Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania PET/CT 18F-FDG i histologii ilościowej do pomiaru dynamicznych zmian w metabolizmie glukozy w mysich modelach raka płuc

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57167

⸱

21 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine, 2University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles, 4Andor Technology, 5Division of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy, jak wykorzystać pozytonową tomografię emisyjną [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy i obrazowanie tomografii komputerowej (18F-FDG PET/CT) do pomiaru odpowiedzi metabolicznej guza na terapię celowaną MLN0128 w mysim modelu raka płuc z mutacją Kras/Lkb1 oraz obrazowania sprzężonego z autoradiografią ex vivo o wysokiej rozdzielczości i histologią ilościową.

Streszczenie

Cechą charakterystyczną zaawansowanych nowotworów jest przejście na glikolizę tlenową, którą łatwo zmierzyć za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy (18F-FDG PET). Komutacje w protoonkogenie KRAS i genie supresorowym LKB1 są częstymi zdarzeniami w raku płuc, które napędzają hipermetaboliczny, glikolityczny wzrost guza. Krytycznym szlakiem regulującym wzrost i metabolizm tych nowotworów jest mechanistyczny cel szlaku rapamycyny (mTOR), który może być skutecznie ukierunkowany za pomocą selektywnych katalitycznych inhibitorów kinazy mTOR. Inhibitor mTOR hamuje MLN0128 glikolizę u myszy z guzami z komutacjami Kras i Lkb1, określanych jako myszy KL. Odpowiedź na leczenie u myszy KL jest najpierw mierzona za pomocą obrazowania 18F-FDG PET i tomografii komputerowej (CT) przed i po podaniu MLN0128. Wykorzystując 18F-FDG PET/CT, naukowcy są w stanie zmierzyć dynamiczne zmiany w metabolizmie glukozy w genetycznie modyfikowanych mysich modelach (GEMM) raka płuc po interwencji terapeutycznej z terapiami celowanymi. Następnie przeprowadzana jest autoradiografia ex vivo i ilościowa analiza immunohistochemiczna (qIHC) przy użyciu oprogramowania morfometrycznego. Zastosowanie qIHC umożliwia wykrycie i ilościowe określenie wyraźnych zmian w profilach biomarkerów po leczeniu, a także scharakteryzowanie odrębnych patologii nowotworowych. Sprzężenie obrazowania PET z ilościową histologią jest skuteczną strategią identyfikacji odpowiedzi metabolicznych i terapeutycznych in vivo w mysich modelach choroby.

Wprowadzenie

Nasze badania skupiły się na badaniu i zwalczaniu nowotworów z mutacjami w raku zmutowanym kinazy wątrobowej B1 (LKB1, zwanym również STK11)1. LKB1 jest głównym supresorem nowotworu, który hamuje kompleks mTOR 1 (mTORC1) poprzez aktywację kinazy AMP (AMPK), co prowadzi do regulacji wzrostu i metabolizmu. W związku z tym utrata LKB1 prowadzi do nieograniczonej aktywacji mTORC1, aktywacji wypadkowej HIF1-alfa w glikolitycznym fenotypie metabolicznym powszechnie określanym jako efekt Warburga2,3,4. Mutacje inaktywujące LKB1 bezpośrednio prowadzą do rozwoju rzadkiego rodzinnego zespołu predyspozycji do raka, znanego jako zespół Peutza-Jeghersa (PJS), który charakteryzuje się rozwojem łagodnych polipów przewodu pokarmowego znanych jako hamartoma5,6,7. Co więcej, LKB1 często mutuje z onkogennym KRAS, powodując hipermetaboliczne i agresywne nowotwory płuc u ludzi8,9.

Choroby związane z Lkb1 są łatwo modelowane u myszy. Heterozygotyczna inaktywacja Lkb1 u myszy prowadzi do rozwoju hamartomów dokładnie modelujących PJS10,11,12,13. Dodatkowo, mutacje Lkb1, które są łatwo modelowane u myszy, dokładnie podsumowują fenotypy raka płuc, skóry, trzustki i piersi14. Komutacja Kras/Lkb1 w tkance płucnej myszy transgenicznych, wykorzystująca aktywację onkogennego alleluKras G12D za pośrednictwem rekombinazy Cre i bialleliczną delecję Lkb1, powoduje powstawanie agresywnych i przerzutowych nowotworów płuc15,16. Charakterystyka KrasG12D; Guzy płuc Lkb1-/- (KL) wyizolowane od myszy pokazują, że guzy te mają wysoką aktywację mTORC1 i są wysoce glikolityczne, wykorzystując zarówno bezpośrednie pomiary metabolitów glukozy i mleczanu, jak i mierząc zużycie [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy (18F-FDG) za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) z tomografią komputerową (CT) 17. Hiperaktywacja mTORC1 w guzach z mutacją LKB1 stanowi wyraźne uzasadnienie dla testowania zarówno allosterycznych, jak i katalitycznych inhibitorów kinazy mTOR w leczeniu tych nowotworów.

