Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57155

⸱

9 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine - Terre Haute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Streszczenie

Kwantyfikacja obciążenia grzybicami płuc jest kluczowa dla określenia względnych poziomów ochrony immunologicznej i zjadliwości grzybów w mysich modelach infekcji grzybiczej płuc. Chociaż do oceny obciążenia grzybami stosuje się wiele metod, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) DNA grzybów pojawiła się jako technika mająca kilka zalet w porównaniu z poprzednimi metodami opartymi na hodowlach. Obecnie kompleksowa ocena patologii płuc, rekrutacji leukocytów, obciążenia grzybami i ekspresji genów u myszy z inwazyjną aspergilozą (IA) wymaga wykorzystania znacznej liczby zwierząt doświadczalnych i kontrolnych. W tym przypadku szczegółowo zbadano ilościowe barwienie histologiczne płuc w celu określenia obciążenia grzybami przy użyciu zmniejszonej liczby zwierząt. Wycinki płuc wybarwiono w celu zidentyfikowania struktur grzybowych za pomocą zmodyfikowanego srebrem metanaminowego (GMS) Gomoriego. Obrazy zostały wykonane z wybarwionych GMS odcinków z 4 dyskretnych pól każdego płuca zanurzonego w parafinie utrwalonego w formalinie. Obszary barwione GMS na każdym obrazie zostały określone ilościowo za pomocą programu do analizy obrazu, a na podstawie tej kwantyfikacji określono średni procent wybarwionego obszaru dla każdej próbki. Stosując tę strategię, myszy z niedoborem eozynofili wykazywały zmniejszone obciążenie grzybami i choroby po terapii kaspofunginą, podczas gdy myszy typu dzikiego z IA nie poprawiły się po zastosowaniu kaspofunginy. Podobnie, obciążenie grzybami u myszy pozbawionych limfocytów T γδ zostało również poprawione przez kaspofunginę, mierzoną za pomocą qPCR i kwantyfikacji GMS. Kwantyfikacja GMS jest zatem wprowadzana jako metoda określania względnego obciążenia grzybicami płuc, która może ostatecznie zmniejszyć liczbę zwierząt doświadczalnych wymaganych do kompleksowych badań inwazyjnej aspergilozy.

Wprowadzenie

IA to infekcja oportunistyczna, która może rozwinąć się u podatnych osób z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporności spowodowanymi terapią immunosupresyjną lub przewlekłą infekcją1,2. Pierwotne zakażenie często występuje w płucach, chociaż w niektórych przypadkach może dojść do rozprzestrzenienia się Aspergillus fumigatus na wątrobę, nerki, serce i mózg, co skutkuje rozległą inwazją strzępek w tkankach, której towarzyszy ciężka choroba i wysokie wskaźniki śmiertelności1,2. Ponadto skuteczność istniejących farmakoterapii jest ograniczona i może być dodatkowo osłabiona przez pojawienie się w środowisku szczepów opornych na leki przeciwgrzybicze3. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy zjadliwości grzybów i patologii gospodarza, które sprzyjają rozwojowi lub zaostrzeniu inwazyjnej choroby grzybiczej.

Mysie modele pozostają ważne dla mechanistycznych badań IA, ponieważ pozwalają badaczom ocenić rolę genów wirulencji grzybów i efektorów immunologicznych gospodarza w tworzeniu i wzroście A. fumigatus in vivo4,5. W związku z tym opracowano wiele strategii w celu skutecznego ilościowego określenia lub porównania obciążenia grzybami w grupach zwierząt doświadczalnych6,7. Strategie te obejmują metody oparte na hodowli, biochemiczne, testach immunologicznych lub qPCR, z których każda ma odrębne zalety i wady. Co więcej, każda z tych metod obejmuje poświęcenie podgrupy zwierząt oprócz tych uśmierconych w celu oceny funkcji efektora immunologicznego, analizy ekspresji genów i histopatologii porównawczej7. W związku z tym kompleksowe badania nad IA często wymagają znacznej liczby zwierząt badawczych, co wiąże się ze znacznymi kosztami. Skuteczne strategie, które skracają czas eksperymentów, koszty zwierząt i względy etyczne poprzez wykorzystanie tkanek zwierzęcych do wielu analiz, są zatem niezwykle cenne7.

W tym raporcie przedstawiono metodę opisującą kwantyfikację barwienia GMS w przekrojach histologicznych w celu porównania względnego obciążenia grzybami między eksperymentalnymi grupami myszy z IA. Każdy krok, od hodowli grzybów do infekcji, pobierania i przetwarzania tkanek oraz pozyskiwania obrazów i analizy danych, jest szczegółowo opisany. Obciążenia grzybami uzyskane przez kwantyfikację GMS porównano z qPCR w neutropenicznych modelach IA, a także u myszy typu dzikiego lub z niedoborem eozynofili leczonych kaspofunginą z IA8. Wyniki wykazują podobieństwo do kwantyfikacji GMS i qPCR DNA grzybów. Sugeruje to, że kwantyfikacja GMS może być przydatna dla badaczy zajmujących się analizami histologicznymi jako uzupełniająca lub alternatywna metoda porównywania względnego obciążenia grzybami u myszy z IA, a ostatecznie może zmniejszyć koszty i wykorzystanie zwierząt badawczych w złożonych, mechanistycznych badaniach.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Stanowego w Indianie, kampusu gospodarza Indiana University School of Medicine — Terre Haute.

