Artykuł metodologiczny

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57133

⸱

24 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Free Electron Laser Science, DESY, 2Department of Physics, University of Hamburg, 3Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Laboratory for Structural Biology of Infection and Inflammation, University of Hamburg, 4The Hamburg Center for Ultrafast Imaging, University of Hamburg, 5Integrated Biology Infrastructure Life-Science Facility at the European XFEL (XBI), 6European Molecular Biology Laboratory, EMBL c/o DESY, 7Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Streszczenie

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych o niskim tło rentgenowskim, zoptymalizowanych pod kątem krystalografii szeregowej opartej na goniometrze. Urządzenia są wzorowane na kleju epoksydowym przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Dołki na próbki są obustronnie przykryte okienkami z polimerowej folii poliimidowej, które umożliwiają zbieranie danych dyfrakcyjnych przy niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Ta metoda produkcji jest mało wymagająca i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowym środowisku laboratorium badawczego. Protokół projektowania i produkcji chipów wykorzystuje zawory kapilarne do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na zdefiniowane kropelki o rozmiarach nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku martwej objętości kanału i może być łatwo wykonany ręcznie bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Opisujemy, w jaki sposób izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów mogą być monitorowane in situ przez dynamiczne rozpraszanie światła w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Po wyhodowaniu odpowiednich kryształów można zebrać kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ o stałym celu w temperaturze pokojowej. Protokół zapewnia niestandardowe skrypty do przetwarzania zestawów danych dyfrakcyjnych przy użyciu zestawu narzędzi programowych do rozwiązywania i udoskonalania struktury krystalicznej białka. Takie podejście pozwala uniknąć artefaktów, które mogą zostać wywołane podczas kriokonserwacji lub ręcznego obchodzenia się z kryształami w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych. Przedstawiamy i porównujemy trzy struktury białkowe, które zostały rozwiązane przy użyciu małych kryształów o wymiarach około 10-20 μm wyhodowanych w chipie. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół szczegółowo opisuje, jak wytworzyć niestandardowy przezroczysty chip mikroprzepływowy przeznaczony do krystalografii szeregowej in situ. Ponieważ prawie każdy kryształ może być używany do zbierania danych dyfrakcyjnych, te mikroprzepływowe chipy są bardzo wydajną metodą dostarczania kryształów.

Wprowadzenie

Znajomość struktury 3D białka jest niezbędna do zrozumienia jego funkcjonalności. Struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej są dotychczas najczęściej uzyskiwane za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Technika ta wystawia kryształy białek na działanie promieniowania rentgenowskiego, a powstałe wzory dyfrakcyjne są następnie analizowane w celu określenia struktury i udoskonalenia. W tradycyjnej krystalografii rentgenowskiej kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych jest rejestrowany z pojedynczego, najlepiej dużego kryształu w temperaturach kriogenicznych. Takie kryształy jednak w większości przypadków nie są trywialne do wyhodowania, a zidentyfikowanie odpowiednich warunków kriokonserwacji może samo w sobie stać się wyzwaniem, a czasami może również powodować odchylenia od natywnej struktury białka5.

Ostatnie osiągnięcia technologiczne w rentgenowskim laserze na swobodnych elektronach (FEL) i liniach synchrotronowych pozwoliły na rozwiązywanie struktur z mniejszych kryształów, ponieważ pojawiły się nowe linie mikroskupiające wiązkę, zwiększona jasność wiązki promieniowania rentgenowskiego i ulepszone detektory promieniowania rentgenowskiego6,7. Zazwyczaj małe kryształy są łatwiejsze do wyhodowania niż duże i wolne od wad kryształy8,9. Jednak małe kryształy cierpią z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim znacznie szybciej niż duże kryształy. Dzieje się tak, ponieważ w porównaniu z dużym kryształem, wyższa dawka promieniowania rentgenowskiego musi być rzutowana na mniejszą objętość kryształu, aby załamać się do porównywalnej rozdzielczości. Dlatego nawet ochrona kriogeniczna często nie wystarcza do zarejestrowania pełnego zestawu danych dyfrakcyjnych z pojedynczego mikrokryształu.

Aby pokonać tę przeszkodę, krystalografia szeregowa stała się metodą z wyboru do zbierania i łączenia wzorów dyfrakcyjnych z wielu losowo rozmieszczonych mikrokryształów w celu uzyskania kompletnego zestawu danych. Uszkodzenia kryształów wywołane promieniowaniem są minimalizowane poprzez rozłożenie całkowitej dawki promieniowania rentgenowskiego użytej do rozwiązania struktury białkowej na dużą liczbę kryształów5,10. W eksperymencie FEL "dyfrakcja przed zniszczeniem" każdy kryształ jest używany tylko do jednej ekspozycji przy użyciu femtosekundowych impulsów promieniowania rentgenowskiego. Z kolei linie mikrofokusowe przy źródłach synchrotronowych trzeciej generacji mogą wykonywać krystalografię szeregową z krótkimi czasami naświetlania promieniowaniem rentgenowskim w ciągu kilku milisekund11,12,13,14. Jednak bez oscylacji lub rotacji kryształów podczas zbierania danych, można zarejestrować tylko częściowe odbicia Bragga, a zatem do określenia struktury zwykle wymagane są dziesiątki tysięcy lub więcej wzorów dyfrakcyjnych15. Do tej pory opracowano różnorodny zestaw metod dostarczania próbek do krystalografii seryjnej, co zostało niedawno sprawdzone14,16,17,18,19. Wśród nich z powodzeniem połączono kilka strategii dostarczania próbek opartych na stałym celu, z rotacją kryształów podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, dzięki czemu znacznie mniej wzorów dyfrakcyjnych może dostarczyć równie kompletnych zestawów danych, a jednocześnie zużywać mniej próbki w porównaniu z klasycznymi eksperymentami krystalografii szeregowej, w których rejestrowane są nieruchome obrazy7,16,20,21,22,23,24.

Przedstawiamy protokół do produkcji urządzeń mikroprzepływowych o niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Urządzenia są wykonane z 5-minutowego kleju epoksydowego przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in-situ w temperaturze pokojowej, które korzystają z integracji przygotowania próbki bezpośrednio z zestawem rentgenowskim, jak ma to miejsce w przypadku badań rozdzielczych w czasie, które przebiegają kinetyką wywołaną mieszaniem18,19. Kanały mikroprzepływowe są obustronnie osłonięte polimerową folią poliimidową, w wyniku czego powstają okienka rentgenowskie o łącznej grubości około 16 μm, które pozwalają na obrazowanie tła o niskim promieniowaniu rentgenowskim. Wszystkie użyte materiały zapewniają dobrą odporność na rozpuszczalniki. Ta metoda produkcji jest stosunkowo prosta i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowych warunkach laboratorium badawczego.

W przykładzie zastosowania opisujemy chipy do krystalografii szeregowej opartej na goniometrze o stałym celu. Po pierwsze, omówiono zagadnienia projektowe i produkcyjne dotyczące stosowania zaworów kapilarnych do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na wybraną liczbę kropel o wielkości nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku objętości martwej kanału, a dzielenie można łatwo przeprowadzić ręcznie, bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Takie izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów są monitorowane in situ za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Wcześniej wykazano, że pomiary DLS mogą być wykonywane w urządzeniach mikroprzepływowych składających się ze struktury polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonej ze szkiełkiem podstawowym 25,26. Ponieważ warstwa poliimidowa ma wysoką transmisję dla długości fal dłuższych niż 550 nm, podejście to można rozszerzyć również na pomiary w przezroczystych chipach rentgenowskich, przy użyciu odpowiedniej długości fali lasera27,28. Na podstawie wyników DLS można zaobserwować początkowe zarodkowanie, a dalsze parowanie kropel można zatrzymać, aby uzyskać mniej, ale większe kryształy białka.

Po wyhodowaniu wystarczającej ilości kryształów, kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej mogą być następnie zebrane za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Zestawy danych dyfrakcyjnych są przetwarzane przy użyciu zestawu narzędzi programowych i niestandardowych skryptów w celu rozwiązania struktury krystalicznej białka. Technika ta pozwala uniknąć artefaktów często indukowanych podczas kriokonserwacji stosowanej w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych.

Porównujemy trzy docelowe struktury białek, które zostały rozwiązane przy użyciu około 10-20 μm małych kryształów hodowanych w chipie do rozdzielczości lepszej niż 2 A. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół ten może być stosowany do kryształów białek, które ulegają dyfrakcji zarówno do wysokiej, jak i niskiej rozdzielczości (1,7 A do 3,0 A). Ponieważ prawie każdy kryształ może być użyty do dyfrakcji, niewiele próbki jest marnowane, co sprawia, że jest to bardzo wydajna metoda dostarczania kryształów.

