Artykuł metodologiczny

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

DOI:

10.3791/57166

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  , 
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obecne w różnych tkankach i mogą być zróżnicowane na wiele typów komórek, w tym osteoblasty. Wśród dentystycznych źródeł MSCs, okostna jest łatwo dostępną tkanką, która została zidentyfikowana jako zawierająca MSC w warstwie kambium. Jednak źródło to nie zostało jeszcze szeroko zbadane.

Wykazano, że witamina D3 i 1,25-(OH)2D3 stymulują in vitro różnicowanie MSC w osteoblasty. Ponadto witamina C ułatwia tworzenie kolagenu i wzrost komórek kostnych. Jednak żadne badanie nie zbadało jeszcze wpływu witaminyD3 i witaminy C na MSC.

Tutaj prezentujemy metodę izolowania MSCs z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i badamy hipotezę, że 1,25-(OH)2D3 może wywierać wpływ osteoindukcyjny na te komórki. Badamy również obecność MSCs w okostnej wyrostka zębodołowego człowieka oraz oceniamy adhezję i proliferację komórek macierzystych. Ocena zdolności witaminy C (jako kontroli) i różnych stężeń 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8 i 10−7 M) do zmiany kluczowych biomarkerów mRNA w izolowanych MSCs ekspresji mRNA fosfatazy alkalicznej (ALP), sialoproteiny kostnej (BSP), rdzeniowego czynnika wiążącego alfa-1 (CBFA1), kolagenu-1, i osteokalcyny (OCN) są mierzone za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż w ostatnich latach opracowano wiele odpowiednich technik, rekonstrukcja kości pozostaje ograniczona przez wiele ograniczeń, a oszacowanie zakresu koniecznej rekonstrukcji jest często niemożliwe. Augmentacja tkanek twardych jest wymagana do osiągnięcia zarówno celów estetycznych, jak i funkcjonalnych, a także korzystnego długoterminowego wskaźnika sukcesu. Metody powszechnie stosowane w takich procedurach obejmują autogenny i allogeniczny przeszczep kości, ksenograf i alloplastyczny przeszczep kości. Spośród różnych rodzajów przeszczepów kostnych za najskuteczniejsze uważa się autogenne przeszczepy kostne. Jednak zachorowalność w miejscu dawczym, upośledzone unaczynienie i ograniczona dostępność tkanek1 były głównymi wadami autogennego przeszczepu kości. Ponadto allogeniczne przeszczepy kostne i ksenoprzeszczepy są związane z przenoszeniem chorób. Obecnie syntetyczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w celu rozwiązania tych problemów. Jednak ze względu na brak potencjału osteogennego, wyniki kliniczne są bardzo zróżnicowane. Materiały takie jak celuloza są związane z wahaniami objętości, infekcjami i brakiem wytrzymałości.

Augmentacja kości za pomocą inżynierii tkankowej wzbudziła spore zainteresowanie. W tej technice mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są początkowo wykorzystywane do promowania różnicowania osteoblastów, które są następnie przeszczepiane do miejsca utraty masy kostnej w celu naprawy kości. Procedura ta jest obecnie stosowana w terapii komórkowej. Osiągnięcie rekonstrukcji kości poprzez ekstrakcję ograniczonej ilości tkanki jest prostsze i mniej inwazyjne w porównaniu z innymi metodami.

Potencjalna rola MSCs jako narzędzia do terapii komórkowych mających na celu regenerację zębów jest coraz bardziej interesująca wśród różnych grup badawczych. Badania potwierdziły, że MSCs można odróżnić od następujących typów tkanek: szpik kostny, tkanka tłuszczowa, błona maziowa, perycyt, kość beleczkowa, ludzka pępowina i tkanki zębowe2,3. Częstymi źródłami MSCs są szpik kostny, tkanka tłuszczowa i tkanki zębowe. W porównaniu z MSCs pochodzącymi z tkanki tłuszczowej i szpiku kostnego, zaletą komórek macierzystych zęba jest łatwa dostępność i mniejsza zachorowalność po pobraniu. W porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi, MSCs pochodzące z tkanek zęba wydają się nieimmunogenne i nie wiążą się ze złożonymi problemami etycznymi3.

