Artykuł metodologiczny

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

DOI:

10.3791/57164

⸱

2 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia konfokalna dostarcza przystępnej metodologii do uchwycenia interakcji subkomórkowych krytycznych dla charakterystyki i dalszego rozwoju czynników przedklinicznych znakowanych sondami fluorescencyjnymi. Dzięki niedawnym postępom w cytotoksycznych systemach dostarczania leków opartych na przeciwciałach, zrozumienie zmian wywołanych przez te czynniki w sferze agregacji receptorów i internalizacji ma kluczowe znaczenie. Protokół ten wykorzystuje dobrze znaną metodologię immunocytochemii fluorescencyjnej i dystrybucję ImageJ w FIJI o otwartym kodzie źródłowym, z wbudowanymi funkcjami autokorelacji i matematycznymi obrazami, do wykonywania spektroskopii korelacji obrazów przestrzennych (ICS). Protokół ten określa ilościowo intensywność fluorescencji znakowanych receptorów w funkcji obszaru wiązki mikroskopu konfokalnego. Zapewnia to ilościową miarę stanu agregacji cząsteczki docelowej na powierzchni komórki. Metodologia ta koncentruje się na charakterystyce komórek statycznych z potencjałem do rozszerzenia się na czasowe badania agregacji receptorów. Protokół ten przedstawia przystępną metodologię zapewniającą kwantyfikację zdarzeń grupowania zachodzących na powierzchni komórki, wykorzystując dobrze znane techniki i niespecjalistyczną aparaturę do obrazowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój przeciwciał terapeutycznych wykazał niezwykły sukces w leczeniu wielu typów nowotworów1. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie koniugatów przeciwciało-lek (ADC) jako mechanizmów dostarczania związków cytotoksycznych poszerzyły wymagania dotyczące zrozumienia dynamiki interakcji przeciwciało-receptor na powierzchni komórki2. Po udanym skierowaniu przeciwciała na receptor na powierzchni komórki, kompleksy te mogą indukować podobne wzorce agregacji do tych obserwowanych w interakcjach ligand:przeciwciało3. Zmiany w agregacji receptorów mogą indukować zmiany w błonie i powodować internalizację receptora i usunięcie go z powierzchni komórki. W kontekście koniugatu przeciwciało-lek, proces ten następnie uwalnia ładunek cytotoksyczny do zinternalizowanych endosomów, a następnie do cytoplazmy, co skutkuje skutecznym zabijaniem komórek.

Mikroskopia konfokalna dostarczyła skutecznego sposobu wizualizacji tych ważnych interakcji przeciwciał i ich docelowych receptorów4. Aby zbadać zmiany agregacji cząsteczki docelowej na powierzchni komórki, protokół ten wykorzystuje przetwarzanie końcowe obrazów mikroskopii konfokalnej za pomocą techniki spektroskopii korelacji obrazów przestrzennych (ICS) 5,6,7.

Podstawą spektroskopii korelacji obrazów jest obserwacja, że przestrzenne fluktuacje intensywności fluorescencji mają związek z gęstością i stanem agregacji oznaczonych struktur. Zależność ta jest ustalana po obliczeniu funkcji autokorelacji przestrzennej przechwyconego obrazu5.

Wszystkie warianty spektroskopii korelacji obrazów wymagają obliczenia autokorelacji obrazu. Następnie dopasowuje się tę funkcję do dwuwymiarowej krzywej Gaussa w celu wyodrębnienia ilościowych parametrów stanu agregacji zawartych w obrazie. Mówiąc prościej, obliczenie autokorelacji obrazu polega na porównaniu wszystkich możliwych par pikseli zawartych w obrazie i obliczeniu prawdopodobieństwa, że oba są równie jasne jak inne. Jest to wizualizowane jako funkcja odległości i kierunków separacji pikseli8.

