Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Streszczenie

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych o niskim tło rentgenowskim, zoptymalizowanych pod kątem krystalografii szeregowej opartej na goniometrze. Urządzenia są wzorowane na kleju epoksydowym przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Dołki na próbki są obustronnie przykryte okienkami z polimerowej folii poliimidowej, które umożliwiają zbieranie danych dyfrakcyjnych przy niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Ta metoda produkcji jest mało wymagająca i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowym środowisku laboratorium badawczego. Protokół projektowania i produkcji chipów wykorzystuje zawory kapilarne do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na zdefiniowane kropelki o rozmiarach nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku martwej objętości kanału i może być łatwo wykonany ręcznie bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Opisujemy, w jaki sposób izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów mogą być monitorowane in situ przez dynamiczne rozpraszanie światła w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Po wyhodowaniu odpowiednich kryształów można zebrać kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ o stałym celu w temperaturze pokojowej. Protokół zapewnia niestandardowe skrypty do przetwarzania zestawów danych dyfrakcyjnych przy użyciu zestawu narzędzi programowych do rozwiązywania i udoskonalania struktury krystalicznej białka. Takie podejście pozwala uniknąć artefaktów, które mogą zostać wywołane podczas kriokonserwacji lub ręcznego obchodzenia się z kryształami w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych. Przedstawiamy i porównujemy trzy struktury białkowe, które zostały rozwiązane przy użyciu małych kryształów o wymiarach około 10-20 μm wyhodowanych w chipie. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół szczegółowo opisuje, jak wytworzyć niestandardowy przezroczysty chip mikroprzepływowy przeznaczony do krystalografii szeregowej in situ. Ponieważ prawie każdy kryształ może być używany do zbierania danych dyfrakcyjnych, te mikroprzepływowe chipy są bardzo wydajną metodą dostarczania kryształów.

Wprowadzenie

Znajomość struktury 3D białka jest niezbędna do zrozumienia jego funkcjonalności. Struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej są dotychczas najczęściej uzyskiwane za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Technika ta wystawia kryształy białek na działanie promieniowania rentgenowskiego, a powstałe wzory dyfrakcyjne są następnie analizowane w celu określenia struktury i udoskonalenia. W tradycyjnej krystalografii rentgenowskiej kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych jest rejestrowany z pojedynczego, najlepiej dużego kryształu w temperaturach kriogenicznych. Takie kryształy jednak w większości przypadków nie są trywialne do wyhodowania, a zidentyfikowanie odpowiednich warunków kriokonserwacji może samo w sobie stać się wyzwaniem, a czasami może również powodować odchylenia od natywnej struktury białka⁵.

Ostatnie osiągnięcia technologiczne w rentgenowskim laserze na swobodnych elektronach (FEL) i liniach synchrotronowych pozwoliły na rozwiązywanie struktur z mniejszych kryształów, ponieważ pojawiły się nowe linie mikroskupiające wiązkę, zwiększona jasność wiązki promieniowania rentgenowskiego i ulepszone detektory promieniowania rentgenowskiego^6,7. Zazwyczaj małe kryształy są łatwiejsze do wyhodowania niż duże i wolne od wad kryształy^8,9. Jednak małe kryształy cierpią z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim znacznie szybciej niż duże kryształy. Dzieje się tak, ponieważ w porównaniu z dużym kryształem, wyższa dawka promieniowania rentgenowskiego musi być rzutowana na mniejszą objętość kryształu, aby załamać się do porównywalnej rozdzielczości. Dlatego nawet ochrona kriogeniczna często nie wystarcza do zarejestrowania pełnego zestawu danych dyfrakcyjnych z pojedynczego mikrokryształu.

Aby pokonać tę przeszkodę, krystalografia szeregowa stała się metodą z wyboru do zbierania i łączenia wzorów dyfrakcyjnych z wielu losowo rozmieszczonych mikrokryształów w celu uzyskania kompletnego zestawu danych. Uszkodzenia kryształów wywołane promieniowaniem są minimalizowane poprzez rozłożenie całkowitej dawki promieniowania rentgenowskiego użytej do rozwiązania struktury białkowej na dużą liczbę kryształów^5,10. W eksperymencie FEL "dyfrakcja przed zniszczeniem" każdy kryształ jest używany tylko do jednej ekspozycji przy użyciu femtosekundowych impulsów promieniowania rentgenowskiego. Z kolei linie mikrofokusowe przy źródłach synchrotronowych trzeciej generacji mogą wykonywać krystalografię szeregową z krótkimi czasami naświetlania promieniowaniem rentgenowskim w ciągu kilku milisekund^11,12,13,14. Jednak bez oscylacji lub rotacji kryształów podczas zbierania danych, można zarejestrować tylko częściowe odbicia Bragga, a zatem do określenia struktury zwykle wymagane są dziesiątki tysięcy lub więcej wzorów dyfrakcyjnych¹⁵. Do tej pory opracowano różnorodny zestaw metod dostarczania próbek do krystalografii seryjnej, co zostało niedawno sprawdzone^{14,16,17,18,19}. Wśród nich z powodzeniem połączono kilka strategii dostarczania próbek opartych na stałym celu, z rotacją kryształów podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, dzięki czemu znacznie mniej wzorów dyfrakcyjnych może dostarczyć równie kompletnych zestawów danych, a jednocześnie zużywać mniej próbki w porównaniu z klasycznymi eksperymentami krystalografii szeregowej, w których rejestrowane są nieruchome obrazy^{7,16,20,21,22,23,24}.

Przedstawiamy protokół do produkcji urządzeń mikroprzepływowych o niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Urządzenia są wykonane z 5-minutowego kleju epoksydowego przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in-situ w temperaturze pokojowej, które korzystają z integracji przygotowania próbki bezpośrednio z zestawem rentgenowskim, jak ma to miejsce w przypadku badań rozdzielczych w czasie, które przebiegają kinetyką wywołaną mieszaniem^18,19. Kanały mikroprzepływowe są obustronnie osłonięte polimerową folią poliimidową, w wyniku czego powstają okienka rentgenowskie o łącznej grubości około 16 μm, które pozwalają na obrazowanie tła o niskim promieniowaniu rentgenowskim. Wszystkie użyte materiały zapewniają dobrą odporność na rozpuszczalniki. Ta metoda produkcji jest stosunkowo prosta i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowych warunkach laboratorium badawczego.

W przykładzie zastosowania opisujemy chipy do krystalografii szeregowej opartej na goniometrze o stałym celu. Po pierwsze, omówiono zagadnienia projektowe i produkcyjne dotyczące stosowania zaworów kapilarnych do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na wybraną liczbę kropel o wielkości nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku objętości martwej kanału, a dzielenie można łatwo przeprowadzić ręcznie, bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Takie izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów są monitorowane in situ za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Wcześniej wykazano, że pomiary DLS mogą być wykonywane w urządzeniach mikroprzepływowych składających się ze struktury polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonej ze szkiełkiem podstawowym ^25,26. Ponieważ warstwa poliimidowa ma wysoką transmisję dla długości fal dłuższych niż 550 nm, podejście to można rozszerzyć również na pomiary w przezroczystych chipach rentgenowskich, przy użyciu odpowiedniej długości fali lasera^27,28. Na podstawie wyników DLS można zaobserwować początkowe zarodkowanie, a dalsze parowanie kropel można zatrzymać, aby uzyskać mniej, ale większe kryształy białka.

Po wyhodowaniu wystarczającej ilości kryształów, kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej mogą być następnie zebrane za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Zestawy danych dyfrakcyjnych są przetwarzane przy użyciu zestawu narzędzi programowych i niestandardowych skryptów w celu rozwiązania struktury krystalicznej białka. Technika ta pozwala uniknąć artefaktów często indukowanych podczas kriokonserwacji stosowanej w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych.

Porównujemy trzy docelowe struktury białek, które zostały rozwiązane przy użyciu około 10-20 μm małych kryształów hodowanych w chipie do rozdzielczości lepszej niż 2 A. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół ten może być stosowany do kryształów białek, które ulegają dyfrakcji zarówno do wysokiej, jak i niskiej rozdzielczości (1,7 A do 3,0 A). Ponieważ prawie każdy kryształ może być użyty do dyfrakcji, niewiele próbki jest marnowane, co sprawia, że jest to bardzo wydajna metoda dostarczania kryształów.

