Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57153

⸱

31 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, The University of Auckland, 2Research School of Biology, The Australian National University, 3Auckland Cancer Society Research Centre, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 4Department of Plastic Surgery, Counties Manukau District Health Board, 5Department of Surgery, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 6Biomedical Imaging Research Unit, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 7Maurice Wilkins Centre, The University of Auckland

W tym artykule

Podsumowanie

Tradycyjne metody oceny różnicowania adipogennego są tanie i łatwe w użyciu, ale nie są specyficzne dla zmian w ekspresji genów. Opracowaliśmy test do ilościowego określania różnicowania komórek mezenchymalnych w dojrzałe adipocyty przy użyciu markera specyficznego dla linii. Test ten ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i medycynie klinicznej.

Streszczenie

Obecnie dostępnych jest kilka barwników do wykrywania różnicowania komórek mezenchymalnych w adipocyty. Barwniki, takie jak Oil Red O, są tanie, łatwe w użyciu i szeroko wykorzystywane przez laboratoria analizujące potencjał adipogenny komórek mezenchymalnych. Nie są one jednak specyficzne dla zmian w transkrypcji genów. Opracowaliśmy test różnicowania specyficznego dla genu, aby przeanalizować, kiedy komórka mezenchymalna zmieniła swój los na linię adipogenną. Znakowanie immunologiczne białka wiążącego kwasy tłuszczowe-4 (FABP4), specyficznego dla linii markera różnicowania adipogennego, umożliwiło wizualizację i kwantyfikację zróżnicowanych komórek. Możliwość ilościowego określenia potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych w formacie mikropłytki 96-dołkowej ma obiecujące implikacje dla wielu zastosowań. Setki badań klinicznych obejmują wykorzystanie dorosłych mezenchymalnych komórek zrębu i obecnie trudno jest skorelować wyniki terapeutyczne w ramach takich badań klinicznych, a zwłaszcza między nimi. Ten prosty, wysokoprzepustowy test FABP4 zapewnia ilościowy test do oceny potencjału różnicowania komórek pochodzących od pacjentów i jest solidnym narzędziem do porównywania różnych metod izolacji i ekspansji. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę coraz większą świadomość niejednorodności komórek podawanych pacjentom w produktach z komórek mezenchymalnych. Test ma również potencjalne zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków, szczególnie w badaniach nad otyłością i stanem przedcukrzycowym.

Wprowadzenie

Jednym z kluczowych wymagań ustanowionych przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT) w celu zdefiniowania multipotencjalnej mezenchymalnej komórki zrębu jest to, że komórki muszą mieć zdolność do różnicowania się w linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne1. Konwencjonalne metody pomiaru różnicowania między tymi trzema liniami opierają się na wykrywaniu produktów wielkocząsteczkowych za pomocą barwników chemicznych1. Barwniki takie jak Oil Red O (który barwi kropelki tłuszczu w komórkach, które przeszły adipogenezę), są tanie i łatwe w użyciu; Nie są jednak w stanie wykryć specyficznych zmian w ekspresji genów, które zachodzą, gdy komórki mezenchymalne różnicują się w każdą odpowiednią linię2. W tym miejscu opracowaliśmy test różnicowania, który określa ilościowo ekspresję białka dla markera specyficznego dla linii adipogennej, białka wiążącego kwasy tłuszczowe-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 został początkowo znaleziony w mysich adipocytach 3T3-L13, a później odkryto, że ulega ekspresji w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej6. Jest to białko cytozolowe, które działa jako białko opiekuńcze, kierując wychwytem kwasów tłuszczowych przez komórki i bierze udział w procesie lipolizy4.

Komórkami prekursorowymi używanymi do testów różnicowania były mezenchymalne komórki zrębowe (ASC) pochodzenia tłuszczowego7,8. ASC mają wiele wspólnych właściwości z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BM-MSCs), główną populacją mezenchymalnych komórek macierzystych u dorosłych8,9. ASC mają kilka zalet w porównaniu z BM-MSC w zastosowaniach klinicznych, ponieważ większą wydajność komórek można wyizolować z łatwiej dostępnych źródeł tkankowych8,9. Wyizolowana populacja komórek musi spełniać określone kryteria, aby mogła zostać zdefiniowana jako ASC. Po pierwsze, muszą wykazać się przestrzeganiem zasad stosowania plastikowych naczyń do hodowli tkanek w standardowych warunkach hodowli1. Muszą również pokazywać specyficzne wyrażenie antygenu powierzchniowego1. Niehodowane ASC charakteryzują się dodatnią ekspresją antygenu powierzchniowego CD34, CD73, CD90, niską ekspresją CD105 i ujemną ekspresją CD45 oraz HLA-DR10. ASC oczyszczone przez hodowlę na plastiku przez 28 dni (przylegające oczyszczone ASCs) wykazują dodatnią ekspresję CD73, CD90 i CD105 oraz ujemną ekspresję CD34, CD45 i HLA-DR10. Wreszcie, komórki muszą zachować zdolność do różnicowania się na różne linie1,7,8.