Ten protokół zawiera szczegółowy przewodnik, jak przygotować przezroczyste mikroprzepływowe chipy rentgenowskie do krystalizacji białek in situ i zbierania danych dyfrakcyjnych. Procedura została starannie zaprojektowana, aby czerpać korzyści z precyzji mikroprzepływowej bez konieczności korzystania z zaawansowanego sprzętu w laboratorium. Ponadto zbieranie danych na linii synchrotronowej może być prowadzone bez konieczności korzystania ze specjalistycznego goniometru lub nawilżacza, co ułatwia odtworzenie wyników przez osoby niebędące ekspertami. Przedstawiona technika może być zastosowana do seryjnego gromadzenia danych z krystalografii milisekundowej w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym utrzymaniu minimalnych uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i bez wprowadzania naprężeń do kryształów po wzroście poprzez krioochronę lub obchodzenie się z kryształami. W związku z tym opisana metoda jest odpowiednia dla każdego projektu krystalizacji białek.

Protokół

1. Projektowanie układów scalonych i produkcja główna

  1. Konstrukcja maski
    1. Nakreśl żądane geometrie kanałów za pomocą odpowiedniego programu do rysowania CAD. Dla każdej warstwy fotorezystu przygotuj indywidualną maskę. Wszystkie projekty użyte w tym protokole są szczegółowo omówione w sekcji wyników i są dostępne jako AutoCad '. DWG' w pliku uzupełniającym 1.
      UWAGA: W przypadku budowania urządzeń opartych wyłącznie na PDMS współczynnik proporcji wysokości do szerokości kanału nie powinien przekraczać 1:10, aby zapobiec zapadaniu się kanału. Zarówno folia poliimidowa, jak i utwardzona żywica epoksydowa są bardziej wytrzymałe i w zasadzie powinny pozwalać również na wyższe proporcje. Celowo jednak nie przekroczyliśmy proporcji 1:10, aby wstępne projekty mogły być prototypowane jako tradycyjne urządzenia PDMS.
    2. Przetłumacz pliki CAD na fotomaski z folii emulsyjnej. Użyj nominalnej rozdzielczości 64k DPI, aby umożliwić dokładne funkcje do rozmiaru około 5 μm.
      UWAGA: Można to zrobić za pośrednictwem usługi komercyjnej. Usługi obrazowania mogą preferować różne konwencje rysowania, aby usprawnić konwersję plików do obrazowania maski. Prosimy o wcześniejsze zapytanie o preferowane konwencje rysowania, aby uniknąć pracochłonnego rozwiązywania problemów podczas konwersji. Maski z przezroczystymi cechami na czarnym tle będą wzorować cechy fotorezystu SU8 na płytce, aby uzyskać funkcjonalne mikrokanały PDMS podczas formowania repliki. Z kolei czarne cechy na przezroczystych maskach tła są potrzebne do przygotowania form PDMS odpowiednich do produkcji chipów rentgenowskich. Zalecamy zamówienie obu polaryzacji maski, aby umożliwić wczesne prototypowanie i walidację projektu w celu wytworzenia urządzeń PDMS przed przełożeniem projektu na chipy rentgenowskie.
  2. SU8 master fabrication
    UWAGA: Jest to jedyny proces, który należy wykonać w pomieszczeniu czystym. Jeśli krytyczne wyposażenie pomieszczeń czystych nie jest dostępne, cały etap można zlecić firmom świadczącym usługi odlewnicze MEMS, które dostarczają gotowe wzorce SU8. Przetwarzaj SU8 zgodnie z instrukcją w karcie katalogowej. Kroki od 1.2.1 do 1.2.4 podsumowują ogólny przebieg procesu produkcji głównej SU8, z pełnymi parametrami projektu trójwarstwowego chipa rentgenowskiego wymienionymi w tabeli 1. Wprowadzenie do wielowarstwowego wyrównania SU8 zostało opublikowane wcześniej29.
    1. Wlej około 1 ml rezystancji SU8 na 3-calową płytkę i obróć SU8 do żądanej grubości, używając odpowiedniej prędkości wirowania i czasu, jak określono w Tabeli 1 (Rysunek 1, krok 1). Wstępnie przypiecz fotorezystor zgodnie z grubością warstwy w temperaturze 65 °C i 95 °C przez kilka minut. Wykonaj wstępne pieczenie, aby zestalić SU8, aby zapobiec jego przywieraniu do fotomaski i poprawić przyczepność do podłoża (Rysunek 1, krok 2).
    2. Wystawić fotorezystor na działanie promieniowania UV, jak określono w Tabeli 1, a następnie przeprowadzić naświetlanie w temperaturze 95 °C, aby katalitycznie zakończyć fotoreakcję, która jest inicjowana podczas ekspozycji (Rysunek 1, krok 3).
    3. Powtórz te kroki dla każdej kolejnej warstwy. Następnie wyrównaj fotomaski kolejnej warstwy z wzorcem za pomocą wyrównywacza maski i znaczników wyrównania suwmiarki noniuszowej29.
    4. Zmyj cały nieodsłonięty rezystancję SU8, rozwijając płytkę w octanie eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA), aż płukanie izopropanolem nie ujawni już mlecznego wytrącania się (Rysunek 1, krok 4). Wysuszyć wafel azotem pod ciśnieniem.
      UWAGA: Izopropanol jest słabym rozpuszczalnikiem dla SU8, a jego wytrącanie wskazuje na resztki nieutwardzonych pozostałości.
  3. Produkcja form PDMS
    1. Umieść kawałek folii aluminiowej (15 × 15 cm) na szalce Petriego (10 cm) i umieść wzorzec SU8 na folii aluminiowej na szalce Petriego w celu łatwego wyjęcia wzorca po utwardzeniu PDMS.
    2. Wymieszaj bazę silikonową z utwardzaczem (10:1), uzyskując łączną ilość 25 g, energicznie za pomocą szpatułki w słoiku lub miksera mechanicznego. 3-calowy wafel na szalce Petriego (10 cm) zużywa około 25 g PDMS, aby uzyskać płytę o grubości 5 mm.
    3. Wlej wstępnie wymieszany PDMS na SU8-master (Rysunek 1, krok 5) na wysokość 4 mm. Wysusz PDMS przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza, aż na powierzchni PDMS nie pozostanie ani kilka pęcherzyków.
    4. Utwardzić PDMS w piecu w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Następnie wytnij utwardzony PDMS skalpelem i delikatnie oderwij formę PDMS od wzorca SU8 (Rysunek 1, Krok 6). Przytnij aż do wzorca, aby zapobiec pękaniu PDMS podczas obierania.
    5. Opcjonalnie: Przygotuj przekroje poprzeczne form PDMS, aby potwierdzić, że wszystkie warstwy SU8 na wzorcu mają żądane grubości (Rysunek 1). Wczesne testy układu kanałów mikroprzepływowych można przeprowadzić we wszystkich układach PDMS.
      UWAGA: Formowany w replikę PDMS można przymocować bezpośrednio do szklanego podłoża po wybiciu portów dostępowych (krok 3.3) w PDMS poprzez aktywację plazmą O2 za pomocą 20 s, 0,4 mbar O2, 50 W, 13,56 MHz. Jak zauważono w sekcji 1.2., wymaga to przeciwnej polaryzacji maski, a tym samym konturu płytki do produkcji chipów rentgenowskich.

