Artykuł metodologiczny

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

DOI:

10.3791/57146

⸱

30 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas replikacji DNA jest ważną cechą komórkową, wykazującą znaczące związki ze strukturą chromatyny, transkrypcją i szybkością mutacji DNA. Zmiany w czasie replikacji zachodzą podczas rozwoju i raka, ale rola, jaką czas replikacji odgrywa w rozwoju i chorobie, nie jest znana. Danio pręgowany został niedawno opracowany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania danio pręgowanego do określenia czasu replikacji DNA. Po posortowaniu komórek od zarodków i dorosłych ryb danio pręgowanego można skonstruować wzorce replikacji DNA w całym genomie o wysokiej rozdzielczości, określając zmiany w liczbie kopii DNA poprzez analizę danych sekwencjonowania nowej generacji. System modelowy danio pręgowanego pozwala na ocenę zmian w czasie replikacji, które zachodzą in vivo w trakcie rozwoju, a także może być wykorzystywany do oceny zmian w poszczególnych typach komórek, modelach chorób lub zmutowanych liniach. Metody te umożliwią badania nad mechanizmami i determinantami ustanawiania i utrzymywania czasu replikacji podczas rozwoju, rolą, jaką czas replikacji odgrywa w mutacjach i nowotworzeniu oraz wpływem zakłócającego czasu replikacji na rozwój i chorobę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby komórki mogły się pomyślnie podzielić, muszą najpierw dokładnie i wiernie odtworzyć cały swój genom. Duplikacja genomu zachodzi w powtarzalnym wzorcu, znanym jako program do pomiaru czasu replikacji DNA1. Czas replikacji DNA jest skorelowany z organizacją chromatyny, znakami epigenetycznymi i ekspresją genów2,3. Zmiany w czasie replikacji zachodzą w trakcie rozwoju i są istotnie związane z programami transkrypcyjnymi oraz zmianami w znacznikach chromatyny i organizacji4,5. Co więcej, czas replikacji jest skorelowany z częstością mutacji, a zmiany w czasie są obserwowane w różnych typach raka6,7,8. Pomimo tych obserwacji, mechanizmy i determinanty ustalania i regulacji czasu replikacji są nadal w dużej mierze nieznane, a rola, jaką odgrywa w rozwoju i chorobie, jest nieokreślona. Ponadto do niedawna zmiany w czasie replikacji całego genomu, które zachodzą w trakcie rozwoju kręgowców, były badane tylko w modelach hodowli komórkowych.

Danio rerio, Danio rerio, są dobrze przystosowane do badania czasu replikacji in vivo podczas rozwoju, ponieważ pojedyncza para godowa może dać setki zarodków, które rozwijają się szybko z wieloma podobieństwami do rozwoju ssaków9,10. Co więcej, w trakcie rozwoju danio pręgowanego zachodzą zmiany w cyklu komórkowym, organizacji chromatyny i programach transkrypcyjnych, które mają związek z czasem replikacji DNA11. Danio pręgowany jest również doskonałym modelem genetycznym, ponieważ są szczególnie podatne na manipulacje poprzez transgenezę, mutagenezę i mutacje celowane, a badania genetyczne zidentyfikowały wiele genów wymaganych do rozwoju kręgowców12. W związku z tym danio pręgowany może być wykorzystywany do identyfikacji genów zaangażowanych w ustalanie i utrzymywanie czasu replikacji oraz do obserwacji wpływu deregulacji czasu replikacji na rozwój kręgowców. Linie transgeniczne mogą być również wykorzystywane do oceny czasu replikacji z poszczególnych typów komórek wyizolowanych w różnych punktach czasowych rozwoju lub w warunkach chorobowych. Co ważne, istnieją różne modele chorób człowieka u danio pręgowanego, które można wykorzystać do zbadania roli czasu replikacji w powstawaniu i postępie choroby9,13,14.