Protokoły różnicowania adipogennego wywołują uderzającą regulację ekspresji FABP4 wśród innych genów linii adipocytów, więc użyliśmy immunochemii do wizualizacji białka FABP4 w komórkach, a następnie określiliśmy ilościowo ekspresję FABP4 na poziomie pojedynczej komórki za pomocą zautomatyzowanego fluorescencyjnego mikroskopu przesiewowego o wysokiej zawartości. Metoda ta jest korzystniejsza w porównaniu z tradycyjnymi barwnikami, ponieważ umożliwia wysoce specyficzne potwierdzenie różnicowania adipocytów i linii. Takie testy linii specyficznych dla genów w połączeniu z metodami przesiewowymi o wysokiej zawartości umożliwiają również ilościowe określenie proporcji komórek w heterogenicznym preparacie komórkowym, które są zdolne do różnicowania się w dół określonej linii. W naszych badaniach wykorzystaliśmy test FABP4 w celu potwierdzenia utraty potencjału różnicowania adipogennego świeżo wyizolowanych ASC po hodowli komórkowej.

Protokół

1. Przygotowanie ASC do testów różnicowania

  1. Przygotować odczynniki do hodowli tkankowych i obchodzić się z żywymi komórkami w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Przygotuj pożywkę A0: Dulbecco Modified Eagle Medium i Ham's F12 Medium (DMEM/F12), 1x glutamax, 1x penicylina/streptomycyna.
  3. Przygotuj kompletną pożywkę ASC: DEM/F12, 1x glutamax, 1x penicylina/streptomycyna, 10% płodowa surowica bydlęca.
  4. Stosować przylegające, oczyszczone ASC, ekspandowane w kolbie hodowlanej T75. Potwierdź czystość ASC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)10.
  5. Odłączyć komórki, usuwając całą pożywkę z kolby hodowlanej T75 i dodając 2 ml enzymu dysocjującego komórki.
  6. Pozostawić kolbę hodowlaną w inkubatorze (37 °C, nawilżony, 5% CO2 ) na 5-10 minut. Wyjąć kolbę hodowlaną z inkubatora i mocno postukać w bok kolby. Sprawdzić, czy komórki odłączyły się od kolby hodowlanej za pomocą mikroskopu odwróconego.
  7. Dodać 13 ml pożywki A0 do kolby hodowlanej T75.
  8. Przenieść 15 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki ASC.
  10. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
  11. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 25 000 komórek mL-1 w kompletnym pożywce ASC.
  12. Dodać 200 μl pożywki A0 do wszystkich studzienek peryferyjnych płytki 96-dołkowej (płaskie dno). Zmniejsza to szybkość parowania studzienek zawierających komórki w środku.
  13. Przenieś 200 μl zawiesiny komórek na płytkę mikrodołkową, aby uzyskać końcową gęstość komórek 5 x 103 komórek na studzienkę. Dla każdej grupy poddawanej działaniu substancji potrzebne są cztery studzienki (trzykrotne powtórzenia techniczne i kontrola bez przeciwciał pierwotnych w immunocytochemii (ICC)).
  14. Pozostawić płytkę mikrodołkową w inkubatorze (37 °C, nawilżona, 5% CO2 ) do momentu, gdy komórki osiągną konfluencję (3-4 dni).

2. Indukowanie różnicowania ASC

  1. Przygotować pożywkę do różnicowania adipogennego, uzupełniając kompletną pożywkę ASC o 1 μM deksametasom, 10 μM insuliny i 200 μM indometacyny. Pełna pożywka różnicująca jest stabilna w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc, dlatego należy ją przygotować tylko w razie potrzeby dla 1 testu. Przechowywać w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby podgrzać podwielokrotność do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Po 3-4 dniach wyjąć płytkę mikrodołkową z inkubatora i zastąpić połowę pożywki hodowlanej pożywką do różnicowania adipogennego.
  3. Wykonuj wymianę podłoża co 2-3 dni.
    UWAGA: Optymalne różnicowanie adipogenne wymaga 14 dni hodowli w pożywce różnicującej. Zróżnicowane komórki są analizowane przy użyciu tradycyjnych barwników i barwników specyficznych dla genów.