2. Produkcja chipów rentgenowskich in situ

  1. Rozcieńczyć oba prekursory żywicy epoksydowej w etanolu do końcowego stężenia etanolu 40% wag. Całkowita masa 0,25 g każdego prekursora żywicy epoksydowej w etanolu jest wystarczająca na jeden wiór o średnicy 1cm2.
    UWAGA: Zmniejsza to lepkość powstałej 5-minutowej żywicy epoksydowej, aby uprościć mieszanie bez pęcherzyków powietrza i odlewanie replik form oraz zminimalizować grubość końcowej utwardzonej warstwy epoksydowej. Etanol odparowuje przez PDMS podczas etapu utwardzania.
  2. Odgazuj formę PDMS w eksykatorze próżniowym przez 30 minut, aby mogła wchłonąć małe pęcherzyki powietrza z żywicy epoksydowej na etapie formowania.
  3. Przyciąć folię poliimidową na około 70 × 70 mm i rozciągnąć ją wokół szkiełka o średnicy 75 × 50 mm za pomocą taśmy, aby uzyskać płaską i sztywną powierzchnię z taśmą na odwrocie. Plazmę aktywować plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbarO2 przez 20 s, a następnie inkubować całe szkiełko foliowe w roztworze wodnym 1% obj. (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (APTS) lub (3-glicydyloksypropylo)trimetoksysilanu (GPTS) przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Dokładnie wymieszaj oba roztwory prekursorów epoksydowych rozcieńczonych etanolem, aby zapewnić optymalne utwardzanie. Wyjmij formy PDMS z komory próżniowej i umieść je na płaskiej powierzchni. Następnie szybko dozuj kroplę zmieszanej żywicy na każdą mikrostrukturę na formie za pomocą mikropipety (około 10 μL na 1cm2 mikrostruktur) (Rysunek 1, krok 7a).
  5. Pobrać warstwę warstwową z folii poliimidowej z wodnego roztworu silanu (APTS lub GTPS). Wysuszyć folię sprężonym powietrzem lub azotem.
  6. Umieść przygotowaną kanapkę z folii poliimidowej, szkła i szkiełka na osadzonej żywicy epoksydowej (Rysunek 1, krok 7b). Mocno dociśnij szkiełko przymocowane do folii poliimidowej do formy PDMS. Umieść blachę na szkiełku szkiełkowym, a następnie nałóż odważniki, aby zastosować nacisk do 1,4 N/cm2 przez 1 godzinę, podczas gdy żywica epoksydowa utwardza się w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Idealnie, aby na folii nie pozostała żywica w miejscach, w których struktury w formie mają maksymalną wysokość. Odpowiadają one studzienkom krystalizacyjnym, w których następuje krystalizacja.
    1. Opcjonalnie: Jeśli dokładne formowanie małych elementów ma kluczowe znaczenie, forma PDMS może być wzmocniona aluminiową ramą podczas etapu formowania31.
  7. Usuń szkiełko z folią poliamidową i wzorzystą żywicą epoksydową, odrywając ją od formy PDMS (Rysunek 1 krok 8). Plazma aktywuje wzorzystą stronę epoksydową plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbarO2 przez 20 s.
  8. Po wyjęciu folii poliimidowej z komory plazmowej, inkubować folię o wzorze epoksydowym w wodnym roztworze APTS (lub GPTS) o stężeniu 1% obj. przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Podobnie, przygotuj drugą folię poliimidową bez wzoru z komplementarną aktywacją silanu GPTS (lub APTS) o zawartości 1% obj. Po inkubacji wysuszyć zarówno strukturalną, jak i niestrukturalną folię sprężonym powietrzem.
  9. Ułóż stronę epoksydową do góry na płaskiej powierzchni, wykorzystując napięcie powierzchniowe kropli wody pod spodem jako mediator, aby zapobiec zwijaniu się folii i zapewnić maksymalną płaskość. Następnie umieść drugą aktywowaną folię poliimidową na wierzchu i delikatnie przesuń palcem od jednego rogu do drugiego, aby się związały i uniknęły tworzenia się pęcherzyków.

3. Porty dostępu do dostarczania płynów

  1. Przygotować płyty PDMS o grubości 4 mm na szalce Petriego zgodnie z krokami od 1.3.1 do 1.3.3 bez użycia wzorca SU8. Pokrój płytę na bloki PDMS o odpowiedniej wielkości, aby pokryć wszystkie porty wlotowe w chipie, bez zakrywania poszczególnych komór krystalizacyjnych chipa.
  2. Plazma aktywuje zarówno chip, jak i blok PDMS plazmą o mocy 50 W, 13,56 MHz, 0,4 mbarO2 przez 20 s. W celu wiązania chemicznego należy następnie inkubować każdą część w wodnym roztworze APTS lub GPTS o stężeniu 1% obj. przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Wysuszyć każdą część sprężonym powietrzem i docisnąć płytę PDMS do wióra foliowego.
  3. Aby poprawić wiązanie, umieść chip na płaskiej płycie PDMS i przykryj go folią z tworzywa sztucznego, a następnie czystym szkiełkiem i metalowym blokiem. Na koniec należy nałożyć ciężarki do 1,4 N/cm2 przez około 1 godzinę.
  4. Przebij otwory dostępowe za pomocą stempla biopsyjnego 0,75 mm w każdym miejscu, w którym porty wlotowe i wylotowe są oznaczone w projekcie chipa i uszczelnij tył taśmą. Chip jest teraz dostępny dla każdej rurki o średnicy zewnętrznej odpowiadającej średnicy otworu (zgodnie z opisem w kroku 4.2).

4. Obróbka powierzchniowa

  1. Przygotować rozcieńczenie 9% wag. fluoropolimeru w rozpuszczalniku fluorowym w stosunku 1:20 do końcowego stężenia 0,45% wag. Roztwory podstawowe i rozcieńczenia przechowywać w lodówce w ciemności w temperaturze 4 °C.
  2. Załadować rozcieńczenie fluoropolimeru w stosunku 1:20 do strzykawki Luer-lock o pojemności 1 ml. Do strzykawki przymocować igłę 27G × 5/8", a następnie rurkę z PTFE do igły.
  3. Podłącz rurkę do wylotu chipa rentgenowskiego i wstrzyknij roztwór roboczy fluoropolimeru przygotowany w kroku 4.1, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione.
  4. Umieść wiór płaską stroną do dołu na płycie grzejnej o temperaturze 190 °C na 5 minut, aby odparować cały rozpuszczalnik i osadzić fluoropolimer w cienkowarstwowej powłoce.
    UWAGA: W przypadku korzystania z nowej geometrii należy sprawdzić, czy kanały nie zostały zatkane fluoropolimerem podczas tego procesu powlekania. Jeśli tak, należy dodatkowo rozcieńczyć roztwór podstawowy.

5. Preparat białkowy

  1. Zważyć liofilizowaną taumatynę i rozpuścić ją w roztworze buforowym wymienionym w tabeli 2 do odpowiedniej objętości, aby uzyskać końcowe stężenie białka 40 mg mL-1.
  2. Dializować izomerazę glukozy w stosunku do buforu wymienionego w tabeli 2 zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przygotować białko tioredoksynę, jak opisano wcześniej przez Schuberta i wsp.30.
  4. Zweryfikuj końcowe stężenia białka fotometrycznie, korzystając ze współczynników ekstynkcji podsumowanych w Tabeli 2, obliczonych przez oprogramowanie ProtParam32.
  5. Przygotuj wszystkie roztwory przy użyciu ultraczystej wody i przefiltruj je filtrem 0,2 μm.
  6. Odwirować roztwory białek w temperaturze 20 °C przez 15 minut w temperaturze 16100 x g i pobrać supernatant do eksperymentów krystalizacji.

6. Krystalizacja białek w chipie rentgenowskim

  1. Aby skrystalizować białka w chipach mikroprzepływowych, wymieszaj równe ilości roztworu białkowego i roztworu strącającego. Stężenie białka, skład buforu i skład strącający zestawiono w tabeli 2. Przygotuj całkowitą objętość około 20 μl do napełnienia chipa mikroprzepływowego.
  2. Natychmiast po wymieszaniu wstrzyknąć roztwór do portu wlotowego chipa za pomocą strzykawki, połączonej z igłą 27G × 5/8" i rurką PTFE o średnicy zewnętrznej 0,75 mm (szczegółowo w kroku 4.2).
    UWAGA: Procedura napełniania układu szeregowego wymaga wcześniejszego zalania chipa olejem fluorowanym, co najłatwiej jest zrobić, ładując olej fluorowany z portu wylotowego przed wstrzyknięciem roztworu krystalizacyjnego przez otwór wlotowy. Wszystkie etapy ładowania powinny być monitorowane za pomocą mikroskopu w celu kontrolowania zastosowanego ciśnienia w strzykawce i odpowiadającego mu natężenia przepływu."
  3. Po napełnieniu chipa oddziel poszczególne komory krystalizacji, wtryskując olej fluorowany do portu wlotowego chipa. Uszczelnij chip, blokując wszystkie porty wlotowe i wylotowe chipa. Można to zrobić, wkładając spinacz do papieru.
    UWAGA: Ponieważ komory krystalizacji są wypełnione roztworem białkowym/strącającym, olej fluorowany wypełnia tylko kanał wlotowy chipa, nie wpływając na roztwór w komorach krystalizacji.
  4. Aby naśladować kinetykę krystalizacji dyfuzji pary, umieść uszczelniony chip w temperaturze otoczenia i normalnej atmosferze, aby umożliwić skurczenie się kropelki w komorze krystalizacji przez odparowanie wody przez folię poliimidową.
  5. Po zaobserwowaniu tworzenia się kryształów za pomocą mikroskopu lub pomiarów DLS (krok 7), należy przenieść cały chip mikroprzepływowy do odpowiedniego roztworu strącającego, aby zatrzymać dalsze parowanie ze studzienek krystalizacyjnych do czasu przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji rentgenowskiej.

7. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła w studniach krystalizacyjnych w chipie

UWAGA: Pomiary DLS zostały wykonane z mocą wyjściową lasera 100 mW, długością fali 660 nm, a rozproszone światło zostało wykryte pod kątem rozproszenia 142°. Ze względu na to, że wszystkie badane roztwory próbek były roztworami wodnymi, we wszystkich obliczeniach zastosowano współczynnik załamania światła wody (n = 1,33).

  1. Umieść chip mikroprzepływowy w uchwycie płytki w formacie SBS instrumentu DLS za pomocą adaptera opisanego w kroku 8.1. Włóż adapter do urządzenia.
  2. Ostrożnie wyreguluj ostrość lasera wewnątrz komory chipa mikroprzepływowego za pomocą zmotoryzowanego stolika x-,y-,z. Ponieważ chip mikroprzepływowy jest bardzo cienki, dostosuj poziom z, stosując małe przyrosty.
    UWAGA: Prawidłowa regulacja jest potwierdzana przez wysokie przecięcie i gładki ogon wynikowej funkcji autokorelacji pomiaru DLS. Można utworzyć plik kalibracyjny, aby dopasować położenie każdej pojedynczej studzienki krystalizacyjnej w chipie mikroprzepływowym, co pozwala na automatyczne pomiary DLS w kilku komorach w czasie.
  3. Wykonuj każdy pomiar DLS w temperaturze 293 K przez 30 s i powtarzaj pomiar co 5 minut, aż do końca eksperymentu z krystalizacją.
    UWAGA: Po początkowym zarodkowaniu można śledzić rozkład promienia pomiarów DLS w czasie, a pomyślne tworzenie kryształów może być równolegle śledzone przez wbudowany mikroskop czytnika płytek DLS.

8. Gromadzenie danych dyfrakcyjnych

  1. Adaptery do goniometrów liniowych
    1. Wydrukuj adaptery do goniometru płytkowego, aby ustawić i obrócić chipy rentgenowskie podczas zbierania danych krystalograficznych.
    2. Stwórz adaptery do goniometru bazowego na hobbystycznej drukarce 3D przy użyciu domyślnych ustawień parametrów zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Adaptery zostały zaprojektowane przy użyciu systemu 3D-CAD, a pliki współrzędnych adapterów są dołączone w ". Format pliku STL w suplemencie.
    3. Przymocuj chipy rentgenowskie do adaptera za pomocą taśmy dwustronnej.
  2. Krystalografia rentgenowska in situ
    1. Zbieraj dane dyfrakcyjne przy użyciu wiązki o wielkości 10 × 5 μm (FWHM profilu Gaussa) w temperaturze 296 K. Użyj promieni rentgenowskich o energii 12,8 keV i strumieniu 2,2 · 1011 fotonów · s-1 w tłumionej wiązce i zarejestruj wzory dyfrakcyjne za pomocą hybrydowego detektora pikseli Pilatus 6M.
      UWAGA: Urządzenia mikroprzepływowe zawierające kryształy taumatyny, izomerazy glukozy lub tioredoksyny są używane do eksperymentów krystalograficznych in situ w zakresie promieniowania rentgenowskiego na linii badawczej EMBL P14 synchrotronu PETRA III. Dostępna wielkość ogniska wiązki i strumień świetlny mogą się różnić w przypadku innych źródeł promieniowania rentgenowskiego. Liczba naświetlonych kryształów białka, liczba wzorów dyfrakcyjnych zarejestrowanych z każdego kryształu, zakres kąta oscylacji na ekspozycję oraz czas ekspozycji podsumowano w tabeli 3.
    2. Przetwarzaj zestawy dwóch następujących po sobie wzorów dyfrakcyjnych indywidualnie za pomocą programu XDS33. Użyj skryptu bash "xds.sh" znajdującego się w suplemencie.
    3. Utwórz pliki HKL dla każdego zestawu danych ze wszystkich kryształów i skaluj je za pomocą oprogramowania XSCALE33. Użyj skryptu powłoki bash "xscale.sh" w uzupełnieniu, aby utworzyć plik wejściowy dla XSCALE.
      UWAGA: Skalowane powinny być tylko zestawy danych kryształów, których współczynniki korelacji są większe niż 90 %, co wskazuje na wysoki stopień izomorfizmu. Do wyznaczenia powłoki o najwyższej rozdzielczości należy zastosować konserwatywne kryterium ‹I/σ(I)› (>2). Zastępowanie molekularne za pomocą programu MOLREP34 z pakietu CCP435 można wykorzystać do uzyskania faz do dalszego budowania modelu przy użyciu współrzędnych 3D Banku Danych Białkowych (PDB) pokazanych w Tabeli 3.
    4. Doprecyzuj wszystkie struktury izotopowo za pomocą Refmac535,36 i użyj COOT37 do wizualnej kontroli końcowego modelu.
      UWAGA: Cząsteczki rozpuszczalnika powinny być dodawane automatycznie podczas procesu rafinacji i muszą być sprawdzane w celu potwierdzenia chemicznie uzasadnionych pozycji. Wszystkie modele muszą zostać sprawdzone w celu zidentyfikowania wartości odstających Ramachandran.

9. Ocena danych

  1. Uszkodzenia popromienne
    1. Przeanalizuj zanik mocy dyfrakcyjnej w czasie, korzystając z metody opisanej przez Owen et al38. W tym celu należy obliczyć całkowitą sumę I/σ(I) (dostarczoną przez XDS33) wszystkich indeksowanych odbić każdego ocenianego zestawu danych dyfrakcyjnych (2 kolejne wzorce dyfrakcyjne), aby użyć ich jako wartości odniesienia. Użyj skryptu bash "ISigma.sh" z suplementu.
    2. Znormalizuj moc dyfrakcyjną każdego zestawu danych do średniej mocy dyfrakcyjnej pierwszego zestawu danych.
    3. Przeanalizuj zmiany wartości Rmeas w czasie, pobierając wartości Rmeas z plików Correct.LP uzyskanych z XDS33 (skrypt bash "Rmeas.sh" z suplementu).
  2. Orientacja kryształu
    1. Określ kąty Eulera, aby uzyskać informacje o rozkładzie orientacji sieci krystalicznej w odniesieniu do laboratoryjnego układu współrzędnych. Oblicz kąty Eulera z macierzy orientacji XDS podanej w pliku wyjściowym XPARM39 za pomocą oprogramowania Matlab. Użyj skryptu bash "rotation_matrix.sh", aby wyodrębnić macierz rotacji z każdego kryształu z pliku XPARM. Użyj pliku wyjściowego jako danych wejściowych w Matlabie, aby obliczyć kąty Eulera za pomocą funkcji Matlab rotro2eu.m (plik uzupełniający).
      UWAGA: Szczegółowy opis obliczeń został opublikowany przez Zarrine-Afsar et al40.
    2. Przelicz uzyskane kąty Eulera z radianów na stopnie. Uzyskane kąty Eulera należy pogrupować dla wszystkich trzech płaszczyzn obrotu (xy, xz i zy) w klasach 10° i wykreślić je za pomocą oprogramowania Origin9.