1. Przygotowanie konidiów A. fumigatus do infekcji

  1. Pracując w dobrze wentylowanej dygestorium, dodaj 125 µL roztworu stokowego A. fumigatus 293 do 900 µL wody jakości hodowlanej (CCGW). Następnie przenieś roztwór pipetą na płytkę z agarem z ekstraktem słodowym (MEA) i rozprowadź równomiernie za pomocą pętli do szczepień.
  2. Przechowuj płytkę z grzybem w ciemności w temperaturze 24 °C przez co najmniej 14 dni, ale nie dłużej niż 28 dni.
  3. Zbierz konidia przy użyciu szklanych kulek zgodnie z wcześniejszym opisem9.
  4. Wsyp 1,5 g szklanych kulek o średnicy 0,5 mm na płytkę i delikatnie przechylaj ją w przód i w tył, aż kulki zostaną pokryte, aby wyekstrahować konidia. Zbierz mieszaninę kulek i konidiów do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Zawieś w 5 mL soli fosforanowo-buforowanej Dulbecco (DPBS) i wymieszaj w wortexie.
  5. Policz konidia w 50-krotnym rozcieńczeniu supernatantu w DPBS, używając hemocytometru. Policz liczbę konidiów w obszarze pokazanym na Rysunku 1 i zastosuj Równanie 1, aby obliczyć stężenie.
    #Konidia × Współczynnik rozcieńczenia × 104=Konidia/mL (Równanie 1)
    UWAGA: Można policzyć dodatkowe obszary narożne o wymiarach 4 x 4 kwadraty, a średnią z tych obszarów przyjąć jako #Konidia w Równaniu 1.

Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza siatki, wektory sił, badanie precyzyjne.
Rysunek 1: Reprezentatywny obszar hemocytometru wykorzystywany do liczenia konidiów (ramka, strzałka).

  1. Rozcieńczyć zawiesinę konidiów sterylną solą fizjologiczną (DPBS), aby uzyskać pożądane stężenie, 1,0 x 108 konidia/ml w celu zakażenia dawką 5 x 106 konidia/50 µLPrzygotuj 50 µL roztworu konidiów na każde „n + 2” myszy przeznaczonych do zakażenia, aby uwzględnić błędy pipetowania.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować standardową metodę zbioru oraz przygotowania/filtracji grzybni10Metoda z użyciem szklanych kulek jest najlepszym sposobem zapewnienia uzyskania próbek konidiów z minimalną zawartością małych lub rozpuszczalnych antygenów strzępkowych do aspiracji.

2. Immunosupresja i zakażanie modelu mysiego

  1. Należy użyć myszy w wieku od 7 do 10 tygodni.
    UWAGA: W badaniu wykorzystano myszy szczepów BALB/c, C57BL/6 (B6), myszy z niedoborem eozynofili (ΔdblGATA, tło BALB/c) oraz myszy z niedoborem limfocytów T γδ (TCRδ-/-, tło B6). W każdym eksperymencie do poszczególnych grup przydzielono myszy o tym samym wieku i płci (zarówno samce, jak i samice).
  2. Wyczerpanie neutrofili poprzez dosytatyczne (IP) wstrzyknięcie 0,1 ml (0,5 mg) przeciwciała anty-mysi Ly-6G w jałowej soli fizjologicznej w 45° w bocznej dolnej ćwiartce prawej (Harmonogram eksperymentu znajduje się w) Rycina 2).
  3. Po 24 h zakażono myszy drogą aspiracyjną dawką 5,0 x 106A. fumigatus konidia zawieszone w 50 µL sterylną sól fizjologiczną (patrz kroki 2.4-2.10) zgodnie z wcześniejszym opisem11Po zakażeniu wstrzyknij podgrupie zwierząt środek przeciwgrzybiczy, taki jak 5 mg/kg diacetylo-kaspofunginy w DPBS zastosowanym w niniejszym badaniu (codziennie, patrz Rysunek 2).
  4. Zanurzyć myszy w anestezji przy użyciu 99,9% izofluranu z wykorzystaniem weterynaryjnego aparatu do znieczulania.
    1. Na dnie komory indukcyjnej należy umieścić ręcznik papierowy w celu zbierania kału i moczu.
    2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej, zamknij szczelnie pokrywę i ustaw parownik na 5% izofluranu na czas 2 min 30 s.
      UWAGA: Nie stosuje się maści weterynaryjnej, ponieważ całkowity czas znieczulenia wynosi mniej niż 5 min.
    3. Zmniejszyć ustawienie parownika do połowy wartości maksymalnej na 30 s.
  5. Należy potwierdzić, że mysz została prawidłowo znieczulona, obserwując spowolniony oddech, brak ruchów oraz brak reakcji na bodziec w postaci uciśnięcia palca u nogi.
  6. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją na desce nachylonej. Ułóż mysz grzbietem do deski. Upewnij się, że górne siekacze są delikatnie unieruchomione gumką receptorką, a dolne siekacze delikatnie unieruchomione metalowym drutem.
  7. Ostrożnie przytrzymaj język w pełnym wysunięciu za pomocą małej pęsety i pipety 50 µL zawiesiny konidiów w PBS u nasady języka.
  8. Utrzymaj język w pełnym wyciągnięciu; nasłuchuj szybkiego oddechu i charakterystycznego dźwięku klikania podczas aspiracji. Utrzymuj przez 20 s lub do czasu pełnego odessania zawiesiny.
  9. Zdjąć mysz z deski nachylonej i delikatnie umieścić w klatce w celu obserwacji.
  10. Po aspiracji mysz powinna odzyskać przytomność w ciągu 1 min. Należy monitorować mysz do czasu pełnego odzyskania przytomności i zdolności do poruszania się po klatce. Zwierzęta powinny być utrzymywane w 21 °C i monitorowano dwa razy dziennie aż do momentu pobrania płuc.
  11. Powtórz proces usuwania neutrofili (krok 2.2) 24 h po infekcji (Rysunek 2).