Teoretyczne ramy dla spektroskopii korelacji obrazów zostały ustalone i zdefiniowane przez Petersena i Wisemana et al. 5,6. W tym protokole obliczenia autokorelacji są wykonywane w Fidżi/ImageJ, a także w aplikacji arkusza kalkulacyjnego, podstawę funkcji autokorelacji przestrzennej fluktuacji intensywności można opisać jako (Równanie 1):

figure-introduction-1

gdzie F oznacza transformację Fouriera; F−1 odwrotna transformata Fouriera; F* jego sprzężenie zespolone; a zmienne opóźnienia przestrzennego ε i η. W przestrzennych ICS, zgodnie z opisem w tym protokole, funkcję autokorelacji można obliczyć przy użyciu algorytmu szybkiej transformaty Fouriera 2D7,9. Autokorelacja przy zerowej separacji przestrzennej, znana również jako zero-lag, g11 (0,0), zapewnia odwrotną średnią liczbę cząstek obecnych na obszar wiązki mikroskopu. Można go uzyskać, dopasowując funkcję autokorelacji przestrzennej do dwuwymiarowej funkcji Gaussa (Równanie 2):

figure-introduction-2

Ponieważ piksele uchwycone na obrazie są zawarte w określonym obszarze i te pomiary nie rozciągają się do nieskończoności, termin g∞ jest używany jako przesunięcie w celu uwzględnienia korelacji przestrzennych dalekiego zasięgu zawartych w obrazie. Dla agregatów o rozmiarach molekularnych ω jest funkcją rozproszenia punktowego mikroskopu i jest opisana przez pełną szerokość w połowie maksimum funkcji autokorelacji przestrzennej. Obszar zawarty w funkcji rozproszenia punktowego przyrządu można skalibrować za pomocą kulek fluorescencyjnych o podrozdzielczości.

Dla opisanego tutaj protokołu spektroskopii korelacji obrazów, autokorelacja i funkcje matematyczne wymagane do ukończenia ICS są wykonywane przy użyciu platformy przetwarzania obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, Fiji10, dystrybucji programu ImageJ11,12. Fiji/ImageJ wykorzystuje preinstalowaną szybką transformację Fouriera w funkcji matematycznej FFT. Ta funkcja skraca czas obliczeniowy wymagany do tego obliczenia, zmniejszając zakres danych dwukrotnie w każdym wymiarze13. Ponieważ funkcja autokorelacji 2D jest w przybliżeniu symetryczna na osi x,y, do pomiaru surowej autokorelacji można użyć wykresu profilu pojedynczej linii przez obraz autokorelacji jako funkcji opóźnienia przestrzennego. Wszelki szum o zerowym opóźnieniu jest usuwany przed dalszymi obliczeniami, a wynikowa amplituda autokorelacji (wartość szczytowa, g(0)T) jest korygowana o tło za pomocą wyrażenia (Równanie 3):

figure-introduction-3

gdzie Ib to średnia intensywność z obszaru tła z wyłączeniem komórki. Gęstość klastra lub gęstość obiektów fluorescencyjnych jest zdefiniowana przez (Korektor 4):

figure-introduction-4

W opisanym tutaj protokole dalej prostujemy obliczanie gęstości klastrów (CD), z założeniem opartym na obserwacji, że znormalizowana funkcja autokorelacji zaniknie do wartości zbliżającej się do 1.0 wraz ze wzrostem opóźnienia przestrzennego. Przy maksymalnym opóźnieniu przestrzennym nie ma już korelacji wartości intensywności fluorescencji, a zatem bez korelacji obliczenia w tym obszarze obliczają wartość intensywności pomnożoną przez to natężenie, która jest następnie dzielona przez kwadrat tego natężenia, który z definicji jest równy 1,0. W związku z tym gęstość klastra ze znormalizowanej funkcji autokorelacji można obliczyć, odejmując 1,0 od znormalizowanej funkcji autokorelacji przed przyjęciem jej odwrotności (Równanie 5):

figure-introduction-5

Można przeprowadzić dalszą kalibrację obszaru wiązki, aby określić ilościowo liczbę klastrów zawartych w obszarze funkcji rozrzutu punktowego instrumentu. Kalibracja ta musi być przeprowadzona przy użyciu tych samych warunków optycznych, które są używane podczas analizy spektroskopii korelacji obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zasiewanie przylegających linii komórkowych do eksperymentu obrazowego