Ten protokół zawiera szczegółowy przewodnik, jak przygotować przezroczyste mikroprzepływowe chipy rentgenowskie do krystalizacji białek in situ i zbierania danych dyfrakcyjnych. Procedura została starannie zaprojektowana, aby czerpać korzyści z precyzji mikroprzepływowej bez konieczności korzystania z zaawansowanego sprzętu w laboratorium. Ponadto zbieranie danych na linii synchrotronowej może być prowadzone bez konieczności korzystania ze specjalistycznego goniometru lub nawilżacza, co ułatwia odtworzenie wyników przez osoby niebędące ekspertami. Przedstawiona technika może być zastosowana do seryjnego gromadzenia danych z krystalografii milisekundowej w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym utrzymaniu minimalnych uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i bez wprowadzania naprężeń do kryształów po wzroście poprzez krioochronę lub obchodzenie się z kryształami. W związku z tym opisana metoda jest odpowiednia dla każdego projektu krystalizacji białek.

Protokół

1. Projektowanie układów scalonych i produkcja główna

1. Konstrukcja maski
   1. Nakreśl żądane geometrie kanałów za pomocą odpowiedniego programu do rysowania CAD. Dla każdej warstwy fotorezystu przygotuj indywidualną maskę. Wszystkie projekty użyte w tym protokole są szczegółowo omówione w sekcji wyników i są dostępne jako AutoCad '. DWG' w pliku uzupełniającym 1.
      UWAGA: W przypadku budowania urządzeń opartych wyłącznie na PDMS współczynnik proporcji wysokości do szerokości kanału nie powinien przekraczać 1:10, aby zapobiec zapadaniu się kanału. Zarówno folia poliimidowa, jak i utwardzona żywica epoksydowa są bardziej wytrzymałe i w zasadzie powinny pozwalać również na wyższe proporcje. Celowo jednak nie przekroczyliśmy proporcji 1:10, aby wstępne projekty mogły być prototypowane jako tradycyjne urządzenia PDMS.
   2. Przetłumacz pliki CAD na fotomaski z folii emulsyjnej. Użyj nominalnej rozdzielczości 64k DPI, aby umożliwić dokładne funkcje do rozmiaru około 5 μm.
      UWAGA: Można to zrobić za pośrednictwem usługi komercyjnej. Usługi obrazowania mogą preferować różne konwencje rysowania, aby usprawnić konwersję plików do obrazowania maski. Prosimy o wcześniejsze zapytanie o preferowane konwencje rysowania, aby uniknąć pracochłonnego rozwiązywania problemów podczas konwersji. Maski z przezroczystymi cechami na czarnym tle będą wzorować cechy fotorezystu SU8 na płytce, aby uzyskać funkcjonalne mikrokanały PDMS podczas formowania repliki. Z kolei czarne cechy na przezroczystych maskach tła są potrzebne do przygotowania form PDMS odpowiednich do produkcji chipów rentgenowskich. Zalecamy zamówienie obu polaryzacji maski, aby umożliwić wczesne prototypowanie i walidację projektu w celu wytworzenia urządzeń PDMS przed przełożeniem projektu na chipy rentgenowskie.
2. SU8 master fabrication
   UWAGA: Jest to jedyny proces, który należy wykonać w pomieszczeniu czystym. Jeśli krytyczne wyposażenie pomieszczeń czystych nie jest dostępne, cały etap można zlecić firmom świadczącym usługi odlewnicze MEMS, które dostarczają gotowe wzorce SU8. Przetwarzaj SU8 zgodnie z instrukcją w karcie katalogowej. Kroki od 1.2.1 do 1.2.4 podsumowują ogólny przebieg procesu produkcji głównej SU8, z pełnymi parametrami projektu trójwarstwowego chipa rentgenowskiego wymienionymi w tabeli 1. Wprowadzenie do wielowarstwowego wyrównania SU8 zostało opublikowane wcześniej²⁹.
   1. Wlej około 1 ml rezystancji SU8 na 3-calową płytkę i obróć SU8 do żądanej grubości, używając odpowiedniej prędkości wirowania i czasu, jak określono w Tabeli 1 (Rysunek 1, krok 1). Wstępnie przypiecz fotorezystor zgodnie z grubością warstwy w temperaturze 65 °C i 95 °C przez kilka minut. Wykonaj wstępne pieczenie, aby zestalić SU8, aby zapobiec jego przywieraniu do fotomaski i poprawić przyczepność do podłoża (Rysunek 1, krok 2).
   2. Wystawić fotorezystor na działanie promieniowania UV, jak określono w Tabeli 1, a następnie przeprowadzić naświetlanie w temperaturze 95 °C, aby katalitycznie zakończyć fotoreakcję, która jest inicjowana podczas ekspozycji (Rysunek 1, krok 3).
   3. Powtórz te kroki dla każdej kolejnej warstwy. Następnie wyrównaj fotomaski kolejnej warstwy z wzorcem za pomocą wyrównywacza maski i znaczników wyrównania suwmiarki noniuszowej²⁹.
   4. Zmyj cały nieodsłonięty rezystancję SU8, rozwijając płytkę w octanie eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA), aż płukanie izopropanolem nie ujawni już mlecznego wytrącania się (Rysunek 1, krok 4). Wysuszyć wafel azotem pod ciśnieniem.
      UWAGA: Izopropanol jest słabym rozpuszczalnikiem dla SU8, a jego wytrącanie wskazuje na resztki nieutwardzonych pozostałości.
3. Produkcja form PDMS
   1. Umieść kawałek folii aluminiowej (15 × 15 cm) na szalce Petriego (10 cm) i umieść wzorzec SU8 na folii aluminiowej na szalce Petriego w celu łatwego wyjęcia wzorca po utwardzeniu PDMS.
   2. Wymieszaj bazę silikonową z utwardzaczem (10:1), uzyskując łączną ilość 25 g, energicznie za pomocą szpatułki w słoiku lub miksera mechanicznego. 3-calowy wafel na szalce Petriego (10 cm) zużywa około 25 g PDMS, aby uzyskać płytę o grubości 5 mm.
   3. Wlej wstępnie wymieszany PDMS na SU8-master (Rysunek 1, krok 5) na wysokość 4 mm. Wysusz PDMS przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza, aż na powierzchni PDMS nie pozostanie ani kilka pęcherzyków.
   4. Utwardzić PDMS w piecu w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Następnie wytnij utwardzony PDMS skalpelem i delikatnie oderwij formę PDMS od wzorca SU8 (Rysunek 1, Krok 6). Przytnij aż do wzorca, aby zapobiec pękaniu PDMS podczas obierania.
   5. Opcjonalnie: Przygotuj przekroje poprzeczne form PDMS, aby potwierdzić, że wszystkie warstwy SU8 na wzorcu mają żądane grubości (Rysunek 1). Wczesne testy układu kanałów mikroprzepływowych można przeprowadzić we wszystkich układach PDMS.
      UWAGA: Formowany w replikę PDMS można przymocować bezpośrednio do szklanego podłoża po wybiciu portów dostępowych (krok 3.3) w PDMS poprzez aktywację plazmą O₂ za pomocą 20 s, 0,4 mbar O₂, 50 W, 13,56 MHz. Jak zauważono w sekcji 1.2., wymaga to przeciwnej polaryzacji maski, a tym samym konturu płytki do produkcji chipów rentgenowskich.