W 2006 roku Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej zaleciło stosowanie następujących standardów do identyfikacji MSC: Po pierwsze, MSC muszą być zdolne do przyczepiania się do plastiku. Po drugie, MSCs muszą być dodatnie dla antygenów powierzchniowych CD105, CD73 i CD90 oraz ujemne dla markerów monocytów, makrofagów i limfocytów B oprócz antygenów krwiotwórczych CD45 i CD344. Ostatnim kryterium jest to, że MSCs muszą być zdolne do różnicowania się w następujące trzy typy komórek w standardowych warunkach różnicowania in vitro: osteoblasty, adipocyty i chondrocyty4. Do tej pory wyizolowano i scharakteryzowano sześć typów ludzkich komórek macierzystych zębów. Pierwszy typ został wyizolowany z ludzkiej tkanki miazgi i nazwany postnatalnymi komórkami macierzystymi miazgi zębowej5. Następnie wyizolowano i scharakteryzowano trzy dodatkowe typy zębowych MSCs: komórki macierzyste z złuszczonych zębów mlecznych 6, więzadło przyzębia7 oraz brodawka wierzchołkowa8. Ostatnio zidentyfikowano również komórki macierzyste pęcherzyków zębowych 9, pochodzące z tkanek dziąsłowych 10, komórki macierzyste pączków zębowych (DBSC) 11 i MSC torbieli okołowierzchołkowej (hPCy-MSCs)12.

Friedenstein jako pierwszy zdefiniował MSCs13. MSCs wykazują wysoki potencjał proliferacyjny i mogą być manipulowane w celu odróżnienia się przed przeszczepieniem, co sugeruje, że są idealnymi kandydatami do procedur regeneracyjnych10.

Chociaż większość badań wykorzystywała szpik kostny jako źródło komórek macierzystych, ostatnio wykorzystano również komórki pochodzące z okostnej (PDC)14. Okostna jest łatwiej dostępna niż szpik kostny. Dlatego w tej technice wykorzystujemy okostną wyrostka zębodołowego, aby wyeliminować konieczność wykonywania dodatkowych nacięć podczas operacji i zmniejszyć zachorowalność pooperacyjną u pacjentów. Okostna jest tkanką łączną, która tworzy zewnętrzną wyściółkę kości długich i składa się z dwóch odrębnych warstw: zewnętrznej warstwy włóknistej złożonej z fibroblastów, kolagenu i włókien elastycznych15, oraz wewnętrznej warstwy kambium bogatej w komórki w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią kości. Warstwa kambium zawiera mieszaną populację komórek, głównie fibroblasty16, osteoblasts17, pericytes18 oraz krytyczną subpopulację zidentyfikowaną jako MSCs19,20,21. Większość badań wykazała, że PDC są porównywalne, jeśli nie lepsze, do komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (bMSC) w gojeniu i regeneracji kości22,23,24. Okostna jest łatwo dostępna i wykazuje doskonałą skuteczność regeneracyjną. Jednak niewiele badań skupiało się na periosteum25,26,27.

Jeśli chodzi o naprawę kości, obecna praktyka kliniczna polega na przeszczepianiu komórek progenitorowych okostnej amplifikowanych w rusztowaniach wspomagających. Ostatnie badania koncentrowały się na pozyskiwaniu komórek macierzystych w uszkodzonych regionach i wykorzystywaniu komórek progenitorowych do regeneracji tkanek20. Dentyści przewidują również przyszłe zastosowanie regeneracji kości przyzębia w leczeniu periodontologicznym i implantach stomatologicznych. Jeśli chodzi o miejsce dawcze, okostna może być łatwo pobrana przez chirurgów stomatologów ogólnych. Wypada to korzystnie w porównaniu z komórkami zrębu szpiku, ponieważ dostęp do okostnej można uzyskać podczas rutynowej operacji jamy ustnej. W związku z tym celem tego badania jest ustalenie protokołu pobierania PDC oraz ocena morfologii, przyczepności, żywotności i proliferacji ludzkich komórek macierzystych okostnej.