W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że allosteryczny inhibitor mTORC1 rapamycyna (RAPA) skutecznie hamuje wzrost i glikolizę w nowotworach przewodu pokarmowego (GI) przy użyciu transgenicznego mysiego modelu Lkb1+/- klasy PJS3. RAPA jest obecnie zatwierdzona jako terapia jednolekowa w leczeniu raka nerkowokomórkowego, ale wykazała ograniczoną skuteczność w NSCLC18,19,20. RAPA jest allosterycznym inhibitorem mTORC1 i może zostać ulepszony poprzez opracowanie inhibitorów kinaz katalitycznych nowej generacji, które zapewniają prawie całkowite hamowanie kompleksów mTOR 1 i 2 (odpowiednio mTORC1 i mTORC2)21. Leki takie jak MLN0128 są obecnie oceniane w badaniach przedklinicznych i badaniach klinicznych wczesnej fazy22,23. Niedawne badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało, że MLN0128 jest silnym inhibitorem mTOR w ludzkich liniach komórkowych raka płuc oraz in vivo w KL GEMM raka płuc15,16. MLN0128 hamowały wzrost guza płuc i metabolizm glukozy u tych myszy24.

W tym badaniu korzystamy z dobrze scharakteryzowanych, indukowanych przez adenowirusowe mysie modele raka płuc wywołanego przez Cre, zainicjowanego przez warunkowo aktywowany onkogen Lox-Stop-Lox-KRASG12D15,25. Te myszy KrasG12D skrzyżowano z myszami z floksowanymi allelami Lkb1 (Lkb1L / L) w celu wytworzenia KrasG12D; Lkb1L/L (KL) myszy16. Po donosowym podaniu adeno- lub lentiwirusa z ekspresją rekombinazy Cre, myszy KL rozwijają wczesne zmiany w ciągu 4 tygodni po indukcji guza. Po 6 tygodniach guzy u myszy KL zmieniają się z guzów gruczolakowatych na bardziej złośliwy, agresywny fenotyp guza typowy dla raka płuc, a po 8 - 10 tygodniach u myszy rozwijają się raki szczere ze 100% penetracją16,26.

Zarówno obrazowanie PET/CT, jak i immunohistochemia ilościowa mogą być wykorzystane do określenia odpowiedzi molekularnych i metabolicznych, jak również odpowiedzi terapeutycznych w nowotworach po dostarczeniu terapii celowanych, takich jak MLN012817,26,27. Opisano tutaj protokół eksperymentalny, który wykorzystuje obrazowanie 18F-FDG PET do pomiaru odpowiedzi metabolicznej na terapię ukierunkowaną na MLN0128. Sprzężenie obrazowania PET z ilościową histologią umożliwia pomiar odpowiedzi molekularnej na hamowanie mTOR, a także ilościowe określenie obciążenia guza i histologii guza.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w protokole zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

1. 18Obrazowanie F-FDG PET i CT u myszy

UWAGA: Używaj sprzętu ochronnego podczas pracy z radioaktywnością. Podczas obchodzenia się z promieniotwórczością należy przestrzegać wszystkich obowiązujących procedur regulacyjnych.