Wyniki

Epoksyd jest doskonałym materiałem wypełniającym do produkcji chipów rentgenowskich. Jest tani, prosty i wytrzymały w obróbce, nie wymagając specjalistycznych narzędzi (Rysunek 1). Zmniejszenie lepkości epoksydy poprzez rozcieńczenie go 40% wag. etanolem ułatwiło usunięcie nadmiaru żywicy nad studnią krystalizacji, co pozwoliło na uzyskanie zdefiniowanych okien rentgenowskich. Wyższe rozcieńczenia etanolem prowadziły do powstania defektów w utwardzonej żywicy. Analizując przekroje poprzeczne chipów rentgenowskich, ustaliliśmy, że całkowita grubość okien po obu stronach wynosi około 19 µm, co jest bardzo bliskie nominalnej grubości zastosowanych folii polimidowych 2 × 7,5 µm (Rysunek 2)

Próby krystalizacji zostały rozdzielone na kilka przedziałów reakcyjnych o rozmiarach nanolitrowych, przy użyciu mechanizmu zaworu kapilarnego opisanego wcześniej41. Ta technika ładowania typu „przechowywanie, a następnie tworzenie” (store-then-create) zapobiega utracie próbki w martwej objętości kanału i może być łatwo wykonana ręcznie, co eliminuje konieczność stosowania pomp lub innego sprzętu do sterowania przepływem cieczy42. Przed załadowaniem próbki wodnej chip zostaje przygotowany poprzez przepuszczenie oleju fluorowanego. Napięcie powierzchniowe na granicy faz olej-woda pomiędzy olejem przygotowującym a próbką wodną powoduje powstanie różnicy ciśnień w obrębie tej granicy. Ciśnienie Laplace'a zależy zarówno od promienia krzywizny, jak i od napięcia powierzchniowego granicy faz. Aby zminimalizować energię, granica faz musi zminimalizować swoją powierzchnię, co jest równoznaczne z maksymalizacją głównych promieni krzywizny przy stałej objętości. Granica faz o niskiej krzywiźnie w szerokim kanale wykazuje niższe ciśnienie Laplace'a niż granica o wysokiej krzywiźnie w wąskim segmencie kanału. W związku z tym czop próbki preferencyjnie wpływa i przepływa przez szeroki kanał obejściowy, zamiast przepływać przez zwężenia wąskiego zaworu kapilarnego. Na koniec za czopem próbki podąża olej fluorowany, aby rozdzielić studzienki z próbką na niezależne krople.

Stabilne i niezawodne ładowanie osiągnięto przy prędkościach przepływu do 1 mL/h zarówno w szeregowym, jak i równoległym układzie studzienek (Rysunek 3). W układzie „szeregowym” wloty do studzienek i zwężenia zaworów kapilarnych są połączone sekwencyjnie poprzez kanał obejściowy31. Z kolei w układzie „równoległym” dwa oddzielne kanały główne łączą wyłącznie wszystkie wloty do studzienek lub zawory kapilarne43. Obie koncepcje układu były wcześniej łączone z kontrolą składu w celu przesiewania kompozycji, co jest użytecznym aspektem w krystalizacji białek43,44. Konstrukcja szeregowa posiada tylko dwa porty płynowe: jeden wlotowy i jeden wylotowy. Posiada ona mniej portów dla cieczy, a dzięki temu jest prostsza w budowie i obsłudze. Układ równoległy posiada 4 porty płynowe: 2 dla kanału głównego łączącego studzienki oraz 2 do podłączenia zaworów kapilarnych, aby umożliwić ucieczkę powietrza lub nadmiaru oleju. Ładowanie może zatem przebiegać z obu stron kanału głównego. Układ ten charakteryzuje się ogólnie niższym oporem przepływu dla tej samej liczby studzienek ze względu na krótszy kanał obejściowy. Jest on zatem lepiej dostosowany do urządzeń o większej skali z dużą liczbą studzienek. Ponadto studzienki z próbkami są zorientowane bliżej siebie, co daje korzyści w przypadku zautomatyzowanego obrazowania.

W obu układach zaobserwowano całkowite wypełnienie dołków na próbkę, niezależnie od tego, czy zostały one wykonane w konstrukcji o dwóch, czy trzech poziomach wysokości. W konstrukcji o dwóch wysokościach zarówno dołek na próbkę, jak i kanały obejściowe mają taką samą wysokość. Konstrukcja o trzech wysokościach wymaga zastosowania trzeciej maski, dodatkowej warstwy SU8 oraz etapu wyrównywania, aby zapewnić, że dołki na próbki będą wyższe niż poprzedzające je kanały obejściowe. Ta różnica wysokości sprzyja wprowadzaniu cieczy z próbki do dołka w oparciu o tę samą zasadę zaworowania kapilarnego, która zatrzymuje przepływ w zwężeniach. W tym przypadku wyższy sufit dołka odpowiada niższemu ciśnieniu Laplace'a posuwającego się menisku, a przepływ w kierunku obejścia jest preferowany dopiero po całkowitym wypełnieniu dołków, gdy zwężenia zaworu blokują dalszy przepływ i kierują go w dół obejścia. Jednak pomyślne ładowanie nie wymaga ściśle, aby dołki były wyższe od obejścia, ponieważ odpowiednie zaworowanie kapilarne można osiągnąć również poprzez stosowne dostosowanie szerokości kanałów. Niemniej jednak, w naszym doświadczeniu, wyższe dołki zapewniały znacznie bardziej stabilne ładowanie, a wolne od defektów wypełnianie zaobserwowano przy przepływach nawet dziesięciokrotnie wyższych we wszystkich konstrukcjach o trzech wysokościach w porównaniu do ich odpowiedników o dwóch wysokościach. Efekt ten był bardziej wyraźny w układzie równoległym.

Aby naśladować kinetykę krystalizacji metodą dyfuzji par, wykorzystano ograniczoną przepuszczalność folii poliimidowej do kontrolowania parowania wody w czasie. Eksperymentalne szybkości parowania określono poprzez monitorowanie zmiany objętości kropli w czasie, zrównując powierzchnię kropli z wysokością wgłębienia (Rysunek 4C). Parowanie z wgłębień krystalizacyjnych w chipie rentgenowskim nie przebiega liniowo, ponieważ zmniejszająca się powierzchnia kropli, zbiegająca się ze wzrostem stężenia substancji rozpuszczonej, prowadzi do spadku szybkości parowania w czasie45. Początkowe parowanie przebiegało z w przybliżeniu liniową szybkością około 0.5 nL h-1 w wgłębieniach o geometrii układu szeregowego.

Aby lepiej zrozumieć kinetykę krystalizacji, przeprowadzono pomiary DLS w studzienkach krystalizacyjnych chipa mikrofluidycznego. Do wstępnych pomiarów DLS wykorzystano chip z PDMS przyklejony do szkiełka przedmiotowego, aby zapewnić lepsze właściwości optyczne dla eksperymentu rozpraszania światła. Chip ten posiadał takie same wymiary studzienek jak chip rentgenowski. PDMS charakteryzuje się wyższą przepuszczalnością dla pary wodnej niż poliimid w oknach poliimidowych chipa rentgenowskiego45. Ponieważ strumień zmienia się liniowo wraz z odległością, trajektorię parowania w studzience z oknem poliimidowym można dopasować do odpowiadającego jej okna z PDMS o odpowiedniej grubości.

Wyniki DLS wskazują, że rozkład promienia zmienia się w czasie (Rysunek 4A-B), co dowodzi, że pomiary DLS pozwalają wykryć wstępną nukleację przed zaobserwowaniem pierwszych cząstek krystalicznych. Informacje te mogą zostać wykorzystane do nukleacji i wzrostu pojedynczych kryształów w każdej studzience poprzez zewnętrzną regulację szybkości odparowywania, a tym samym poziomów przesycenia na wczesnym etapie nukleacji46.

Chip rentgenowski został zamocowany na wydrukowanym w technologii 3D adapterze do goniometru dla płytek kompatybilnych z systemem SBS w linii wiązki EMBL synchrotronu P14 w PETRA III (Rycina 5A). Alternatywnie, do montażu chipów rentgenowskich w standardowych goniometrach linii wiązki można użyć mniejszej ramki wydrukowanej w 3D21. Kryształy taumatyny mają rozmiar od 10 do 20 µm (Rycina 5B) i dyfrakują do rozdzielczości 2.0 Å (Rycina 5C). Zgodnie z oczekiwaniami, wkład tła rentgenowskiego z dwóch cienkich okien z folii poliimidowej chipu rentgenowskiego ogranicza się do pierścieni rozproszenia polimeru poliimidowego przy 11 Å (2θ ~ 5°) i 33 Å (2θ ~ 1.7°) dla długości fali rentgenowskiej 0.97 Å. Te dwa pierścienie nie zakłócają przetwarzania danych. Zebrano pełny zestaw danych obejmujący 83 kryształy taumatyny, rejestrując 10 obrazów dyfrakcyjnych z każdego kryształu przy obrocie o 1° podczas każdej klatki. Parametry przetwarzania i udoskonalania danych, a także statystyki zestawu danych dla taumatyny, zestawione i porównane z dwoma innymi zestawami danych dla glukozoizomerazy i tioredoksyny, które również zostały zebrane in situ, wymieniono w Tabeli 3 oraz Tabeli 4.

