Artykuł metodologiczny

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

25.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57174

⸱

10 czerwca 2018

 , 
1Department of Chemistry, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Streszczenie

Istnieje wiele technik, które można zastosować do charakterystyki syntetycznych homopolimerów, ale niewiele dostarcza tak użytecznych informacji do analizy grup końcowych, jak wspomagana matrycą desorpcja laserowa, czas jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS). W tym samouczku przedstawiono metody optymalizacji przygotowania próbki, akwizycji spektralnej i analizy danych polimerów syntetycznych przy użyciu MALDI-TOF MS. Krytyczne parametry podczas przygotowania próbki obejmują wybór matrycy, identyfikację odpowiedniej soli kationizacyjnej oraz dostrojenie względnych proporcji matrycy, kationu i analitu. Ważne są również parametry akwizycji, takie jak tryb (liniowy lub odbłyśnik), polaryzacja (dodatnia lub ujemna), napięcie przyspieszenia i czas opóźnienia. Biorąc pod uwagę pewną wiedzę na temat chemii zaangażowanej do syntezy polimeru i optymalizacji zarówno parametrów pozyskiwania danych, jak i warunków przygotowania próbki, widma powinny być uzyskiwane z wystarczającą rozdzielczością i dokładnością masy, aby umożliwić jednoznaczne określenie grup końcowych większości homopolimerów (masy poniżej 10 000) oprócz masy jednostki powtórzenia i ogólnego rozkładu masy cząsteczkowej. Chociaż wykazano to na ograniczonym zestawie polimerów, te ogólne techniki mają zastosowanie do znacznie szerszego zakresu polimerów syntetycznych do określania rozkładów masy, chociaż określenie grupy końcowej jest możliwe tylko dla homopolimerów o wąskiej dyspersji.

Wprowadzenie

Dzięki ulepszeniom w technikach polimeryzacji na żywo, coraz częściej dostępne są precyzyjne polimery z ilościowo funkcjonalizowanymi grupami końcowymi1. Równoczesny rozwój chemii azydkowo-alkinowej i tiolenowej umożliwił niemal ilościowe sprzężenie makrocząsteczek z innymi cząstkami, zapewniając dostęp do szeregu materiałów hybrydowych2,3,4. Potrzebne są jednak precyzyjne techniki analityczne, aby scharakteryzować zarówno materiały wyjściowe, jak i produkty tych reakcji koniugacji polimerów. Spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS) jest cenną techniką analityczną miękkiej jonizacji do charakteryzowania polimerów, ponieważ może generować jony polimerowe w pojedynczym stanie ładunku przy minimalnej fragmentacji5,6. MALDI-TOF MS ma dużą przewagę nad innymi konwencjonalnymi metodami charakteryzowania polimerów, ponieważ może zapewnić widma masowe z rozdzielczością poszczególnych n-merów w rozkładzie masy polimeru. W konsekwencji takie widma mas mogą dostarczyć precyzyjnych informacji o średniej masie cząsteczkowej, powtarzalnej masie jednostkowej i dyspersyjności masy cząsteczkowej7, co z kolei może wyjaśnić konkurencyjne mechanizmy polimeryzacji, takie jak transfer łańcuchowy8. Jednak MALDI-TOF MS jest szczególnie skuteczny w dostarczaniu informacji o grupach końcowych polimerów9,10, które mogą być używane do potwierdzania modyfikacji grupy końcowej10,11 i inne transformacje12 takie jak cyklizacje polimerów11,13. Co równie ważne, stosunkowo niewielka ilość analitu (submikrogramów) wymagana do analizy spektrometrii mas sprawia, że technika ta jest przydatna do charakteryzacji, gdy dostępne są tylko śladowe ilości materiału.

Analizę polimerów metodą MALDI-TOF MS można podzielić na cztery odrębne etapy: przygotowanie próbki, kalibrację instrumentu, akwizycję spektralną i analizę danych. Przygotowanie próbki jest najważniejszym krokiem do generowania zoptymalizowanych widm masowych MALDI-TOF i odbywa się przed wprowadzeniem próbki do urządzenia14,15. Wybór odpowiedniej matrycy o podobnych parametrach rozpuszczalności jak analit polimerowy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości widm masowych MALDI-TOF, a wytyczne dotyczące wyboru matrycy zostały przedstawione gdzie indziej14,15,16,17. W Internecie opublikowano również bazę danych polimerowych "receptur" MALDI na przygotowanie próbek18. W przypadku nowych polimerów do wyboru matrycy można podejść, najpierw rozumiejąc rozpuszczalność polimeru i wybierając matrycę o podobnych parametrach rozpuszczalności14,19. Polimery o wysokim powinowactwie do protonów mogą być protonowane przez większość matryc14 (które często zawierają grupy kwasów karboksylowych), ale dla innych polimerów wymagany jest środek kationizacyjny14. Jony alkaliczne dobrze addukują z substancjami zawierającymi tlen (np. poliestrami i polieterami), natomiast węglowodory nienasycone (np. polistyren) addukują z metalami przejściowymi, takimi jak jony srebra i miedzi14,19. Ponieważ próbki polimerów w tym eksperymencie zawierały atomy tlenu w szkielecie, jako środek kationizacyjny użyto trifluorooctanu sodu lub potasu (TFA). Po wybraniu matrycy i środków kationizacyjnych względne proporcje analitu, kationu i matrycy muszą być starannie zoptymalizowane, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu. W tej procedurze parametry przygotowania próbki zostały już zoptymalizowane, jednak empiryczna procedura optymalizacji próbki (krok 1.4.1., Rysunek 1), która systematycznie zmienia stężenia trzech składników (analitu, matrycy i kationu) jest skuteczna w szybkim określaniu ich optymalnych proporcji.

Akwizycja danych wymaga również optymalizacji wielu parametrów. Do najważniejszych parametrów należą: tryb jonów dodatnich lub ujemnych spektrometru, tryb pracy przyrządu (liniowy kontra reflektor), napięcie przyspieszenia oraz czas opóźnienia ekstrakcji. Innym sposobem na zwiększenie rozdzielczości jest wykorzystanie trybu "reflectron"20,21,22,23. Tryb reflektronowy zasadniczo podwaja tor lotu jonów do detektora, odbijając jony na końcu rurki przelotowej z powrotem w kierunku detektora w pobliżu źródła, jednocześnie ponownie skupiając jony z różnymi pędami, a tym samym zwiększając rozdzielczość, choć zmniejszając siłę sygnału. Ponadto widma o wyższej rozdzielczości można uzyskać poprzez zmniejszenie mocy lasera, co minimalizuje stosunek sygnału do szumu poprzez zmniejszenie liczby i energii zderzeń, a tym samym zmniejszenie fragmentacji i niejednorodności kinetycznych24. Dostrajając wszystkie te parametry, jony mogą być skupione w celu zminimalizowania wpływu jakiejkolwiek niejednorodności pozycji początkowej lub prędkości, która występuje podczas procesu desorpcji laserowej. Gdy parametry akwizycji są zoptymalizowane, rozdzielczość izotopową można często osiągnąć dla jonów o masach przekraczających 10 000 Da, choć zależy to również od długości rurki przelotowej i konstrukcji instrumentu. Większość związków organicznych, które zawierają co najmniej jeden heteroatom, jest podatna na kompleksowanie z kationami alkalicznymi, takimi jak lit, sód i potas. Wiele metali alkalicznych to monoizotopy lub o ograniczonych izotopach, a zatem nie rozszerzają ich dystrybucji.