  1. Umieść klatkę z myszami, które mają być zobrazowane, na ciepłym łóżku w temperaturze 37 °C na 1 godzinę przed wstrzyknięciem 18F-FDG, aby zmniejszyć spożycie brązowego tłuszczu przez 18F-FDG.
    UWAGA: Post myszy przez 4 - 16 godzin może pomóc zmniejszyć zużycie 18F-FDG w mięśniu sercowym.
  2. Zważ mysz i zapisz jej wagę.
  3. Znieczulić mysz za pomocą 2 - 3% izofluranu w tlenie w ilości 0,5 - 2 l/min przez 2 - 3 minuty za pomocą komory anestezjologicznej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że mysz została znieczulona przez uszczypnięcie palca u nogi; nie zaobserwuje się żadnej reakcji, jeśli mysz została znieczulona. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  4. Rozcieńczyć 18F-FDG (109 min radioaktywny okres półtrwania) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przy skorygowanym o rozpad stężeniu iniekcji wynoszącym 70 - 75 μCi/100 μL.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z zalecaną przez producenta skanera PET dawką 18F, aby uzyskać optymalne obrazowanie skanera.
  5. Pobrać 70 - 75 μCi za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 28 G, zmierzyć dawkę radioaktywności za pomocą kalibratora dawki, a następnie zapisać pomiar i czas. Umieścić strzykawkę w ołowianym uchwycie na strzykawkę.
    UWAGA: Ilość radioaktywności 18F-FDG w każdej dawce jest mierzona za pomocą kalibratora dawki, który jest kalibrowany względem standardowego materiału odniesienia, takiego jak cez-137, zgodnie z protokołami producenta. Czas odczytu jest również rejestrowany w celu określenia korekcji zaniku.
  6. Nakłuj dystalny koniec ogona myszy i zmierz poziom glukozy we krwi myszy za pomocą glukometru.
  7. Ogrzewaj ogon przez 1 - 2 minuty gazą nasączoną ciepłą wodą. Przetrzyj ogon 70% izopropanolem, aby rozszerzyć żyłę ogonową tuż przed wstrzyknięciem. Podać 100 μl 18F-FDG (cała objętość w strzykawce) z wstrzyknięciem bolusa przez żyłę ogonową boczną i zanotować czas wstrzyknięcia. Odmierzyć pozostałą dawkę w strzykawce za pomocą kalibratora dawki i zapisać pomiar oraz czas.
    UWAGA: W strzykawce pozostanie pewna ilość sondy. Stosowanie strzykawek insulinowych jest preferowane w stosunku do strzykawek połączonych z igłami za pomocą zamków Luer ze względu na zmniejszoną ilość dawki uwięzionej w strzykawce/igle po wstrzyknięciu.
  8. Umieść mysz, której wstrzyknięto iniekcję, w komorze anestezjologicznej utrzymywanej w temperaturze 1,5 - 2% izofluranu w temperaturze 37 °C, aby umożliwić rozprowadzenie sondy przez krążenie ogólnoustrojowe myszy przez 1 godzinę przed skanowaniem PET.
    UWAGA: Korzystne może być opróżnienie pęcherza moczowego przed skanowaniem, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację 18F-FDG PET guzów wszczepionych w dolne boki myszy.
  9. Po 1 godzinie umieścić mysz w komorze obrazowania w znieczuleniu izofluranem stożkowym na nos i w temperaturze 37 °C, a następnie zabezpieczyć jej kończyny taśmą medyczną w pozycji leżącej.
  10. Umieść komorę obrazowania w skanerze PET/CT.
  11. Wykonaj skany PET i CT zgodnie z opisem w instrukcji skanera PET/CT class28.
    UWAGA: Obrazy PET są pozyskiwane przez 600 s z oknem energetycznym 150 - 650 keV, zrekonstruowane przy użyciu maksymalizacji oczekiwań maksymalnego prawdopodobieństwa z poprawkami na tłumienie fotonów, normalizację detektora i rozpad izotopów promieniotwórczych (poprawka rozproszenia nie została zastosowana). Obrazy TK są pozyskiwane w trybie ciągłym przez 50 s przy użyciu źródła promieniowania rentgenowskiego 50 kVp, 200 μA i detektora płaskiego, a następnie rekonstruowane są za pomocą algorytmu Feldkampa.
  12. Po zakończeniu badania PET/CT wyjmij mysz z komory obrazowania i pozwól jej dojść do siebie w klatce. Monitoruj mysz, aż w pełni odzyska przytomność i będzie w stanie utrzymać leżący mostek.
  13. Zaimportuj zrekonstruowane obrazy PET/CT do oprogramowania AMIDE, klikając Plik, a następnie Otwórz i wybierając odpowiedni plik.
  14. Przelicz dane PET na jednostkę procentowej wstrzykniętej dawki na gram (%ID/g), wprowadzając dawkę w momencie wstrzyknięcia po uwzględnieniu pozostałej dawki w strzykawce, lub na jednostkę znormalizowanej wartości wychwytu (SUV), dodatkowo wprowadzając masę ciała pacjenta. Aby to zrobić, kliknij prawym przyciskiem myszy na zestaw danych PET i znajdź pole %ID/g na karcie Informacje podstawowe. Wprowadź zarejestrowany wcześniej %ID/g.
  15. Narysuj obszary zainteresowania (ROI) na guzach i normalnych tkankach (wątroba, mięśnie, płuca, serce, mózg i podskórna tkanka tłuszczowa). Aby to zrobić, kliknij Edytuj, wybierz Dodaj ROI, wybierz kształt ROI i nadaj nazwę ROI. Narysuj ROI nad guzami i tkankami i dostosuj ich wymiary, aby pokryć tkankę będącą przedmiotem zainteresowania we wszystkich 3 osiach.
    UWAGA: Aby uwzględnić różnice w biodystrybucji sondy PET między zwierzętami, wartości ROI guza można dodatkowo znormalizować do wartości ROI wątroby, dobrze ukrwionego narządu o minimalnej aktywności glikolitycznej reprezentującej 18F-FDG w krążeniu. Analizy ROI guza i normalnych tkanek są wykonywane na tej samej myszy. Zmiany nowotworowe płuc są na ogół identyfikowane przez 18F-FDG PET, ponieważ retencja 18F-FDG w normalnym płucu jest stosunkowo niska. Tomografia komputerowa służy również do identyfikacji zmian chorobowych, w szczególności zmian, które są 18F-FDG nieawidne. Analiza ex vivo izolowanych płuc pomaga również w lokalizacji zmian nowotworowych.