Spadek intensywności znormalizowanej mocy dyfrakcyjnej w czasie zbadano poprzez podział zbioru danych dla taumatyny na pięć podzbiorów (w celu zachowania kompletności zbiorów danych w każdym podzbiorze wykorzystano dwa wzorce dyfrakcyjne). Jak pokazano na Ryc. 6B, moc dyfrakcyjna zaczęła spadać po pierwszym podzbiorze i w czwartym podzbiorze spadła poniżej 50%. W rezultacie wartości Rmeas podzbiorów również wzrastały w czasie, co wskazuje na uszkodzenia wywołane promieniowaniem rentgenowskim podczas gromadzenia danych. Hipotezyzujemy, że wolne rodniki generowane podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie szybko degradują sąsiednie kryształy w tej samej komorze reakcyjnej. Przykładowo, takie wtórne uszkodzenia rentgenowskie były mniej wyraźne w pokrewnym podejściu eksperymentalnym, w którym kryształy zostały rozmieszczone na znacznie większej powierzchni w kanapce z poliimidu21. Aby zminimalizować całkowite uszkodzenia rentgenowskie, w temperaturze pokojowej należy zebrać jedynie niewielką liczbę wzorców dyfrakcyjnych z danego kryształu. Ponadto w każdej komorze chipa mikroprzepływowego powinna znajdować się tylko jedna pojedyncza kryształy białka. Niemniej jednak wszystkie modele strukturalne udoskonalone z wykorzystaniem przetworzonych zbiorów danych wykazują bardzo dobrą stereochemię i odpowiednie statystyki (Tabela 4). Dodatkowo wszystkie końcowe mapy gęstości elektronowej były bardzo wysokiej jakości.

W poprzednich podejściach krystalograficznych z wykorzystaniem chipów przezroczystych dla promieni rentgenowskich, orientację i rozmieszczenie kryształów należało manipulować celowo, aby uzyskać losowy rozkład orientacji kryształów40, lub osiągano to poprzez ruchy kryształów w warstwie cieczy21. Aby ocenić orientację kryształów w opisanych w niniejszym protokole mikrofluidycznych chipach przezroczystych dla promieni rentgenowskich, określono orientację komórki elementarnej wszystkich wyeksponowanych kryształów względem laboratoryjnego układu współrzędnych. W przypadku bipyramidalnych kryształów taumatyny zaobserwowano lekką preferencję (Rysunek 7A), natomiast dla kryształów izomerazy glukozy uzyskano szeroki rozkład (Rysunek 7B). Przyjęliśmy, że w skali nanometrycznej większość materiałów wykazuje znaczną chropowatość. W konsekwencji kryształy mogły spontanicznie nukleować na powierzchni w orientacjach znacznie mniej stronniczych. Tak małe jądro kryształu może zostać zablokowane w danej orientacji, kontynuując wzrost do odpowiedniego rozmiaru bez zmiany orientacji względem normalnej do powierzchni. W rzeczywistości nukleacja kryształów pośredniczona przez powierzchnię od dawna stanowiła problem dla krystalografów próbujących odseparować przytwierdzony kryształ od powierzchni za pomocą pętli, nie uszkadzając go przy tym. Tutaj możemy bezpośrednio wykorzystać takie kryształy do zbierania danych dyfrakcyjnych. Istnieją jednak ograniczenia specyficzne dla danego układu, gdyż tioredoksyna wykazała silną preferencję dla określonych orientacji w płaszczyznach xy-, xz- i yz (Rysunek 7C). Przedstawione przykłady pokazują, że rozkład orientacji zależy nie tylko od środowiska wzrostu, ale także od kształtu kryształu. Kryształy tioredoksyny mają wydłużone kształty, które mają tendencję do wzrostu w preferowanej orientacji, podczas gdy tetragonalne bipyramidalne kryształy taumatyny lub ortorombiczne kryształy izomerazy glukozy nie wykazują takiego zachowania. Jednak we wszystkich przypadkach, nawet przy preferowanych orientacjach, dostępny zakres rotacji kryształów pozwolił na wystarczająco dobre pokrycie przestrzeni odwrotnej, a tym samym na uzyskanie kompletnych zestawów danych dla wszystkich badanych białek. W związku z tym nie należało podejmować żadnych dodatkowych środków podczas wyboru kryształów do naświetlania promieniami rentgenowskimi.

Schemat procesu wytwarzania matrycy PDMS; fotolitografia SU-8, formowanie, tworzenie chipa mikroprzepływowego.
Rysunek 1: Schemat wytwarzania mikroprzepływowego chipa rentgenowskiego. (1) SU-8 jest nanoszony na podłoże krzemowe i rozprowadzany metodą spin-coatingu w celu uzyskania pożądanej grubości warstwy. (2) Fotorezyst jest naświetlany promieniowaniem UV przez maskę. (3) Nienaświetlony fotorezyst jest następnie wywoływany poprzez kolejne przemywanie PGMEA i izopropanolem, co skutkuje powstaniem (4) matrycy SU-8 do dalszych etapów odlewania. (5) PDMS jest wlewany na matrycę, a (6) po utwardzeniu formy z PDMS, zostaje ona oddzielona od matrycy SU-8. (7a) Klej epoksydowy jest nanoszony na formę z PDMS, a (7b) aktywowana folia poliimidowa jest chemicznie wiązana z żywicą epoksydową. (8) Po utwardzeniu folia poliimidowa z ukształtowaną cienką warstwą epoksydową jest oddzielana od formy z PDMS. (9) W końcowym kroku urządzenie zostaje zamknięte drugą folią poliimidową, aby uzyskać szczelny mikroprzepływowy chip o niskim tle rentgenowskim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat złącza płynowego matrycy dołków; pomiary mikrokanałów; układ mikroprzepływowy.
Rycina 2: Fotografia (lewo) oraz obrazy mikroskopowe przekrojów gotowych chipów. Przedstawiono reprezentatywny odcinek kanału (środek) oraz dołek krystalizacyjny (prawo) z dwóch oddzielnych chipów. Strzałki wskazują zmierzone odległości. Wszystkie wymiary podano w µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krystalizacja mikrofluidyczna: układy równoległe i szeregowe; schemat i obrazy mikroskopowe; analiza przepływu.
Rycina 3: Schematy konstrukcji studni krystalizacyjnych z układem [A] równoległym lub [B] szeregowym, widziane z góry i z boku, z wymiarami podanymi w µm. Typowe wysokości kanałów wynosiły: 50 µm dla obejścia (bypass), 50-60 µm dla studni krystalizacyjnej, 5-10 µm dla zaworu kapilarnego, co odpowiadało objętościom studni około 2,5 nL (układ równoległy) i 8 nL (układ szeregowy). Reprezentatywne zachowanie podczas napełniania studni pokazano z użyciem barwników spożywczych. Chip został przygotowany za pomocą 12 wt% 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol w FC-43 przed wstrzyknięciem barwnika spożywczego do studni magazynowych. Białe strzałki wskazują kierunek przepływu. Obrazy ogólne napełnionych urządzeń pokazują wszystkie studnie napełnione bez wad, co ilustruje niezawodne wprowadzanie próbek. Układ równoległy przedstawiono jako konstrukcję o trzech wysokościach, w której studnie krystalizacyjne są wyższe niż obejście, natomiast układ szeregowy przedstawiono jako konstrukcję o dwóch wysokościach, w której studnie i obejście mają taką samą wysokość. Typowe szybkości przepływu wynosiły około 150 µL/h podczas napełniania, jednak napełnianie bez wad zaobserwowano dla szybkości przepływu do 1 mL/h w konstrukcji o trzech wysokościach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment krystalizacji mikrofluidycznej; przedstawia sekwencję czasową, wykres promienia hydrodynamicznego, redukcję objętości.
Rysunek 4: In situ dynamiczne rozpraszanie światła w studzience krystalizacyjnej w funkcji czasu. [A] Seria obrazów mikroskopowych studzienki krystalizacyjnej. Magazynowana kropla stale kurczy się w miarę odparowywania pary wodnej w czasie. Pierwsze mikrokryształy taumatyny można zaobserwować po 4 h. [B] Odpowiadający temu rozkład promienia hydrodynamicznego cząsteczek taumatyny zmierzony metodą DLS podczas tego samego procesu krystalizacji przedstawionego na [A]. Formowanie się drugiej frakcji promienia, wskazujące na początkowe zdarzenia nukleacji, jest widoczne po około 1-2 h. [C] Reprezentatywny spadek objętości dwóch referencyjnych objętości kropel wynikający z utraty wody przez odparowanie w czasie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces krystalografii białek; mikroskopia kryształów białek; analiza obrazu dyfrakcji promieni X.
Rycina 5: zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ. [A] Pojedyncze chipy mikrofluidyczne są montowane za pomocą adaptera wydrukowanego w technologii 3D (kolor niebieski) na goniometrze płaskim. [B] Kryształy taumatyny w chipie mikrofluidycznym podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, obrazowane przez mikroskop zintegrowany w linii wiązki P14. [C] Dyfrakcję kryształów taumatyny zarejestrowano do rozdzielczości 2.0 Å, przy pomijalnie niskim tle. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wizualizacja struktury białka; wpływ dawki promieniowania rentgenowskiego na mapy gęstości elektronowej; analiza wykresów pudełkowych.
Rysunek 6: Ocena danych dyfrakcyjnych z kryształów taumatyny w chipie mikrofluidycznym, zarejestrowanych w temperaturze pokojowej. [A] Gęstość elektronowa udoskonalonego modelu taumatyny z wykorzystaniem wyłącznie zestawu danych z klatek 1-2 (niebieskie kontury przy 1.5 σ). [B] Spadek intensywności kryształów taumatyny w funkcji dawki promieniowania rentgenowskiego. [C] Ewolucja wartości Rmeas w funkcji dawki promieniowania rentgenowskiego. Wykresy pudełkowe w [B] i [C] z kwartylami (wartości górne 75%, mediana 50%, wartości dolne 25% i średnia) oraz wąsami z 95% przedziałami ufności reprezentują spadek intensywności dyfrakcji i Rmeas wszystkich naświetlonych kryształów (n = 83). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie struktury białek, wykres polarny przedstawiający kąty płaszczyzn, diagramy dla taumatyny, izomerazy glukozowej, tioredoksyny.
Rysunek 7: Rozkład orientacji komórek elementarnych w folii chipa mikroprzepływowego względem laboratoryjnego układu współrzędnych. [A] Bipiramidalne kryształy taumatyny wykazały szeroki rozkład orientacji obejmujący niemal 180° w płaszczyźnie xy (niebieska), xz (zielona) i yz (czerwona). [B] Izomeraza glukozowa również wykazuje szeroki zakres rozkładu, natomiast [C] tioredoksyna wykazała silną preferencję dla określonych orientacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Warstwa SU8Naniesienie metodą spin-coatinguWstępne wypalanieEkspozycjaPo wypalaniu
[65 / 95 °C][65 / 95 °C]
1Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. warstwa: Dołki1000 obr./min0 / 10 min200 mJ/cm²21 / 4 min
15 µm SU8-3010
2nd warstwa: Pominięcie2000 obr./min0 / 16 min220 mJ/cm²21 / 5 min
35 µm SU8-3025
3rd warstwa: Zawory3000 obr./min0 / 3 min150 mJ/cm²21 / 2 min
5 µm SU8-3005