Podczas gdy parametry instrumentu można dostroić w celu optymalizacji precyzji danych, dokładność danych można osiągnąć tylko dzięki odpowiedniej kalibracji11. Białka i peptydy były pierwotnie używane jako kalibranty ze względu na ich monodyspersyjność i dostępność, ale cierpią z powodu zmiennej stabilności i występowania zanieczyszczeń25. Bardziej opłacalne i stabilne alternatywy obejmują klastry nieorganiczne i polimery polidyspersyjne26,27,28,29. Niestety, te alternatywy charakteryzują się masami rozproszonymi, które komplikują przypisywanie masy, a także mniejszymi masami ogólnie, co czyni je przydatnymi tylko do kalibracji poniżej 10 000 Da. Aby zwalczyć te problemy, Grayson i wsp. 25 opracował oparty na dendrymerach, poliestrowy system kalibracji MS, który jest monodyspersyjny i może pochwalić się zarówno szeroką kompatybilnością matryc i rozpuszczalników, stabilnością trwałości (> 8 lat) i niższymi kosztami produkcji. Opierając się na mocnych stronach tego systemu, został on wybrany jako kaliber do tych eksperymentów.

Istnieją dwa główne typy kalibracji: wewnętrzna i zewnętrzna30. Podczas kalibracji zewnętrznej wzorzec o masach zbliżonych do mas analitu umieszcza się na płytce docelowej MALDI w innej pozycji próbki niż analit, aby wygenerować oddzielne widmo masowe, z którego można wygenerować plik kalibracyjny. Z drugiej strony, zwiększoną dokładność można często osiągnąć dzięki kalibracji wewnętrznej, która polega na zmieszaniu kalibru z analitem w celu uzyskania widma hybrydowego z sygnałami zarówno kalibru, jak i analitu. W procedurze opisanej poniżej została zaimplementowana kalibracja zewnętrzna. Po prawidłowym wykalibrowaniu wagi masowej można uzyskać dokładne dane dotyczące masy analitu. Aby zapewnić jak najdokładniejszą kalibrację, ważne jest, aby akwizycja danych nastąpiła wkrótce po kalibracji.

Na koniec, po uzyskaniu zoptymalizowanych, skalibrowanych zestawów danych, a dane zostały przeanalizowane w celu dostarczenia informacji strukturalnych o próbkach polimerów. Odstępy między n-merami w rozkładzie polimeru mogą zapewnić dokładny pomiar powtarzającej się masy jednostkowej. Średnią liczbową masę cząsteczkową (Mn) i inne obliczenia rozkładu masy (np. Mw (średnia wagowo masa cząsteczkowa) i Đ (dyspersyjność)) można również wyznaczyć na podstawie rozkładu sygnału w widmach masowych (krok 4.2 dla obliczeń). Być może najbardziej unikalne, w przypadku homopolimerów, sumę mas grup końcowych można potwierdzić poprzez określenie przesunięcia rozkładu polimeru w stosunku do masy samych powtarzających się jednostek. Bogate w informacje widma masowe MALDI-TOF dostarczają cennych danych charakterystycznych, które są komplementarne z bardziej tradycyjnymi technikami charakteryzacji polimerów, takimi jak chromatografia wykluczania wielkości, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera i magnetyczny rezonans jądrowy.

Protokół

Uwaga: Wszystkie reakcje przeprowadzano w dygestorium. Prosimy o przeczytanie wszystkich Kart Charakterystyki (MSDS) dla każdego użytego związku chemicznego i zastosowanie odpowiednich środków ostrożności.

1. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie roztworów zapasowych matryc
    1. Rozpuścić 20 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA) w 1 mL niestabilizowanego tetrahydrofuranu (THF) i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Rozpuścić 20 mg kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) w 1 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Przygotowanie roztworu zapasowego kationów alkalicznych
    1. Rozpuścić 2 mg trifluoroacetanu sodu (NaTFA) w 1 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Rozpuścić 2 mg trifluoroacetanu potasu (KTFA) w 1 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Przygotowanie roztworów zapasowych analitów
    1. Próbka 1: Rozpuścić 2 mg eteru 2-aminoetylowego kwasu octowego glikolu polietylenowego (Mn = 5000) w 0,5 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Próbka 2: Rozpuścić 2 mg bis(azydku) polioksyetylenu (Mn = 2000) w 0,5 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Próbka 3: Rozpuścić 2 mg poli(L-laktydu) z grupą końcową tiolową (Mn = 2500) w 0,5 mL THF i mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia.
  4. Przygotowanie mieszanin próbek do analizy
    1. Przygotować serię roztworów poprzez mieszanie matrycy, analitu i roztworu kationów, zmieniając proporcje składników w taki sposób, aby uzyskać dziewięć unikalnych mieszanin próbek. Na przykład, utrzymując stałą ilość dodanego roztworu zapasowego matrycy (np. 10 µL), należy trzykrotnie zróżnicować ilość roztworu analitu (np. 45, 15 i 5 µL), zmieniając jednocześnie trzykrotnie ilość roztworu kationów (np. 9, 3 i 1 µL). Próbki te tworzą efektywnie siatkę 3 x 3 z dwiema różnymi zmiennymi stężeń na osiach x i y (Rycina 1).
    2. W reprezentatywnym przykładzie połączyć 15 µL roztworu poli(L-laktydu), 15 µL roztworu DHB oraz 1 µL roztworu NaTFA.
    3. Nanieść pipetą 1 μL każdej mieszaniny roztworów do poszczególnych dołków na płytce docelowej MALDI (Rycina 2). Próbki należy nanosić stopniowo, małymi porcjami, aby zapobiec ich wypłynięciu z dołka, pozwalając każdej porcji odparować do suchości przed dodaniem kolejnej części próbki.
      UWAGA: W przypadku rozpuszczalników o wyższej temperaturze wrzenia konieczne może być zastosowanie pistoletu powietrznego w celu przyspieszenia odparowania rozpuszczalnika; należy jednak zachować ostrożność, aby nie przegrzać płytki z próbkami, co mogłoby spowodować jej odkształcenie.
  5. Przygotowanie próbek standardowych do kalibracji
    1. Przygotować standardy kalibracyjne zgodnie z protokołem sugerowanym przez dostawcę.
      UWAGA: W tej badaniu wybrano kalibranty dendrymerowe, które są dostępne jako czyste dendrymery lub gotowe mieszaniny z matrycą, kalibrantem i kationem w zoptymalizowanych proporcjach.

