zespół Browna-Séquarda u ludzi. Połączony system oceny zachowania dla hemisekcji oferuje bardziej dyskryminacyjną miarę indywidualnych wyników behawioralnych kończyn tylnych w celu oceny mechanizmów urazów i leczenia po jednostronnym SCI. Chociaż przedstawiamy jedynie wizualny opis procedur chirurgicznych i ocen behawioralnych HX klatki piersiowej, opisane tutaj metody mogą być stosowane do innych niekompletnych SCI na różnych poziomach urazu.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Panu Jeffreyowi Recchia-Rife za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były częściowo wspierane przez Fundację Dyrektora Szpitala Ogólnego Regionu Wojskowego Jinan w ChALW 2016ZD03 i 2014ZX01 (XJL i TBZ). Badania w laboratorium Xu są wspierane przez NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 oraz Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 z Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Baby-Mixter HemostatFST13013-14Może być dowolną marką
z wyboru Podwyższona siatka druciana powlekana tworzywem sztucznymDowolna36 i razy; 38 cm z otworami 3 cm2
Pianka żelowaMoore Medical2928Może być dowolnej marki.
Zestaw cementu do chwytania, proszek i rozpuszczalnikDentsply675570Może być dowolnej marki.
Sterylizator mikrokulekFSTNAMoże być dowolną marką
do wyboru Pearson RongeurFST16015-17Może być dowolną marką.
RetraktoryNarzędzia chirurgiczne Jinxie6810Może być dowolnej marki do wyboru
Rękojeść skalpelaFST10003-12Może być dowolną marką
do wyboru Cement Simplex-PStrykerMoże być dowolną marką do wyboru.
Automatyczna analiza chodu TreadScanCleverSys IncNAMoże być dowolną marką z wyboru

Bibliografia

  1. Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
  2. Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
  3. Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
  4. Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395(2014).
  5. Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
  6. Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
  7. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  8. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
  9. Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
  10. Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
  11. Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
  12. Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
  13. Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
  14. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  15. Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
  16. Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
  17. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
  18. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  19. Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
  20. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  21. Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
  22. Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
  23. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  24. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  25. Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
  26. Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
  27. Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
  28. Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
  29. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
  30. Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
  31. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
  32. Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
  33. Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hemisekcja rdzenia kr gowegomodel Browna Sequardaz o ona skala behawioralnajednostronne stawianie krok w ko czyn tylnychocena chodzenia po kratcetesty kontaktu z pod o empoziom kr gu T9szczurzy model SCIasymetryczna ocena behawioralna

Powiązane artykuły