Niedawno, pierwsze profile czasu replikacji zostały wygenerowane z danio pręgowanego, ustanawiając go modelowym systemem do badania czasu replikacji in vivo15. Aby to osiągnąć, pobrano komórki z zarodków danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju i w typie komórki wyizolowanym od dorosłego danio pręgowanego. Komórki zostały następnie posortowane za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją) na podstawie zawartości DNA w celu wyizolowania populacji faz G1 i S. Używając próbki G1 jako kontrolki liczby kopii, określono wariacje liczby kopii w populacjach fazy S i wykorzystano je do wywnioskowania względnego czasu replikacji16. Zmiany w czasie replikacji można następnie bezpośrednio porównać między różnymi próbkami rozwojowymi i typami komórek, co wykorzystano do określenia zmian w czasie replikacji, które zachodzą in vivo w trakcie rozwoju kręgowców. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami genomicznymi, przede wszystkim dlatego, że nie wymaga znakowania analogami tymidyny ani immunoprecypitacji DNA4,6.

Tutaj szczegółowo opisano protokoły do profilowania czasu replikacji DNA w całym genomie w wysokiej rozdzielczości u danio pręgowanego. Protokoły te zostały wykorzystane do określenia relacji z cechami genomicznymi i epigenetycznymi w genomie danio pręgowanego, a także do profilowania zmian w tych relacjach, które zachodzą w trakcie rozwoju. Protokoły te można również łatwo dostosować do badania zmian w czasie replikacji w zmutowanych szczepach danio pręgowanego oraz w modelach chorób. Ponadto metody te stanowią podstawę, którą można rozszerzyć w celu zbadania czasu replikacji w określonych typach komórek, najpierw sortując poszczególne typy komórek od danio pręgowanego. Danio pręgowany może służyć jako doskonały system modelowy in vivo do badania czasu replikacji i ostatecznie ujawnienia biologicznych funkcji tej ważnej cechy epigenetycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane ściśle według protokołów zatwierdzonych przez Oklahoma Medical Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie dorosłego danio pręgowanego do hodowli

  1. Do hodowli należy użyć dużej kohorty dorosłych samców i samic danio pręgowanego z jednego szczepu. Istnieją niewielkie różnice w składzie genetycznym danio pręgowanego nawet pojedynczego szczepu, należy użyć dużej kohorty, aby upewnić się, że wyniki są reprezentatywne dla zmienności genetycznej populacji i nie ograniczają się do niewielkiej podgrupy populacji.
  2. W noc poprzedzającą pobranie zarodków umieść dziesiątki dorosłych osobników lęgowych w zbiornikach hodowlanych, użyj w przybliżeniu równej liczby samców i samic. W zależności od eksperymentu zastosuj jedną z następujących strategii hodowlanych.
    1. Strategia hodowlana 1: Umieść kilka samców i samic danio pręgowanego w indywidualnych zbiornikach hodowlanych, oddziel samce od samic przegrodą. Jeśli zastosujesz to podejście, skonfiguruj wiele różnych zbiorników hodowlanych i połącz zarodki z każdego z nich, aby zapewnić, że zmienność biologiczna jest reprezentatywna dla populacji.
    2. Strategia hodowlana 2: Połącz dziesiątki samców i samic danio pręgowanego w dużym zbiorniku hodowlanym. Strategię tę należy stosować tak długo, jak długo istnieje wystarczająco duża liczba zarodków, można założyć, że pochodzą one od różnych założycieli, a zatem są genetycznie reprezentatywne dla populacji.

2. Krycie czasowe - zbieranie, sortowanie i przechowywanie zarodków danio pręgowanego do eksperymentów

  1. Wykonuj krycia czasowe, zaczynając od momentu, gdy tylko światło zacznie się zmieniać rano. Wyrzuć wszystkie zarodki powstałe w ciągu nocy.
  2. Pozwól rybom rozmnażać się w płytkiej wodzie (3-5 cm) przez okres 10 minut, z fałszywym dnem, przez które mogą uciec zarodki.
  3. Po 10 minutach zbierz zarodki, przesypując je przez sitko i spłukując na 10-centymetrową płytkę z butelką do mycia. Zebrać wszystkie zarodki pobrane w tym samym punkcie czasowym, oznaczyć je godziną pobrania i niezwłocznie umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.
  4. Z jednej pary godowej można spodziewać się setek zarodków w ciągu jednego dnia. Pozwól dorosłym rozmnażać się w cyklach 10-minutowych, aż liczba uzyskanych zarodków będzie mniejsza niż dwadzieścia.
  5. Około 1-1,5 godziny po pobraniu należy posortować zarodki w celu usunięcia martwych i niezapłodnionych zarodków. Aby posortować zarodki, wyjmij je z inkubatora i obserwuj pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Policz zarodki i umieść je w gęstości 100 zarodków na 10 cm płytce.
    2. Dodać świeżą pożywkę E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4) i umieścić zarodki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