2. Optymalizacja akwizycji danych

  1. Rozpoczęcie akwizycji danych
    1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych "FlexControl".
    2. Wysuń platformę, aby umożliwić załadowanie płytki docelowej, naciskając przycisk "figure-protocol-1" przycisk
    3. Ostrożnie umieść płytkę docelową z naniesionymi próbkami kalibratora i analitytu na platformie w odpowiedniej orientacji.
    4. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby wprowadzić docelową płytkę na platformę, naciskając przycisk "figure-protocol-2" ponownie przycisk
    5. Wybierz odpowiednią metodę akwizycji danych (metodę akwizycji w trybie dodatnim), naciskając Plik | Wybierz metodę.
      UWAGA: W przypadku większości próbek polimerów, w tym naszych reprezentatywnych analitów, oczekiwana jest jonizacja poprzez kompleksowanie z kationem, w związku z czym najodpowiedniejsza jest metoda akwizycji w trybie pozytywnym. W zależności od instrumentu, dla niższych zakresów mas (500-10 000 Da) lub w przypadku potrzeby uzyskania wyższej rozdzielczości, należy wybrać plik metody w trybie reflektorycznym. Dla próbek o wyższej masie cząsteczkowej lub gdy wymagana jest wyższa czułość sygnału, a niższa rozdzielczość jest dopuszczalna, należy wybrać plik metody w trybie liniowym.
    6. Przed rozpoczęciem akwizycji danych należy upewnić się, że wybrano odpowiedni zakres mas dla zbieranych danych – idealnie zakres ten powinien obejmować połowę najniższej masy w oczekiwanym rozkładzie oraz dwukrotność najwyższej masy w oczekiwanym rozkładzie. Można to sprawdzić, klikając w Detekcja zakładka i podgląd Zakres mas.
      UWAGA: Pomaga to zapewnić, że w zestawie danych znajdą się sygnały pochodzące od fragmentów degradacji o niższej masie cząsteczkowej lub agregatów (dimerów) o wyższej masie cząsteczkowej, które mogą występować w próbce. Należy również zauważyć, że w większości widm mas MALDI-TOF często obserwuje się oligomery matrycy o wysokiej intensywności sygnału, co generuje szum o wysokiej intensywności dla mas sięgających 1 000 Da, co utrudnia analizę poniżej tej wartości. Chociaż przed uzyskaniem końcowego zestawu danych wymagana będzie kalibracja, dokładny plik kalibracyjny można uzyskać jedynie przy zastosowaniu takich samych parametrów akwizycji, jakie zostały zoptymalizowane dla konkretnego anality. W związku z tym przed kalibracją wymagana jest wstępna optymalizacja widma masowego anality, a następnie ponowna akwizycja skalibrowanego widma masowego anality.
  2. Wstępne pozyskiwanie danych
    1. W oprogramowaniu do akwizycji należy wybrać pozycję na płytce docelowej, która odpowiada żądanemu analitytowi.
    2. Rozpocznij zbieranie danych, przesuwając cel lasera wokół próbki, aby zmaksymalizować sygnał. Aby rozpocząć zbieranie danych, naciśnij Start.
      UWAGA: Po wielokrotnym pobieraniu próbek laser może doprowadzić do wyczerpania matrycy w określonym miejscu.
    3. Używając suwaka po lewej stronie okna kamery, należy dostosować moc lasera tak, aby uzyskać minimalną moc niezbędną do osiągnięcia rozdzielczości izotopowej.
      UWAGA: Podczas analizy wielu próbek w celu potwierdzenia optymalnego stosunku analitytu, kationu i matrycy, należy zastosować tę samą moc lasera dla każdej z próbek analitytu, aby określić, która z nich wykazuje najlepszy stosunek sygnału do szumu dla danych parametrów akwizycji. Dalszą optymalizację akwizycji należy kontynuować przy użyciu próbki, która wykazuje najlepszy stosunek sygnału do szumu.
  3. Optymalizacja akwizycji danych
    1. Przy powiększeniu pojedynczego piku w środkowym zakresie interesującym mas, należy zoptymalizować rozdzielczość poprzez dostosowanie różnicy napięć przyspieszających (w przypadku instrumentów wykorzystanych w niniejszym badaniu wiąże się to z regulacją "IS2" wartość), która znajduje się w Spektrometr tab.
      UWAGA: Można to zoptymalizować najszybciej, zmieniając wartość IS2 w dużych krokach i odnotowując, która wartość zapewnia najlepszą rozdzielczość (tj.., najmniejszą pełną szerokość sygnału w połowie maksimum), a następnie dalsza optymalizacja w mniejszych krokach wartości IS2. Zazwyczaj optymalna wartość IS2 jest wyższa (bliższa IS1) dla polimerów o niskiej masie i niższa dla polimerów o wysokiej masie.
    2. W razie potrzeby można zwiększyć rozdzielczość, stosując tryb reflektronowy.
      UWAGA: Tryb reflektronowy pozwala na kompensację różnic w prędkości początkowej jonów o tej samej m/z poprzez wymuszanie ruchu jonów o wyższej prędkości z tej samej m/z wartość w dłuższą drogę do detektora. To zwiększenie drogi do detektora umożliwia wolniejszym jonom o tej samej m/z wartość, aby dotarły do detektora jednocześnie, co skutecznie ogniskuje jony w celu zwiększenia rozdzielczości. Chociaż tryb reflektronowy zazwyczaj poprawia rozdzielczość sygnału, w przypadku próbek o słabej intensywności sygnału może być wymagany tryb liniowy w celu wizualizacji danych.
    3. Na koniec zoptymalizuj moc lasera, zmniejszając ją do możliwie najniższego poziomu, który nadal pozwala na uzyskanie odpowiedniego stosunku sygnału do szumu (np.., stosunek sygnału do szumu wynoszący około 10).
      UWAGA: Ponieważ wyższe moce lasera zazwyczaj obniżają rozdzielczość i mogą indukować fragmentację, widma mas o najlepszej jakości uzyskuje się przy zastosowaniu zredukowanej mocy lasera, ale większej liczby skanowań.
    4. Po zoptymalizowaniu parametrów akwizycji należy zapisać niekalibrowane widma mas, wybierając Plik a następnie Zapisz widmo do pliku jakoW przypadku kalibracji zewnętrznej, przed rozpoczęciem nowej akwizycji w celu wygenerowania skalibrowanego widma masowego analizytu, należy przeprowadzić nową akwizycję substancji kalibracyjnej przy zastosowaniu tych samych, zoptymalizowanych parametrów.