2. Produkcja chipów rentgenowskich in situ

1. Rozcieńczyć oba prekursory żywicy epoksydowej w etanolu do końcowego stężenia etanolu 40% wag. Całkowita masa 0,25 g każdego prekursora żywicy epoksydowej w etanolu jest wystarczająca na jeden wiór o średnicy 1^cm2.
   UWAGA: Zmniejsza to lepkość powstałej 5-minutowej żywicy epoksydowej, aby uprościć mieszanie bez pęcherzyków powietrza i odlewanie replik form oraz zminimalizować grubość końcowej utwardzonej warstwy epoksydowej. Etanol odparowuje przez PDMS podczas etapu utwardzania.
2. Odgazuj formę PDMS w eksykatorze próżniowym przez 30 minut, aby mogła wchłonąć małe pęcherzyki powietrza z żywicy epoksydowej na etapie formowania.
3. Przyciąć folię poliimidową na około 70 × 70 mm i rozciągnąć ją wokół szkiełka o średnicy 75 × 50 mm za pomocą taśmy, aby uzyskać płaską i sztywną powierzchnię z taśmą na odwrocie. Plazmę aktywować plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar_O2 przez 20 s, a następnie inkubować całe szkiełko foliowe w roztworze wodnym 1% obj. (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (APTS) lub (3-glicydyloksypropylo)trimetoksysilanu (GPTS) przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
4. Dokładnie wymieszaj oba roztwory prekursorów epoksydowych rozcieńczonych etanolem, aby zapewnić optymalne utwardzanie. Wyjmij formy PDMS z komory próżniowej i umieść je na płaskiej powierzchni. Następnie szybko dozuj kroplę zmieszanej żywicy na każdą mikrostrukturę na formie za pomocą mikropipety (około 10 μL na 1^cm2 mikrostruktur) (Rysunek 1, krok 7a).
5. Pobrać warstwę warstwową z folii poliimidowej z wodnego roztworu silanu (APTS lub GTPS). Wysuszyć folię sprężonym powietrzem lub azotem.
6. Umieść przygotowaną kanapkę z folii poliimidowej, szkła i szkiełka na osadzonej żywicy epoksydowej (Rysunek 1, krok 7b). Mocno dociśnij szkiełko przymocowane do folii poliimidowej do formy PDMS. Umieść blachę na szkiełku szkiełkowym, a następnie nałóż odważniki, aby zastosować nacisk do 1,4 N/^cm2 przez 1 godzinę, podczas gdy żywica epoksydowa utwardza się w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Idealnie, aby na folii nie pozostała żywica w miejscach, w których struktury w formie mają maksymalną wysokość. Odpowiadają one studzienkom krystalizacyjnym, w których następuje krystalizacja.
   1. Opcjonalnie: Jeśli dokładne formowanie małych elementów ma kluczowe znaczenie, forma PDMS może być wzmocniona aluminiową ramą podczas etapu formowania³¹.
7. Usuń szkiełko z folią poliamidową i wzorzystą żywicą epoksydową, odrywając ją od formy PDMS (Rysunek 1 krok 8). Plazma aktywuje wzorzystą stronę epoksydową plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar_O2 przez 20 s.
8. Po wyjęciu folii poliimidowej z komory plazmowej, inkubować folię o wzorze epoksydowym w wodnym roztworze APTS (lub GPTS) o stężeniu 1% obj. przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Podobnie, przygotuj drugą folię poliimidową bez wzoru z komplementarną aktywacją silanu GPTS (lub APTS) o zawartości 1% obj. Po inkubacji wysuszyć zarówno strukturalną, jak i niestrukturalną folię sprężonym powietrzem.
9. Ułóż stronę epoksydową do góry na płaskiej powierzchni, wykorzystując napięcie powierzchniowe kropli wody pod spodem jako mediator, aby zapobiec zwijaniu się folii i zapewnić maksymalną płaskość. Następnie umieść drugą aktywowaną folię poliimidową na wierzchu i delikatnie przesuń palcem od jednego rogu do drugiego, aby się związały i uniknęły tworzenia się pęcherzyków.

3. Porty dostępu do dostarczania płynów

1. Przygotować płyty PDMS o grubości 4 mm na szalce Petriego zgodnie z krokami od 1.3.1 do 1.3.3 bez użycia wzorca SU8. Pokrój płytę na bloki PDMS o odpowiedniej wielkości, aby pokryć wszystkie porty wlotowe w chipie, bez zakrywania poszczególnych komór krystalizacyjnych chipa.
2. Plazma aktywuje zarówno chip, jak i blok PDMS plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbar_O2 przez 20 s. W celu wiązania chemicznego należy następnie inkubować każdą część w wodnym roztworze APTS lub GPTS o stężeniu 1% obj. przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Wysuszyć każdą część sprężonym powietrzem i docisnąć płytę PDMS do wióra foliowego.
3. Aby poprawić wiązanie, umieść chip na płaskiej płycie PDMS i przykryj go folią z tworzywa sztucznego, a następnie czystym szkiełkiem i metalowym blokiem. Na koniec należy nałożyć ciężarki do 1,4 N/^cm2 przez około 1 godzinę.
4. Przebij otwory dostępowe za pomocą stempla biopsyjnego 0,75 mm w każdym miejscu, w którym porty wlotowe i wylotowe są oznaczone w projekcie chipa i uszczelnij tył taśmą. Chip jest teraz dostępny dla każdej rurki o średnicy zewnętrznej odpowiadającej średnicy otworu (zgodnie z opisem w kroku 4.2).

4. Obróbka powierzchniowa

1. Przygotować rozcieńczenie 9% wag. fluoropolimeru w rozpuszczalniku fluorowym w stosunku 1:20 do końcowego stężenia 0,45% wag. Roztwory podstawowe i rozcieńczenia przechowywać w lodówce w ciemności w temperaturze 4 °C.
2. Załadować rozcieńczenie fluoropolimeru w stosunku 1:20 do strzykawki Luer-lock o pojemności 1 ml. Do strzykawki przymocować igłę 27G × 5/8", a następnie rurkę z PTFE do igły.
3. Podłącz rurkę do wylotu chipa rentgenowskiego i wstrzyknij roztwór roboczy fluoropolimeru przygotowany w kroku 4.1, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione.
4. Umieść wiór płaską stroną do dołu na płycie grzejnej o temperaturze 190 °C na 5 minut, aby odparować cały rozpuszczalnik i osadzić fluoropolimer w cienkowarstwowej powłoce.
   UWAGA: W przypadku korzystania z nowej geometrii należy sprawdzić, czy kanały nie zostały zatkane fluoropolimerem podczas tego procesu powlekania. Jeśli tak, należy dodatkowo rozcieńczyć roztwór podstawowy.

5. Preparat białkowy

1. Zważyć liofilizowaną taumatynę i rozpuścić ją w roztworze buforowym wymienionym w tabeli 2 do odpowiedniej objętości, aby uzyskać końcowe stężenie białka 40 mg mL-1.
2. Dializować izomerazę glukozy w stosunku do buforu wymienionego w tabeli 2 zgodnie z protokołem producenta.
3. Przygotować białko tioredoksynę, jak opisano wcześniej przez Schuberta i wsp.³⁰.
4. Zweryfikuj końcowe stężenia białka fotometrycznie, korzystając ze współczynników ekstynkcji podsumowanych w Tabeli 2, obliczonych przez oprogramowanie ProtParam³².
5. Przygotuj wszystkie roztwory przy użyciu ultraczystej wody i przefiltruj je filtrem 0,2 μm.
6. Odwirować roztwory białek w temperaturze 20 °C przez 15 minut w temperaturze 16100 x g i pobrać supernatant do eksperymentów krystalizacji.

6. Krystalizacja białek w chipie rentgenowskim

1. Aby skrystalizować białka w chipach mikroprzepływowych, wymieszaj równe ilości roztworu białkowego i roztworu strącającego. Stężenie białka, skład buforu i skład strącający zestawiono w tabeli 2. Przygotuj całkowitą objętość około 20 μl do napełnienia chipa mikroprzepływowego.
2. Natychmiast po wymieszaniu wstrzyknąć roztwór do portu wlotowego chipa za pomocą strzykawki, połączonej z igłą 27G × 5/8" i rurką PTFE o średnicy zewnętrznej 0,75 mm (szczegółowo w kroku 4.2).
   UWAGA: Procedura napełniania układu szeregowego wymaga wcześniejszego zalania chipa olejem fluorowanym, co najłatwiej jest zrobić, ładując olej fluorowany z portu wylotowego przed wstrzyknięciem roztworu krystalizacyjnego przez otwór wlotowy. Wszystkie etapy ładowania powinny być monitorowane za pomocą mikroskopu w celu kontrolowania zastosowanego ciśnienia w strzykawce i odpowiadającego mu natężenia przepływu."
3. Po napełnieniu chipa oddziel poszczególne komory krystalizacji, wtryskując olej fluorowany do portu wlotowego chipa. Uszczelnij chip, blokując wszystkie porty wlotowe i wylotowe chipa. Można to zrobić, wkładając spinacz do papieru.
   UWAGA: Ponieważ komory krystalizacji są wypełnione roztworem białkowym/strącającym, olej fluorowany wypełnia tylko kanał wlotowy chipa, nie wpływając na roztwór w komorach krystalizacji.
4. Aby naśladować kinetykę krystalizacji dyfuzji pary, umieść uszczelniony chip w temperaturze otoczenia i normalnej atmosferze, aby umożliwić skurczenie się kropelki w komorze krystalizacji przez odparowanie wody przez folię poliimidową.
5. Po zaobserwowaniu tworzenia się kryształów za pomocą mikroskopu lub pomiarów DLS (krok 7), należy przenieść cały chip mikroprzepływowy do odpowiedniego roztworu strącającego, aby zatrzymać dalsze parowanie ze studzienek krystalizacyjnych do czasu przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji rentgenowskiej.

7. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła w studniach krystalizacyjnych w chipie

UWAGA: Pomiary DLS zostały wykonane z mocą wyjściową lasera 100 mW, długością fali 660 nm, a rozproszone światło zostało wykryte pod kątem rozproszenia 142°. Ze względu na to, że wszystkie badane roztwory próbek były roztworami wodnymi, we wszystkich obliczeniach zastosowano współczynnik załamania światła wody (n = 1,33).

1. Umieść chip mikroprzepływowy w uchwycie płytki w formacie SBS instrumentu DLS za pomocą adaptera opisanego w kroku 8.1. Włóż adapter do urządzenia.
2. Ostrożnie wyreguluj ostrość lasera wewnątrz komory chipa mikroprzepływowego za pomocą zmotoryzowanego stolika x-,y-,z. Ponieważ chip mikroprzepływowy jest bardzo cienki, dostosuj poziom z, stosując małe przyrosty.
   UWAGA: Prawidłowa regulacja jest potwierdzana przez wysokie przecięcie i gładki ogon wynikowej funkcji autokorelacji pomiaru DLS. Można utworzyć plik kalibracyjny, aby dopasować położenie każdej pojedynczej studzienki krystalizacyjnej w chipie mikroprzepływowym, co pozwala na automatyczne pomiary DLS w kilku komorach w czasie.
3. Wykonuj każdy pomiar DLS w temperaturze 293 K przez 30 s i powtarzaj pomiar co 5 minut, aż do końca eksperymentu z krystalizacją.
   UWAGA: Po początkowym zarodkowaniu można śledzić rozkład promienia pomiarów DLS w czasie, a pomyślne tworzenie kryształów może być równolegle śledzone przez wbudowany mikroskop czytnika płytek DLS.

8. Gromadzenie danych dyfrakcyjnych

1. Adaptery do goniometrów liniowych
   1. Wydrukuj adaptery do goniometru płytkowego, aby ustawić i obrócić chipy rentgenowskie podczas zbierania danych krystalograficznych.
   2. Stwórz adaptery do goniometru bazowego na hobbystycznej drukarce 3D przy użyciu domyślnych ustawień parametrów zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Adaptery zostały zaprojektowane przy użyciu systemu 3D-CAD, a pliki współrzędnych adapterów są dołączone w ". Format pliku STL w suplemencie.
   3. Przymocuj chipy rentgenowskie do adaptera za pomocą taśmy dwustronnej.
2. Krystalografia rentgenowska in situ
   1. Zbieraj dane dyfrakcyjne przy użyciu wiązki o wielkości 10 × 5 μm (FWHM profilu Gaussa) w temperaturze 296 K. Użyj promieni rentgenowskich o energii 12,8 keV i strumieniu 2,2 · 10¹¹ fotonów · ^s-1 w tłumionej wiązce i zarejestruj wzory dyfrakcyjne za pomocą hybrydowego detektora pikseli Pilatus 6M.
      UWAGA: Urządzenia mikroprzepływowe zawierające kryształy taumatyny, izomerazy glukozy lub tioredoksyny są używane do eksperymentów krystalograficznych in situ w zakresie promieniowania rentgenowskiego na linii badawczej EMBL P14 synchrotronu PETRA III. Dostępna wielkość ogniska wiązki i strumień świetlny mogą się różnić w przypadku innych źródeł promieniowania rentgenowskiego. Liczba naświetlonych kryształów białka, liczba wzorów dyfrakcyjnych zarejestrowanych z każdego kryształu, zakres kąta oscylacji na ekspozycję oraz czas ekspozycji podsumowano w tabeli 3.
   2. Przetwarzaj zestawy dwóch następujących po sobie wzorów dyfrakcyjnych indywidualnie za pomocą programu XDS³³. Użyj skryptu bash "xds.sh" znajdującego się w suplemencie.
   3. Utwórz pliki HKL dla każdego zestawu danych ze wszystkich kryształów i skaluj je za pomocą oprogramowania XSCALE³³. Użyj skryptu powłoki bash "xscale.sh" w uzupełnieniu, aby utworzyć plik wejściowy dla XSCALE.
      UWAGA: Skalowane powinny być tylko zestawy danych kryształów, których współczynniki korelacji są większe niż 90 %, co wskazuje na wysoki stopień izomorfizmu. Do wyznaczenia powłoki o najwyższej rozdzielczości należy zastosować konserwatywne kryterium ‹I/σ(I)› (>2). Zastępowanie molekularne za pomocą programu MOLREP³⁴ z pakietu CCP4³⁵ można wykorzystać do uzyskania faz do dalszego budowania modelu przy użyciu współrzędnych 3D Banku Danych Białkowych (PDB) pokazanych w Tabeli 3.
   4. Doprecyzuj wszystkie struktury izotopowo za pomocą Refmac5^35,36 i użyj COOT³⁷ do wizualnej kontroli końcowego modelu.
      UWAGA: Cząsteczki rozpuszczalnika powinny być dodawane automatycznie podczas procesu rafinacji i muszą być sprawdzane w celu potwierdzenia chemicznie uzasadnionych pozycji. Wszystkie modele muszą zostać sprawdzone w celu zidentyfikowania wartości odstających Ramachandran.

9. Ocena danych

1. Uszkodzenia popromienne
   1. Przeanalizuj zanik mocy dyfrakcyjnej w czasie, korzystając z metody opisanej przez Owen et al³⁸. W tym celu należy obliczyć całkowitą sumę I/σ(I) (dostarczoną przez XDS³³) wszystkich indeksowanych odbić każdego ocenianego zestawu danych dyfrakcyjnych (2 kolejne wzorce dyfrakcyjne), aby użyć ich jako wartości odniesienia. Użyj skryptu bash "ISigma.sh" z suplementu.
   2. Znormalizuj moc dyfrakcyjną każdego zestawu danych do średniej mocy dyfrakcyjnej pierwszego zestawu danych.
   3. Przeanalizuj zmiany wartości Rmeas w czasie, pobierając wartości Rmeas z plików Correct.LP uzyskanych z XDS³³ (skrypt bash "Rmeas.sh" z suplementu).
2. Orientacja kryształu
   1. Określ kąty Eulera, aby uzyskać informacje o rozkładzie orientacji sieci krystalicznej w odniesieniu do laboratoryjnego układu współrzędnych. Oblicz kąty Eulera z macierzy orientacji XDS podanej w pliku wyjściowym XPARM³⁹ za pomocą oprogramowania Matlab. Użyj skryptu bash "rotation_matrix.sh", aby wyodrębnić macierz rotacji z każdego kryształu z pliku XPARM. Użyj pliku wyjściowego jako danych wejściowych w Matlabie, aby obliczyć kąty Eulera za pomocą funkcji Matlab rotro2eu.m (plik uzupełniający).
      UWAGA: Szczegółowy opis obliczeń został opublikowany przez Zarrine-Afsar et al⁴⁰.
   2. Przelicz uzyskane kąty Eulera z radianów na stopnie. Uzyskane kąty Eulera należy pogrupować dla wszystkich trzech płaszczyzn obrotu (xy, xz i zy) w klasach 10° i wykreślić je za pomocą oprogramowania Origin9.