Harmonogram deplecji neutrofili z użyciem konidiów Af, leczenie Caspo; uśmiercenie w 3. dniu po infekcji.
Rysunek 2: Harmonogram eksperymentalny. Ten rysunek został zmodyfikowany z poprzedniej publikacji8.

3. Pobieranie i utrwalanie płuc myszy do analizy histologicznej

  1. Głęboko upuść zwierzę w narkozę, podając śmiertelną dawkę 0,1 ml roztworu pentobarbitalu sodu (390 mg/ml) drogą IP.
  2. Potwierdź eutanazję, obserwując brak spontanicznego oddychania oraz brak reakcji na stymulację kończyn pęsetą. Po przeprowadzeniu eutanazji spryskaj ciało 70% etanolem w celu sterylizacji.
  3. Umieść ciało na płytce z pianki pokrytej chłonną podkładką.
    UWAGA: Ciało powinno zostać ułożone na plecach, a wszystkie cztery kończyny należy przymocować do płytki z pianki za pomocą szpilek.
  4. Ostrożnie otwórz górną jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek. Wycięcie klatki piersiowej w celu odsłonięcia płuc i serca. Przetnij żyłę główną dolną, aby umożliwić perfuzję. Unikaj przecinania naczyń krwionośnych i nakłuwania narządów.
  5. Powoli wykonaj perfuzję, wprowadzając 5 mL zimnego DPBS do prawej komory serca pod kątem 45° za pomocą igły 25-G. Powtórz perfuzję z użyciem 5 mL 10% formaliny.
  6. Ostrożnie odsłoń tchawicę i oddziel otaczające ją poduszki tłuszczowe. Zachowaj ostrożność i unikaj nakłuwania tchawicy. Przed kontynuacją upewnij się, że nadmiar tkanki łącznej został usunięty, aby w pełni uwidocznić tchawicę. Po odsłonięciu tchawicy umieść pod nią pęsetę, aby ją unieść.
  7. Za pomocą igły 25-G wykonaj mały otwór w górnej części tchawicy.
    UWAGA: Otwór powinien być umiejscowiony tak, aby cała kaniula zmieściła się w tchawicy. Zachowaj ostrożność, aby nie przerwać ciągłości tchawicy.
  8. Wprowadź kaniulę przez otwór w kierunku płuc. Zabezpiecz kaniulę nicią chirurgiczną, zawiązaną luźno wokół tchawicy.
    UWAGA: W przypadku przerwania tchawicy kaniulę można wprowadzić za tchawicę tak daleko, jak to możliwe w drogach oddechowych.
  9. Za pomocą strzykawki napompuj płuca 1 mL buforu z 10% formaliną przez kaniulę. Upewnij się, że napompowanie płuc jest widoczne. Jeśli nie, skoryguj położenie cewnika i powtórz czynność. Po napompowaniu płuc ostrożnie i szybko usuń kaniulę, a następnie mocno zaciśnij nić, aby zamknąć tchawicę.
    UWAGA: Jeśli tchawica jest przerwana i nie można napompować płuc, płuca nadal mogą zostać pobrane, ale może to uniemożliwić prawidłową fiksację.
  10. Delikatnie wyjmij tchawicę i płuca z klatki piersiowej, ostrożnie oddzielając tkankę łączną tchawicy pęsetą przy jednoczesnym delikatnym pociąganiu za nić. Umieść płuca i tchawicę w probówce stożkowej o pojemności 50 mL z 15 mL buforu z 10% formaliną. Wyprowadź jeden koniec nici na zewnątrz probówki i szczelnie zamknij nakrętkę. Odwróć probówkę, aby całkowicie zanurzyć próbkę w utrwalaczu.
  11. Przechowuj próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 h lub do czasu dalszej obróbki.
    UWAGA: Formalina jest substancją niebezpieczną. Stosuj odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym gogle i maskę ochronną. Próbki przetwarzaj pod wyciągiem chemicznym.

4. Pobieranie i konserwacja płuc myszy w celu oceny obciążenia grzybiczego DNA

  1. Należy wykonać kroki 3.1–3.5 opisane powyżej na oddzielnej myszy.
  2. Powoli przemyć prawą komorę serca 10 ml zimnego DPBS przy użyciu 45° pod kątem za pomocą igły 25-G.
  3. Wyciąć płuca nożyczkami i umieścić w opisanych probówkach o pojemności 1,5 ml.
  4. Przechowywać płuca w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
  5. Należy zastosować standardowe techniki zgodnie z opisem (wtapianie i krojenie) oraz zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów).