Metabolity witaminy D wpływają na dynamiczną równowagę kostno-mineralną in vivo. Jedno z badań wykazało, że aktywna forma witaminy D 24R,25-(OH)2D3 jest niezbędna do różnicowania osteoblastycznego ludzkich MSCs (hMSCs)28. Homeostaza i naprawa kości są regulowane przez sieć metabolitów witaminyD3, z których 1,25-(OH)2D3 (kalcytriol) jest najbardziej aktywny biologicznie i ma znaczenie w regulacji zdrowia kości. Witamina D3 jest niezbędna do zwapnienia29. W jednym z badań z udziałem 2-dniowych białych myszy z Kunming, ciała embrionoidalne u myszy wykazały, że suplementy witaminy C i witaminy D skutecznie promowały różnicowanie osteoblastów pochodzących z ESC30. Wśród innych działań biologicznych, 1,25-(OH)2D3 stymuluje różnicowanie in vitro hMSC do osteoblastów, które można monitorować na podstawie wzrostu aktywności enzymu fosfatazy alkalicznej (ALP) lub ekspresji genu OCN.

Niewiele badań wykryło zależność między dawką a reakcją w skojarzonym leczeniu witaminą C i 1,25-(OH)2D3 u ludzkich PDC, ze szczególnym naciskiem na inżynierię tkanki kostnej. Dlatego w tym badaniu badamy optymalne stężenia dla pojedynczego lub skojarzonego leczenia 1,25-(OH)2D3 i witaminy C w celu indukowania różnicowania osteogennego ludzkich PDC. Celem tego protokołu jest ustalenie, czy populacja komórek wyizolowana z okostnej wyrostka zębodołowego zawiera komórki o fenotypie MSC i czy komórki te mogą być namnażane w hodowli (in vitro) i różnicowane w celu utworzenia pożądanej tkanki. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty. Druga część badania ocenia wpływ witaminy C i 10−10, 10−9, 10−8 i 10−7 M 1,25-(OH)2D3 na aktywność osteogenną PDC. Głównym celem tego badania jest ocena funkcji witaminy C i 1,25-(OH)2D3 podczas różnicowania osteoblastycznego PDC przez aktywność ALP oraz genów proosteogennych, takich jak ALP, kolagen-1, OCN, BSP i CBFA1. Ponadto na podstawie tych ustaleń badanie to określa optymalne warunki osteoindukcyjne dla ludzkich PDC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Pobieranie tkanek okostnej od pacjentów podczas zabiegu chirurgii stomatologicznej (Rysunek 1). Po odbiciu płata w znieczuleniu miejscowym należy pobrać fragment tkanki okostnej z kości wyrostka zębodołowego za pomocą separatora okostnej31.
  2. Po zbiorach należy przechowywać plastry tkanek okostnej o wielkości około 5 mm × 2 mm w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z 300 j./ml penicyliny i 300 mg/ml streptomycyny. Przenieść tkanki do laboratorium w ciągu 24 godzin.
  3. Fragmenty tkanki okostnej pęcherzyków płucnych należy rozdrobnić skalpelami, aż zostaną dobrze rozdrobnione, a następnie utrzymać próbki w pożywce pasażowej 0 (składającej się z 300 U/ml penicyliny i 300 mg/ml streptomycyny, α-MEM i 5% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) hodowanej w inkubatorze w temperaturze 37 °C z wilgotnym powietrzem (5% dwutlenku węgla). W inkubatorze przygotuj miskę na wodę, aby utrzymać wilgotność.
  4. Zmień podłoże po 3 dniach, a następnie dwa razy w tygodniu.
  5. Gdy komórki osiągną subkonfluencję (80%), uwolnij przylegające komórki z 200 μl 0,25% trypsyny w inkubatorze (37 °C) na 3 minuty, a następnie użyj 4,5 ml pożywki do zakończenia reakcji.
  6. Ponownie umieść komórki w świeżym pasażu 1 pożywce (α-MEM, 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Płytka składa się z 5 × 103 komórek (zliczonych za pomocą hemocytometru).
  7. Wykonuj każde kolejne przejście po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji31.
    UWAGA: Na początku podłoże będzie pomarańczowo-czerwone. Po około trzech dniach średni kolor powinien zmienić się na żółtawy odcień. Czas podwajania komórek wynosi około 30–40 godzin, co wymaga 7 dni na 3–5 pokoleń.
  8. Hodowla wyizolowanych PDC w α-MEM uzupełnionych 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2).
  9. Codziennie obserwuj wzrost komórek i wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu. Używaj komórek od trzeciej do piątej generacji do wszystkich dalszych eksperymentów.