Wyniki

Żywica epoksydowa jest doskonałym materiałem wypełniającym do produkcji chipów rentgenowskich. Jest tani, prosty i wytrzymały w obróbce bez konieczności stosowania specjalistycznych narzędzi (Rysunek 1). Zmniejszenie lepkości żywicy epoksydowej poprzez rozcieńczenie jej 40% wag. etanolem ułatwiło usunięcie nadmiaru żywicy powyżej dołka krystalizacyjnego, co zaowocowało określonymi oknami rentgenowskimi. Wyższe rozcieńczenia etanolu powodowały defekty utwardzonej żywicy. Analizując przekroje poprzeczne chipów rentgenowskich, określiliśmy, że całkowita grubość okienka po obu stronach wynosi około 19 μm, co jest bardzo zbliżone do nominalnej grubości zastosowanych folii poliimidowych wynoszącej od 2 × 7,5 μm (Rysunek 2)

Próby krystalizacji zostały wyizolowane w kilku nanolitrowych komorach reakcyjnych każdy, przy użyciu mechanizmu zaworu kapilarnego, jak opisano wcześniej⁴¹. Ta technika ładowania "przechowuj, a następnie utwórz" pozwala uniknąć utraty próbki z powodu martwej objętości kanału i może być łatwo wykonana ręcznie, eliminując potrzebę używania pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu⁴². Chip jest zalewany olejem fluorowanym przed załadowaniem próbki wodnej. Napięcie powierzchniowe na granicy faz olej-woda między olejem gruntującym a próbką wodną powoduje różnicę ciśnień na granicy faz. To ciśnienie Laplace'a zależy zarówno od promienia krzywizny, jak i napięcia powierzchniowego interfejsu. Aby zminimalizować jego energię, interfejs musi zminimalizować swoją powierzchnię, co jest równoznaczne z maksymalizacją jego głównych promieni krzywizny przy stałej objętości. Interfejs o niskiej krzywiźnie w szerokim kanale ma niższe ciśnienie Laplace'a niż interfejs o wysokiej krzywiźnie w wąskim segmencie kanału. W związku z tym korek próbki preferencyjnie wchodzi i przepływa przez szeroki kanał obejściowy, zamiast przepływać przez wąskie ograniczenia zaworu kapilarnego. Na koniec po zatyczce próbki podaje się olej fluorowany w celu oddzielenia studzienek próbki na niezależne kropelki.

Solidne i niezawodne obciążenie osiągnięto przy natężeniu przepływu do 1 mL/h zarówno w układzie szeregowym, jak i równoległym (Rysunek 3). W układzie 'szeregowym' zwężenia zaworu wlotowego i kapilarnego studni są sekwencyjnie połączone przez kanał obejściowy³¹. W przeciwieństwie do tego, w układzie "równoległym", dwa oddzielne kanały główne łączą tylko wszystkie wloty studzienek lub zawory kapilarne⁴³. Obie koncepcje układu zostały wcześniej połączone z kontrolą formuły w celu przesiewania kompozycji, co jest użytecznym aspektem krystalizacji białek^43,44. Konstrukcja szeregowa ma tylko dwa porty płynów, jeden wlot i jeden wylot. Ma mniej portów cieczy, dzięki czemu jest prostszy w budowie i obsłudze. Układ równoległy ma 4 porty płynów, 2 dla głównego kanału łączącego studnie i 2 do łączenia zaworów kapilarnych, aby umożliwić ucieczkę powietrza lub nadmiaru oleju. Ładowanie może więc odbywać się z obu stron kanału głównego. Ten układ ma ogólnie niższy opór przepływu dla równej liczby studni ze względu na krótsze obejście. Dlatego lepiej nadaje się do urządzeń o większej skali z dużą liczbą studzienek. Ponadto studzienki na próbki są zorientowane bliżej siebie, co zapewnia korzyści w przypadku automatycznego obrazowania.

Pełne obciążenie studni próbki zostało zaobserwowane dla obu układów, jeśli zostały zbudowane jako projekty o dwóch lub trzech wysokościach. W konstrukcji o dwóch wysokościach zarówno studzienka na próbkę, jak i kanały obejściowe mają równą wysokość. Konstrukcja o trzech wysokościach wymaga trzeciej maski, dodatkowej warstwy SU8 i stopnia wyrównania, aby jeszcze bardziej zapewnić, że studzienki na próbki staną się wyższe niż poprzednie kanały obejściowe. Ta różnica wysokości sprzyja wprowadzaniu próbki płynu do studni za pomocą tej samej zasady zaworów kapilarnych, która zatrzymuje przepływ w zwężeniach. W tym przypadku wyższy sufit studni odpowiada niższemu ciśnieniu Laplace'a posuwającej się menisku, a przepływ wzdłuż kierunku obejścia jest preferowany tylko po całkowitym napełnieniu studni, tak że zwężenia zaworu blokują dalszy przepływ i kierują go w dół obejścia. Jednak pomyślne obciążenie nie wymaga ściśle, aby studnie znajdowały się wyżej niż obejście, ponieważ odpowiednie zawory kapilarne można również uzyskać, odpowiednio dostosowując szerokości kanałów. Niemniej jednak, z naszego doświadczenia, wyższe studnie były znacznie bardziej wytrzymałe, a obciążenie wolne od wad zaobserwowano przy nawet dziesięciokrotnie wyższych natężeniach przepływu we wszystkich konstrukcjach o trzech wysokościach w porównaniu z ich odpowiednikami o dwóch wysokościach. Efekt ten był bardziej wyraźny w układzie równoległym.

Aby naśladować kinetykę krystalizacji dyfuzji pary, wykorzystano skończoną przepuszczalność folii poliimidowej do kontrolowania parowania wody w czasie. Eksperymentalne szybkości parowania określono ilościowo, monitorując zmianę objętości kropli w czasie, zrównując powierzchnię kropli i wysokość studni (Rysunek 4C). Parowanie ze studni krystalizacyjnych w chipie rentgenowskim nie przebiega w sposób liniowy, ponieważ kurcząca się powierzchnia kropli zbiegająca się ze wzrostem stężenia substancji rozpuszczonej powoduje zmniejszenie szybkości parowania w czasie⁴⁵. Początkowe parowanie następowało w przybliżeniu z szybkością liniową około 0,5 nL ^h-1 w studzienkach o geometrii układu szeregowego.

Aby lepiej zrozumieć kinetykę krystalizacji, wykonano pomiary DLS w studniach krystalizacji mikroprzepływowego chipa. Do wstępnych pomiarów DLS użyto chipa PDMS połączonego ze szklanym szkiełkiem, aby zapewnić lepsze właściwości optyczne w eksperymencie rozpraszania światła. Chip ten miał takie same wymiary studni jak chip rentgenowski. PDMS ma wyższą przepuszczalność pary wodnej niż poliimid okien poliimidowych w chipie rentgenowskim ⁴⁵. Ponieważ strumień skaluje się liniowo wraz z odległością, trajektoria parowania studni z okienkiem poliimidowym może być dopasowana do odpowiedniego okna PDMS o odpowiedniej grubości.

Wyniki DLS pokazują, że rozkład promienia zmienia się w czasie (Rysunek 4A-B), co pokazuje, że pomiary DLS pozwalają wykryć początkowe zarodkowanie, zanim zostaną zaobserwowane pierwsze cząstki krystaliczne. Informacje te mogą być wykorzystane do zarodkowania i hodowli monokryształów w każdym dołku poprzez zewnętrzną regulację szybkości parowania, a tym samym poziomów przesycenia na wczesnym etapie zarodkowania⁴⁶.

Układ rentgenowski został umieszczony na wydrukowanym w 3D adapterze do goniometru płytkowego kompatybilnego z SBS na linii EMBL synchrotronu P14 w PETRA III (Rysunek 5A). Alternatywnie, mniejsza ramka wydrukowana w 3D może być użyta do zamontowania chipów rentgenowskich do standardowych goniometrów linii badawczej²¹. Kryształy taumatyny mają wielkość 10 - 20 μm (Rysunek 5B) i ulegają dyfrakcji do rozdzielczości 2,0 A (Rysunek 5C). Zgodnie z oczekiwaniami, udział tła rentgenowskiego dwóch cienkich okien folii poliimidowych z chipa rentgenowskiego jest ograniczony do pierścieni rozpraszających polimer poliimidowy pod kątem 11 A (2 θ ~ 5 °) i 33 A (2 θ ~ 1,7 °) dla długości fali promieniowania rentgenowskiego 0,97 A. Te dwa pierścienie nie zakłócają przetwarzania danych. Zebrano całkowity zestaw danych z 83 kryształami taumatyny i zarejestrowano 10 wzorów dyfrakcyjnych z każdego kryształu z obrotem o 1° podczas każdej klatki. Parametry przetwarzania i udoskonalania danych, jak również statystyki zbioru danych taumatyny są wymienione i porównane z dwoma innymi zestawami danych izomerazy glukozy i tioredoksyny, które również zostały zebrane in situ, wymieniono w tabelach 3 i 4.