2. 18F-FDG Autoradiografia

  1. Przygotuj mysz do obrazowania za pomocą 18F-FDG, wykonując kroki 1.1 - 1.12, z wyjątkiem teraz, rozcieńczyć 18F-FDG w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o skorygowanym stężeniu wtrysku 1,000 μCi/200 μL.
    UWAGA: Wyższe dawki 18F-FDG są stosowane w autoradiografii, aby uwzględnić dodatkowy czas przetwarzania próbki i optymalne wykrywanie przez płytki luminoforowe.
  2. Poddać mysz eutanazji poprzez śmiertelne wdychanie izofluranu w stężeniu 5% lub za pomocą CO2 (procedura zatwierdzona przez IACUC).
    UWAGA: Nie należy stosować zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki płucnej.
  3. Przygnij mysz tak, aby odsłonięta była powierzchnia brzuszna i spryskaj ją 70% etanolem, aby zmatowić jej włosy przed nacięciem.
  4. Otwórz klatkę piersiową, wykonując nacięcie w linii środkowej, odcinając przeponę i usuwając ściany klatki piersiowej. Odsłoń tchawicę, ostrożnie usuwając gruczoł ślinowy. Umieść zacisk buldoga na tchawicy jak najbliżej szczęki, zapewniając ścisłe dopasowanie do tchawicy. Umieść igłę 23 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 3 ml wewnątrz tchawicy poniżej zacisku buldoga i wstrzyknij ~ 2 ml roztworu OCT: PBS (1:1) (optymalna temperatura cięcia: sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
    UWAGA: OCT jest bardzo lepki i miesza się go z PBS, aby umożliwić łatwiejsze wstrzyknięcie do płuc.
  5. Wyjąć igłę z tchawicy i za pomocą kleszczyków zacisnąć się na miejscu wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi roztworu OCT:PBS.
  6. Ostrożnie wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej i oddziel lewy płat od reszty płuc. Umieść lewy płat w oznaczonym kriofordzie wypełnionym kilkoma kroplami OCT. Gdy płat płuc znajdzie się w formie, napełnij krioformer do góry OCT.
  7. Powtórz tę samą procedurę z prawą połową płuc.
    UWAGA: Jeśli oczekuje się, że sygnał 18F-FDG w sercu będzie wysoki lub jeśli guzy płuc znajdują się blisko serca, korzystne może być usunięcie serca, aby zapobiec wyciekowi znacznika. Alternatywnie, całe płuca mogą być osadzone w jednej krioformie. Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza podczas pracy z OCT.
  8. Za pomocą długich kleszczy umieść przygotowany kriomold w pojemniku z ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach, zawierającym mieszaninę suchego lodu i izopentanu.
    UWAGA: Ta mieszanina powinna mieć temperaturę około -70 °C przed umieszczeniem w niej kriomoldu w celu zamrożenia. Po stwardnieniu związek OCT stanie się biały. Jeśli w tym samym czasie przetwarzanych jest wiele próbek, zamrożone próbki w krioformach OCT mogą być tymczasowo przechowywane na suchym lodzie.
  9. Wyjmij zamrożony blok z kriomoldu i zamontuj go na kriosacie w celu przekrojenia. Ciąć blok na grubość 4 μm za pomocą ostrzy mikrotomowych (34°/80 mm, wysoki profil). Przenieś skrawki tkanki na szkiełko podstawowe, które było przechowywane w temperaturze pokojowej.
  10. Umieść szkiełka z próbką na płytce obrazowej z luminoforem. Umieść płytkę w kasecie i delikatnie ją zamknij, aby zapobiec przesuwaniu się prowadnic. Kasetę należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu naświetlania płyty, zwykle przez noc.
    UWAGA: Płyty i kasety muszą być wstępnie schłodzone do temperatury -20 °C przed użyciem. Dopuszczalne jest również umieszczanie próbek w temperaturze -80 °C.
  11. Po naświetleniu wyjmij szkiełka z płyty i odczytaj płytkę na czytniku obrazu.
  12. Szkiełka mogą być zawijane w folię i przechowywane w temperaturze -80 °C lub mogą być przygotowane do barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemii.

3. Pobieranie tkanki płucnej do badań histologicznych

  1. Wykonaj kroki 2.2 - 2.4, z wyjątkiem tego, że teraz, zamiast używać roztworu OCT:PBS, wstrzyknij 2-3 ml 10% normalnej buforowanej formaliny, aby naprawić płuca.
  2. Wyjąć igłę z tchawicy i za pomocą kleszczy zacisnąć się na miejscu wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi formaliny. Ostrożnie wyjmij płuca z klatki piersiowej i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej ~20 ml 10% normalnej buforowanej formaliny na 16 - 24 godziny, aby zapewnić całkowite utrwalenie.
    UWAGA: Unieruchomienie płuc pozwala na zachowanie optymalnych cech anatomicznych.
  3. Następnego dnia przenieś unieruchomione płuca z formaliny do 70% etanolu i przygotuj płuca do umieszczenia w kasecie na tkanki.
  4. Przygotuj płuca do badania histologicznego, ostrożnie preparując płaty za pomocą nożyczek, aby przeciąć punkty rozgałęzień między 5 płatami, ponumerowanymi od 1 do 5, jak pokazano na Rysunek 1D, i umieść je w orientacji niezachodzącej na siebie w kasecie tkankowej. Delikatnie umieść podkładkę piankową na tkance płucnej, aby zachować nienaruszoną orientację.
  5. Przechowuj wypreparowane płaty płuc w 70% etanolu do momentu osadzenia się parafiny.
  6. Parafina zatapia tkankę w kasetach i wycina odcinki o grubości 4 μm do barwienia, stosując standardowe procedury.