3. Kalibracja MALDI

  1. Pozyskanie kalibracyjnego widma masowego
    1. Przy użyciu parametrów akwizycji zoptymalizowanych dla analizowanego związku, pozyskaj zoptymalizowane widmo masowe próbki wzorców masowych.
      UWAGA: W idealnym przypadku zestaw kalibracyjny powinien zawierać jeden standard powyżej zakresu zainteresowania, jeden poniżej oraz co najmniej jeden w badanym zakresie. Dokładność kalibracji jest najwyższa, gdy wszystkie parametry akwizycji są identyczne dla obu próbek.
  2. Tworzenie pliku kalibracyjnego
    1. Upewnij się, że każda istniejąca kalibracja została unieważniona lub może zostać nadpisana, klikając Invalidate Calibration w zakładce Spectrometer.
    2. Używając tych samych parametrów akwizycji (np. mocy lasera, napięcia IS2), przesuń laser nad dołek z próbką zawierającą kalibrant (np. standard dendrymerowy, peptyd), wybierając odpowiedni dołek kursorem, a następnie pozyskaj widmo, klikając Start.
  3. Po pozyskaniu wystarczającego sygnału naciśnij Start, aby zakończyć zbieranie danych.
  4. Po pozyskaniu widma masowego kalibranta wybierz z menu rozwijanego Mass Control List w zakładce Calibration listę odpowiadającą temu standardowi kalibracyjnemu. Odpowiednia lista kontrolna mas będzie zawierać wybrane masy referencyjne kalibranta z odpowiednim kationem.
    UWAGA: Dane te powinny być dostępne od dostawcy kalibranta; należy pamiętać o użyciu wartości masy monoizotopowej w przypadku uzyskania rozdzielczości izotopowej (np. tryb reflektora poniżej m/z = 5000) oraz wartości masy średniej, gdy rozdzielczość izotopowa nie jest osiągalna (np. tryb liniowy powyżej m/z = 5000),
  5. Przed przypisaniem odpowiedniego piku referencyjnego do każdego wybranego piku kalibranta, upewnij się w zakładce Processing, że stosowany jest odpowiedni protokół wyznaczania pików (peak picking).
    UWAGA: Protokoły wyznaczania pików mogą różnić się w zależności od rozdzielczości widma. Dla obliczeń masy średniej oprogramowanie powinno wyznaczyć średnią masę dla całej serii pików izotopowych. Dla obliczeń masy monoizotopowej oprogramowanie powinno być ustawione tak, aby obliczać masę dokładną tylko dla pierwszego piku izotopowego.
  6. Przypisz masę referencyjną z listy kontrolnej mas do odpowiadającego sygnału w widmie masowym kalibranta, zaznaczając obszar po lewej stronie interesującego piku, a następnie klikając odpowiednią masę na liście kontrolnej. Powtórz ten proces dla pozostałych pików kalibranta.
    UWAGA: Aby uzyskać najwyższą dokładność i precyzję kalibracji, umieść próbkę analizytu i kalibranta jak najbliżej siebie na płytce docelowej, ponieważ niewielkie różnice w wysokości płytki mogą wpływać na dokładność kalibracji.
  7. Ponownie pozyskaj widmo analizytu po skalibrowaniu skali mas dla zoptymalizowanych parametrów akwizycji.

4. Analiza i interpretacja danych

  1. Wybór pików
    1. Otwórz widmo analizowanego związku w oprogramowaniu do analizy danych (FlexAnalysis).
    2. Przybliż wybrany pik, aby sprawdzić, czy osiągnięto rozdzielczość izotopową, wybierając przycisk Zoom in X-Range.
    3. Naciśnij Mass List | Find, aby wybrać piki. Jeśli pik monoizotopowy jest rozdzielony, wybierz pierwszy pik w rozkładzie izotopowym, aby określić jego masę zgodnie z protokołem wyboru piku monoizotopowego. Jeśli pik monoizotopowy nie jest rozdzielony, zastosuj protokół wyboru piku dla masy średniej i wyznacz średnią masę całego rozkładu izotopowego.
    4. Kontynuuj proces wyboru pików dla każdego n-meru w rozkładzie polimeru.
  2. Charakterystyka polimeru i obliczenia analizy grup końcowych
    UWAGA: Prawidłowo stosowana metoda MALDI-TOF MS może dostarczyć cennych i dokładnych danych do obliczeń rozkładu mas polimerów. Należy pamiętać, że dane o rozkładzie mas są dokładne tylko wtedy, gdy dyspersyjność próbki polimeru jest stosunkowo niska (np. w przybliżeniu Đ=1,3 lub mniej).
    1. Oblicz średnią liczbową masę cząsteczkową, czyli średnią masową w stosunku do liczby moli każdej frakcji masowej, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-3
      gdzie Ni = liczba cząsteczek o określonej masie cząsteczkowej, a Mi = określona masa cząsteczkowa tych cząsteczek.
    2. Oblicz średnią wagową masę cząsteczkową, czyli średnią masową w stosunku do wagi każdej frakcji masowej, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-4
      gdzie N i = liczba cząsteczek o określonej masie cząsteczkowej, a M i = określona masa cząsteczkowa tych cząsteczek.
    3. Po obliczeniu Mw oraz Mn, określ szerokość rozkładu masy cząsteczkowej za pomocą stosunku Mw/Mn, który nazywany jest dyspersyjnością, Đ.
    4. Najbardziej unikalną i potężną cechą analizy danych MALDI-TOF MS jest możliwość określenia lub potwierdzenia grup końcowych homopolimerów. Wyznacz grupę końcową, przekształcając poniższy wzór dla obserwowanej masy n-meru w widmie masowym (Mn-mer):
      Mn-mer = n(MRU ) + MEG1 + MEG2 + Mion
      gdzie n = stopień polimeryzacji,
      MEG1 = masa grupy końcowej α,
      MEG2 = masa grupy końcowej ω,
      MRU = masa jednostki powtarzalnej polimeru,
      a Mion = masa jonu tworzącego kompleks z polimerem.

Wyniki

Próbka 1: Próbkę poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru kwasu octowego (Mn = 5000) (Rycina 3) przeanalizowano, stosując trifluoroacetylan potasu jako czynnik kationizujący oraz HCCA jako matrycę. Widmo wykazało oczekiwane addukty K+ oraz addukty powstałe z pozostałości Na+.

Analiza MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 3) kwasu octowego 2-aminoetylowego eteru poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000). Ponieważ pik monoizotopowy (składający się wyłącznie z najliczniejszych izotopów pierwiastkowych, mianowicie 12C, 1H 16O i 14N) nie jest wystarczająco rozdzielony, aby umożliwić jego identyfikację, zastosowano protokół wyboru piku (pick peaking), który określa średnią masę w całym rozkładzie izotopowym dla każdego piku n-meru. Podobnie, wszystkie obliczenia teoretyczne zostały wykonane z użyciem mas średnich, a nie monoizotopowych dla każdego pierwiastka. Wykorzystując równania z kroku 4, za pomocą oprogramowania analitycznego obliczono następujące parametry rozkładu masy polimeru: Mn: 4700, Mw: 4710, Đ: 1.00.

W celu potwierdzenia tożsamości grup końcowych do dalszej analizy wybrano pojedynczy n-mer (104) (Rycina 4). Podobnie jak w przypadku obliczeń rozkładu masy, ze względu na brak możliwości rozdzielenia piku monoizotopowego, do kolejnych obliczeń wykorzystano średnie wartości masy. Teoretyczna wartość masy 104-meru poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylu eteru kwasu octowego składa się z masy jednostek powtarzalnych (44,0530 × 104) oraz masy grupy końcowej α-aminowej (+ 16,02300) i masy grupy końcowej ω-karboksylowej (+ 59,0440) oraz masy kationu potasu (+ 39,09775), co daje całkowitą masę 104-meru wynoszącą 4695,67675. Obserwowana wartość masy dla 104-meru + K+ wynosi 4695,5, co odpowiada wartości teoretycznej, biorąc pod uwagę precyzję obliczeń średniej masy. Seria mniejszych, przesuniętych pików w widmie odpowiada jonizacji polimeru sodem, gdzie teoretyczna wartość masy 104-meru składa się z masy jednostek powtarzalnych (44,0530 × 104), masy grupy końcowej α-aminowej (+ 16,02300), masy grupy końcowej ω-karboksylowej (+ 59,0440) oraz masy kationu sodu (+ 22,98922), co daje całkowitą masę 104-meru 4679,56822. Obserwowana wartość masy dla 104-meru + Na+ wynosi 4679,4, co różni się od wartości teoretycznej jedynie o 0,2 Da. Bardziej dokładne oznaczenia masy grup końcowych można przeprowadzić poprzez pomiar średniej z wielu pików, co zostało omówione w innym opracowaniu11.