Intensywność zaniku znormalizowanej mocy dyfrakcyjnej w czasie została zbadana poprzez podzielenie zestawu danych taumatyny na pięć podzbiorów danych (użyto dwóch wzorców dyfrakcyjnych na podzbiór w celu utrzymania kompletnych zbiorów danych). Jak pokazano w Rysunek 6B, moc dyfrakcyjna zaczęła spadać po pierwszym podzbiorze danych i wynosiła poniżej 50% w czwartym podzbiorze danych. W rezultacie, wartości Rmeas w podzbiorach danych również rosną w czasie, co wskazuje na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem rentgenowskim podczas zbierania danych. Stawiamy hipotezę, że wolne rodniki powstające podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie szybko degradują sąsiednie kryształy w tym samym przedziale reakcyjnym. Na przykład, takie wtórne uszkodzenia spowodowane promieniowaniem rentgenowskim były mniej wyraźne w powiązanym podejściu eksperymentalnym, w którym kryształy zostały rozmieszczone na znacznie większym obszarze w warstwie poliimidowej typu sandwich²¹. Aby zminimalizować ogólne uszkodzenia spowodowane promieniowaniem rentgenowskim, w temperaturze pokojowej należy zebrać tylko niewielką liczbę wzorów dyfrakcyjnych z danego kryształu. Ponadto tylko jeden pojedynczy kryształ białka powinien być odsłonięty na każdy przedział chipa mikroprzepływowego. Niemniej jednak wszystkie modele struktur dopracowane na podstawie przetworzonych zbiorów danych wykazują bardzo dobrą stereochemię i odpowiednie statystyki (tab. 4). Ponadto wszystkie końcowe mapy gęstości elektronowej były bardzo dobrej jakości.

W poprzednich metodach krystalografii na przezroczystych chipach rentgenowskich, orientacja i rozmieszczenie kryształów musiały być celowo manipulowane, aby uzyskać losowy rozkład orientacji kryształów⁴⁰ lub zostało uzyskane przez ruchy kryształów w warstwie cieczy²¹. Aby ocenić orientację kryształów w przezroczystych rentgenowskich chipach mikroprzepływowych opisanych w tym protokole, określono orientację komórek elementarnych wszystkich odsłoniętych kryształów w odniesieniu do laboratoryjnego układu współrzędnych. W przypadku dwupiramidalnych kryształów taumatyny zaobserwowano niewielką preferencję (Rysunek 7A), podczas gdy uzyskaliśmy szeroki rozkład dla kryształów izomerazy glukozy (Rysunek 7B). Doszliśmy do wniosku, że w skali nanometrowej większość materiałów wykazuje znaczną chropowatość. W związku z tym kryształy mogą spontanicznie zarodkować na powierzchni w znacznie mniej stronniczych orientacjach. Takie małe jądro kryształu może być zablokowane w orientacji, jednocześnie kontynuując wzrost do odpowiednich rozmiarów bez zmiany orientacji względem normalnej powierzchni. W rzeczywistości zarodkowanie kryształów za pośrednictwem powierzchni od dawna jest uciążliwe dla krystalografów próbujących zapętlić dołączony kryształ z powierzchni bez uszkadzania kryształu w tym procesie. Tutaj możemy bezpośrednio wykorzystać takie kryształy do zbierania danych dyfrakcyjnych. Istnieją jednak ograniczenia specyficzne dla systemu, ponieważ tioredoksyna wykazała silną preferencję dla pewnych orientacji w płaszczyznach xy, xz i yz (Rysunek 7C). Pokazane przykłady pokazują, że rozkład orientacji zależy nie tylko od środowiska wzrostu, ale także od kształtu kryształu. Kryształy tioredoksyny mają wydłużone kształty, które mają tendencję do wzrostu w preferowanej orientacji, podczas gdy tetragonalne dwupiramidowe kryształy taumatyny lub rombowe kryształy izomerazy glukozy nie wykazują tego zachowania. Jednak we wszystkich przypadkach, nawet przy preferowanych orientacjach, dostępny zakres rotacji kryształów skutkował wystarczająco dobrym pokryciem przestrzeni odwrotnej, a tym samym kompletnymi zestawami danych dla wszystkich badanych białek. W związku z tym nie trzeba było podejmować żadnych dodatkowych działań przy wyborze kryształów do naświetlania promieniami rentgenowskimi.

Rysunek 1: Schemat wytwarzania mikroprzepływowych chipów rentgenowskich. (1) SU-8 jest dozowany na podłoże krzemowe i powlekany wirowo w celu uzyskania pożądanej grubości warstwy. (2) Fotorezystor jest wystawiony na działanie promieniowania UV przez maskę. (3) Nienaświetlony fotorezystor jest następnie wywoływany przez kolejno mycie PGMEA i izopropanolu, w wyniku czego powstaje (4) mistrz SU-8 do dalszych etapów odlewania. (5) PDMS wylewa się na formę PDMS i (6) po utwardzeniu formy PDMS odrywa się od mastera SU-8. (7a) Klej epoksydowy jest dozowany na formę PDMS i (7b) aktywowana folia poliimidowa jest chemicznie związana z żywicą epoksydową. (8) Po utwardzeniu folia poliimidowa z wzorzystą cienką folią epoksydową jest odrywana od formy PDMS. (9) W końcowym etapie urządzenie jest pokrywane drugą folią poliimidową, aby uzyskać zamknięty mikroprzepływowy chip o niskim promieniowaniu rentgenowskim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zdjęcie (po lewej) i obrazy mikroskopowe przekrojów końcowych chipów. Pokazany jest reprezentatywny segment kanału (środek) i studzienka krystalizacyjna (po prawej) z dwóch oddzielnych chipów. Strzałki wskazują zmierzone odległości. Wszystkie wymiary podane są w μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematy projektów studni krystalizacyjnych z [A] równoległym lub [B] układem szeregowym, widzianym z góry i z boku, z wymiarami podanymi w μm. Typowe wysokości kanałów wynosiły: obejście 50 μm, studnia krystalizacyjna 50-60 μm, zawór kapilarny 5-10 μm, co odpowiada objętościom studni około 2,5 nL (układ równoległy) i 8 nL (układ szeregowy). Reprezentatywne zachowanie ładowania studni pokazano przy użyciu barwników spożywczych. Chip zagruntowano 12% wag. 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanol w FC-43, zanim barwnik spożywczy został wstrzyknięty do studzienek magazynowych. Białe strzałki wskazują kierunek przepływu. Obrazy poglądowe załadowanych urządzeń pokazują, że wszystkie studzienki są załadowane bez wad, co ilustruje solidne ładowanie próbki. Układ równoległy jest zilustrowany jako projekt o trzech wysokościach, z odwiertami krystalizacyjnymi wyższymi niż obejście, podczas gdy układ szeregowy jest przedstawiony jako projekt o dwóch wysokościach, w którym studnie i obejście mają równą wysokość. Typowe natężenia przepływu wynosiły około 150 μl/h podczas załadunku, ale zaobserwowano obciążenie wolne od wad dla natężeń przepływu do 1 mL/h w układzie o trzech wysokościach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dynamiczne rozpraszanie światła in situ w krystalizacji w czasie. [A] Mikroskopowa seria obrazów studni krystalizacji. Przechowywana kropla w sposób ciągły kurczy się, gdy para wodna odparowuje z czasem. Pierwsze mikrokryształy taumatyny można zaobserwować po 4 godzinach. [B] Odpowiedni hydrodynamiczny rozkład promieni cząstek taumatyny zmierzony za pomocą DLS podczas tego samego procesu krystalizacji sfotografowany w [A]. Tworzenie się frakcji o drugim promieniu, wskazującej na początkowe zdarzenia zarodkowania, można zaobserwować po około 1-2 godzinach. [C] Reprezentatywny spadek objętości dwóch objętości kropel odniesienia spowodowany utratą wody przez parowanie w czasie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ. [A] Poszczególne układy mikroprzepływowe są montowane za pomocą wydrukowanego w 3D adaptera (niebieskiego) na goniometrze płytkowym. [B] Kryształy taumatyny w chipie mikroprzepływowym podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, zobrazowane przez mikroskop in-line na linii badawczej P14. [C] Dyfrakcję kryształów taumatyny zarejestrowano z rozdzielczością 2,0 A, przy pomijalnie niskim tle. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ocena danych dyfrakcyjnych z kryształów taumatyny w chipie mikroprzepływowym, zarejestrowanych w temperaturze pokojowej. [A] Gęstość elektronowa wyrafinowanego modelu taumatyny przy użyciu zestawu danych ramki 1-2 (niebieskie kontury przy 1,5 σ). [B] Intensywność rozpadu kryształów taumatyny w funkcji dawki promieniowania rentgenowskiego. [C] Ewolucja wartości Rmeas w stosunku do dawki promieniowania rentgenowskiego. Wykresy pudełkowe w [B] i [C] z kwartylami (górne wartości 75%, wartości mediany 50%, dolne wartości 25% i średnia) oraz wąsami z 95% przedziałami ufności reprezentują rozpad intensywności dyfrakcji i Rmeas wszystkich odsłoniętych kryształów (n = 83). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Rozkład orientacji komórek elementarnych w folii mikroprzepływowej w stosunku do laboratoryjnego układu współrzędnych. [A] Dwupiramidalne kryształy taumatyny wykazały szeroki rozkład orientacji obejmujący prawie 180° w płaszczyźnie xy- (niebieski), xz (zielony) i yz-(czerwony). [B] Izomeraza glukozy również wykazuje szeroką dystrybucję, podczas gdy [C] tioredoksyna wykazywała silną preferencję dla pewnych orientacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Warstwa SU8	Wirujący płaszcz	Pieczenie wstępne	Wystaw	Po wypieku
		[65 / 95 °C]		[65 / 95 °C]
1warstwa: Studnie	1000 obr./min	0 / 10 min	200 mJ/cm2	1 / 4 min
15 μm SU8-3010
2warstwa: Bypass	2000 obr./min	0 / 16 min	220 mJ/ cm2	1 / 5 min
35 μm SU8-3025
3 warstwa: Zawory	3000 obr./min	0 / 3 min	150 mJ/ cm2	1 / 2 min
5 μm SU8-3005