5. Mikroskopia i obrazowanie

  1. Otwórz program do kwantyfikacji obrazowania (patrz Tabela materiałów).
  2. Za pomocą mikroskopu świetlnego należy obrazować co najmniej 4 różne pola widzenia na preparatach barwionych metodą GMS (obiektyw 10X). Należy upewnić się, że obrazy są reprezentatywne dla zakażonych dróg oddechowych w płucach o podobnej gęstości tkanki.
    UWAGA: Jeśli gęstość i rozmieszczenie ognisk strzępek wydają się wyraźnie różnić między grupą kontrolną a doświadczalną, można pobrać dodatkowe pola widzenia lub obrazować obszar GMS całego przekroju płuca (obiektyw 4X). W razie potrzeby można uzyskać obrazy tych samych obszarów płuca (zidentyfikowanych na podstawie równoważnej morfologii tkanki) na seryjnym przekroju płuca barwionym hematoksyliną i eozyną.
  3. Dodaj paski skali do obrazów tam, gdzie jest to konieczne, a następnie zapisz obrazy przeznaczone do kwantyfikacji. Wybierz, Edytuj > Dodawanie/Edycja znaczników kalibracyjnych > Menu: wybór grubości linii, koloru i rozmiaru paska skali > Kliknij na obrazie w miejscu, w którym ma zostać umieszczony pasek skali. Zamknij menu i wybierz Edytuj. > Scalanie > Scalanie znaczników kalibracyjnych > wybierz Zapisz jako > nadaj nazwę plikowi i kliknij Zapisz.

6. Wykorzystanie programu do przetwarzania obrazów w celu obliczenia obciążenia grzybiczego (Rysunek 3)

  1. Otwórz program do przetwarzania obrazów. Wybierz Plik > folder z próbkami do kwantyfikacji > obraz (Rycina 3A). Wybierz Obraz > Typ > konwertuj na „RGB Stack” (Rycina 3B).
  2. Użyj prawego klawisza strzałki, aby wybrać drugi z trzech podanych obrazów (Rycina 3B). Naciśnij „control + shift + T”, aby wyświetlić ustawienia menu „Threshold” (Rycina 3C). Znajdź oryginalny obraz w formacie .tiff lub .jpg jako punkt odniesienia i otwórz go w programie do przeglądania obrazów (Rycina 3C).
  3. Przesuń górny suwak całkowicie w lewo i reguluj dolny suwak, aż wybrany obszar (zaznaczony na czerwono) będzie reprezentatywny dla obrazu mikroskopowego (zazwyczaj w zakresie 130-160, jak wskazano po prawej stronie suwaka (Rycina 3C).
  4. Po dokonaniu wyboru naciśnij „Set” > „OK” (Rycina 3D). Wybierz „Analyze” > „Set Measurements” > zaznacz „Area, Area Fraction, Limit to Threshold, Display Label” i pozostaw dolne ustawienia (menu rozwijane i miejsca po przecinku) jako domyślne > „OK” (Rycina 3D).
  5. Znaczące obszary białych plam lub zabarwień tła można wykluczyć, zaznaczając odpowiednią tkankę za pomocą narzędzia obszaru lub wielokąta.
  6. Na koniec wybierz „Analyze” > „Measure” (powinno pojawić się okno z danymi lub karta na pasku zadań systemu Windows o nazwie „Results”) (Rycina 3E). Przenieś dane do programu do analizy danych w celu stworzenia wykresów i przeprowadzenia analizy statystycznej.
  7. Wprowadź średnią z czterech wartości procentowych powierzchni dla każdej próbki płuca. Zazwyczaj 5-8 próbek jest wystarczających do wykrycia istotnych różnic między grupami. W przypadku porównywania dwóch grup eksperymentalnych przeprowadź nieparowany test t Studenta w celu określenia istotności.

Proces segmentacji obrazu; etapy A-E; schemat; analiza danych wizualnych; wykrywanie klastrów.
Rysunek 3: Reprezentatywne zrzuty ekranu dla każdego kroku ilościowej analizy pól histologicznych w programie GMS. (A) Select File > folder z próbkami do analizy > wybór obrazu. (B) Select Image > Type > konwersja na „RGB Stack”. Użyj prawego klawisza strzałki, aby wybrać drugi z trzech podanych obrazów. (C) Naciśnij „control + shift + T”, aby otworzyć panel ustawień menu „Threshold”. Znajdź oryginalny obraz w formacie .tiff lub .jpg jako punkt odniesienia i otwórz go w programie do przeglądania zdjęć. Przesuń górny suwak całkowicie w lewo i dostosuj dolny suwak, aż zaznaczony obszar (na czerwono) będzie reprezentatywny dla obrazu mikroskopowego (zazwyczaj w zakresie 130-160, jak wskazano po prawej stronie suwaka). (D) Po zaznaczeniu naciśnij „Set” > „OK”. Wybierz „Analyze” > „Set Measurements” > zaznacz „Area, Area Fraction, Limit to Threshold, Display Label” i pozostaw dolne ustawienia (menu rozwijane i miejsca po przecinku) jako domyślne > „OK”. (E) Na koniec wybierz „Analyze” > „Measure” (powinno pojawić się okno z danymi lub karta na pasku zadań systemu Windows o nazwie „Results”). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Obciążenie grzybicze DNA