Próbka poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru kwasu octowego (Mn = 5000) zachowała wąski rozkład po selektywnej funkcjonalizacji poprzez reakcję (Ryc. 5) z 2,4-dinitrofluorobenzenem (DNFB) (Ryc. 6). Widmo wykazało obecność adduktów sodowych, a jako matryca zastosowano HCCA.

Metoda MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rycina 6) poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru kwasu octowego (Mn = 5000) po modyfikacji DNFB. Z wykorzystaniem równań z kroku 4, oprogramowanie analityczne posłużyło do obliczenia następujących charakterystyk rozkładu masy polimeru: Mn: 4940, Mw: 4950 Đ: 1.00.

Aby ustalić, czy doszło do pełnej funkcjonalizacji eteru kwasu octowego 2-aminoetylowego poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) za pomocą DNFB, do analizy wybrano pojedynczy n-mer z rozkładu (Rysunek 7). Teoretyczna masa funkcjonalizowanego 104-meru eteru kwasu octowego 2-aminoetylowego poli(glikolu etylenowego) przereagowanego z 2,4-dinitrofluorobenzenem składa się z 44,0530 × 104 (masa jednostek powtarzalnych) + 182,115 (masa grupy α-aminowej przereagowanej z 2,4-dinitrofluorobenzenem) + 59,044 (masa grupy karboksylowej) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 4845,66022. Obserwowana wartość masy dla n = 104 wynosi 4845,8, co różni się od wartości teoretycznej o -0,1 Da. Tak bliska zgodność między wartościami teoretycznymi a obserwowanymi wskazuje na całkowitą modyfikację materiału wyjściowego w produkt, lecz co ważniejsze, brak sygnałów powiązanych z materiałem wyjściowym (4811,72722 i 4855,78022 dla tego zakresu mas) lub jakichkolwiek dodatkowych produktów ubocznych potwierdza ilościową, selektywną funkcjonalizację grupy aminowej. Drugi piki obserwuje się przy 4823,8, co odpowiada 103-merowi funkcjonalizowanego polimeru, ale z utratą protonu w końcowej grupie kwasu karboksylowego, która tworzy kompleks z kolejnym jonem sodu, przy teoretycznej masie 4823,58899, co daje różnicę -0,2 Da.

Próbka 2: Próbkę bis(azydku) polioksyetylenu (Mn = 2000) (Rycina 8) przeanalizowano przy użyciu trifluoroacetanu sodu jako czynnika kationizacji oraz HCCA jako matrycy; stwierdzono obecność wyłącznie oczekiwanych adduktów Na+.

Dzięki rozdzielczości osiągniętej w tym niższym zakresie mas, piki monoizotopowe dla każdego z n-merów mogły zostać łatwo rozdzielone, dlatego wybrano protokół wyboru pików monoizotopowych (uśredniający tylko sygnał masy pierwszego piku w rozkładzie izotopowym), a wszystkie odpowiadające im obliczenia oparto na masach monoizotopowych każdego pierwiastka. Analiza MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 8) bis(azydku) polioksyetylenu (Mn = 2000). Wykorzystując równania z kroku 4, za pomocą oprogramowania analitycznego obliczono następujące charakterystyki rozkładu masy polimeru: Mn: 1940, Mw: 1950, Đ: 1,01.

Aby potwierdzić funkcjonalizację grup końcowych, wybrano pojedynczy n-mer (42) (Rycina 9). Podobnie jak w przypadku wyznaczonych powyżej rozkładów mas, zastosowano masy monoizotopowe, ponieważ piki monoizotopowe w rozkładzie izotopowym każdego n-mera były dobrze rozdzielone. Teoretyczna wartość masy 42-meru polioksyetylenowego bis(azydku) odpowiada 44,02621 × 42 (masa jednostek powtarzalnych) + 42,00922 (masa grupy końcowej azydowej) + 70,04052 (masa grupy końcowej azydowoetylowej) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 1984,13978. Obserwowana wartość masy dla n = 42 wynosi 1983,95, co stanowi różnicę 0,19 Da względem wartości teoretycznej. Należy zauważyć, że szczególnie przy wyższych mocach lasera funkcjonalność azydowa może wykazywać fragmenty metastabilne; jednak w tym konkretnym przypadku nie zaobserwowano takiego zjawiska31.

Próbka polioksyetylenobis(azydku) (Mn = 2000) zachowała wąski rozkład po selektywnej funkcjonalizacji za pomocą reakcji cykloaddycji azydkowo-alkinowej katalizowanej miedzią (Rysunek 10) z 1-etynylo-4-fluorobenzenem(EFB) (Rysunek 11>) w celu otrzymania grupy 4-fluorofenylotriazolowej (FPT). W widmach pojawiły się oczekiwane addukty Na+ wynikające ze zastosowania trifluoroacetanu sodu jako czynnika kationizacji oraz HCCA jako matrycy.

Analiza MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rycina 11) bis(azydku) polyoxyetylenu (Mn = 2000) po funkcjonalizacji za pomocą EFB. Wykorzystując równania z kroku 4, przy użyciu oprogramowania analitycznego obliczono następujące charakterystyki polimeru: Mn: 2240, Mw: 2250, Đ: 1,00.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację próbki, w celu analizy wybranego pojedynczego n-meru (42) wykorzystano masy monoizotopowe (Rycina 12). Teoretyczna wartość masy 42-meru bis(azydku)tlenku polietylenu po reakcji z 1-etynylo-4-fluorobenzenem wynosi 44,02621 × 42 (masa jednostek powtarzalnych) + 162,04675 (masa grupy końcowej FPT) + 190,07805 (masa FPT z grupą końcową etylową i 1-etynylo-4-fluorobenzenem) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2224,21484. Obserwowana wartość masy dla n = 42 wynosi 2224,16, co stanowi różnicę 0,05 Da od wartości teoretycznej.

Próbka 3: Próbkę poli(L-laktydu) z grupami końcowymi tiolowymi (Mn = 2500) (Rysunek 13) przeanalizowano przy użyciu trifluoroacetanu sodu jako czynnika kationizacji; wykazano jedynie oczekiwane addukty Na+ oraz DHB jako macierz.