3. Dechorionat, deyolk i utrwalanie zarodków danio pręgowanego

UWAGA: Ta sekcja protokołu jest przeznaczona dla zarodków przed 48 godzinami po zapłodnieniu (hpf). Nie ma potrzeby usuwania kosmówki zarodków w późniejszych stadiach rozwoju (po 48 hpf), ponieważ często odpadają one w sposób naturalny. Nie ma potrzeby usuwania żółtka ani usuwania kosmówki ryb starszych 5 dni po zapłodnieniu (dpf).

  1. Gdy zarodki osiągną pożądany wiek rozwojowy, sprawdź odpowiedni etap rozwoju morfologicznego pod mikroskopem świetlnym zgodnie z "Etapy rozwoju embrionalnego danio pręgowanego"17.
  2. Przenieś do 1500 zarodków w stadium zaawansowania do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przemyj kilkakrotnie E3.
    1. Dodać 1 ml E3 i 20 μl roztworu pronazy (30 mg/ml) na każde 100 zarodków i delikatnie zamieszać. Do 1500 zarodków może zostać zdekorionowanych w jednej probówce zawierającej 15 ml E3.
    2. Połóż probówkę na boku i ułóż zarodki w równej warstwie, aby zapewnić maksymalny stosunek powierzchni do objętości. Delikatnie mieszaj rurkę co 2-3 minuty, aż wszystkie kosmówki odpadną z zarodków. Całkowity czas dechorionacji będzie się różnić w zależności od aktywności Pronazy.
  3. Usunąć supernatant i delikatnie spłukać zarodki 3 razy 10 ml E3. Umieść zarodki na lodzie do końca niniejszej sekcji protokołu.
  4. Usuń E3 i umyj zarodki świeżo przygotowanym lodowatym buforem do usuwania żółtka (0,5x roztwór Ginzburg Fish Ringer, bez wapnia: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO3).
    1. Dodaj 1 ml lodowatego buforu do usuwania żółtka dla maksymalnie 500 zarodków.
    2. Za pomocą P1000 delikatnie pipetuj zarodki w górę i w dół 5-10 razy, aby rozbić worek żółtkowy.
    3. Przenieść 1 ml do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 4 °C i 500 x g przez 5 minut.
  5. Usunąć supernatant i przepłukać osad 1 ml lodowatego 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,0) w celu usunięcia roztworu Ringera. Wirować w temperaturze 4 °C i 500 x g przez 5 min.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS. Umieść rurkę na lodzie.
  7. Dodaj 3 ml lodowatego etanolu (EtOH) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rurkę wirową EtOH delikatnie na niskim ustawieniu.
    1. Za pomocą P1000 powoli (1 kropla na sekundę) wkraplaj zawiesinę komórek zarodka danio pręgowanego do EtOH, delikatnie wirując.
    2. Dodać w sumie 1 ml zawiesiny komórek zarodkowych, aby uzyskać końcowy roztwór utrwalający 75% EtOH.
  8. Po dodaniu 1 ml zawiesiny komórkowej delikatnie zamieszać probówkę i umieścić w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę. Zaleca się umieszczenie probówek na boku, aby zapewnić maksymalny stosunek powierzchni do objętości i zmniejszyć liczbę sklejających się ze sobą zarodków i komórek. Komórki zarodkowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez 2-3 tygodnie.

4. Barwienie DNA i sortowanie zarodków metodą FACS

UWAGA: Ta sekcja protokołu jest przeznaczona dla zarodków przy 1 dpf.