4. Segmentacja tkanek i kwantyfikacja za pomocą komercyjnego oprogramowania

  1. Obrazowanie wycinków płuc barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) w powiększeniu 1,25x przy użyciu komercyjnego systemu obrazowania wielospektralnego.
  2. Przekonwertuj obrazy na cyfrowe kostki obrazu i załaduj (kliknij na Plik, a następnie na Załaduj bibliotekę spektralną) gotowe biblioteki spektralne dla H&E.
    UWAGA: Biblioteki spektralne zostały opracowane z wyprzedzeniem poprzez uzyskanie obrazów spektralnych z pojedynczo barwionych odcinków płuc, z których jedna była barwiona tylko eozyną, a druga tylko hematoksyliną, które zostały zapisane w zastrzeżonym pliku biblioteki spektralnej o otwartym kodzie źródłowym (.csl). System obrazowania jest wyposażony w oprogramowanie operacyjne, które rejestruje obraz na każdej potrzebnej długości fali (zgodnie z definicją w protokole akwizycji). Obrazy te ("kostka obrazu") są przechowywane w zastrzeżonym formacie pliku wielospektralnego o otwartym kodzie źródłowym (.im3). Widma są wyodrębniane z kostki obrazu za pomocą oprogramowania morfometrycznego i przechowywane w oddzielnych plikach biblioteki spektralnej.
  3. Spektralnie rozmieszaj pseudo-kolorowe obrazy H&E całych płuc, klikając przycisk Unmix.
    UWAGA: Rozmieszanie zajmuje mniej niż 1 s. Liczbę pikseli w każdym typie tkanki określono ilościowo za pomocą oprogramowania do morfometrycznej analizy obrazu.
  4. Wizualizuj każdą kostkę obrazu, przekształcając dane wielospektralne na równoważny obraz 3-kolorowy (czerwony, zielony, niebieski), wykorzystując reakcję koloru zależną od długości fali oka, zwiniętą z intensywnością każdego obrazu.
    UWAGA: Wynikowe 3 obrazy są wyświetlane jako standardowy 24-bitowy obraz kolorowy.
  5. Pseudo-pokoloruj każdy niezmieszany obraz, skalując go do wybranego przez użytkownika koloru (np. czerwonego, zielonego, fioletowego itp.) i dodaj go razem z innymi pseudo-kolorowymi niezmieszanymi obrazami w jeden standardowy 24-bitowy kolorowy obraz.
  6. Użyj ustawień domyślnych dla wszystkich analiz.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ponieważ ten rodzaj segmentacji opiera się na wizualnej ocenie wyników (tj. ocenie tego, jak dobrze działa segmentacja na obrazach poza zbiorem treningowym), ważne jest, aby odpowiednio podzielić obrazy na zestawy treningowe, testowe i walidacyjne.
  7. Zacznij od 2-3 obrazów jako zestawu treningowego (10-15 dla próbek z biopsji człowieka), trenuj na nich, aż wyniki będą wyglądać dobrze, a następnie zastosuj ten algorytm do kolejnych 2-3 obrazów. Następnie zastosuj wynikowy algorytm do pełnego zestawu walidacji.
    UWAGA: Najprawdopodobniej konieczne będzie przekwalifikowanie.
  8. Przeanalizuj obszar guza w całych odcinkach płuc, obliczając całkowitą liczbę pikseli dla czerwonych pseudokolorowych guzów w płatach 1 - 5 każdej myszy.
    UWAGA: Normalna tkanka była pseudo-zabarwiona na zielono, a krew/naczynia krwionośne były pseudo-zabarwione na różowo, jak pokazano na Rysunek 3. Średnie obciążenie guzem dla każdej grupy leczonej obliczono, mierząc całkowitą liczbę pikseli dla każdej myszy w grupie leczonej.

Wyniki

Obrazowanie PET z użyciem 18F-FDG wykonano u myszy KL, co wykazało, że guzy u tych zwierząt charakteryzowały się wysoką glikolizą, o czym świadczyło zwiększone zużycie 18F-FDG (Rycina 1A), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami26,29. Resekcja całych płuc ujawniła obecność kilku guzów (Rycina 1B). Płuca myszy można podzielić na 5 osobnych płatów, przedstawionych na Rycinnach 1C i 1D. Płaty 1–5 oznaczono na przekrojach płuc barwionych H&E lub przeciwciałem przeciwko transporterowi glukozy 1 (Glut1) (Rycina 1D). Glut1 jest głównym transporterem zarówno glukozy, jak i 18F-FDG, a jego ekspresja i lokalizacja w błonie plazmatycznej komórek nowotworowych bezpośrednio korelują z SUV dla 18F-FDG29. Analiza barwienia Glut1 o wyższej rozdzielczości (40X) w guzach płuc wykazujących powinowactwo do 18F-FDG pokazuje zwiększoną ekspresję i lokalizację transportera w błonie plazmatycznej (Rycina 1D).

Ze względu na ograniczoną rozdzielczość obrazowania PET, przeprowadzono zarówno badanie PET/CT, jak i autoradiografię tkanek. Wyższa rozdzielczość autoradiografii może pozwolić na zidentyfikowanie mniejszych guzów i/lub heterogeniczności rozkładu 18F-FDG w guzie. Po indukcji guza u myszy KL wykonano obrazowanie 18F-FDG PET/CT (Rycina 2A>), a następnie przeprowadzono autoradiografię płuc wyizolowanych od tych myszy (Ryciny 2B i 2C). Jak widać na Rycynach 2B i 2C, w autoradiografii zidentyfikowano dwa dodatkowe mniejsze guzy, które były dodatnie pod kątem 18F-FDG, lecz nie były wyraźnie widoczne w badaniu PET. Po autoradiografii preparaty z tkanką można było wykorzystać do barwienia immunohistochemicznego (IHC) w celu wykrycia biomarkerów. Barwienie H&E guzów potwierdziło obecność zmian nowotworowych w lewym płacie (Rycina 2D).

Następnie wykonano obrazowanie PET z użyciem 18F-FDG u myszy KrasG12D;Lkb1-/- leczonych MLN0128, aby wykorzystać 18F-FDG jako funkcjonalny biomarker metabolizmu glukozy w guzach płuc (Rycina 3). Stwierdzono, że leczenie MLN0128 silnie hamowało sygnalizację mTORC1 oraz glikolizę, co objawiało się zmniejszonym zużyciem 18F-FDG (Ryciny 3A i 3B). Wyniki te są zgodne z badaniami przedklinicznymi oceniającymi MLN0128 u myszy KL, opublikowanymi wcześniej przez nasz zespół17,27. Na koniec wykonano barwienie IHC guza (Rycina 3C). Guzy barwiono metodą H&E lub przeciwciałami przeciwko fosfo-S6, który jest konserwowanym substratem mTORC1 i służy do wykazania aktywacji (P-S6) vs. inaktywacji (S6) mTORC1. Rycina 3C pokazuje silne hamowanie P-S6 przez MLN0128 w guzach KL w porównaniu do grupy leczonej placebo, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi pracami17. Oprócz KRAS, inne onkogenne sterowniki, takie jak receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), również wspomagają metabolizm glikolityczny w guzach płuc. Dlatego sprawdzono, czy hamowanie konstytutywnie aktywnego zmutowanego EGFR za pomocą erlotynibu tłumi metabolizm 18F-FDG w ksenoprzeszczepach mysich. Ryciny 3D i 3E pokazują, że ludzka linia komórkowa guza płuca HCC827, posiadająca mutację EGFR del19, wykazała znacząco zmniejszone zużycie 18F-FDG po pięciu dniach leczenia erlotynibem.