3. Barwienie dla zróżnicowania - tradycyjne bejce na bazie barwników

  1. Przygotować 4% roztwór formaldehydu, rozcieńczając 16% formaldehydu PBS. Rozcieńczyć tylko ilość potrzebną do eksperymentu i przechowywać szczelnie zamknięte w probówce wirówkowej.
    UWAGA: Formaldehyd jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i może powodować podrażnienie nosa, gardła i płuc po wdychaniu . Wszystkie procedury związane z formaldehydem należy wykonać w dygestorium.
  2. Przygotować roztwór podstawowy czerwieni olejowej O, rozpuszczając 300 mg w 100 ml izopropanolu.
  3. Wyjąć płytkę mikrodołkową z inkubatora. Poniższe kroki można wykonać w niesterylnym środowisku.
  4. Usuń całe podłoże ze studzienek i utrwal komórki 4% formaldehydem przez 30 minut.
  5. W czasie inkubacji przygotuj roztwór roboczy Oil Red O. Roztwór roboczy składa się z 6 części czerwonego oleju O i 4 części wody destylowanej (dH2O). Dobrze wymieszaj i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut, a następnie przefiltruj za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm. Roztwór roboczy jest stabilny tylko przez 2 godziny.
  6. Usunąć cały formaldehyd ze studzienek za pomocą pipetowania.
  7. Umyj komórki raz 60% izopropanolem i pozwól studzienkom całkowicie wyschnąć przed kontynuowaniem.
  8. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu roboczego Oil Red O i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Usunąć roztwór czerwieni olejowej O i natychmiast dodać dH2O. Przemyć dH2O 4 razy przed obejrzeniem pod mikroskopem.

4. Barwienie dla różnicowania - Przeciwciała specyficzne dla genu

  1. Przygotować roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), rozpuszczając 80 g NaCl, 2 g KCl i 30 g zasady Tris w 1 ldH2O (pH 8). Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając go w stosunku 1:10 przy użyciudH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować immunobufor (IB) (1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w TBS). Oznaczyć probówkę wirówkową o pojemności 15 ml datą i przechowywać w temperaturze 4 °C. IB można stosować przez 1 tydzień od daty sporządzenia.
  3. Przygotować 0,25% bloker kazeiny, rozpuszczając 0,5 g kazeiny i 0,195 g azydku sodu w 200 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Całkowicie rozpuść składniki, mieszając przez noc. Porcjować do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Rozmrożone roztwory kazeiny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  4. Przygotować roztwór DAPI, rozcieńczając podstawowy DAPI w stosunku 1:200 w TBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  5. Przygotować podstawowy roztwór tiomersalu (10 mg mL-1) rozpuszczając tiomersal w sterylnym PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć odpowiednią ilość do 0,4 mg mL-1 do użycia.
  6. Utrwalaj i przepuszczalność komórek lodowatym metanolem (płytka 96-dołkowa) przez 5 minut. Umyj komórki raz 200 μl TBS.
  7. Zablokuj 50 μl 0,25% kazeiny w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przemyj raz TBS.
  8. Dodać 50 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w IB (szczegóły dotyczące przeciwciał znajdują się w tabeli 1) i inkubować z zamkniętymi pokrywkami przez 1 godzinę.
  9. Umyj raz 200 μl TBS, a następnie 3 razy TBS przez 5 minut z delikatnym kołysaniem.
  10. Dodać 50 μl przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w IB (szczegóły dotyczące przeciwciał patrz Tabela 2) w stosunku 1:2000 DAPI w każdym, inkubować z zamkniętymi pokrywkami przez 1 godzinę. Przykryć płytkę folią, aby zapobiec fotowybielaniu.
  11. Umyj raz TBS, a następnie dwa razy TBS przez 15 minut z delikatnym kołysaniem.
  12. Usuń wszystkie TBS i dodaj 200 μl roztworu tiomersalu.
  13. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania obrazowania.

5. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu wysokoprzepustowego

  1. Analizuj komórki barwione przeciwciałami specyficznymi dla genów i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (immunofluorescencja) przy użyciu mikroskopu przesiewowego o wysokiej zawartości kontrolowanego za pomocą dołączonego oprogramowania.
  2. Załaduj płytkę mikrodołkową do stolika mikroskopu. Na kontrolce akwizycji płytki wybierz obraz w średnim powiększeniu (soczewka obiektywu 10x). Upewnij się, że obrazy są wykonywane ze środka każdej studzienki, z zachowaniem odstępów 50 μm między każdym miejscem, aby upewnić się, że jedna komórka nie pojawia się w dwóch sąsiednich polach.
  3. Wybierz studnie do zobrazowania.
  4. Wybierz odpowiednie kombinacje kanałów, czas naświetlania i parametry przesunięcia Z. Patrz Tabela 3, aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat każdego filtra (Tabela uzupełniająca 2).
  5. Uzyskaj test za pomocą kreatora akwizycji (obrazy są automatycznie zapisywane na serwerze bazy danych).
  6. Użyj alternatywnych kombinacji kanałów, aby uzyskać płytki barwione czerwienią olejową O. (Tabela uzupełniająca 3).

6. Analizuj pozyskany obraz

Uwaga: Zdalny dostęp do serwera bazy danych umożliwia szybką i łatwą ocenę pozyskanych obrazów oraz korzystanie z oprogramowania do analizy obrazów.

  1. Otwórz moduł Cell Scoring w oprogramowaniu do analizy.
  2. Wykrywaj jądra komórkowe za pomocą kanału DAPI (marker jądrowy) i segmentów jąder zainteresowania ze zdefiniowanymi przez użytkownika parametrami dotyczącymi wielkości i intensywności sygnału powyżej tła.
  3. Wykrywanie sygnału FABP4 za pomocą kanału FITC. Segmentuj zróżnicowane komórki za pomocą zdefiniowanych przez użytkownika parametrów rozmiaru i intensywności sygnału powyżej tła, aby wybrać wszystkie dodatnie regiony FABP4 na każdym obrazie.
  4. Otwórz moduł Transfluor w oprogramowaniu analitycznym, aby przeanalizować płytki zabarwione olejem Red O.
  5. Określ rozmiar i intensywność obszarów zabarwionych czerwienią olejową O jako "wgłębienia".

Wyniki

W niniejszym badaniu zmierzono potencjał różnicowania adipogennego ASC przy użyciu 3 różnych metod. Barwienie immunofluorescencyjne FABP4 wykazało, że marker ten lokalizuje się w cytoplazmie zróżnicowanych komórek, a barwienie nakłada się na jądra komórkowe zabarwione DAPI (Rycina 1A). Zautomatyzowana analiza obrazu wykazała 24,6-krotny wzrost odsetka komórek dodatnich pod kątem FABP4 w grupie zróżnicowanej w komórkach z wczesnych pasaży w porównaniu do 6,9-krotnego wzrostu w komórkach z późnych pasaży (Rycina 1B). Barwienie Oil Red O lokalizowało się w kropelkach tłuszczu rozproszonych w cytosolu zróżnicowanych komórek, a barwienie rzadko nakładało się na jądra komórkowe zabarwione DAPI; jednak w ocenie wizualnej w komórkach z późnych pasaży stwierdzono mniej jąder komórkowych powiązanych z kropelkami tłuszczu Oil Red O w porównaniu do komórek z wczesnych pasaży (Rycina 2A). Zautomatyzowana analiza obrazu wykazała 11,1-krotny wzrost powierzchni barwienia Oil Red O na komórkę w komórkach z wczesnych pasaży oraz 53,9-krotny wzrost powierzchni barwienia na komórkę w komórkach z późnych pasaży (Rycina 2B). Wykonano obrazowanie obu barwień, a następnie przeprowadzono kwantyfikację z wykorzystaniem modułu Cell Scoring (FABP4) lub Transfluor (Oil Red O) w oprogramowaniu (Rycina uzupełniająca 1, Tabela uzupełniająca 2-5). Podwyższoną ekspresję FABP4 potwierdzono za pomocą analizy Western blot (Rycina 3, Rycina uzupełniająca 5). Wszystkie 3 metody analizy wykazały, że ASC z wczesnych pasaży mają wyższy potencjał różnicowania adipogennego niż komórki z późnych pasaży. Różnicowanie adipogenne nie wpłynęło na całkowitą liczbę komórek w studience (Rycina uzupełniająca 2, 3). Jednakże rozmiar jąder zróżnicowanych komórek dodatnich pod kątem FABP4 był istotnie mniejszy niż w komórkach kontrolnych wyłącznie w przypadku ASC z późnych pasaży (Rycina uzupełniająca 3).