  1. Usunąć komórki zarodkowe utrwalone EtOH z temperatury -20 °C i odwirować w temperaturze 4 °C 1500 x g przez 5 minut.
    1. Umieść probówkę na lodzie i ostrożnie usuń supernatant. Za pomocą P1000 delikatnie zawiesić komórki w 1 ml świeżo przygotowanego zimnego PBS-BSA (1x PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej).
    2. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 1500 x g przez 5 minut i umieścić na lodzie.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze barwiącym jodku propidyny (PI) (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNazy A, PBS, pH 7,0), używając 200 μl na każde 1000 zarodków.
    1. Pozostawić komórki do inkubacji w roztworze PI przez 30 minut na lodzie, delikatnie mieszając co 5 minut.
    2. Umieść sitko z nylonu o pojemności 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Delikatnie odpipetuj komórki, aby wymieszać i przefiltrować przez siatkę.
      UWAGA: Jeśli w sekcji 3 protokołu pobrano wiele probówek z zarodkami z tego samego punktu czasowego, należy połączyć te zarodki w tym momencie, tak aby wszystkie zostały posortowane razem.
    3. Używając płaskiego wewnętrznego końca tłoka strzykawki, delikatnie rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek na siatce.
    4. Przepłukać komórki przez filtr 500 μl zimnego PBS-BSA na każde 1000 zarodków.
    5. Umieść siatkę 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie i przefiltruj zawiesinę komórek z rurki stożkowej o pojemności 50 ml po raz drugi do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Za pomocą odpowiedniego przyrządu do sortowania komórek ustaw wzbudzenie lasera na 561 nm i detekcję emisji na 610/20, aby wykryć jodek propidyny.
    1. Zmieszać krótko 15 ml probówki z barwionymi komórkami przez wirowanie i umieścić w urządzeniu w temperaturze 4 °C.
    2. Uruchom komórki z wolnym natężeniem przepływu, najlepiej 1,0 ml/min, aby uzyskać czysty profil cyklu komórkowego i uniknąć mieszania komórek G1 lub G2/M z populacją fazy S.
    3. Najpierw bramka dla FSC-A x SSC-A (obszar rozproszenia przodu przez obszar rozproszenia bocznego) w celu usunięcia zanieczyszczeń ( Rysunek 1A).
      UWAGA: Komórki z zarodków mogą mieć różne rozmiary w zależności od stadium i typu komórki. Filtr o neutralnej gęstości (ND) może wymagać przełączenia między 1,0 a 1,5 w zależności od wielkości obecnych komórek. Bramka na dużym obszarze, aby zebrać większość komórek i usunąć zanieczyszczenia.
    4. Po drugie, bramka dla obszaru SSC (SSC-A) według obszaru PI (PI-A), aby usunąć zanieczyszczenia i dublety komórek (Rysunek 1B).
    5. Po trzecie, bramka dla SSC-A przez SSC-W (szerokość), aby usunąć wszelkie pozostałe dublety komórek (Rysunek 1C).
  4. Wyświetl bramkowane populacje na histogramie z numerem komórki (liczbą) na osi y i obszarem jodku propidyny (PI-A) na osi x. Dla zarodków z 24 zarodkami hpf powinno to dać stereotypowy profil cyklu komórkowego, jak w Rysunek 1D.
    1. Aby posortować populację fazy S, ustaw bramkę od prawej strony piku G1 do lewej strony piku G2, uwzględniając tylko minimalną ilość populacji G1 i G2. W przypadku 24 zarodków hpf zazwyczaj będzie to około 10-15% populacji bramkowanej (patrz Rysunek 1D).
    2. Aby posortować populację G1, ustaw bramę po lewej stronie szczytu G1, aby nie przechodzić przez szczyt szczytu. Dostosuj szerokość bramki G1 tak wąską, jak to możliwe (patrz Rysunek 1D).
    3. Tylna bramka populacji faz G1 i S, aby zapewnić prawidłowe początkowe bramkowanie (Rysunek 1E).
  5. Posortuj populacje faz G1 i S do stożkowych probówek o pojemności 15 ml z 3 ml PBS-BSA. Celem powinno być uzyskanie od 500 000 do 1 miliona lub więcej posortowanych komórek na frakcję (faza G1 i S).
  6. Po zakończeniu sortowania probówki wirować w temperaturze 1500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Granulka o małych komórkach będzie trudna do zauważenia i ważne jest, aby jej nie zakłócać, dlatego najlepiej używać wahadłowego wirnika kubełkowego zamiast wirnika o stałym kącie.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml 1x PBS. Przenieść komórki do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 6 000 x g i 4 °C przez 5 minut.
  8. Ostrożnie usuń cały płyn z probówki i zamroź suchy granulat w temperaturze -20 °C. Przechowuj granulki w temperaturze -20 °C przez 2-3 tygodnie.