Tabela 1: Przykład procesu SU8 dla trójwarstwowej równoległej konstrukcji chipa rentgenowskiego. Taka kolejność warstw umożliwi odlew formy z PDMS do produkcji chipa rentgenowskiego. Aby bezpośrednio odlać PDMS podczas prototypowania, należy odwrócić kolejność warstw podczas wytwarzania matrycy, zaczynając od 3rd i kończąc na 1st warstwie.

BiałkoStężenie białkaBufor białkowyczynnik wytrącającyGrupa przestrzenna, wpis PDBWspółczynnik ekstynkcji [M⁻¹cm⁻¹]-1 cm-1]
Taumatyna (Thaumatococcus daniellii)40 mg/ml-150 mM Bis-Tris, pH 6,51,1 M tartran sodu, 50 mM Tris, pH 6,8I4222, 1LR229420
glukozaizomeraza (*Streptomyces rubiginosus*)25 mg/ml-110 mM HEPES, 1 mM MgCl22, pH 7,0100 mM Bis-Tris, 2,7 M siarczanu amonu, pH 5,7I222, 4ZB246410
Tioredoksyna (*Wuchereria bancrofti*)34 mg/ml-120 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,027,5% PEG1500, bufor SPG 100 mM, pH 6,3P41212, 4FYU24075

Tabela 2: Warunki krystalizacji i grupy przestrzenne otrzymanych kryształów białka, wraz z współczynnikiem ekstynkcji i kodem PDB.

BiałkoLiczba odsłoniętych kryształówLiczba obrazów dyfrakcyjnych na kryształZakres oscylacji na jedną ekspozycję [°]Czas ekspozycji [ms]wpis PDB dla MR
Taumatyna (Thaumatococcus daniellii)103101401LR2
Izomeraza glukozy (Streptomyces rubiginosus)691000.1804ZB2
Tioredoksyna (Wuchereria bancrofti)68101404FYU

Tabela 3: Parametry gromadzenia danych dyfrakcji rentgenowskiej.

Statystyki gromadzenia danychathaumatin
(Klatka 1-20)		glukozoizomeraza (Klatka 1-100)tioredoksyna
(Klatka 1-10)
Linia wiązkiP14
Długość fali [Å]0.96863
Grupa przestrzennaP41212I222P42212
Parametry komórki elementarnej: a = b, c [Å]58.62, 151.4893.91, 99.60, 103.0458.45, 151.59
Liczba kryształów1014134
Całkowity kąt oscylacji [°]101010
Rozdzielczość [Å]30.1.1989
(1.95 – 1.89)		30.1.1975
(1.80 – 1.75)		30.3.2000
(3.20 – 3.00)
Temperatura [K]296296296
R p.i.m.b7.5 (25.5)8.8 (28.0)9.1 (33.2)
Zmierzone refleksy15532006900001111196
Unikalne refleksy218504894244449
Średnie I/σ(I)6.07 (1.78)5.85 (1.66)4.08 (1.47)
Korelacja połowiczna zestawu Mn(I) CC(1/2)96.2 (72.2)95.8 (68.2)97.9 (75.3)
Kompletność [%]99.8 (100.0)100.0 (99.9)99.9 (100.0)
Redundancja71.114.125
Statystyki udoskonalenia
Zakres rozdzielczości [Å]1/30/19891/30/19753/30/2000
R/ Rfree [%]18.8/23.918.1/20.518.9/23.1
Atomy białka155030451129
Cząsteczki wody51111164
Cząsteczki ligandu2000
Odchylenie RMS
   Długość wiązania [Å]0.020.0260.01
   Kąt wiązania [°]2.042.221.43
Czynnik B [Å2]
   Białko22.62050
   Woda25.127.129.7
   Ligand20.4
Analiza wykresu Ramachandrana
Regiony najbardziej preferowane [%]97.6795.3296.13
Regiony dopuszczalne [%]2.444.163.64
Regiony szeroko dopuszczalne [%]0.490.520.23
a: Wartości w nawiasach dotyczą powłoki o najwyższej rozdzielczości.
b: (Równanie Rmerge dla analizy danych krystalograficznych; wzór oceniający jakość danych w eksperymentach.), gdzie I (hkl) jest średnią intensywnością refleksów hkl, Σhkl jest sumą wszystkich refleksów, a Σi jest sumą pomiarów i dla refleksu hkl.

Tabela 4: Statystyki gromadzenia danych dla zestawów danych dla taumatyny, izomerazy glukozowej i tioredoksyny.

Plik uzupełniający 1: chip_geometry.dwg. Plik CAD z wykorzystanymi geometriami układu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: goniometer_adapter.stl. Plik STL określający adapter goniometru do chipa rentgenowskiego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: xds.sh. Skrypt Bash służący do tworzenia plików wejściowych do przetwarzania klinów danych dyfrakcyjnych przez program XDS. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: xscale.sh. Skrypt Bash służący do łączenia danych dyfrakcyjnych z podzbiorów i tworzenia pliku HKL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: ISigma.sh. Skrypt Bash służący do wyodrębniania wartości ISigma ze wszystkich poszczególnych podzbiorów. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 6: Rmeas.sh. Skrypt Bash do wyodrębniania wartości Rmeas ze wszystkich poszczególnych podzbiorów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: rotation_matrix.sh. Skrypt Bash służący do przygotowania pliku wejściowego dla programu Matlab w celu obliczenia kątów Eulera z macierzy rotacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Produkujemy urządzenia mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej in situ poprzez modelowanie żywicy epoksydowej jako materiału wypełniającego i folii poliimidowej jako materiału okiennego. Nasza procedura zoptymalizowała różne etapy procesu produkcyjnego w porównaniu z poprzednimi projektami chipów rentgenowskich16,21. Zmniejszyliśmy grubość okna, a tym samym rozproszenie tła, jednocześnie ułatwiając produkcję, ponieważ wymagana jest mniejsza liczba etapów procesu. Krystalizacja in situ przy użyciu opisanego protokołu przynosi znaczne korzyści. Umożliwia zbieranie danych dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej, a tym samym wyklucza potrzebę ochrony kriogenicznej, która w niektórych przypadkach wiąże się z ryzykiem wprowadzenia artefaktów do struktury białka. Co więcej, kryształy nie są poddawane naprężeniom fizycznym, ponieważ można uniknąć przenoszenia kryształów z ich rodzimego środowiska. Dzięki tej procedurze kryształy zachowują swoją najwyższą jakość i nie są poddawane żadnej obróbce.