Wykazaliśmy, że w miarę namnażania komórek w kulturze lub ich pasażowania, odsetek komórek w kulturze zdolnych do różnicowania adipogennego spadał, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi11. Należy zauważyć, że w niniejszym badaniu nie można było kontrolować takich czynników jak wiek, wskaźnik masy ciała lub wcześniejsza historia medyczna12, co prawdopodobnie przyczyniło się do zmienności zaobserwowanej między różnymi próbkami od dawców (Tabela uzupełniająca 1).

Obrazowanie różnicowania adipogennego, barwienie FABP4, nałożenie DAPI, segmentacja, wyniki na wykresie słupkowym.
Rycina 1: Immunoznakowanie FABP4 wykazuje, że komórki z wczesnych pasaży mają większy potencjał różnicowania niż komórki z późniejszych pasaży. A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek kontrolnych i zróżnicowanych z wczesnych i późnych pasaży, znakowanych DAPI (barwienie jąder) oraz FABP4, wraz z obrazami nałożonymi (merge) i obrazami segmentacji. Obrazy segmentacji przedstawiają komórki zróżnicowane z zieloną nakładką oraz komórki niezróżnicowane z czerwoną nakładką. B) Odnotowano istotny wzrost liczby komórek wykazujących ekspresję FABP4 podczas różnicowania adipogennego w komórkach z wczesnych i późnych pasaży, jednak komórki z wczesnych pasaży wykazały istotnie większy wzrost różnicowania niż komórki z późnych pasaży (test Manna-Whitneya: * oznacza P<0.05, a *** oznacza P<0.001). Przedstawione dane są średnią z próbek dawców z wczesnych pasaży (p4; n=8) lub późnych pasaży (p10; n=4), ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopowe różnicowania adipogennego; barwienie DAPI i Oil Red O, segmentacja, analiza na wykresie słupkowym.
Rycina 2: Barwienie Oil Red O wykazuje, że komórki z wczesnych pasażów mają większy potencjał różnicowania niż komórki z późniejszych pasażów. A) Reprezentatywne obrazy DAPI (barwienie jąder) i Oil Red O (szary, barwienie kropel lipidowych) przedstawiono obok obrazów z nałożeniem (merge) i obrazów segmentacji. Obrazy segmentacji przedstawiają wszystkie jądra z zieloną nakładką oraz zabarwione Oil Red O krople lipidowe z czerwoną nakładką. B) Zaobserwowano istotny wzrost powierzchni zabarwienia Oil Red O podczas różnicowania adipogennego. Komórki z wczesnych pasażów wykazały większą powierzchnię zabarwienia Oil Red O na komórkę w porównaniu do komórek z późnych pasażów. Powierzchnia zabarwienia Oil Red O na komórkę (μm2) jest tutaj wykorzystana jako miara potencjału różnicowania adipogennego. Przedstawione dane są średnią z próbek dawców z wczesnych pasażów (p4; n=8) lub późnych pasażów (p10; n=4), ± SEM (test Mann-Whitneya: * oznacza P=<0,05, a *** oznacza P=<0,001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot ekspresji FABP4 i ACTB w wczesnych i późnych pasażach komórek, wykres słupkowy z efektami różnicowania.
Rycina 3: Analiza Western blot poziomu ekspresji białka FABP4 w zróżnicowanych ASC z wczesnych i późnych pasaży.Półilościowa analiza gęstości optycznej prążków FABP4 w stosunku do całkowitej kontroli załadunku białka, beta aktyny (ACTB), wykazała, że znakowanie immunologiczne FABP4 było znacząco zwiększone w zróżnicowanych komórkach z wczesnych pasaży oraz, w mniejszym stopniu, z późnych pasaży. Przedstawione dane stanowią średnią z próbek dawców z wczesnego pasażu (p4; n=8) lub późnego pasażu (p10; n=4), ± SEM (test Mann-Whitneya * oznacza P=<0.05, a *** oznacza P=<0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Antygen docelowyIzotyp (klon)GatunkiRozcieńczanie
FABP4PoliklonalneKrólik1:100

Tabela 1: Przeciwciało pierwszorzędowe

Przeciwciało celowaneZnacznik fluoroforowyGatunkiRozcieńczanie
Królicze IgGAlexa Fluor 488Koza1:200