  1. Wysiewaj 10 000 komórek raka naskórka A431 na studzienkę przez noc (O/N) w 300 μl pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 1% GlutaMAX w 8-komorowym szkiełku obrazowym odpowiednim do soczewek obiektywowych o wysokiej rozdzielczości (np. Komorowe szkło nakrywkowe NuncTM Lab-TekTM
    2. ).
  2. Stymuluj agregację receptorów na komórkach A431 przez dodanie 100 ng / ml liganda EGF w pożywce przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).

2. Inkubacja przeciwciał pierwotnych

  1. Usunąć pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 300 μl buforowanej soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej (RT) fosforanu (1x PBS).
  2. Utrwalić komórki za pomocą 200 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w RT.
    UWAGA: Aby zbadać czasowe zmiany agregacji celów, ten etap fiksacji należy pominąć.
  3. Usunąć PFA i dwukrotnie przemyć komórki 300 μl PBS o temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować komórki z 200 μl PBS zawierającego pierwszorzędowe przeciwciało o stężeniu 10 μg/ml przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby obliczenia ICS były prawidłowe, wszystkie receptory obecne na powierzchni komórki muszą być znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym. Wymaga to przeprowadzenia wstępnych eksperymentów z serią rozcieńczeń każdego przeciwciała pierwszorzędowego (1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000 itd.). Optymalne stężenie przeciwciał pierwszorzędowych określa się poprzez analizę intensywności fluorescencji w funkcji gęstości klastra. Wybrane stężenie pierwotne występuje, gdy gęstość klastra utrzymuje się na stałym poziomie ze wzrostem stężeń przeciwciał pierwszorzędowych przed dalszym wzrostem gęstości klastra w wyniku nieswoistego wiązania przeciwciał. Przeciwciało pierwszorzędowe można rozcieńczyć w pożywce wolnej od surowicy, jeśli przeprowadza się eksperyment obrazowania w czasie.
  5. Po upływie żądanego czasu inkubacji należy dwukrotnie przemyć komórki 300 μl RT PBS.
  6. Zatrzymać próbkę 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Utrwalone próbki są rutynowo blokowane przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.

3. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał

  1. Przygotować zapas 10 μg/ml znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego (np. Alexa Fluor 488 IgG) w PBS. 2 μg/ml Hoechst 33342 można dodać do tego rozcieńczenia, aby umożliwić lepsze odkrycie próbki pod mikroskopem.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów poklatkowych PBS można wymienić na pożywkę wolną od surowicy.
  2. Usunąć 5% BSA/PBS z komórek i inkubować z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, chroniąc próbki przed światłem otoczenia.
  3. Po zakończeniu czasu inkubacji przeciwciał wtórnych przemyć komórki 300 μl PBS (dwukrotnie) i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem otoczenia.
  4. Aby zapobiec parowaniu, owiń krawędzie zjeżdżalni komory parafilmem.

4. Mikroskopia konfokalna próbek

UWAGA: Ustawienia używane do analizy konfokalnej będą się różnić w zależności od sprzętu i fluoroforów użytych w indywidualnym eksperymencie. Nowoczesne instrumenty konfokalne zapewniają mechanizmy zapisu wszystkich parametrów obrazowania użytych w eksperymencie w natywnym formacie pliku obrazu instrumentu. Ważne jest, aby ustawienia te były rejestrowane w celu zapewnienia odpowiedniej replikacji warunków eksperymentalnych w różnych okresach pozyskiwania danych.