Z naszego doświadczenia wynika, że najbardziej krytyczne kroki w ramach protokołu koncentrują się na kontrolowaniu procesu krystalizacji. Parametry pozwalające uzyskać odpowiednie do promieniowania rentgenowskiego kryształy o odpowiednich wymiarach muszą być zidentyfikowane empirycznie i nie mogą być uzyskane bezpośrednio z eksperymentów dyfuzji pary. Stosowanie identycznych stężeń białka i środka strącającego nie zawsze skutkowało kryształami w różnych chipach, a czasami w różnych dołkach w tym samym chipie. Wskazuje to, że należy dokładnie rozważyć wszystkie czynniki wpływające na zarodkowanie i wzrost kryształów, takie jak skład ługu macierzystego lub kinetyka krystalizacji (poprzez trajektorię parowania). Ponieważ większe kryształy ulegają dyfrakcji do wyższej rozdzielczości, idealnie rosną odpowiednio duże kryształy. Proces zarodkowania i wzrostu kryształów może być śledzony za pomocą pomiarów DLS. Regulacja ostrości lasera w cienkich przedziałach krystalizacyjnych chipa o grubości ~50 μm może być trudna i może wymagać starannego ręcznego wyrównania. Dzięki zastosowaniu odwiertów głębszych niż 100 μm, automatyczne wyrównywanie lasera było wykonalne i niezawodne, dzięki czemu wiele odwiertów można było monitorować za pomocą zautomatyzowanych schematów akwizycji.

Chipy rentgenowskie na bazie poliimidu wytwarzają tylko niskie tło, a my wykazujemy przydatność tych urządzeń do rutynowego zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, rozwiązując struktury dla trzech modelowych białek. Najlepsza rozdzielczość uzyskana w chipie różniła się, w porównaniu z poprzednio osiąganymi rozdzielczościami, od znacznie większych kryształów białkowych i konwencjonalnego zbierania danych rentgenowskich. Może to wynikać z kilku czynników, a dalsza optymalizacja warunków krystalizacji może jeszcze bardziej poprawić dyfrakcję. Możliwe było zebranie danych dyfrakcyjnych in situ z rozdzielczością do 1,8 A przy zastosowaniu kryształu o wymiarach mniejszych niż 30 μm. Szczegółowa analiza danych dyfrakcji taumatyny dostarczyła informacji na temat uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Aby ograniczyć zakres uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, tylko jeden pojedynczy kryształ powinien być odsłonięty na każdy przedział w urządzeniu mikroprzepływowym, ponieważ może dojść do dyfuzji rodników do i w sąsiednich kryształach. Aby zwiększyć szybkość gromadzenia danych, powinno to zostać zautomatyzowane w przyszłości.

Ze względu na morfologię kryształów w niektórych przypadkach może wystąpić preferowana orientacja. Tak było na przykład w przypadku zestawu danych dotyczących tioredoksyny, w którym kryształy miały zdecydowanie preferowaną orientację w stosunku do okien chipów. Nawet tutaj udało nam się zebrać kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych. Jeżeli kryształy wykazują preferowaną orientację w chipie, a w szczególności, jeśli odpowiadająca im grupa przestrzenna ma również niską symetrię, wówczas kompletność zbioru danych powinna być monitorowana podczas zbierania w taki sposób, aby można było zebrać wystarczające wzory dyfrakcyjne.

Badania czasowo-rozdzielcze z wykorzystaniem tych chipów są bezpośrednio możliwe przy użyciu reakcji indukowanych światłem z podejściem pompa-sonda. Należy wyjaśnić przepuszczalność światła z folii poliimidowej dla lasera pompującego i alternatywnie można zastosować optycznie przezroczysty poliimid lub COC. Obecne geometrie mikroprzepływowe nie pozwalają na eksperymenty z mieszaniem substratu po wyhodowaniu kryształów. Spodziewamy się jednak, że opisany protokół wytwarzania chipów rentgenowskich będzie również odpowiedni dla takich projektów mieszania zarówno dla dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w czasie, jak i podejścia rozpraszania19.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusz zalążkowy PIER PIF-2015-46, granty BMBF 05K16GUA i 05K12GU3 oraz klaster doskonałości "Hamburskie Centrum Ultraszybkiego Obrazowania – Struktura, Dynamika i Kontrola Materii w Skali Atomowej" Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Praca autorów związanych z Center for Free-Electron Laser Science została sfinansowana przez Stowarzyszenie Helmholtza z funduszy zorientowanych na program. Dane synchrotronowe MX zostały zebrane na linii badawczej P14 obsługiwanej przez EMBL Hamburg w pierścieniu magazynowym PETRA III (DESY, Hamburg, Niemcy).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SU-8 Seria 3000MicroChem Corp.SU-8 3000Photoresist
PGMEASigma-Aldrich484431Developer
izopropylowy
Etanol
Rozpuszczalnik Klej epoksydowyUHUPlus Schnellfest 5 minKlej epoksydowy
PDMSDow CorningSylgard 184Folia silikonowa
KaptonDupont/ Amerykański gatunek DurafilmHN, rozstaw 30 (7,5 μ m)folia poliamidowa
APTSSigma-Aldrich440140Chemiczny
GPTSSigma-Aldrich440167Chemiczny
Cytop CTX-109AEAsahi Glass Co. LtdCytop CTX-109AEPowłoka fluoropolimerowa Cytop
CT-Solv 100EAsahi Glass Co. LtdCT-Solv 100ECytop fluororozpuszczalnik
HFE-75003MNovec 7500Olej fluorowany
AutoCADAutoDesk Inc.AutoCADCAD Software
Biopsy PunchHarrisUni-core 0,75 mm
Maska fotograficznaJD Photo Data
3-calowy wafelUniversity WafelSilicon wafer
Mask alignerSÜ SS MicroTecMJB4Maska wyrównująca
mikser PDMSThinkyARE-250
Maszyna plazmowaDiener elektronicznaZepto
ThaumatinSigma AldrichT7638Białko
Glukoza IzomerazaHamton ResearchHR7-102Białko
Bis-TrisSigma AldrichB9754Chemiczny
Winian soduMerck106664Chemiczny
Tris-HClSigma Aldrich10812846001Chemiczny
HEPESCarl Roth6763.2Chemiczny
chlorek magnezuSigma Aldrich208337Chemiczny
siarczan amonuSigmaAldrich A4418Chemiczny
EDTASigma AldrichE6758Chemiczny
chlorek soduSigma Aldrich1064060250Chemiczny
PEG1500Wymiary molekularneMD2-100-6Chemiczny
bufor SPGJena BioscienceCSS-389
Spektrofotometr chemiczny Light600XtalConceptsDLS Instrument
NanodropThermo Scientific
ZentrifugeEppendorf
Ultimaker2Drukarka 3DUltimaker
Drukarka3DForm2 Formlabs
Filtr AmiconSartorius Stedim0,2 i mikro; m filtr
RurkiAdtech Polymer Engineering LtdBioblock/05Rurka PTFE 0,3 mm Średnica wewnętrzna x 0,76 mm Średnica zewnętrzna
Strzykawki Igła dokońcówek Luer-Lock 1 ml309628
 Igła Terumo AganiAN*2716R127Gx5/8"
Alkohol RozpuszczalnikBD

Bibliografia

  1. Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
  2. Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
  3. Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
  5. Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
  6. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  7. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
  8. von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
  9. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  10. Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
  11. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
  12. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  13. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
  14. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
  15. White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
  16. Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
  17. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
  18. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
  19. Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
  20. Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
  21. Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
  22. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309(2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
  25. Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
  26. Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
  27. Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
  28. Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
  29. Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
  30. Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
  31. Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
  32. Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
  34. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
  36. Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
  37. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  38. Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
  39. Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
  40. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).
  41. Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
  42. Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
  43. Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
  44. Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
  45. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
  46. Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Krystalizacja białekodlewanie w formie epoksydowejfolia polimidowamontaż w goniometrzezawory kapilarnepowłoka fluoropolimerowa
Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.