Analiza MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład poli(L-laktydu) zakończonego grupami tiolowymi (Mn = 2500) (Rycina 13). Wykorzystując równania z kroku 4, przeprowadzono analizę programową w celu obliczenia następujących charakterystyk polimeru: Mn: 2310, Mw: 2360, Đ: 1.02.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację próbki, do analizy wybranego pojedynczego n-meru (26) wykorzystano masy monoizotopowe (Rysunek 14). Teoretyczna wartość masy 26-meru poli(L-laktydu) z zakończeniem tiolowym (Mn = 2500) odpowiada wartości 72,02113 × 26 (masa jednostek powtarzalnych) + 17,00274 (masa grupy hydroksylowej) + 61,0112 (masa końcowej grupy ω-tiolowej) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 1973,55254. Obserwowana wartość masy dla n = 26 wynosi 1973,62, co stanowi różnicę -0,07 Da względem wartości teoretycznej. Mniejszy sygnał obserwuje się przy 2045,74, co odpowiada 72,02113 × 27 (masa jednostek powtarzalnych) + 17,00274 (masa końcowej grupy hydroksylowej) + 61,0112 (masa końcowej grupy ω-tiolowej) + 22,98922 (masa kationu sodu). Masa teoretyczna wynosi 2045,57367, co daje różnicę 0,17 względem masy obserwowanej. Ten sygnał o małej intensywności, odpowiadający nieparzystej liczbie jednostek powtarzalnych, świadczy o zachodzeniu transestryfikacji podczas polimeryzacji z otwarciem pierścienia kwasu mlekowego. Trzeci, bardzo niewielki piki obserwuje się przy 2057,73. Wartość ta różni się o -0,14 Da od masy teoretycznej poli(L-laktydu) z końcową grupą kwasu karboksylowego (zamiast grupy tiolowej), której masa teoretyczna wynosi 72,02113 × 27 (masa jednostek powtarzalnych) + 17,00274 (masa końcowej grupy hydroksylowej) + 73,02895 (masa kwasu karboksylowego) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2057,59142. Ta dodatkowa, niewielka domieszka jest prawdopodobnie następstwem inicjacji wodą podczas polimeryzacji z otwarciem pierścienia monomeru laktydu.

Próbka poli(L-laktydu) z grupami końcowymi tiolowymi (Mn = 2500) zachowała wąski rozkład po selektywnej funkcjonalizacji za pomocą reakcji thiol-en (Rysunek 15) z maleimidem (Rysunek 16). Widma wykazały oczekiwane addukty Na+ wynikające z zastosowania trifluoroacetanu sodu jako czynnika kationizującego oraz DHB jako matrycy.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład poly(L-laktydu) zakończonego grupą tiolową (Mn = 2500) po reakcji thiol-ene z maleimidem (Rysunek 16). Przy użyciu równań z kroku 4, oprogramowanie analityczne posłużyło do obliczenia następujących charakterystyk polimeru: Mn: 2310, Mw: 2340, Đ: 1,01. Należy zauważyć, że spadek Mn i Mw w porównaniu z materiałem wyjściowym wynika z błędu jonizacji (jedna z wad metody MALDI-TOF MS). Gdy modyfikacja materiału wyjściowego jest stosunkowo niewielka (~97 Da w tej konkretnej modyfikacji), a dyspersyjność po modyfikacji spada, obliczenia średniej masy cząsteczkowej za pomocą MALDI-TOF MS mogą stać się mniej dokładne.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację poli(L-laktydu) z końcem tiolowym (Mn = 2500) maleimidem za pomocą reakcji thiol-ene, wykorzystano masy monoizotopowe do analizy wybranego pojedynczego n-meru (26) (Rycina 17). Teoretyczna wartość masy dla 26-meru poli(L-laktydu) z końcem tiolowym odpowiada wartości 72,02113 × 26 (masa jednostek powtarzalnych) + 17,00274 (masa końcowej grupy hydroksylowej) + 158,02757 (masa końcowej grupy ω-tiolowej połączonej z maleimidem) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2070,56891. Obserwowana wartość masy dla n = 26 wynosi 2070,54, co stanowi różnicę 0,03 Da w stosunku do wartości teoretycznej. Zaobserwowano również ten sam gatunek jonizowany potasem przy wartości 2086,49, co odpowiada różnicy 0,05 Da od masy teoretycznej. Bardzo mały pik widoczny jest przy 2167,58, co odpowiada 72,02113 × 28 (masa jednostek powtarzalnych) + 17,00274 (masa końcowej grupy hydroksylowej) + 72,02168 (masa anionu karboksylowego) + 22,98922 (masa kationu sodu) + 38,96371 (masa kationu potasu). Masa teoretyczna wynosi 2167,56844, co stanowi różnicę -0,01 w stosunku do masy obserwowanej i wskazuje na tę samą śladową zanieczyszczenie wynikające z inicjacji wodą, które zaobserwowano w materiale wyjściowym. Polimer ten wykazuje jonizację z jednym ekwiwalentem sodu, jednym ekwiwalentem potasu oraz utratą protonu. Utrata protonu kwasu karboksylowego i kompleksowanie z dwoma kationami to powszechny sposób jonizacji polimerów funkcjonalizowanych kwasami monokarboksylowymi. Warto zauważyć, że takie samo przesunięcie masy, jakie obserwuje się dla produktów reakcji thiol-ene, nie występuje w przypadku tego związku z końcem kwasowym, co dodatkowo wskazuje na brak końcowej grupy tiolowej umożliwiającej zajście reakcji funkcjonalizacji.