2. Cytometria przepływowa

  1. Zbierz 1 × 106 komórek poprzez trawienie trypsyny:
    1. Dodaj 200 μl 0,25% trypsyny. Po 3 minutach użyć 4,5 ml pożywki hodowlanej zawierającej FBS, aby zakończyć reakcję trypsyny i zebrać przez odwirowanie (1500 obr./min, 5 min, 22 °C).
    2. Umyj granulki komórek trzy razy za pomocą 1x DPBS. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl 1x bufor przepuszczalny. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  2. Zbadaj wyrażone markery powierzchniowe PDC za pomocą cytometrii przepływowej (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją)32. Użyj przeciwciał monoklonalnych (MAb) przeciwko CD19 (izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (fikoerytryna [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allofikocyjanina [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) i HLA-DR (FITC)32.
    1. Dodać przeciwciała do próbek i hodować je w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Umyj komórki trzykrotnie 1x DPBS.
    3. Napraw komórki za pomocą 2% formaldehydu i kontynuuj analizę cytometrii przepływowej32.

3. Przyczepność i żywotność komórek z różnicowaniem osteogennym, adipogennym i chondrogennym

Indukuj różnicowanie w komórkach na linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne poprzez hodowlę komórek okostnej we wszystkich trzech przejściach na sześciodołkowych płytkach ze specyficznymi mediami różnicującymi.

  1. W celu różnicowania kościobiornego należy hodować komórki w α-MEM o gęstości 5000 komórek na studzienkę na sześciodołkowych płytkach hodowlanych.
    1. Po osiągnięciu 80% konfluencji hoduj komórki w pożywkach zawierających α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosforan (10 mM), 10−7 M deksametazon (0,1 mM) i 5 ml kwasu askorbinowego (100 mM). Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.
    2. Zmieniaj nośnik dwa razy w tygodniu.
    3. Po 4 tygodniach oceń potencjał komórek do różnicowania się w linię osteogenną, barwiąc komórki za pomocą testu von Kossa, który rozróżnia obecność zwapniałych osadów w culture33.
      1. Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut dodaj 5% azotanu srebra i poddaj działaniu światła ultrafioletowego (UV) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Dodaj 5% Na2SO4 cztery razy, pozostawiając 3 minuty na każdą reakcję. Na koniec umyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną.
        UWAGA: Barwienie von Kossa to reakcja wytrącania, w której jony srebra i fosforan reagują w obecności kwaśnego materiału; Ta technika barwienia nie jest specyficzna dla wapnia. W tym badaniu, gdy badane komórki potraktowano roztworem azotanu srebra, wapń – który jest redukowany przez silne światło UV – został zastąpiony srebrem, które stało się widoczne jako srebro metaliczne.
  2. W celu różnicowania adipogennego hoduj komórki o gęstości 5000 komórek na basenie na sześciodołkowych płytkach hodowlanych zawierających α-MEM.
    1. Po osiągnięciu 80% konfluencji hoduj komórki w pożywkach zawierających α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (100 mg / ml), 1% penicyliny, 10-6 M deksametazonu (1 mM), insulinę (5 mg / ml) i indometacynę (60 mM).
    2. Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.
    3. Po 6–9 tygodniach użyj czerwonego oleju O, aby zabarwić komórki i podkreślić krople lipidów, określając w ten sposób obecność różnicowania adipogennego33:
      1. Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut zabarwić komórki 0,5% czerwienią olejową O w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie trzykrotnie umyć komórki 60% izopropanolem przez 3 minuty za każdym razem; Na koniec umyj komórki wodą destylowaną.
        UWAGA: Czerwień olejowa O jest barwnikiem diazowym lizochromowym (rozpuszczalnym w tłuszczach) używanym do barwienia obojętnych lipidów, głównie triacyloglicerolu, lipoprotein i estrów cholesterolu. Barwnik rozpuszcza się w kropelkach lipidów w komórce, zmieniając kolor kropelek lipidów na czerwony.
  3. W celu różnicowania chondrocytów, hoduj komórki na sześciodołkowych płytkach hodowlanych, z których każda zawiera 5000 komórek.
    1. Dodać pożywkę różnicującą zawierającą α-MEM, 5% FBS, 10−7 M deksametazon (0,1 mM), pirogronian sodu (100 μg/ml), insulinę-transferynę-selen-A (1 × ITS), transformujący czynnik wzrostu-β (10 ng/ml) i 5 ml kwasu askorbinowego (100 μM).
    2. Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.
    3. Po 4-5 tygodniach użyj barwienia niebieskim Alcian, aby podkreślić kwaśne polisacharydy, takie jak glikozaminoglikany lub niektóre rodzaje mukopolisacharydów, w chrząstce komórek, aby określić obecność różnicowania chondrocytów33.
      1. Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut dodaj 3% kwasu octowego i odczekaj 2 minuty na reakcję. Następnie przemyć trzykrotnie wodą destylowaną, dodać 1% błękitu Alcian 8GX inkubowanego przez 30 min, a następnie przemyć wodą destylowaną. Na koniec dodaj 3% kwasu octowego i myj przez 3 min, a następnie umyj wodą destylowaną do końca.
        UWAGA: Części komórki, które specyficznie barwią się tym barwnikiem, po barwieniu stają się niebieskie do niebiesko-zielonego i nazywane są "alcianofilnymi".