Tabela 2: Przeciwciało wtórne

Rysunek uzupełniający 1: Przegląd wirtualnego środowiska analizy obrazów. Barwione komórki obrazowano przy użyciu zautomatyzowanego fluorescencyjnego mikroskopu wysokoprzepustowego, aby uniknąć jakichkolwiek źródeł błędu systematycznego. Obrazy pozyskane za pomocą systemu ImageXpress Micro XLS zapisywano bezpośrednio w bazie danych MDCStore Data Manager i udostępniano do przeglądania poprzez wirtualne połączenia pulpitowe, których użytkownicy używają do optymalizacji i testowania swoich specyficznych parametrów analizy. Obrazy analizowano za pomocą dedykowanej instancji „autorun”, która umożliwia wielu różnym użytkownikom przesyłanie „zadań” do kolejki autorun. Użytkownicy mogą pobrać swoje dane z instancji wirtualnej po zakończeniu przetwarzania ich „zadań”. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 2: Porównanie całkowitej liczby komórek na dołek w grupach kontrolnych i zróżnicowanych dla ASC z wczesnych i późnych pasażów, z wykorzystaniem płytek barwionych na FABP4. Przedstawione dane stanowią średnią dla próbek od dawców z wczesnych pasażów (p4; n=8) lub późnych pasażów (p10; n=4), ± SEM. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy między komórkami kontrolnymi a zróżnicowanymi zarówno dla ASC z wczesnych, jak i późnych pasażów. W przypadku komórek z wczesnych pasażów odnotowano większą liczbę komórek na dołek w porównaniu do komórek z późnych pasażów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 3: Porównanie całkowitej liczby komórek na dołek w grupach kontrolnych i zróżnicowanych dla ASC z wczesnych i późnych pasaży, z wykorzystaniem płytek barwionych Oil Red O. Przedstawione dane stanowią średnią z próbek dawców z wczesnego pasażu (p4; n=8) lub późnego pasażu (p10; n=4), ± SEM. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między komórkami kontrolnymi a zróżnicowanymi zarówno dla ASC z wczesnych, jak i późnych pasaży. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 4: W późniejszych pasażach zróżnicowane komórki wykazujące pozytywną ekspresję FABP4 miały istotnie mniejszą powierzchnię jąder niż komórki w studzienkach kontrolnych. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w powierzchni jąder między komórkami kontrolnymi a zróżnicowanymi we wczesnym pasażu. Przedstawione dane stanowią średnią z próbek dawców we wczesnym pasażu (p4; n=8) lub późnym pasażu (p10; n=4), ± SEM. (Nieparzysty test t. *** oznacza P=<0.001). Przedstawiono średnią ± SEM.) Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rycina uzupełniająca 5: Obrazy żeli Western blot. Kanał czerwony przedstawia beta-aktynę. Kanał zielony przedstawia immunoznakowanie FABP4. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Tabela uzupełniająca 1: Informacje kliniczno-patologiczne dawców Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Ustawienia obrazowania (FABP4) Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Ustawienia obrazowania (Oil Red O) Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 4: Tabela użytych parametrów analizy (FABP4). Moduł oceny komórek (Cell Scoring). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 5: Tabela użytych parametrów analizy (Oil Red O). Moduł Trans Fluor. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W artykule przedstawiono przydatność i zalety znakowania immunologicznego FABP4 w celu dokładnego wykrywania i ilościowego oznaczania dojrzałych adipocytów pochodzących z mezenchymalnych komórek zrębu. FABP4 jest w stanie wykryć zmiany w ekspresji białka 3,4,5 specyficznego dla linii w dojrzałych adipocytach, w przeciwieństwie do innych powszechnie stosowanych barwników, które oznaczają zmiany makromolekularne13,14, takich jak czerwień olejowa O15, czerwień nilowa16 i czerń sudańska17. Znakowanie immunologiczne FABP4 pozwala na wizualizację i analizę zmian w morfologii komórek. Jest to wyraźna przewaga nad poprzednio opisanymi metodami wykorzystującymi ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), która analizuje zmiany na poziomie transkryptu bez żadnej wizualizacji 5,18,19,20, lub cytometrię przepływową, która wymaga, aby komórki znajdowały się w zawiesinie 20, lub Western blot, który wymaga lizy komórek w celu wyizolowania białka19,20. Znakowanie immunologiczne FABP4 jest stabilne w utrwalonych komórkach, nie wycieka w roztworze i jest białkiem cytozolowym po znakowaniu w przylegającej monowarstwie komórek, nakłada się na jądro, co pozwala na łatwą wizualizację i dodatkową dokładność w automatycznej analizie.