  1. Podczas obrazowania sygnałów fluorescencyjnych należy unikać nadmiernego nasycenia. Użyj tabeli wyszukiwania obrazów, która zapewnia fałszywe odwzorowanie kolorów nasycenia pikseli i odpowiednio zmniejsz wzmocnienie detektora i moc lasera. Większość instrumentów konfokalnych zawiera ustawienie "wskaźnika zasięgu" lub analogiczną opcję w oprogramowaniu do akwizycji.
  2. Zminimalizuj ekspozycję fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania na moc lasera. Zastosowanie barwnika znakującego DNA, takiego jak Hoechst 33342, zapewnia łatwy mechanizm wykrywania i umieszczania próbki w polu widzenia przed pobraniem.
  3. Wykonaj początkowe skanowanie próbki w niskiej rozdzielczości i, jeśli oprogramowanie pozwala na to duża prędkość skanowania. Ograniczy to możliwe fotowybielanie próbki.
  4. Zwiększ rozdzielczość przechwytywania i zmniejsz prędkość skanowania, gdy wszystko będzie gotowe do zebrania danych obrazu.
  5. Jeśli instrument konfokalny na to pozwala, zbierz dane w trybie zliczania fotonów.
    UWAGA: Jeśli zliczanie fotonów nie jest dostępne w urządzeniu: upewnij się, że poziomy szarości są liniowe podczas akwizycji obrazu.
  6. Ustaw otwór dla każdej używanej linii laserowej na 1 jednostkę Airy (AU).
  7. Użyj uśredniania linii lub klatek podczas akwizycji obrazu (x4), aby zredukować szum związany z detektorem.
    UWAGA: W tym wariancie ICS, ponieważ rejestrowany jest tylko jeden punkt czasowy, czas akwizycji nie jest eksperymentalnym czynnikiem ograniczającym.
  8. Do zbierania obrazów wybierz obiektyw o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej, taki jak obiektyw Plan-Apochromat, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość i korekcję aberracji sferycznych i chromatycznych (Przykłady obejmują obiektywy Plan-Apochromat 100X lub 63X /1,40 Oil).
  9. Zbyt duże próbkowanie rozmiaru przechwyconych pikseli zawartych w obrazie. Zaleca się, aby każdy piksel przechwytywał obszar o wymiarach 50 x 50 nm. Aby zapewnić skuteczne ICS, rozmiar piksela musi być mniejszy niż 0,1 x 0,1μm2 na piksel. Osiąga się to poprzez połączenie powiększania w celu zeskanowania stosunkowo małego obszaru i wybrania stosunkowo dużego formatu obrazu (np. 1024 x 1024 lub 2048 x 2048 pikseli).
  10. Skoncentruj się na wierzchołkowej lub podstawowej powierzchni komórki w obszarze tak płaskim, jak to możliwe. Na jednym obrazie można zebrać wiele komórek, a obszary zainteresowania mogą być przetwarzane indywidualnie podczas analizy ICS.
  11. Przechwyć obszar tła wolny od komórki, używając tych samych ustawień instrumentu, które mają być używane do normalizacji próbki.

5. Obliczanie spektroskopii korelacji obrazów

UWAGA: Platforma przetwarzania obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, Fiji, dystrybucja programu ImageJ, jest wymagana do wykonywania autokorelacji i funkcji matematycznych niezbędnych dla ICS. Ta dystrybucja ImageJ jest zalecana, ponieważ zawiera wiele wstępnie zainstalowanych wtyczek i łatwiejszą architekturę aktualizacji, która może wykonywać operacje w wielu eksperymentach obrazowania.