Na koniec przeprowadzono morfometryczną analizę tkanek w przekrojach płuc i guzów płuc w celu określenia całkowitego obciążenia nowotworowego oraz rozróżnienia patologii guza, obejmującej podtyp tkanki, martwicę, naczynia krwionośne w odniesieniu do prawidłowej tkanki płucnej oraz przestrzenie powietrzne. W modelach GEMM KL rozwinęła się złożona i patologicznie heterogenna choroba, objawiająca się guzami płuc o zróżnicowanej histopatologii. Obejmują one gruczolaki (ADC) oraz raka płaskonabłonkowego (SCC) – ta heterogenność sprawia, że leczenie tego nowotworu stanowi ogromne wyzwanie. Rycina 4A przedstawia pojedynczy płat płuca barwiony H&E z dwoma dużymi guzami. Obrazy przy większym powiększeniu przedstawione na Rycynie 4B identyfikują prawidłową tkankę płucną, naczynia, przestrzenie powietrzne oraz martwicę guza, a także gruczolaka, charakteryzującego się dobrze zdefiniowaną strukturą brodawkowatą, oraz raka płaskonabłonkowego. Rycina 4C przedstawia pseudokolorowanie płata płuca i guza z wykorzystaniem oprogramowania morfometrycznego Inform. Rycina 4D pokazuje procentowy udział prawidłowej tkanki płucnej, naczyń oraz poszczególnych patologii, takich jak martwica guza i podtypy nowotworowe, co pozwoliło na odseparowanie dobrze zróżnicowanego gruczolaka od raka płaskonabłonkowego.

Analiza PET/CT oraz H&E, analiza Glut1 płatów; skany poprzeczne, strzałkowe i czołowe; wyniki histologiczne.
Rysunek 1Aktywne metabolicznie KrasG12D; Lkb1-/- mutanty guzy płuc (KL) są 18wykazują dodatni wynik w badaniu F-FDG i wysoką ekspresję transportera glukozy 1 (Glut1). Panele A i B wyświetl obraz maksymalnej intensywności projekcji [zwany również obrazem trójwymiarowym (3D)] 18Analiza F-FDG-PET i CT u wybranych myszy KL z guzkami płuc o wysokim powinowactwie do FDG i typie płaskonabłonkowym. Przedstawiono (A) rekonstrukcję 3D oraz (Bprzekroje poprzeczny, strzałkowy i czołowy guza/guzów płuca oznaczone jako (T).C) Na tym panelu przedstawiono histologię całego płuca myszy KL obrazowaną na panelach A i B, albo barwione pod kątem H&E (panel górny) lub z przeciwciałem specyficznym dla Glut1 (panel dolny). Płaty płuc są ponumerowane. Pasek skali = 2 mm. (D) Ten schemat przedstawia orientację i liczbę płatów u myszy (panel górny) oraz obrazy o wyższej rozdzielczości (powiększenie 40X) H&Guzy barwione na E- lub Glut1 z preparatów przedstawionych na panelu C dla H&E (panel środkowy) lub barwione przeciwciałem specyficznym dla Glut1 (panel dolny). Pasek skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat badania PET/CT i autoradiografii; aktywność metaboliczna; analiza lewego płata; badanie H&E.
Rysunek 2: 18Autoradiografia z użyciem F-FDG pozwala na zidentyfikowanie małych guzów wykazujących aktywność metaboliczną. (A) To 18Obraz PET/CT z użyciem F-FDG wykazuje 18Guzy wykazujące wysoką akumulację F-FDG u myszy KL, przedstawione na obrazie z maksymalną projekcją intensywności. T1 i T2 = guzy, H = serce, B = pęcherz moczowy, K = nerki. (B) Ten panel przedstawia ex vivo autoradiografia seryjnych przekrojów prawego i lewego płata płuc myszy. Płuca na panelach lewym i prawym są identyczne. Płuca na panelach lewych są przedstawione w pomarańczowej pseudokolorystyce. Płuca na panelach prawych są przedstawione w czerni i bieli. Guzy (T1, T2 i T3) wskazano strzałkami.C) Jest to powiększony widok autoradiografii w pseudokolorach pomarańczowych (panel górny) oraz w czerni i bieli (panel dolny). (D) Ten panel przedstawia H&Barwienie E górnego przekroju lewego płata pokazanego na panelu BPasek skali = 200 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wpływu leczenia nowotworów: wykresy SUVmax, obrazowanie molekularne, analiza histologiczna, skuteczność leku.
Rysunek 3Inhibitor mTOR MLN0128 hamuje zużycie glukozy w guzach płuc myszy KL, co wykazano za pomocą 18PET z użyciem F-FDG. (A) Na tym panelu przedstawiono reprezentatywne 18Obrazy F-FDG PET/CT myszy KL leczonych nośnikiem (18wykazujące powinowactwo do F-FDG, lewa) lub MLN0128 (18brak wychwytu F-FDG, prawa strona). Przedstawiono przekroje poprzeczny (górny panel), czołowy (środkowy panel) i strzałkowy (dolny panel). Guzy obrysowano czerwonymi liniami; H = serce, L = wątroba. (B) Ten panel przedstawia ilościowe zestawienie wartości SUVmax (%ID/g) pomiędzy guzami w grupie kontrolnej (vehicle) a guzami traktowanymi związkiem MLN0128. (C) Ten panel przedstawia H&Barwienie E i P-S6 w przekrojach całych płuc myszy KL leczonych placebo lub MLN0128. Pasek skali = 25 µm. (D) Ten panel przedstawia reprezentatywne 18Obrazy F-FDG-PET i CT ksenoprzeszczepów HCC827 EGFR (del19) przed i po leczeniu erlotynibem. Guz (T) wskazano strzałką, K = nerka, B = mózg. (E) Ten panel przedstawia ilościowe oznaczenie SUVmax (%ID/g) dla ksenoprzeszczepów HCC827 przed i po leczeniu erlotynibem. n = 10 guzów/grupa. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Analiza tkanki płucnej; schemat histologiczny, różnicowanie raka płaskonabłonkowego i gruczołowego; dane pikselowe.
Rycina 4Obciążenie nowotworowe oraz histologia guza są ilościowo określane przy użyciu oprogramowania morfometrycznego.
(A) Ten panel przedstawia H&Barwienie pojedynczego płata płuca myszy z guzem pobranym od myszy KL.BTe obrazy o wyższej rozdzielczości przedstawiają raka плоскоepithelialnego (górny lewy róg), prawidłową tkankę płuca, naczynia i przestrzenie powietrzne (górny prawy róg) oraz dobrze zróżnicowanego brodawkowatego gruczolakoraka (dolny lewy róg) i martwicę (dolny prawy róg).C) Ten panel przedstawia pseudokolorowanie H&Przymierze płuca barwione hematoksyliną i eozyną z wykorzystaniem oprogramowania morfometrycznego.D) Ten panel przedstawia wartości procentowe dla poszczególnych płatów płuc oraz patologii nowotworowych zmierzonych przez program Inform. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W artykule tym opisano eksperymentalne podejście oparte na obrazowaniu, w którym wykorzystano obrazowanie 18F-FDG PET/CT z qIHC w celu zmierzenia zarówno odpowiedzi metabolicznej, jak i molekularnej w nowotworach płuc po podaniu inhibitora mTOR MLN0128. MLN0128 skutecznie zmniejszył zużycie 18F-FDG, co wskazuje na znaczącą odpowiedź metaboliczną w guzach. Łącząc obrazowanie PET/CT z immunohistochemią, byliśmy w stanie przestrzennie zarejestrować wycięte guzy z obrazami 3D PET/CT i przeprowadzić szczegółowe badanie całych guzów na poziomie komórkowym i molekularnym. Umożliwiło to potwierdzenie, że MLN0128 hamuje sygnalizację mTOR, potwierdzając w ten sposób docelową odpowiedź molekularną na lek w guzach. Wreszcie, wykorzystując histologię ilościową, byliśmy w stanie zmapować i oddzielić odrębne patologie guza, takie jak ogólna masa guza z martwicy guza, zdefiniować gruczolakoraka od raka płaskonabłonkowego i obrazować mikroPET za pomocą uzupełnienia.