Badanie przesiewowe o wysokiej zawartości jest korzystne, ponieważ jest szybkie, dokładne, powtarzalne i obiektywne. Stanowi platformę do ekonomicznego wykorzystania odczynników i czasu badaczy, ponieważ pozyskiwanie i analiza obrazu wymagają minimalnej ręcznej manipulacji i polegają na automatycznym przetwarzaniu urządzenia. Zidentyfikowano kilka czynników mających kluczowe znaczenie dla dokładności i odtwarzalności testów przesiewowych o wysokiej zawartości31. Kwantyfikacja ekspresji antygenu zależy od jakości obrazu. Aby analiza obrazu zakończyła się pomyślnie, obrazy z każdego kanału na studzienkę muszą być ostre i mieścić się w optymalnym zakresie dynamicznym dla wartości szarości (ustawienia Automatyczna ekspozycja są idealne). Nieostre lub nasycone obrazy prowadzą do błędnych wyników.

Niektóre potencjalne ograniczenia metod opisanych w tym artykule obejmują następujące elementy. Zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt do obrazowania i oprogramowanie analityczne. Chociaż wykracza to poza zakres tego artykułu, alternatywne opcje oprogramowania open source (na przykład ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) mogą być używane do wykonywania podobnych zadań segmentacji obrazu; Wymagają jednak umiejętności pobierania i dostosowywania makr dostępnych online lub pisania makr/poleceń dla określonych potoków analizy. Nieodłącznym elementem wszystkich zautomatyzowanych potoków analizy obrazowania jest poziom szumu tła. Można to w dużej mierze przypisać szczątkom, niskiej jakości obrazu lub błędom analizy, co podkreśla potrzebę starannego przygotowania próbki i starannego ustawienia platformy obrazowania i analizy. Stwierdzono, że znacznik FABP4 u myszy wykrywa niezróżnicowanych przodków30; podczas gdy kontrole w tym badaniu (które składają się z niezróżnicowanych komórek) są pozbawione specyficznego barwienia FABP4. Podkreśla to konieczność sprawdzenia ekspresji FABP4 u niezróżnicowanych komórek progenitorowych w każdym kontekście biologicznym, w którym stosuje się test.

Aby dokonać wiarygodnych porównań między oznakowaniem FABP4 a barwieniem czerwienią olejową O, pomiary wyjściowe z analizy obrazu musiały być biologicznie istotne. W związku z tym pomiar "% komórek dodatnich" zastosowano dla FABP4, a "obszar barwienia na komórkę" użyto dla czerwieni olejowej O. Warto zauważyć, że miara "% komórek dodatnich" nie została użyta dla komórek znakowanych czerwienią olejową O w naszym badaniu, ponieważ nie było możliwe dokładne przypisanie znakowanych kropelek tłuszczu do danego jądra; Kropelki tłuszczu różniły się znacznie pod względem wielkości, liczby i rozmieszczenia w całym ciele komórki i rzadko pokrywały się z jądrem. Zmienność barwienia czerwienią olejową O występuje między komórkami pochodzącymi z różnych źródeł tkankowych; podczas gdy miara % komórek dodatnich nie była odpowiednia dla obecnego badania, inna grupa z powodzeniem wykorzystała ją do ilościowego określenia adipocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych gruczołów22 , w których barwienie czerwienią olejową O pojawiło się jako jedna duża kropla tłuszczu, która obejmowała cytoplazmę i nakładała się na jądra, umożliwiając przedstawienie danych jako% komórek dodatnich.

Natomiast morfologia znakowania immunologicznego FABP4 jest spójna w adipocytach pochodzących z wielu różnych źródeł tkankowych 23,24,25. Zdolność do ilościowego określenia proporcji komórek w kulturze zdolnych do różnicowania ma wiele zastosowań. Dorosłe mezenchymalne komórki zrębu są bardzo obiecujące dla różnorodnych zastosowań terapeutycznych. Istotnym problemem, który pojawił się w związku z translacją kliniczną, jest nieodłączna zmienność zdolności tych komórek między pacjentami26, między miejscami izolacji27,28 oraz między metodami izolacji12 i zwiększania liczby komórek12 do użytku terapeutycznego. Wykazano wcześniej, że hodowle przylegających komórek zrębu są często niejednorodne, przy czym niektóre komórki są zdolne do różnicowania, a niektóre nie 12,17, jak pokazuje nasz test FABP4 dla kultur ASC. Testy takie jak ten, w połączeniu z technikami wzbogacania, pomogą zidentyfikować subpopulacje w heterogenicznych kulturach zdolnych do różnicowania w zależności od linii. Posiadanie standaryzowanego, ilościowego testu, takiego jak ten test FABP4, zapewnia prostą metodę porównania wszystkich tych zmiennych oraz potencjał oceny wyników terapeutycznych w ramach badań klinicznych i między nimi.