  1. Usunąć płuca z -80 °C następnie liofilizować przez co najmniej 4 h (optymalnie przez noc) lub do całkowitego wysuszenia za pomocą liofilizatora.
  2. Podczas suszenia płuc należy przygotować bufor do ekstrakcji DNA (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris HCl pH 8,0 oraz 0,5% SDS).
  3. Umieść przygotowany bufor do ekstrakcji DNA w 60 °C łaźnia wodna do wstępnego ogrzania. Ponadto należy przelać fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1) do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i odczekać do rozwarstwienia.
  4. Liofilizowane płuca umieść w probówce z nakrętką o pojemności 2 ml, dodając 0,2 ml kulek szklanych. Za pomocą homogenizatora kulkowego rozcieraj suchą tkankę płuc przez 15–30 s, aż do uzyskania drobnego proszku.
  5. Do każdej probówki należy dodać 0,8 ml podgrzanego buforu do ekstrakcji DNA i dokładnie wymieszać na wstrząsarku vortex. Następnie każdą probówkę należy inkubować przez 15 min w 65 °C poddać działaniu łaźni z kuleczkami, a następnie wymieszać w wortexie przed inkubacją przez kolejne 15 min. Po inkubacji wymieszać w wortexie, a następnie odwirować probówki przy 25 000 x g przez 10 min.
  6. Oznakuj 3 zestawy probówek o pojemności 1,5 ml dla każdej z próbek i przelej górną warstwę nadsączu do jednego z zestawów probówek. Podczas pipetowania wodnej warstwy górnej zachowaj ostrożność, aby nie zakłócić warstwy środkowej.
  7. Dodać taką samą objętość mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i dokładnie wymieszać. Następnie wirować z przyspieszeniem 25 000 x g przez 15 min, po czym odpipetować górną warstwę do drugiego zestawu probówek.
  8. Dodać równą objętość chloroformu:chloroformu z izoamylollem, dobrze wymieszać i wirować przy 25 000 x g przez 10 min. Ostrożnie przenieść górną warstwę pipetą do trzeciego zestawu probówek.
  9. Dodaj 500 µL izopropanolu i 50 µL NaoAc (pH 5,2), wymieszać dokładnie i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 min. Następnie wirować z prędkością 25 000 x g przez 30 min i odlać nadsącz.
  10. Przemyć osad DNA za pomocą 750 µL lodowatym 70% etanolem, a następnie wirować przez 5 min przy 25 000 x g. Odlać etanol i pozostawić osady do wyschnięcia w probówkach w dygestorium przez 40 min.
  11. Resuspender suche osady w 300 µL buforu TE.
    UWAGA: DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu określenia ilościowego.
  12. Oznaczenie ilości DNA za pomocą spektrofotometru i przygotowanie 100 µL z 0.2 µg/µL każdej próbki DNA do analizy qPCR.
  13. Przeprowadzić standardową reakcję qPCR w trzech powtórzeniach zgodnie z wcześniejszym opisem za pomocą 1 µg próbki DNA, starterów do grzybiczege 18S rDNA oraz zestawów sond z zmodyfikowanym wygaszaczem sondy (5'-/56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/-3')12,13.
  14. Przygotować krzywą standardową z A. fumigatus genomiczne DNA i obliczyć stężenie DNA grzybów w pg w każdej próbce, wykorzystując średnie wartości Ct barwnika raportującego.
  15. Wykreśl pg/µg DNA grzybów wraz z błędem standardowym średniej. Przeprowadź test t-Studenta t-analiza testowa w celu określenia istotności.
    UWAGA: Jako mniej toksyczna alternatywa dla zastosowanej tutaj ekstrakcji DNA z użyciem fenolu i chloroformu, można wykorzystać zestawy do ekstrakcji DNA oparte na kolumienkach.

Wyniki

Rysunek 4 zawiera wykres przeżywalności myszy typu dzikiego lub z niedoborem eozynofili z IA leczonych kaspofunginą. Wyniki pokazują, że myszy z niedoborem eozynofili wykazywały zwiększoną przeżywalność w porównaniu z myszami typu dzikiego (śmiertelność odpowiednio 50% i 100%). Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne barwienie GMS u neutropenicznych myszy typu dzikiego i z niedoborem eozynofili z IA, leczonych lub nieleczonych kaspofunginą. Leczenie kaspofunginą doprowadziło do względnego oczyszczenia z grzybów u myszy z niedoborem eozynofili, ale nie u myszy typu dzikiego (panele prawe), podczas gdy obie grupy, które nie otrzymały kaspofunginy, były podobne (panele lewe). Rysunek 6 przedstawia porównanie obciążenia grzybiczego u myszy typu dzikiego lub z niedoborem eozynofili leczonych kaspofunginą oraz w grupie kontrolnej nieleczonej, z wykorzystaniem zarówno qPCR DNA grzybów (Rysunek 6A), jak i reprezentatywnej ilościowej oceny GMS z 4 pól (obiektyw 10X) (Rysunek 6B). Wyniki uzyskane obiema technikami wskazują, że leczenie kaspofunginą skutkuje najbardziej znaczącym spadkiem obciążenia grzybiczego pomiędzy myszami typu dzikiego a myszami z niedoborem eozynofili (Rysunek 6A). Jednak u myszy nieleczonych tylko ilościowa ocena GMS wykazała istotny spadek u myszy z brakiem eozynofili (Rysunek 6B). Po obliczeniu średniej powierzchni całych przekrojów płuc barwionych metodą GMS (obiektyw 4X) różnice były podobne do wyników uzyskanych z 4 reprezentatywnych pól 10X, choć o mniejszej istotności statystycznej (Rysunek 6C). Rysunek 7 przedstawia przeżywalność, obrazy reprezentatywnego barwienia GMS (4 pola 10X) oraz ilościową ocenę obciążenia grzybiczego obiema metodami u myszy z niedoborem limfocytów T γδ (TCRδKO) leczonych kaspofunginą w porównaniu do kontrolnych myszy nieleczonych. Leczenie kaspofunginą poprawiło przeżywalność (Rysunek 7A) i zmniejszyło obciążenie grzybiczego (Rysunek 7B-D) u myszy TCRδKO. Podobnie jak w przypadku wyników na Rysunku 6, wyniki obciążenia grzybiczego mierzonego za pomocą qPCR (Rysunek 7B) i reprezentatywnej ilościowej oceny GMS (Rysunek 7C) były porównywalne.