  1. Zainstaluj program Fidżi (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Załaduj pozyskane zestawy danych.
  3. Zidentyfikuj obszar błony wierzchołkowej lub podstawnej powierzchni komórki będący przedmiotem zainteresowania i zduplikuj go do rozmiaru piksela 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menu: Obraz > duplikat..."
  4. Oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania "Menu: Analizuj > pomiary".
  5. Zidentyfikuj obszar tła i zduplikuj go do tego samego rozmiaru piksela, co błona powierzchniowa komórki przechwytującej (2n: 256x256, 128x128, 64x64). "Menu: Obraz > duplikat..."
  6. Oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania w tle. "Menu: Analizuj > pomiary".
  7. Odejmij średnią intensywność tła od obrazu zawierającego obszar zainteresowania. "Przetwarzaj > Kalkulator obrazów > Odejmij".
  8. Wykonaj obliczenia autokorelacji. To obliczenie jest zawarte w strukturze menu: "Przetwarzanie > FTT > matematyka FD".
    1. W oknie dialogowym Matematyka FD wybierz: Obraz 1: Nazwa przyciętego obrazu, Operacja jako korelacja, Obraz 2: Nazwa przyciętego obrazu, Transformacja odwrotna WŁ.
  9. Znormalizuj wynikowy obraz, dzieląc go przez całkowitą liczbę pikseli. "Menu: Przetwarzaj > matematyczną > dziel..." (tj.: 64x64 piksele = 4096)
  10. Normalizuj ponownie, dzieląc przez średnią intensywność znormalizowanego przyciętego obszaru do kwadratu. "Menu: Przetwarzaj > Matematyka > Dziel..." "
    UWAGA: Można to osiągnąć, dwukrotnie dzieląc obraz przez średnią wartość intensywności.
  11. Narysuj linię przechodzącą przez funkcję rozrzutu punktowego.
  12. Wykreśl profil tej linii, aby obliczyć wartość szczytową. "Menu: Analizuj > Profil wykresu".
  13. Oblicz klastry na powierzchnię wiązki, przenosząc wartość szczytową (wynik 5,12) do arkusza kalkulacyjnego i wykonaj następujące obliczenia (równanie 6):
    figure-protocol-1

6. Przetwarzanie wsadowe zbiorów danych ICS

UWAGA: Zaleca się utworzenie makra FIJI/ImageJ w celu powielenia procedur opisanych w powyższym protokole. Pozwala to na spójną i szybką analizę wielu plików obrazów podczas analizy spektroskopii korelacji obrazu.

  1. Ustanów przepływ pracy makr ICS, rejestrując każde polecenie menu w protokole ICS
    "Menu: Wtyczki > makra > nagrywania...".
  2. Wybierz "Utwórz", aby wygenerować makro.
  3. Wybierz "Język > makro IJ1".
  4. Zapisz makro.
  5. Dodaj okna dialogowe do różnych kroków makra, dostarczając przypomnienia dla operatorów każdej funkcji. Okna dialogowe służą również jako metoda wstrzymywania procesu analizy, aby umożliwić dokonanie odpowiednich wyborów przed dalszym przetwarzaniem (np. regionem do przycięcia)
    1. Okno dialogowe Kod makra
      title = "Tytuł okna dialogowego";
      msg = "Okno dialogowe/Komunikat kroku protokołu";
      waitForUser(title, msg);
      UWAGA: Dodatkowe korzyści można uzyskać, subskrybując stronę aktualizacji BAR w FIJI Updater (Instrukcje https://imagej.net/BAR). W ten sposób FIDŻI otrzymuje "zbiór szeroko stosowanych procedur" 14. Jedną z takich rutyn jest Find Peaks. Struktura menu: "BAR > Analiza danych > Znajdź szczyty." Ten skrypt zapewnia szybki sposób obliczenia wartości szczytowej w profilu funkcji rozpiętości punktów.