MicroPET jest obecnie ograniczony rozdzielczością przestrzenną wynoszącą około 1 mm. Ponadto na retencję 18F-FDG w niektórych tkankach mogą wpływać różne czynniki, w tym poziom glukozy w osoczu, rodzaj i czas trwania ekspozycji na środek znieczulający, temperatura otoczenia i ogólny stan zdrowia zwierzęcia, co może mieć wpływ na farmakokinetykę 18F-FDG30. Parametry te zostały zoptymalizowane dla tego protokołu, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego modelu zwierzęcego. Badania odtwarzalności obrazowania 18F-FDG guzów podskórnych u myszy wykazują współczynnik zmienności dla średniego %ID/g wynoszący około 15%, co sugeruje, że odpowiedź terapeutyczna guza pojedynczej myszy ocenianej za pomocą 18F-FDG PET powinna być większa niż ten próg, aby można ją było uznać za wiarygodną i znaczącą31.

Komórkową i równomierną subkomórkową dystrybucję znaczników PET można ocenić za pomocą autoradiografii tkankowej, w której skrawki są następnie barwione i współrejestrowane z qIHC. Jednoczesna rejestracja PET z tomografią komputerową pozwala na umieszczenie obrazu PET w kontekście anatomicznym; Jest to niezwykle cenne, nawet przy niskim kontraście tkanek miękkich. Brak kontrastu tkanek miękkich w tomografii komputerowej można przezwyciężyć za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). Ponadto biomarkery do obrazowania fluorescencyjnego mogą być wykorzystywane do oceny glikolizy in vivo, ale absorpcja i rozpraszanie fotonów w jamie płuc może wpływać na dokładną ocenę ilościową lub czułość wykrywania32. Podsumowując, wykorzystanie obrazowania PET/CT całego zwierzęcia z ilościową histologią zapewnia dokładną mapę biologii guza w czasie rzeczywistym po interwencji terapeutycznej.

Obrazowanie wielospektralne (MSI) ma zastosowanie w każdej sytuacji, w której można użyć kolorowego obrazu. Przynajmniej MSI dostarcza tych samych informacji, co obraz kolorowy, a w przypadku niektórych zastosowań MSI może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji o właściwościach widmowych próbki niż prosty szerokopasmowy obraz trójkolorowy (RGB). Ogólnie rzecz biorąc, ograniczenia MSI dotyczą obrazowania kolorowego, z wyjątkiem tego, że MSI jest wolniejszy i zajmuje więcej czasu na uzyskanie obrazów. Oprogramowanie morfometryczne zostało wykorzystane do uzyskania powtarzalnych, dokładnych wyników segmentacji obrazów i jest opisane w Tabeli Materiałów. Istnieją dodatkowe dostępne na rynku produkty, które można wykorzystać do segmentacji tkanek i ilościowego oznaczania histologii.