5. Izolacja DNA, leczenie RNazą i oczyszczanie DNA

  1. Usunąć osad komórkowy z temperatury -20 °C i umieścić na lodzie.
    1. Dodać 400 μl buforu SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) do osadu i ponownie zawiesić.
    2. Dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,2 mg/ml i wymieszać, krótko wirując.
    3. Próbki inkubować w temperaturze 56 °C przez 2 godziny, wirować co 15 minut.
  2. Po 2 godzinach przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową dodając 400 μL chloroformu fenolowego (Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1, nasycony 10 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA).
    1. Wirować przez 20 s i odwirowywać próbkę o masie 16 000 x g przez 5 minut w celu rozdzielenia faz.
    2. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną (400 μl) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Przeprowadzić wytrącanie EtOH, dodając 40 μl octanu sodu 3M (pH 5,2), 2 μl glikogenu i 1 ml EtOH.
    1. Dokładnie wymieszać i umieścić w temperaturze -20 °C na noc, aby wytrącić DNA. Próbka może być również wytrącana w temperaturze -80 °C lub na suchym lodzie przez 1 godzinę.
    2. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C i 16 000 x g przez 30 minut w celu osadzenia DNA.
    3. Wyrzucić supernatant i przepłukać osad 1 ml 70% EtOH. Wirować w temperaturze 4 °C i 16 000 x g przez 5 min.
    4. Wyrzucić supernatant i suchy na powietrzu granulat w temperaturze otoczenia na 2-3 minuty.
  4. Rozpuść osad w 96 μl autoklawowanej wody i dodaj 4 μl RNazy A (2 mg/ml).
    1. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową przez dodanie 100 μl chloroformu fenolowego i postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 5.2.1 - 5.2.2.
  6. Przeprowadzić wytrącanie EtOH, dodając 10 μl 3M octanu sodu, 1 μl glikogenu i 250 μl EtOH i postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 5.3.1 - 5.3.5.
  7. Zawiesić osad w 60 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)) i oznaczyć stężenie DNA metodą ilościową opartą na fluorescencji. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby określić ilościowo DNA przy użyciu barwników wiążących DNA na bazie fluorescencji lub innych środków bardziej wiarygodnych niż metody oparte na spektrometrze UV.

6. Przygotowanie bibliotek DNA i sekwencjonowanie nowej generacji

UWAGA: Próbka referencyjna o numerze kopii G1 dla każdego źródła biologicznego jest wymagana dla każdego przebiegu sekwencjonowania (np. WT, mutant, transgeniczny, linia komórkowa, itp.). Porównaj wszystkie próbki fazy S z tego samego źródła biologicznego w tym samym przebiegu sekwencjonowania z tym samym odniesieniem G1. Przeprowadzić co najmniej dwie kontrpróby biologiczne każdej próbki, aby zapewnić spójność między próbkami.

  1. Rozcieńczyć 1 μg DNA do końcowej objętości 50 μl i przenieść do specjalistycznej probówki do sonikacji.
  2. Ścinanie genomowego DNA dla celu 250-300 pz w skoncentrowanym ultrasonografie, zgodnie ze specyfikacją producenta i protokołem.
  3. Sprawdź jakość i rozmiar ściętego genomowego DNA za pomocą zautomatyzowanej maszyny do elektroforezy, zgodnie ze specyfikacjami i protokołem producenta. Upewnij się, że występuje duży pik ~ 250-300 pz dla ściętego genomowego DNA.
  4. Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki DNA z oligonukleotykami multipleksowymi do sekwencjonowania na platformie Illumina, zgodnie z protokołem producenta.
  5. Sprawdź jakość przygotowania biblioteki za pomocą automatycznej maszyny do elektroforezy, zgodnie z protokołem producenta. Upewnij się, że występuje duży pik ~400-450 pz i minimalne piki dla dimerów starterów (80-85 pz) i dimerów adapterowych (~120 pz).
  6. Ilościowe określanie bibliotek za pomocą zestawu do kwantyfikacji biblioteki DNA do sekwencjonowania DNA nowej generacji, zgodnie z protokołem producenta.
  7. Rozcieńczyć 15 μl biblioteki do stężenia 5 nM i połączyć biblioteki multipleksowane zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać pożądaną liczbę odczytów w jednoznacznym odwzorowaniu na próbkę.
    UWAGA: Rozdzielczość będzie określana przez liczbę odczytów unikalnego mapowania na próbkę. Użyj zaledwie 5 milionów zmapowanych odczytów, aby ocenić czas replikacji genomu danio pręgowanego. Zaleca się rozpoczęcie od 10-20 milionów odczytów.
  8. Wykonaj sekwencjonowanie całego genomu całego genomu o długości 100 pz próbek na platformie sekwencjonowania nowej generacji, zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Analiza danych sekwencjonowania