figure-results-1
Rycina 1: Siatka 3 x 3 służąca do wyznaczania stosunku składników próbki. Dzięki zastosowaniu siatki 3 x 3 próbek można systematycznie zmieniać względne stężenia czynnika kationizującego, anality i matrycy, aby empirycznie wyznaczyć zoptymalizowany sposób przygotowania próbki. Zazwyczaj odbywa się to poprzez utrzymanie jednej z trzech zmiennych na stałym poziomie (15 µL roztworu anality) przy jednoczesnym zwiększaniu ilości pozostałych dwóch składników (czynnika kationizującego (oś y) i matrycy (oś x)) o określony mnożnik (w przedstawionym przykładzie 3-krotnie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Płytka docelowa MALDI-TOF MS. Płytka docelowa MALDI-TOF MS to metalowa płyta, w której próbki do analizy MALDI-TOF MS umieszcza się w poszczególnych dołkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Widmo masowe MALDI-TOF Próbki 1. To pełne widmo pokazuje ogólny rozkład kwasu 2-aminoetylowego eteru glikolu polietylenowego (Mn= 5000) zjonizowanego zarówno Na+ , jak i K+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtarzającej się Próbki 1. Widmo to przedstawia pojedynczą jednostkę powtarzającą się kwasu octowego 2-aminoetylowego eteru poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) w celu analizy grup końcowych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-5
Rycina 5: Schemat reakcji modyfikacji Próbki 1. W celu potwierdzenia grup końcowych materiału wyjściowego, 2-aminoetylowy eter kwasu octowego poli(glikolu etylenowego) poddano reakcji z 2,4-dinitrofluorobenzenem (znanym również jako odczynnik Sangera). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Widmo masowe MALDI-TOF modyfikacji Próbki 1. Pełne widmo przedstawia ogólny rozkład kwasu 2-aminoetylu eteru poli(glikolu etylenowego) octowego (Mn = 5000) funkcjonalizowanego 2,4-dinitrofluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtarzalnej zmodyfikowanej próbki 1. W celu potwierdzenia funkcjonalizacji grup końcowych, widmo to przedstawia pojedynczą jednostkę powtarzalną kwasu 2-aminoetylu eteru poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) po reakcji z 2,4-dinitrofluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Widmo mas MALDI-TOF Próbki 2. Pełne widmo przedstawia ogólny rozkład polioksyetylenowego bis(azydku) (Mn = 2000) jonizowanego za pomocą adduktów Na+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzeniowej Próbki 2. Widmo to przedstawia jednostkę powtórzeniową bis-azydku polioksyetylenu (Mn = 2000) w celu potwierdzenia grup końcowych Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Schemat reakcji modyfikacji Próbki 2. Aby potwierdzić grupy końcowe materiału wyjściowego, polioxyetylenowy bis-azydka (Mn = 2000) została poddana reakcji z 1-etynylo-4-fluorobenzenem poprzez cykloaddycję azydku i alkinu katalizowaną miedzią (CuAAC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-11
Rysunek 11: Widmo masowe MALDI-TOF modyfikacji Próbki 2. To pełne widmo przedstawia ogólny rozkład polioksyetylenowego bis(azydku) (Mn = 2000) funkcjonalizowanego 1-etynyl-4-fluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rycina 12: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtarzalnej modyfikacji Próbki 2. Widmo to przedstawia pojedynczą jednostkę powtarzalną bis(azydku) polioksyetylenu (Mn = 2000) poddanego reakcji z 1-etynylo-4-fluorobenzenem poprzez miedziową cykloaddycję azydkowo-alkinową w celu potwierdzenia funkcjonalizacji grup końcowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-13
Rycina 13: Widmo masowe MALDI-TOF próbki 3. To pełne widmo pokazuje całkowity rozkład poli(L-laktydu) z grupami końcowymi tiolowymi (Mn = 2500). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-14
Rysunek 14: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzeniowej Próbki 3. Widmo przedstawia pojedynczą jednostkę powtarzalną poli(L-laktydu) z zakończeniem tiolowym (Mn = 2500) w celu potwierdzenia grup końcowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-15
Rycina 15: Schemat reakcji modyfikacji Próbki 3. Aby potwierdzić grupy końcowe materiału wyjściowego, poli(L-laktyd) z grupami końcowymi tiolowymi (Mn = 2500) poddano reakcji z maleimidem poprzez sprzęganie thiol-ene. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-16
Rysunek 16: Widmo mas MALDI-TOF modyfikacji próbki 3. To pełne widmo pokazuje ogólny rozkład produktu reakcji pomiędzy poli(L-laktydem) z grupą końcową tiolową (Mn = 2500) a maleimidem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-17
Rysunek 17: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzeniowej modyfikacji Próbki 3. W celu potwierdzenia funkcjonalizacji grup końcowych, widmo to przedstawia pojedynczą jednostkę powtórzeniową poli(L-laktydu) z zakończeniem tiolowym (Mn = 2500) po reakcji thiol-ene z maleimidem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Spektrometria mas MALDI-TOF jest nieocenionym narzędziem analitycznym do charakteryzowania polimerów ze względu na jej zdolność do generowania jonów polimerowych w stanie pojedynczo naładowanym i przy minimalnej fragmentacji. Ta technika miękkiej jonizacji wykorzystuje krótkie impulsy laserowe do desorpcji próbek analitu polimerowego w stanie stałym osadzonych w związku matrycowym w celu wytworzenia jonów polimerowych w fazie gazowej. Makrocząsteczki są zwykle jonizowane przez kompleksowanie kationami, które są dodawane do matrycy, aby umożliwić ich analizę za pomocą spektrometrii mas. Te jony wielkocząsteczkowe są następnie przyspieszane przez napięcie ekstrakcyjne, aby wprowadzić je do wolnego od pola obszaru rurki przelotowej, co może umożliwić określenie ich m/z na podstawie czasu ich przelotu między źródłem jonów a detektorem 5,32.

W porównaniu z innymi technikami charakteryzacji polimerów, jakość widm MALDI-TOF MS jest silnie zależna od parametrów pozyskiwania danych i przygotowania próbki. Chociaż nie ma ustalonego wzoru na przygotowanie próbki, zrozumienie funkcji każdego składnika przygotowania próbki pozwala na szybszą optymalizację empiryczną. Najważniejszym czynnikiem w przygotowaniu próbki MALDI jest wybór matrycy, ponieważ kompatybilność matrycy z analitem polimerowym ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia wzbudzonej matrycy generowania pojedynczych, zdesorbowanych makrocząsteczek w stanie zjonizowanym 5,15,17,19. Po wybraniu odpowiedniej matrycy i środków kationizacyjnych należy określić prawidłowy stosunek analitu, matrycy i środka kationizacyjnego. Można to osiągnąć empirycznie, tworząc dwuwymiarową siatkę próbek (rysunek 1) na płytce docelowej MALDI-TOF MS (rysunek 2) ze wzrostem stężenia matrycy na jednej osi i rosnącym stężeniem środka kationizacyjnego na drugiej.

Podobnie jak w przypadku przygotowania próbki MALDI, nie ma ustalonego wzoru na określenie parametrów akwizycji danych; Należy jednak wziąć pod uwagę pewne trendy, aby przyspieszyć optymalizację widmową. Tryb reflektronowy, który zwiększa rozdzielczość, ale zmniejsza ogólny sygnał, jest zwykle wybierany dla niższych zakresów mas (w tych przykładach poniżej 4000 Da), gdzie można osiągnąć rozdzielczość izotopową. W tych przypadkach zastosowano monoizotopowe obliczenia masy i metody wybierania pików. W przypadku próbek polimerów o masach powyżej 4 000 Da zastosowano tryb liniowy z obliczeniami średniej masy i metodami pobierania szczytowego. Aby poprawić rozdzielczość sygnału, napięcia źródła jonów powinny być regulowane w małych przyrostach, zgodnie z ogólnym trendem polimerów o większej masie o większej różnicy napięć (IS1 kontra IS2).

Podczas gdy zoptymalizowane parametry przygotowania i akwizycji próbek mogą zapewnić precyzję, dokładność masy można osiągnąć tylko poprzez skuteczną kalibrację. Czas przelotu dla danej masy może się nieznacznie różnić w odniesieniu do zmiennych parametrów akwizycji, a nawet pozycji płyty, dlatego należy przeprowadzić kalibrację dla każdego zestawu zoptymalizowanych parametrów akwizycji w celu uzyskania dokładnych określeń masy 5,30. Po zoptymalizowaniu parametrów akwizycji i przygotowania próbki, widma powinny zostać skalibrowane przy użyciu dokładnie tych samych warunków.

Ze względu na wyjątkową rozdzielczość i dokładność masy obserwowaną w zoptymalizowanych widmach masowych polimerów MALDI-TOF, technika ta stała się cennym narzędziem uzupełniającym do określania danych dotyczących rozkładu masy polimerów. Jednak jego zdolność do rozdzielania pojedynczych powtarzających się jednostek w rozkładzie masy polimeru zapewnia szczególną przewagę w analizie grup końcowych w porównaniu z innymi technikami charakteryzacji polimerów, takimi jak chromatografia żelowa (GPC) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR). Jest to szczególnie cenne dla określenia wierności reakcji funkcjonalizacji grupy końcowej i ilościowego charakteru reakcji koniugacji grup końcowych. W manuskrypcie tym wykazano zdolność do rozdzielania masy pojedynczych jednostek powtórzeń polimeru z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku, co umożliwia potwierdzenie modyfikacji grup końcowych z wysokim poziomem pewności. Dzięki znacznemu postępowi, jaki dokonał się w ostatnim czasie w dziedzinie precyzyjnej syntezy polimerów, MALDI-TOF MS staje się coraz ważniejszym narzędziem do określania struktury i funkcjonalności makromolekularnej.

Oświadczenia

Autorzy mają interes finansowy związany z kalibrantami sferycznymi użytymi w tym badaniu.