Kwantyfikacja FABP4 w sposób półautomatyczny umożliwia obiektywność i odtwarzalność w analizie w wielu przypadkach dawców i próbkach. Ponadto, ponieważ etykieta jest cytoplazmatyczna, może być potencjalnie używana do analizy hipertrofii (powiększenia rozmiaru adipocytów) oprócz hiperplazji (wzrostu liczby adipocytów), rozróżnienie, które ma duże znaczenie w badaniach nad otyłością, gdzie hipertrofia jest silnie związana z dysfunkcją tkanki tłuszczowej u osób otyłych21. Epidemia otyłości wzbudziła znaczne zainteresowanie identyfikacją leków zdolnych do kontrolowania magazynowania lipidów. Ten test FABP4 zapewnia również prosty odczyt do badań przesiewowych tysięcy związków pod kątem ich zdolności do hamowania akumulacji lipidów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni darczyńcom tkanki tłuszczowej oraz profesjonalistom naukowym, którzy zbierają i udostępniają nam ten zasób do użytku badawczego. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe ze strony firmy Allergan. Jesteśmy również wdzięczni Funduszowi Badawczemu Opartemu na Wynikach Wydziału Nauk Medycznych i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Auckland za sfinansowanie kosztów filmu i montażu tego artykułu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris BaseInvitrogen15504-020Tris buforowana sól fizjologiczna
Chlorek soduMerck1064041000Tris buforowana sól fizjologiczna
Chlorek potasuMerck1049360500Tris buforowana sól fizjologiczna
Azydek soduScharlauSO0091Roztwór blokujący kazeinę
KazeinaSigmaC7078-500GKazeina roztwór blokujący
PBS tabletkaSigmaP4417-100TABSól fizjologiczna buforowana fosforanami
DMEM/F12Gibco11330-032Hodowla komórkowa
Penicylina/streptomycynaInvitrogen15140-122Posiew komórkowy
GlutamaxGibco35050-061Posiew komórkowy
Surowica bydlęcapłodu Gibco10091-148Hodowla komórkowa
TrypLE Select Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowejGibco12563-029Enzym dysocjacji komórek
96-dołkowa płytka (płaskie dno)FalconFAL353072Sprzęt do hodowli komórkowych
Kolba hodowlana T75, z nasadką filtrującąGreiner658175Sprzęt do hodowli komórkowych
InsulinaSigma 19278-5MLAdipogenne podłoże
różnicujące deksametazonSigmaD2915-100MGAdipogeniczne podłoże różnicujące
indometacynasigmaI7378-5GAdipogeniczne podłoże różnicujące
Olej-Czerwień OSigmaO-0625Klasyczna barwa do adipogenezy
IzopropanolMerck1.09634Klasyczna plama do adipogenezy
16% formaldehydPierce28908Utrwalanie komórek
AcetonMerck100983Utrwalanie komórek
DAPISigmaD9542Immunocytochemia
Anty królicze IgG alexa 488 SondymolekularneA11008Immunocytochemia
TiomersalSigmaT5125-10GImmunocytochemia
Przeciwciało przeciwko ludzkiemu białku wiążącemu kwasy tłuszczowe królika 4 (FABP4)Cayman Chemicals10004944Marker adipogenezy
Probówki wirówkowe (15 ml)GreinerGR188271Ogólne
Probówki wirówkowe (50 ml)GreinerGR227261-POgólne
ImageXpress Micro XLSMolecular DevicesMaszyna do badań przesiewowych o wysokiej zawartości
MetaXpressOprogramowanie dobadań przesiewowych o wysokiej zawartości Molecular Devices
, wersja 5.4.01

Bibliografia

  1. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  2. Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
  3. Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
  4. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
  5. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
  6. Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
  7. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  8. Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  9. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
  10. Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
  11. Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
  12. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
  13. Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
  14. Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
  15. Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
  16. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  17. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
  18. Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
  19. Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
  20. Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  21. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  22. Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
  23. Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811(2013).
  24. Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
  25. LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
  26. Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
  27. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  28. Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
  29. Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
  30. Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
  31. Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
  32. Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
  33. Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunofluorescencja FABP4test różnicowania adipogennegowysokoprzepustowe przesiewanie (HCS)izolacja komórek zialnychbarwienie Oil Red Obiałko wiążące kwasy tłuszczowe 4analiza morfologii komórekzautomatyzowana analiza obrazupożywka do różnicowania adipogennego
Wizualizacja i kwantyfikacja potencjału różnicowania adipogennego komórek mezenchymalnych za pomocą markera specyficznego dla linii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.