UWAGA: Instrukcje w tej sekcji mają służyć jako wytyczne do analizy. Użyj dodatkowych metod sekwencjonowania, wyrównywania, filtrowania, przetwarzania itp. W tej części protokołu omówiona zostanie preferowana metoda analizy w niniejszej pracy. Jeśli stosowane są dodatkowe metody, dostosuj parametry i funkcje do tych celów. Poniższe polecenia są wprowadzane w terminalu Ubutnu lub Mac, z zainstalowanymi odpowiednimi pakietami.

  1. Uzyskaj najnowsze wersje genomu danio pręgowanego (danRer10, w momencie pisania tego protokołu) z przeglądarki genomów UCSC za pomocą następujących poleceń:
    wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. Rozpakuj plik fa.gz za pomocą następującego polecenia:
      Gunzip danRer10.fa.gz
    2. Dopasuj dane sekwencjonowania do genomu za pomocą BWA-mem za pomocą następujących poleceń:
      bwa mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. Konwertuj plik .sam na plik .bam za pomocą samtools za pomocą następującego polecenia:
    samtools view -bS wejście.sam > wyjście.bam
    1. Posortuj wyrównane pliki sekwencjonowania za pomocą samtools za pomocą następującego polecenia:
      samtools sortuj output.bam > output_sorted.bam
    2. Indeksuj plik .bam za pomocą samtools za pomocą następującego polecenia:
      samtools index output.bam (wyjście) indeksu samtools
  3. Oznacz duplikaty PCR za pomocą Picarda za pomocą następujących poleceń:
    java -Xmx2g -jar picard.jar MarkDuplicates \
    INPUT=input.bam
    OUTPUT=wyjście.bam
    REMOVE_DUPLICATES=false
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. Wygeneruj pliki tekstowe (.txt) odczytów dla każdego chromosomu za pomocą następującego polecenia:
    dla i w {1,25}; do CHROM="chr"$i; echo $CHROM; Samtools View input.bam $CHROM | cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr${i}.txt; Zrobione
    UWAGA: Kolumny w wynikowym pliku .txt to odpowiednio: Flaga, Lokalizacja, mapQ, para chr, lokalizacja pary i rozmiar fragmentu.
  5. Wczytaj .txt pliki do Matlaba (lub innego podobnego oprogramowania) za pomocą funkcji textscan.
    1. Odfiltruj odczyty o niskiej jakości mapowania, ustawiając próg mapQ na 30.
    2. Usuń odczyty z flagami dla niepierwszorzędowego wyrównania, duplikatów PCR lub mapowania par do innego chromosomu.
    3. Odfiltruj wszystkie odczyty z ich parą poza progiem odległości 2000 bp.
    4. Oceń statystyki wynikowych odczytów, aby określić liczbę statystyk odczytu, pokrycie, rozmiar płytki i jakość (Rysunek 2).
  6. Określ pokrycie odczytem w stałych oknach 100 pz dla każdej próbki, zliczając liczbę odczytów w odstępach 100 pz na całej długości każdego chromosomu.
    1. Oblicz medianę liczby odczytów dla wszystkich okien.
    2. Odfiltruj obszary o dużym pokryciu, usuwając okna większe niż 5 odchyleń standardowych od mediany.
  7. Zdefiniuj regiony do analizy w próbkach referencyjnych G1, znajdując segmenty wzdłuż każdego chromosomu z 200 odczytami za pomocą przesuwanych okien.
    1. Określ głębokość odczytu w każdej próbce fazy S, zliczając liczbę odczytów fazy S w 200 oknach zliczania odczytów zdefiniowanych dla towarzyszącego odniesienia G1.
  8. Wygładź surowe dane za pomocą funkcji csaps w oprogramowaniu, ze współczynnikiem interpolacji (p) 10-16.
  9. Normalizuj wygładzone dane do wskaźnika Z ze średnią 0 i odchyleniem standardowym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opublikowanych danych dotyczących czasu replikacji, podano reprezentatywne profile czasu replikacji i środki kontroli jakości15. Początkowe etapy przetwarzania obejmują dostosowanie danych sekwencjonowania do genomu, obliczenie statystyk długości odczytu i pokrycia genomu oraz filtrowanie zduplikowanych odczytów o niskiej jakości, niesparowanych i PCR. Statystyki odczytu dla typowej próbki sekwencjonowania danio pręgowanego są pokazane w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany zapewnia nowy i