Wykres analizy przeżywalności; dni po zakażeniu vs. wskaźnik przeżywalności; WT vs. Eo-/- z kaspofunginą.
Rycina 4: Zwiększona przeżywalność myszy z niedoborem eozynofilów (ΔdblGATA) z IA po leczeniu kaspofunginą. 15-30 myszy/grupa. Podsumowanie 3-6 eksperymentów. **** p < 0.0001. Rycina ta została zmodyfikowana z wcześniejszej publikacji8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Histologia tkanki płucnej; leczenie przeciwgrzybicze kaspofunginą; grupy kontrolne/leczone; mikroskopia.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy przekrojów płuc barwionych metodą GMS u myszy z IA typu dzikiego, z niedoborem eozynofili oraz myszy leczonych kaspofunginą lub nieleczonych (grupa kontrolna). Reprezentatywne dla 3-4 myszy na grupę. Pasek skali odpowiada 100 µm. Rycina ta została zmodyfikowana z poprzedniej publikacji8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki qPCR i GMS; wykresy słupkowe przedstawiają efekty leczenia Caspo w odniesieniu do fungalnego DNA oraz powierzchni GMS+.
Rycina 6: Obciążenie grzybicze u myszy typu dzikiego oraz myszy z niedoborem eosinofilów z IA, leczonych kaspofunginą lub w grupie kontrolnej. (A) qPCR DNA grzybów. 15-30 myszy/grupa, podsumowanie 3-6 eksperymentów. (B) Ilościowa analiza GMS w przekrojach histologicznych, średni % barwienia GMS z 4 pól (obiektyw 10x). (C) Ilościowa analiza GMS, średni % całego przekroju płuca (obiektyw 4X). B i C stanowią podsumowanie dla 5 myszy/grupa. * p < 0.05. *** p < 0.001. **** p < 0.0001. Rycina ta została opracowana na podstawie danych przedstawionych w poprzedniej publikacji8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza infekcji TCRδKO; krzywa przeżywalności, ilościowe oznaczanie DNA, porównanie obszarów GMS; obrazy mikroskopowe.
Rycina 7: Zmniejszenie nasilenia IA u myszy z niedoborem limfocytów T γδ po leczeniu kaspofunginą. (A) Przeżywalność. (B) qPCR DNA grzybów. (C) Ilościowe oznaczanie GMS w badaniu histologicznym. (D) Reprezentatywne obrazy przekrojów barwionych GMS z limfocytów T γδ z IA, leczonych lub nieleczonych kaspofunginą. A i B stanowią podsumowanie dwóch eksperymentów z 7-10 myszami na grupę. C i D stanowią podsumowanie dla 4 myszy na grupę. * p < 0.05. ** p < 0.01. *** p < 0.001. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie wcześniejszej publikacji8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Celem tego artykułu było przedstawienie metody oznaczania obciążenia grzybicą płuc u myszy z IA poprzez wykorzystanie wybarwionych GMS histologicznych skrawków płuc do analizy obrazu i kwantyfikacji. W tym badaniu leczenie lekiem przeciwgrzybiczym kaspofungina14 ukierunkowanym na syntezę β-glukanów nie poprawiło przeżycia ani obciążenia grzybiczego u neutropenicznych myszy typu dzikiego z IA8. Jednak przy braku eozynofili lub limfocytów T γδ przeżywalność i obciążenie grzybami uległy poprawie. Wyniki naszego badania wykazały również, że porównywalne wyniki można uzyskać przy obciążeniu grzybami GMS w porównaniu z powszechnie stosowaną metodą qPCR DNA z grzybów6.