Tabela 1: Przykład procesu SU8 dla trójwarstwowego równoległego układu rentgenowskiego. To uporządkowanie warstw pozwoli na odlewanie formy PDMS do produkcji chipów rentgenowskich. Aby bezpośrednio uformować PDMS podczas prototypowania, odwróć kolejność warstw podczas produkcji głównej, aby zacząć od 3. warstwy, aby zamiast tego zakończyć na 1. warstwie.

tabletki powlekane tabletki powlekane tabletki powlekane

białko	Stężenie białka	Bufor białkowy	Środek strącający	Grupa kosmiczna, wpis PDB	Współczynnik ekstynkcji [M-1 cm-1]
Taumatyna (Thaumatococcus daniellii)	40 mg tabletki powlekane mL-1	50 mM Bis-Tris, pH 6,5	1,1 M winian sodu, 50 mM Tris, pH 6,8	I4222, 1LR2	Numer katalogowy 29420
Izomeraza glukozy (Streptomyces rubiginosus)	25 mg tabletki powlekane mL-1	10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,0	100 mM Bis-tris, 2,7 M siarczan amonu, pH 5,7	I222, 4ZB2	Numer katalogowy: 46410
Tioredoksyna (Wuchereria bancrofti)	34 tabletki powlekane mL-1	20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0	27,5 % PEG1500, 100 mM bufor SPG, pH 6,3	P41212, 4FYU	Numer katalogowy: 24075

Tabela 2: Warunki krystalizacji i grupy przestrzenne przygotowanych kryształów białka, w tym współczynnik ekstynkcji i kod pdb.

TGL szt. powiedział: Rozdział

białko	Liczba naświetlonych kryształów	Liczba wzorów dyfrakcyjnych na kryształ	Zakres oscylacji na ekspozycję [°]	Czas naświetlania [ms]	Wpis PDB dla MR
Taumatyna (Thaumatococcus daniellii)	Rozdział 103	10	1	Rozdział 40	Zobacz materiał 1LR2
Izomeraza glukozy (Streptomyces rubiginosus)	Rozdział 69	100	0,1	Rozdział 80	4ZB2
Tioredoksyna (Wuchereria bancrofti)	68	10	1	Rozdział 40	4FYU

Tabela 3: Parametr zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej.

powiedział: pkt. szt. TGL pkt. pkt. pkt. jest w stanie uzyskać informacje od 2, pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Statystyki gromadzenia danycha	Thaumatin (Klatka 1-20)	izomeraza glukozy (ramka 1-100)	Tioredoksyna (Klatka 1-10)
Linia badawcza		P14
Długość fali [A]		0.96863
Grupa kosmiczna	P4121 2	I222	P42212
Parametry komórki elementarnej: a = b, c [Å]	58,62, 151,48	93.91, 99.60, 103.04	58.45, 151.59
Liczba kryształów	Rozdział 101	Rozdział 41	Rozdział 34
Całkowita oscylacja [°]	10	10	10
Uchwała [A]	30.1.1989 (1,95 – 1,89)	30.1.1975 (godz. 1.80 – 1.75)	30.3.2000 (godz. 3.20 – 15.00)
Temperatura [K]	Rozdział 296	Rozdział 296	Rozdział 296
R p.i.m.b	7,5 (25,5)	8,8 (28,0)	9,1 w stosunku do 33,2
Zmierzone odbicia	Numer katalogowy: 1553200	Numer katalogowy: 690000	1111196
Wyjątkowe odbicia	Numer katalogowy: 21850	Numer katalogowy: 48942	Numer katalogowy: 44449
Średnia I/σ(I)	6,07 (1,78)	5,85 (1,66)	4,08 (1,47)
Mn(I) korelacja połówkowa zbiorów CC(1/2)	96,2 (72,2)	95,8 (68,2)	97,9 (75,3)
Kompletność [%]	99,8 (100,0)	100,0 (99,9)	99,9 (100,0)
Nadmiarowości	71,1	Rozdział 14,1	25
Statystyki uściślania
Zakres rozdzielczości [Å]	30.01.1989	30.01.1975	30.03.2000
R/R wolne [%]	18,8/23,9	18,1/20,5	18,9/23,1
Atomy białek	1550	3045	Numer katalogowy 1129
Cząsteczki wody	51 Rozdział 51	Rozdział 111	Rozdział 164
Cząsteczki ligandów	20	0	0
Odchylenie wartości skutecznej
Długość wiązania [A]	0,02	0,026	0,01
Kąt wiązania [°]	Informacja o tym, że produkt leczniczy	Pytanie 2,22	1,43
Współczynnik B [A2]
białko	Rozdział 22,6	20	50
Woda	Pytanie 25,1	Z dnia 27,1 ust. 27	29,7
Ligand	Dnia 20,4
Analiza wykresu Ramachandrana
Regiony objęte klauzulą najwyższego uprzywilejowania [%]	Nr 97,67	95,32	Nr 96,13
Dozwolone regiony [%]	Godzina 2,44	Rozdział 4.16	Pytanie 3,64
Regiony z hojnie dozwolonymi [%]	0,49	0,52	0,23
a: Wartości w nawiasach dotyczą powłoki o najwyższej rozdzielczości.
b: (), gdzie I (hkl) jest średnią intensywnością odbić hkl, Σhkl jest sumą wszystkich odbić, a Σi jest sumą pomiarów odbicia hkl w i.

Tabela 4: Statystyki zbierania danych z taumatyny, izomerazy glukozy i tioredoksyny.