4. Wpływ 25-dihydroksywitaminy D3 (1,25-(OH)2D3) na osteogenezę

  1. Podzielić PDC od P3 do P5 na sześć grup i hodować na płytkach 6-dołkowych z różnymi pożywkami hodowlanymi:
  2. grupa negatywna (α-MEM i 5% FBS);
  3. Grupa witamin C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu i 10−7 M deksametazon + 100 uM witaminy C);
  4. i grupa 10−7 M 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforan i 10−7 M deksametazon + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Dodać 2 ml pożywki do inkubatora (37 °C) w każdym dołku i zmieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.

5. Odwrotna transkrypcja/Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

  1. Po 7 dniach różnicowania osteoblastów, wyizolować całkowite RNA na lodzie za pomocą dostępnego w handlu odczynnika (patrz Tabela Materiałów):
    1. Dodać 1 ml odczynnika izolacyjnego do każdej studzienki. Dodać 200 μl bromochloropropanu i pozostawić na 10 minut w celu wytworzenia warstwowego RNA, a następnie odwirować z prędkością 10 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Po odwirowaniu dodać 500 μl 2-propanolu do 500 μl supernatantu zawierającego RNA. Wytrącić RNA na lodzie i odczekać 15 minut na reakcję.
    3. Po zabiegu odwirować z prędkością 12 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 °C, po czym RNA znajduje się na dnie probówki. Następnie usunąć sklarowany osad przy użyciu 1 ml 75% alkoholu do przemywania i odwirować z prędkością 7 500 obr./min przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć supernatant i użyć koncentratora próżniowego do wytworzenia RNA z dna cieczy. Odzyskać za pomocą wody.
  2. Odwrotna transkrypcja RNA (1 μg) przy użyciu odwrotnej transkryptazy wirusa mieloblastozy ptaków. Ustawić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) tak, aby przebiegała w temperaturze 25 °C przez 10 minut, następnie w temperaturze 50 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 minut, zanim ostatecznie utrzyma się w temperaturze 4 °C.
  3. Zsyntetyzuj pierwszą nić komplementarnego DNA (cDNA). Wykonaj ilościową PCR (qPCR) przy użyciu 5 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:10. Przeprowadź ilościowy RT-PCR (QRT-PCR) przy użyciu starterów dla ALP, BSP, OCN, CBFA1 i kolagenu-1.
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia DNA sygnałami, sekwencje do przodu i do tyłu każdego startera zostały zaprojektowane na odrębnych eksonach.
  4. Wykonaj qPCR przy użyciu komercyjnej mieszanki PCR Master Mix (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw termocykler na 50 °C na 2 minuty, następnie 95 °C na 10 minut, a następnie 40 cykli każdy w temperaturze 95 °C na 15 s, a następnie 60 °C na 60 s.
    UWAGA: Protokół SYBR wymaga również etapu krzywej topnienia, który jest prowadzony w temperaturze 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s, a następnie 95 °C przez 15 s.
  5. Znormalizuj wartości progowe cyklu dla ALP, BSP, CBFA1, kolagenu-1 i OCN do wartości genu porządkowego GAPDH. 34
  6. Pary podkładów są wymienione w tabeli materiałów.