Istnieje kilka korzyści z wykorzystania kwantyfikacji obciążenia grzybami GMS. Po pierwsze, proces może wykorzystywać istniejące próbki histologiczne, co potencjalnie zmniejsza liczbę eksperymentów wymaganych do określenia znaczących różnic. Po drugie, w tym badaniu do ilościowego oznaczania obciążenia grzybami GMS potrzeba było mniejszej liczby zwierząt, aby osiągnąć znaczące różnice w porównaniu z qPCR DNA grzybów (Figura 6, Figura 7). Po trzecie, na porównanie obciążenia grzybami w różnych izolatach za pomocą qPCR mogą mieć wpływ zależne od izolatu różnice w kopii rybosomalnego DNA o liczbie15. W przeciwieństwie do tego, na kwantyfikację GMS nie ma wpływu liczba kopii, ponieważ obciążenie grzybami zależy od względnego poziomu wzrostu grzyba w płucach. W związku z tym zastosowanie kwantyfikacji GMS w odniesieniu do obciążenia grzybami zmniejsza wykorzystanie kręgowców i nie wymaga wstępnego określenia liczby kopii rDNA. Wreszcie, oprócz modyfikowania morfologii grzybów, terapia kaspofunginą zwiększa fragmentację grzybów, a zatem może sztucznie zwiększać obciążenie grzybami, gdy mierzy się je poprzez izolację jednostek tworzących kolonie z homogenatów płuc 12,16,17. W związku z tym kwantyfikacja obciążenia grzybami GMS pozwala uniknąć kilku ograniczeń związanych z innymi powszechnie stosowanymi metodami.