Plik uzupełniający 1: chip_geometry.dwg. Plik CAD z zastosowanymi geometriami wiórów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: goniometer_adapter.stl. STL-file określający adapter goniometru rentgenowskiego z chipem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: xds.sh. Skrypt Bash do tworzenia plików wejściowych do przetwarzania klinów danych dyfrakcyjnych przez XDS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: xscale.sh. Skrypt Bash do scalania danych dyfrakcyjnych z podzbiorów i tworzenia pliku HKL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: ISigma.sh. Skrypt Bash do wyodrębniania wartości ISigma ze wszystkich poszczególnych podzbiorów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Rmeas.sh. Skrypt Bash do wyodrębniania wartości Rmeas ze wszystkich indywidualnych podzbiorów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: rotation_matrix.sh. Skrypt Bash do przygotowania pliku wejściowego dla Matlaba do obliczenia kątów Eulera z macierzy rotacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Produkujemy urządzenia mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej in situ poprzez modelowanie żywicy epoksydowej jako materiału wypełniającego i folii poliimidowej jako materiału okiennego. Nasza procedura zoptymalizowała różne etapy procesu produkcyjnego w porównaniu z poprzednimi projektami chipów rentgenowskich^16,21. Zmniejszyliśmy grubość okna, a tym samym rozproszenie tła, jednocześnie ułatwiając produkcję, ponieważ wymagana jest mniejsza liczba etapów procesu. Krystalizacja in situ przy użyciu opisanego protokołu przynosi znaczne korzyści. Umożliwia zbieranie danych dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej, a tym samym wyklucza potrzebę ochrony kriogenicznej, która w niektórych przypadkach wiąże się z ryzykiem wprowadzenia artefaktów do struktury białka. Co więcej, kryształy nie są poddawane naprężeniom fizycznym, ponieważ można uniknąć przenoszenia kryształów z ich rodzimego środowiska. Dzięki tej procedurze kryształy zachowują swoją najwyższą jakość i nie są poddawane żadnej obróbce.

Z naszego doświadczenia wynika, że najbardziej krytyczne kroki w ramach protokołu koncentrują się na kontrolowaniu procesu krystalizacji. Parametry pozwalające uzyskać odpowiednie do promieniowania rentgenowskiego kryształy o odpowiednich wymiarach muszą być zidentyfikowane empirycznie i nie mogą być uzyskane bezpośrednio z eksperymentów dyfuzji pary. Stosowanie identycznych stężeń białka i środka strącającego nie zawsze skutkowało kryształami w różnych chipach, a czasami w różnych dołkach w tym samym chipie. Wskazuje to, że należy dokładnie rozważyć wszystkie czynniki wpływające na zarodkowanie i wzrost kryształów, takie jak skład ługu macierzystego lub kinetyka krystalizacji (poprzez trajektorię parowania). Ponieważ większe kryształy ulegają dyfrakcji do wyższej rozdzielczości, idealnie rosną odpowiednio duże kryształy. Proces zarodkowania i wzrostu kryształów może być śledzony za pomocą pomiarów DLS. Regulacja ostrości lasera w cienkich przedziałach krystalizacyjnych chipa o grubości ~50 μm może być trudna i może wymagać starannego ręcznego wyrównania. Dzięki zastosowaniu odwiertów głębszych niż 100 μm, automatyczne wyrównywanie lasera było wykonalne i niezawodne, dzięki czemu wiele odwiertów można było monitorować za pomocą zautomatyzowanych schematów akwizycji.

Chipy rentgenowskie na bazie poliimidu wytwarzają tylko niskie tło, a my wykazujemy przydatność tych urządzeń do rutynowego zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, rozwiązując struktury dla trzech modelowych białek. Najlepsza rozdzielczość uzyskana w chipie różniła się, w porównaniu z poprzednio osiąganymi rozdzielczościami, od znacznie większych kryształów białkowych i konwencjonalnego zbierania danych rentgenowskich. Może to wynikać z kilku czynników, a dalsza optymalizacja warunków krystalizacji może jeszcze bardziej poprawić dyfrakcję. Możliwe było zebranie danych dyfrakcyjnych in situ z rozdzielczością do 1,8 A przy zastosowaniu kryształu o wymiarach mniejszych niż 30 μm. Szczegółowa analiza danych dyfrakcji taumatyny dostarczyła informacji na temat uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Aby ograniczyć zakres uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, tylko jeden pojedynczy kryształ powinien być odsłonięty na każdy przedział w urządzeniu mikroprzepływowym, ponieważ może dojść do dyfuzji rodników do i w sąsiednich kryształach. Aby zwiększyć szybkość gromadzenia danych, powinno to zostać zautomatyzowane w przyszłości.

Ze względu na morfologię kryształów w niektórych przypadkach może wystąpić preferowana orientacja. Tak było na przykład w przypadku zestawu danych dotyczących tioredoksyny, w którym kryształy miały zdecydowanie preferowaną orientację w stosunku do okien chipów. Nawet tutaj udało nam się zebrać kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych. Jeżeli kryształy wykazują preferowaną orientację w chipie, a w szczególności, jeśli odpowiadająca im grupa przestrzenna ma również niską symetrię, wówczas kompletność zbioru danych powinna być monitorowana podczas zbierania w taki sposób, aby można było zebrać wystarczające wzory dyfrakcyjne.

Badania czasowo-rozdzielcze z wykorzystaniem tych chipów są bezpośrednio możliwe przy użyciu reakcji indukowanych światłem z podejściem pompa-sonda. Należy wyjaśnić przepuszczalność światła z folii poliimidowej dla lasera pompującego i alternatywnie można zastosować optycznie przezroczysty poliimid lub COC. Obecne geometrie mikroprzepływowe nie pozwalają na eksperymenty z mieszaniem substratu po wyhodowaniu kryształów. Spodziewamy się jednak, że opisany protokół wytwarzania chipów rentgenowskich będzie również odpowiedni dla takich projektów mieszania zarówno dla dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w czasie, jak i podejścia rozpraszania¹⁹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SU-8 Seria 3000	MicroChem Corp.	SU-8 3000	Photoresist
PGMEA	Sigma-Aldrich	484431	Developer
			izopropylowy
Etanol
Rozpuszczalnik Klej epoksydowy	UHU	Plus Schnellfest 5 min	Klej epoksydowy
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184	Folia silikonowa
Kapton	Dupont/ Amerykański gatunek Durafilm	HN, rozstaw 30 (7,5 μ m)	folia poliamidowa
APTS	Sigma-Aldrich	440140	Chemiczny
GPTS	Sigma-Aldrich	440167	Chemiczny
Cytop CTX-109AE	Asahi Glass Co. Ltd	Cytop CTX-109AE	Powłoka fluoropolimerowa Cytop
CT-Solv 100E	Asahi Glass Co. Ltd	CT-Solv 100E	Cytop fluororozpuszczalnik
HFE-7500	3M	Novec 7500	Olej fluorowany
AutoCAD	AutoDesk Inc.	AutoCAD	CAD Software
Biopsy Punch	Harris	Uni-core 0,75 mm
Maska fotograficzna	JD Photo Data
3-calowy wafel	University Wafel		Silicon wafer
Mask aligner	SÜ SS MicroTec	MJB4	Maska wyrównująca
mikser PDMS	Thinky	ARE-250
Maszyna plazmowa	Diener elektroniczna	Zepto
Thaumatin	Sigma Aldrich	T7638	Białko
Glukoza Izomeraza	Hamton Research	HR7-102	Białko
Bis-Tris	Sigma Aldrich	B9754	Chemiczny
Winian sodu	Merck	106664	Chemiczny
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10812846001	Chemiczny
HEPES	Carl Roth	6763.2	Chemiczny
chlorek magnezu	Sigma Aldrich	208337	Chemiczny
siarczan amonu	Sigma	Aldrich A4418	Chemiczny
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Chemiczny
chlorek sodu	Sigma Aldrich	1064060250	Chemiczny
PEG1500	Wymiary molekularne	MD2-100-6	Chemiczny
bufor SPG	Jena Bioscience	CSS-389
Spektrofotometr chemiczny Light600	XtalConcepts		DLS Instrument
Nanodrop	Thermo Scientific
Zentrifuge	Eppendorf
Ultimaker2	Drukarka 3D	Ultimaker
Drukarka	3D	Form2 Formlabs
Filtr Amicon	Sartorius Stedim		0,2 i mikro; m filtr
Rurki	Adtech Polymer Engineering Ltd	Bioblock/05	Rurka PTFE 0,3 mm Średnica wewnętrzna x 0,76 mm Średnica zewnętrzna
Strzykawki	Igła do	końcówek Luer-Lock 1 ml	309628
	Igła Terumo Agani	AN*2716R1	27Gx5/8"