7. Rozszerzenia protokołu: Obliczanie pola wiązki mikroskopu

UWAGA: Funkcja transferu optycznego mikroskopu zapewnia, że nawet obiekty o rozmiarach molekularnych wyglądają jak obrazy o promieniu około 200-300 nm w płaszczyźnie x-y. Protokół ICS umożliwia wyznaczenie funkcji rozrzutu punktowego poprzez wykonanie kroków 4-5 na koralikach fluorescencyjnych o podrozdzielczości. Specyficznie:

  1. Zamontuj kulki fluorescencyjne o podrozdzielczości (tj. średnicy <100 nm) na 8-komorowym szkiełku obrazowym.
  2. Koraliki obrazu zgodnie z opisanym protokołem przy użyciu mikroskopu konfokalnego wykorzystywanego do eksperymentów ICS.
  3. Oblicz funkcję ICS na podstawie wynikowego obrazu zgodnie z krokami protokołu 5.1-5.13.
  4. Na podstawie wykreślonego profilu oblicz promień wiązki (r) jako pełną szerokość przy połowie maksymalnej wartości funkcji ICS.
  5. Oblicz pole wiązki (BA) jako (Równanie 7): figure-protocol-2

8. Rozszerzenia protokołu: Obliczanie klastrów na jednostkę powierzchni

  1. Oblicz gęstość klastra (CD) na jednostkę powierzchni jako (Równanie 8):
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. Podziel klastry na obszar wiązki (wynik 5.13) przez obszar wiązki (wynik 7.5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udany eksperyment ze spektroskopią korelacji obrazów zależy od właściwego zastosowania kontroli leczenia. Te grupy leczenia obejmują badanie fluorescencji w grupach bez przeciwciał pierwszorzędowych i bez przeciwciał drugorzędowych. Po ustaleniu optymalnych ustawień lasera konfokalnego dla eksperymentu, należy uchwycić obrazy tych grup kontrolnych, aby potwierdzić brak niespecyficznej fluorescencji w próbce. W przypadku wielu przylegających linii komórek nowotworowych identyfikacja region...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika spektroskopii korelacji obrazu (ICS), którą opisujemy w tym protokole, wykorzystuje standardowe mikroskopy konfokalne bez konieczności stosowania specjalistycznych detektorów. Opisana technika ICS wykorzystuje dobrze znane metody immunocytochemiczne, aby zapewnić szybkie pobieranie próbek z wielu stanów leczenia w celu zwiększenia analizy statystycznej. Metodologia ta czyni to z niewielkim zmniejszeniem absolutnej precyzji w porównaniu z alternatywnymi technikami pojedynczych cząsteczek opartymi na korelacji flu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrew M. Scott jest wspierany finansowo przez AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono i Daiichi-Sankyo Co, a także jest konsultantem i właścicielem udziałów w Life Science Pharmaceuticals. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w manuskrypcie, poza tymi, które zostały ujawnione.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od NHMRC (Fellowship 1084178 and Grants 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), Cancer Australia, Ludwig Cancer Research, John T Reid Trusts, Cure Brain Cancer Foundation, La Trobe University i Victoria Cancer Agency. Docenia się również finansowanie z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej zapewnionego przez rząd stanu Wiktoria w Australii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II - 8 dołkówThermoFisher Scientific155409
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific14190144
Surowica bydlęcapłodu ThermoFisher Scientific10099141
Enzym TrypLE Express (1x), bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific12604021
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher Scientific15140122
Suplement GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061
Kozie przeciwciało wtórne anty-ludzkiej IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck Wzorce mikrosfery fluorescencyjnej 0,1 i mikro; mThermoFisher ScientificT7279
CetuximabMerck Serono3023715501
Parafilm M 38mx100mmMerck MilliporeBRND701605
16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)ProSciTechC004
Rekombinowany ludzki EGFR& System D236-EG

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Image Correlation SpectroscopyConfocal MicroscopyCell Surface Receptor AggregationFluorescent ImmunocytochemistryEGF Receptor ClusteringPoint Spread Function AnalysisFiji ImageJ ProcessingA431 Epidermoid Carcinoma CellsSpatial Intensity QuantificationBeam Area Measurement

Powiązane artykuły