Należy jednak zwrócić uwagę na ograniczenia kwantyfikacji GMS i/lub tego badania. Po pierwsze, autorzy przyjęli porównywalny rozkład wzrostu strzępek w płucach każdej grupy eksperymentalnej, a zatem wykorzystali kwantyfikację z 4 reprezentatywnych 10-krotnych pól obiektywnych jako reprezentatywny pomiar obciążenia grzybami w całych płucach (Figura 6B). Możliwe jest, że w niektórych przypadkach względny rozkład, rozmiar i gęstość ognisk strzępek będą się wystarczająco różnić, tak że obciążenie grzybami będzie wyglądało inaczej w przypadku tej metody i równoważne w przypadku metody qPCR. Jednak nasze dodatkowe wyniki z kwantyfikacją całego odcinka płuc przy użyciu pól obiektywu 4X wykazały podobne, choć mniej istotne statystycznie, różnice między grupami (Figura 6C). Błąd standardowy tej kwantyfikacji został zwiększony przy użyciu tej strategii, prawdopodobnie z powodu zmniejszonej rozdzielczości strzępek z obiektywem 4X i zwiększonego tła w polach nieoptymalnych. W związku z tym preferowana jest reprezentatywna kwantyfikacja mniejszej liczby pól przy większym powiększeniu. Po drugie, dla każdej próbki użyto tylko jednej, środkowej sekcji. Możliwe jest, w oparciu o użyte izolaty grzybów lub szczepy myszy, że niektóre badania mogą skutkować nierównomiernym rozkładem wzrostu strzępek. W takich przypadkach należy określić ilościowo dodatkowe sekcje w każdym bloku parafiny, aby uzyskać bardziej reprezentatywne obciążenie. Po trzecie, w eksperymentach, które indukują znaczną produkcję mucyn (tj. ilościowe określenie wzrostu grzybów dróg oddechowych w alergicznej aspergilozie oskrzelowo-płucnej (ABPA)18 lub mukowiscydozie (CF)18), reaktywność GMS z mucynami bogatymi w polisacharydy19 może dać niespecyficzne wyniki GMS+, a tym samym zniekształcić niektóre próbki na korzyść wyższego obciążenia grzybami. Ponieważ w tym badaniu wykorzystano tylko neutropeniczny model IA, możliwe jest, że zastosowanie innych modeli immunokompetentnych lub supresyjnych może skutkować mniej porównywalnymi wynikami. Pomimo tych zastrzeżeń, kwantyfikacja GMS zapewnia porównywalną technikę określania obciążenia grzybami, a jej ciągłe stosowanie w dodatkowych badaniach może dodatkowo potwierdzić użyteczność tej metody jako spójnej, wiarygodnej i opłacalnej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Indiana University School of Medicine Research Enhancement Grant oraz przez NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. było częściowo wspierane w tym okresie przez Careers in Immunology Fellowship od American Association of Immunoists.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aspergillus fumigatus 293 Roztwór podstawowyGenetyka grzybów Centrum magazynoweFGSC #A1100
HyPure Cell Culture Grade WaterThermo Fisher ScientificSH30529.03
Ekstrakt słodowyMP Biomedicals2155315Biały proszek
BD  BBL Acidicase Dehydrated CultureMedia: PeptonFisher ScientificL11843
Dekstroza (D-glukoza) Bezwodna (granulowany proszek/certyfikowany ACS)Fisher ScientificD16-3
Fisher BioReagents Agar, proszek / płatki, Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1423-500
Automatyczna sucha szafkaShanghai Hasuc Instrument Manufacture Co., LTDHSFC160FD
Seria 1300 klasa II, typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo Fisher Scientific1375
Koraliki szklane 0,5 mmProdukty BioSpec 11079105
Rurki stożkowe 15 mlThermo Fisher Scientific339650
Fisher Scientific# 0267110
Mikroskop Leica Model DMELeica13595XXX
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8662-500 ml
probówki 1,5 mlFisher Scientific# 05-408-129
BD Precyzyjny ślizg  igły strzykawkowe, rozmiar 27, L 1/2 calaSigma-AldrichZ192384
Przeciwciało anty-mysie-Ly-6GBioXCellBP0075-1Klon 1A8
Dioctan kaspofunginySigma-AldrichSML0425
IzofluranHenry Schein Zdrowie zwierząt1169567762
Stołowa maszyna do znieczulenia weterynaryjnego bez oddychaniaSupera Innowacje anestezjologiczneM3000
Koncentrator tlenu PurelineSupera Anesthesia InnovationsOC8000
Ukośny ogranicznik deskiobiektami Indiana State UniversityCustom made
Gilson  PIPETMAN Classic 200 ml FisherScientificF123601G
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)Vortech Pharmaceuticals0298-9373-68
Kleszcze ogólnego przeznaczenia z szeroką końcówkąFisher Scientific10-300
Fisherbrand  Standardowe nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-951-20
Zakrzywione kleszcze ogólnego przeznaczenia FisherScientific10-275
Alkohol etylowy-200 ProofPHARMCO-AAPER111000200
Podkłady chłonne FisherbrandFisher Scientific14-206-63
BD Precyzyjny ślizg  igły strzykawkowe, rozmiar 25, L 1 cal.Fisher ScientificZ192406
Całkowicie plastikowe strzykawki Norm-JectFisher Scientific14-817-30
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50BFisher ScientificNC9742754
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128-4L
50 ml Rurki stożkoweThermo Fisher Scientific339652
Kasety do zatapiania Thermo Scientific Shandon II w tubkachFisher ScientificB1000729
Fisherfinest  Histoplast Wosk parafinowyFisher Scientific22-900-700
Jednorazowe formy bazoweFisher Scientific22-363-554
Reichert Jung Histocut 820 MicrotomeLabequip.com31930
Kąpiel wodnaPrecision Scientific66630-23
Inkubator CO2Fisher Scientific116875H
Srebrna bejca ( Zmodyfikowany GMS) ZestawSigma-AldrichHT100A-1KT
Fast Green FCFFisher ScientificAC410530250
Matowe szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-343
Fisherfinest Superslip Cover GlassFisher Scientific12-545-89
Cytoseal XYLFisher Scientific22-050-262
Mikroskop Olympus Provis AX70OlympusOLYMPUS-AX70
U-PHOTO Uniwersalny system fotograficznyOlympusOLYMPUS-U-PHOTO
U-MCB-2 WIELOFUNKCYJNA SKRZYNKA KONTROLNAOLYMPUSOLYMPUS-U-MCB-2
FreeZone 1-litrowy stołowy system liofilizacjiLABCONCO7740020
Maxima C  Plus  Pompa próżniowaFisher Scientific01-257-80Pojemność skokowa- 6,1 cfm
1-butanolFisher ScientificA383-4
AMRESCO  FENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML  DFSFisher Scientific NC9573988
Wolnostojące probówki do mikrowirówek z nakrętkamiFisher Scientific# 02-682-557
Mini-Beadbeater-24Produkty BioSpec112011
Produkty BioSpecDostawca Diversity Partner 2,3 MM KORALIKI CYRKONOWEFisher ScientificNC0451999
Tris Base (białe kryształy lub krystaliczny proszek/ Biologia molekularna)Fisher ScientificBP152-1
Kwas solny, certyfikowany ACS PlusFisher ScientificA144S
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzianFisher ScientificS311
Dodecylosiarczan sodu (SDS), biały proszek, elektroforezaFisher ScientificBP166
Chloroform/alkohol izoamylowy 24:1Fisher ScientificAC327155000
Biotek Epoch Spektrofotometr mikropłytkowyFisher Scientific11-120-570
Thermo Scientific™   ABsolute Blue qPCR miesza sondęFisher ScientificAB4137A
, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Podkład do amplifikacji antysensownej, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′Zintegrowane technologie DNANie dotyczy
Biosystemy stosowane i handel; MicroAmp&handel; Pasek optyczny z 8 probówkami, 0,2 mlFisher Scientific43-165-67
Thermo Scientific  Wypukłe i płaskie paski z nasadką do PCRFisher ScientificAB-0386
Mx3005P QPCR System, 110 VoltAgilent401443Stratagene jest teraz własnością myszy Agilent
BALB/cMyszy Jackson Laboratory000651
C57BL/6 (B6)The Jackson Laboratory000664
Niedobór eozynofili (Δ dblGATA, tło BALB/c) myszyLaboratorium Jacksona005653
γ δ Myszy z niedoborem limfocytów T (TCRδ-/-, tło B6)Laboratorium Jacksona002120
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of HealthNie dotyczyhttps://imagej.nih.gov/ij/
Spot Zaawansowane oprogramowanieObrazowanie punktoweSPOT53A http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/
GraphPad Prism 6Oprogramowanie GraphPadNie dotyczyhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Fisherbrand Podkłady chłonneFisher Scientific14-206-62
Step 4.5http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf
Hemacytometr Zarządzanie Olympus OLYMPUS-U-PS hybrydyzacyjną

Bibliografia

  1. Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
  2. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743(2013).
  3. Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
  4. Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841(2017).
  5. Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
  6. Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
  7. Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
  8. Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
  9. Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777(2011).
  10. Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
  11. Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
  12. Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
  13. Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
  14. Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
  15. Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
  16. Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
  17. Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
  18. Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
  19. Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie GMSanaliza obrazuinwazyjna aspergilozaqPCR DNA grzyb wdeplekcja neutrofiliterapia kaspofunginmyszy z niedoborem eozynofilimyszy z niedoborem limfocyt w T gamma delta

Powiązane artykuły