6. Aktywność fosfatazy alkalicznej

  1. Oceń aktywność enzymu ALP w komórkach za pomocą wcześniej opisanej techniki35, która przekształca fosforan p-nitrofenylu w p-nitrofenol; Fosforan p-nitrofenylowy jest substratem fosfatazy, który zmienia kolor na żółty po defosforylacji przez ALP, jak określono przy długości fali 405 nm. Normalizować całkowity utworzony p-nitrofenol na podstawie całkowitego białka określonego w teście Bradforda.
  2. Porównaj aktywność ALP kontrolnej (α-MEM, 5% FBS), witaminy C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu, 10−7 M deksametazonu + 100 uM witaminy C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu i 10−7 M deksametazonu + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), i grupy Witamina C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu, 10−7 M deksametazon + 100 uM Witamina C +1,25-(OH)2D3) po 1, 2, 3 i 4 tygodniach hodowli.
  3. Wykonaj procedurę ekstrakcji białka na lodzie:
    1. Zeskrobać komórki z płytek 6-dołkowych i dodać 50 μl buforu do lizy. Następnie umieść komórki na lodzie na 30 minut, aby zniszczyć komórki i uwolnić białko.
    2. Po 30 minutach odwirować z prędkością 13000 obr./min w temperaturze 4 °C przez 15 min. Po odwirowaniu ekstrahować supernatant do przechowywania i użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich testów ilościowych dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane za pomocą testu t-Studenta. W sumie uzyskano 34 próbki o średnim wieku uczestników od 48,1 ± 12,3 lat. Jedenaście z tych próbek pobrano od pacjentów płci męskiej i 23 od kobiet. Dwadzieścia osiem próbek pobrano z okolic trzonowych i sześć z obszarów przednich; 26 uzyskano ze szczęki, a 8 z żuchwy. Średni czas pomiędzy zabiegiem stomat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opracowana metoda terapeutyczna, a mianowicie inżynieria tkankowa wykorzystująca MSC, ma wiele zalet. MSCs, które są obecne w kilku typach tkanek, są komórkami multipotencjalnymi, które mogą różnicować się w różne funkcjonalne komórki tkanki mezodermalnej37 i inne komórki, takie jak osteoblasty.

Okostna służy jako nisza dla komórek progenitorowych i jako bogate zaopatrzenie naczyniowe dla kości, którą otacza38. W naszym badaniu, z 34 bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board for Clinical Research of Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B i 103-4223C). Badanie to było wspierane przez Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 i NMRPG3C0151). Ten rękopis został zredagowany przez Wallace Academic Editing.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibco25200-056
Kwas 2-fosfo-L-askorbinowysól trisodowaSigma49752
35-milimetrowe naczyniahodowlane Corning430165
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigmaI5879
6  płytka dołkowaCorning3516
Fosfataza alkalicznaABIHs01029144_m1
Zestaw do oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej Zestaw do oznaczania kolorymetrycznegoBioVisionK412-500
odwrotna transkryptaza wirusa mieloblastozy ptakówRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
bankier komórkowy1ZEAOAQ11888
czynnik wiążący rdzeń alfa-1ABIHs00231692_m1
deksametazonSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD
indometacynaSigmaI7378
insulinasigma91077C
insulina– transferyna– selen-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml)Żywotność4346907
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmpŻywotność4311971
Minimum Niezbędne podłoże 1X Alfa ModyfikacjaHyklonSH30265.02
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
Bufor przepuszczalnyeBioscience00-8333-56
Pirogronian soduGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transformujący czynnik wzrostu-βSigmaT7039 
Odczynnik Trizol (do izolacji RNA)Life15596018
β-glicerofosforanSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN
Invitrogenstarter do przodu 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
starter do odwróconego 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP
Podkład do przodu Invitrogen5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
starter do tyłu 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'Komercyjne
podkłady ALP Komercyjne startery
CBFA1
562008

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79(2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Witamina D3r nicowanie osteogenneizolacja kom rekanaliza RT PCRfosfataza alkalicznaekspresja kolagenu typu 1sialoproteina kostnatest Von Kossa

Powiązane artykuły