Złożoność metabolizmu nowotworów wykracza poza efekt Warburga i metabolizm glukozy33,34. Jest wysoce prawdopodobne, że nowotwory łatwo przystosują się do leczenia pojedynczym środkiem, które hamuje glikolizę. Zależność od metabolizmu aminokwasów została dobrze udokumentowana w raku i oczekuje się, że nowotwory opierają się na wielu aminokwasach, takich jak glutamina, glicyna i seryna, a także inne metabolity, takie jak wolne kwasy tłuszczowe 35,36,37. Oprócz 18F-FDG, sondy, takie jak 18F i 11znakowanych C glutaminy, choliny, octanu, 1-(2'-Deoksy-2'-fluoroarabinofuranozylo)cytozyny (FAC) i fluorotymidyny (FLT) zostały z powodzeniem wykorzystane do obrazowania metabolizmu aminokwasów, nukleotydów i lipidów w zwierzęcych modelach raka 38,39,40,41. Automatyzacja i technologie radiochemii znacznikowej w mikroskali w połączeniu ze skanerami PET o wyższej rozdzielczości i czułości poprawią dostępność PET do pomiaru różnych procedur biologicznych42,43. Wraz ze wzrostem wiedzy na temat metabolizmu logiczne jest, że repertuar radioznaczników PET również się zwiększy, umożliwiając naukowcom i lekarzom nieinwazyjne profilowanie metabolizmu guza.

Wykorzystanie obrazowania PET/CT i histologii ilościowej jest odpowiedzią na potrzebę kliniczną, jaką jest szybkie przełożenie odkryć laboratoryjnych na zastosowanie kliniczne. Aby to osiągnąć, naukowcy muszą być w stanie dokładnie zmierzyć odpowiedź terapeutyczną, a także nabytą oporność na leki, co umożliwia obrazowanie PET/CT. Co więcej, PET/CT i analiza immunohistochemiczna nowotworów płuc są stosowane jako standard opieki nad pacjentami, a tym samym można je bezpośrednio przełożyć na praktykę kliniczną. Co ważne, obrazowanie PET/CT pozwala na łatwą identyfikację nowotworów opornych na terapię, które naukowcy mogą izolować i badać na poziomie molekularnym, aby lepiej zrozumieć mechanizmy choroby. Jest to proces iteracyjny, który umożliwił lepsze zrozumienie mechanizmów oporności i zaprojektowanie skuteczniejszych strategii terapeutycznych w translacji klinicznej.

Oświadczenia

Kevin P. Francis jest pracownikiem firmy Perkin Elmer. James Mansfield jest publicznym akcjonariuszem akcji PerkinElmer, Inc (PKI) na NASDAQ. Autorzy nie mają nic więcej do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Centrum Technologii Obrazowania Przedklinicznego Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles za pomoc w obrazowaniu PET/CT myszy, Laboratorium Patologii Translacyjnej i Podstawy Statystyki w Szkole Medycznej Davida Geffena Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles za pomoc w przygotowaniu i analizie próbki guza. Jeśli chodzi o finansowanie, David B. Shackelford otrzymał wsparcie od CTSI i KL2 Translational Science Award o numerach KL2TR000122 i UL1TR000124 w David Geffen School of Medicine na UCLA oraz przez Departament Obrony Lung Cancer Research Program Translational Research Partnership W81XWH-13-1-0459 i ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey był wspierany przez grant szkoleniowy NIH T32 HL072752 za pośrednictwem David Geffen School of Medicine na UCLA. Anthony Jones jest wspierany przez UCLA Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady jest wspierany przez NIH/NCI Diversity Supplement R01CA208642.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
G8 PET/CTPerkin ElmerCLS139564Używany do obrazowania 18F-FDG PET i CT myszy
Axio Imager.M2Zeiss490020-0003-000Pozyskiwanie obrazów wycinków guza płuc FFPE
Oprogramowanie InformPerkin ElmerCLS135781Morphometric służy do analizy obrazowej patologii nowotworowych
Przeciwciało Glut1Alpha DiagnosticsGT12-ABarwienie IHC skrawków guza płuca FFPE
Białko rybosomalne Phospho-S6 (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Technologiesygnalizacji komórkowej4858Barwienie IHC odcinków guza płuc FFPE
Ostrza mikrotomu MX35 Premier Ostrza mikrotomowe Thermo Fisher Scientific3051835do cięcia tkanek do autoradiografii
mAb królika

Bibliografia

  1. Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
  2. Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
  3. Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
  4. Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
  5. Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
  6. Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
  7. Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
  8. Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
  9. Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
  10. Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
  11. Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
  12. Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
  13. Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
  14. Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16(2013).
  15. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  16. Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
  17. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  18. Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
  19. Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
  20. Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
  21. Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
  22. Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
  23. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
  24. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  25. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  26. Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
  27. Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
  28. Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
  29. Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503(2017).
  30. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  31. Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
  32. Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
  33. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  34. Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
  35. Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
  36. Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
  37. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
  38. Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
  39. Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
  40. Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217(2015).
  41. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  42. Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
  43. Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar metabolizmu glukozymodele raka p uc u myszyko mutacje KRAS LKB1inhibitor mTOR MLN0128autoradiografia ex vivoilo ciowa analiza immunohistochemicznaekspresja transportera glukozy 1ocena metabolizmu guzamonitorowanie odpowiedzi terapeutycznej

Powiązane artykuły