unikalny system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA. Kiedy krzyżowanie w czasie jest wykonywane zgodnie z opisem w tym protokole eksperymentalnym, tysiące zarodków może zostać pobranych w ciągu jednego dnia do eksperymentów. Zarodki te rozwijają się synchronicznie przez precyzyjnie określone w czasie i wyraźnie scharakteryzowane etapy rozwoju. Danio pręgowany można łatwo i dokładnie określić pod względem morfologii za pomocą stereomikroskopu, ponieważ zarodki danio pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health poprzez granty 5P20GM103636-02 (w tym wsparcie dla cytometrii przepływowej) i 1R01GM121703, a także nagrody od Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
PronazaSigma10165921001roztwór proteazy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaD1408
Etanol (EtOH)KOPTECV1016
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA9647-100G
Jodek propidyny (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Proteinaza KNEBP8107S
Fenol: ChloroformSigmaP3803-100ML
Octan soduJT Baker3470
GlikogenAmbionAM9510
RNaza AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130Odczynniki do ilościowego oznaczania DNA na podstawie fluorescencji
Covaris AFA microTUBECovaris520045specjalistyczna probówka do sonikacji
Covaris E220 SonicatorCovarisE220skoncentrowany ultrasonograf
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAautomatyczna maszyna do elektroforezy
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Odczynniki do automatycznej maszyny do elektroforezy
Zestaw NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit dla IlluminaNEBCat#E7370LZestaw do przygotowania biblioteki DNA
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)NEBCat#E7335Smultipleksowe oligonukleotydy do zestawu
do przygotowania biblioteki DNANEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)NEBCat#E7500Sdodatkowe multipleksowe oligonukleoty do zestawu do przygotowania biblioteki DNA
NEBNext Library Quant Kit dla IlluminaNEBZestaw do kwantyfikacjiE7630L
Koraliki Agencourt AMPure XP KoralikimagnetyczneBeckman CoulterA63882
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501platforma sekwencjonowania DNA nowej generacji
40 i mikro; m Nylonowe sitko komórkowe FalconFisher Scientific08-771-1
Jednorazowa szalka Petriego VWR 100 x 25 mmVWR89107-632
Strzykawka 6,0 ml do Nichiryo Model 8100VWR89078-446
Rurki Posi-Click, 1,7 mL, kolor naturalnyDenville ScientificC2170 (1001002)Vortex Genie bez Dnazy/Rnazy
2 ScientificIndustriesSI-0236
Butelki do myciaVWR16650-022Polietylen o niskiej gęstości, sitko z szerokimi ustami
VWR470092-4406,9 cm, drobne oczka
Zbiornik do korkówAquaneeringZHCT100indywidualny zbiornik hodowlany
iSpawnTechniplastN/Aduży zbiornik hodowlany
FACSAria IIBD biosciencesN/Amaszyna do sortowania komórek
Dziki mikroskop steromikroskopowy M5apreparacyjnyWild HeerbruggN/A
Fluorometr Qubit 3Thermo ScientificQ33216ilościowa metoda oznaczania stężenia DNA
MatlabMathworkswersja 2017a
Matlab StatisticsToolbox Mathworkswersja 11.1
Matlab Curve Fitting ToolboxMathworksw wersji 3.5.5
NEB do przygotowania biblioteki Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  4. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).
  5. Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
  6. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  7. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  8. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  9. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  10. Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
  11. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  14. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  15. Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
  16. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

DNA Replication TimingZebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

Powiązane artykuły