Podziękowania

Autorzy dziękują konsorcjum Smart MAterials Design, Analysis, and Processing (SMATDAP) finansowanemu przez National Science Foundation na mocy umowy o współpracy IIA-1430280 oraz Radę Regentów LA na stypendium dla absolwentów (MEP). Próbki polimerów do tych eksperymentów zostały dostarczone przez MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie jest sponsorowana przez MilliporeSigma.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
polioksyetylenowy bis(azydek) (Mn=2000)MiliporeSigma (Aldrich)689696http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US
poli(glikol etylenowy) 2-amino-etylowy kwas octowy (Mn= 5000)MiliporeSigma (Aldrich)757918 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US
poli(L-laktyd), tiol zakończony (Mn=2500)MilliporeSigma (Aldrich)747386http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US
sferyczny®   peptyd o niskiej zawartościmiliporówSigma (Sigma-Aldrich)PFS20http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US
sferyczny®   podłoże peptydoweMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS21http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US
sferyczne®   peptyd o wysokiejzawartości miliporówSigma (Sigma-Aldrich)PFS22http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US
2,4 dinitrofluorobenzenTCIA5512
maleimidMilliporeSigma (Aldrich)129585http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US
1-etynylofluorobenzen Fisher Scientific766-98-3
trietyloaminaMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)471283
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US N,N,N',N",N"-pentametylodietylenetriaminaMilliporeSigma (Aldrich)369497http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US
Bromek miedzi(I)MiliporeSigma (Aldrich)254185
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US lodowaty kwas octowyFisher ScientificA38212
pirosiarczyn soduMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)13459http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US
trifluorooctan potasuMilliporeSigma (Aldrich)281883 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US
trans-2-[3-(tert-butylofenylo)-2-metylo-2-properyliden]malononitrylMiliporeSigma (Aldrich)727881http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US
kwas a-cyjano-4-hydroksycynamonowyMilliporeSigma (Sigma)C8982http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US
tetrahydrofuranFisher ScientificT425-1
dichlorometanVWR AnalyticalBDH1113-4LG

Bibliografia

  1. Wu, K. J., Odom, R. W. Peer Reviewed: Characterizing Synthetic Polymers by MALDI MS. Anal. Chem. 70, 456A-461A (1998).
  2. Lowe, A. B. Thiol-ene "click" reactions and recent applications in polymer and materials synthesis: a first update. Polym. Chem. 5, 4820-4870 (2014).
  3. Shi, Y., Cao, X., Gao, H. The use of azide-alkyne click chemistry in recent syntheses and applications of polytriazole-based nanostructured polymers. Nanoscale. 8, 4864-4881 (2016).
  4. Lutz, J. F. 1,3-dipolar cycloadditions of azides and alkynes: a universal ligation tool in polymer and materials science. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 1018-1025 (2007).
  5. Montaudo, G., Samperi, F., Montaudo, M. S. Characterization of synthetic polymers by MALDI-MS. Prog. Polym. Sci. 31, 277-357 (2006).
  6. Weidner, S. M., Trimpin, S. Mass spectrometry of synthetic polymers. Anal. Chem. 80, 4349-4361 (2008).
  7. Zhu, H., Yalcin, T., Li, L. Analysis of the accuracy of determining average molecular weights of narrow polydispersity polymers by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectr. 9, 275-281 (1998).
  8. Cortez, M. A., Grayson, S. M. Application of time-dependent MALDI-TOF mass spectral analysis to elucidate chain transfer mechanism during cationic polymerization of oxazoline monomers containing thioethers. Macromolecules. 43, 10152-10156 (2010).
  9. Liu, J., Loewe, R. S., McCullough, R. D. Employing MALDI-MS on poly(alkylthiophenes): analysis of molecular weights, molecular weight distributions, end-group structures, and end-group modifications. Macromolecules. 32, 5777-5785 (1999).
  10. Zhang, B., et al. Determination of polyethylene glycol end group functionalities by combination of selective reactions and characterization by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chim. Acta. 816, 28-40 (2014).
  11. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, M. A., Grayson, S. M. The identification of synthetic homopolymer end groups and verification of their transformations using MALDI-TOF mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 587-611 (2010).
  12. Enjalbal, C., et al. MALDI-TOF MS analysis of soluble PEG based multi-step synthetic reaction mixtures with automated detection of reaction failure. J. Am. Soc. Mass Spectr. 16, 670-678 (2005).
  13. Laurent, B. A., Grayson, S. M. An efficient route to well-defined macrocyclic polymers via "click" cyclization. J. Am. Chem. Soc. 128, 4238-4239 (2006).
  14. Owens, K. G., Hanton, S. Conventional MALDI sample preparation. Maldi Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. Li, L. , John Wiley & Sons, Inc. 129-158 (2009).
  15. Hanton, S. D. Mass spectrometry of polymers and polymer surfaces. Chem. Rev. 101, 527-570 (2001).
  16. Samperi, F., Montaudo, G., Montaudo, M. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of polymers (MALDI-MS). Mass Spectrometry of Polymers. Montaudo, G., Lattimer, R. P. , CRC Press. Ch. 10 419-500 (2001).
  17. Nielen, M. W. F. Maldi time-of-flight mass spectrometry of synthetic polymers. Mass Spectrom. Rev. 18, 309-344 (1999).
  18. NIST, Synthetic Polymer MALDI Recipes Search Form. , Available from: http://maldi.nist.gov/ (2014).
  19. Hanton, S. D., Owens, K. G. Polymer MALDI sample preparation. Mass Spectrometry in Polymer Chemisty. Barner-Kowollik, C., Gründling, T., Falkenhagen, J., Weidner, S. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 119-147 (2011).
  20. Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1044-1050 (1995).
  21. Kaufmann, R., Spengler, B., Lutzenkirchen, F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization. Rapid Commun. Mass Sp. 7, 902-910 (1993).
  22. Mamyrin, B. A., Karataev, V. I., Shmikk, D. V., Zagulin, V. A. The mass-reflectron, a new nonmagnetic time-of-flight mass spectrometer with high resolution. Sov. Phys. JETP. 37, 45(1973).
  23. Belu, A. M., DeSimone, J. M., Linton, R. W., Lange, G. W., Friedman, R. M. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry for polymer characterization. J. Am. Soc. Mass Spectr. 7, 11-24 (1996).
  24. Kaufmann, R., Chaurand, P., Kirsch, D., Spengler, B. Post-source decay and delayed extraction in matrix-assisted laser desorption/ionization-reflectron time-of-flight mass spectrometry. Are there trade-offs? Rapid Commun. Mass Sp. 10, 1199-1208 (1996).
  25. Grayson, S. M., Myers, B. K., Bengtsson, J., Malkoch, M. Advantages of monodisperse and chemically robust "SpheriCal" polyester dendrimers as a "universal" MS calibrant. J. Am. Soc. Mass Spectr. 25, 303-309 (2014).
  26. McEwen, C. N., Larsen, R. S. Accurate mass measurement of proteins using electrospray ionization on a magnetic sector instrument. Rapid Commun. Mass Sp. 6, 173-178 (1992).
  27. Anacleto, J. F., Pleasance, S., Boyd, R. K. Calibration of ion spray mass spectra using cluster ions. J. Mass Spectrom. 27, 660-666 (1992).
  28. Fales, H. M. Calibration of mass ranges up to m/z 10,000 in electrospray mass spectrometers. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 273-276 (1999).
  29. Hop, C. E. C. A. Generation of high molecular weight cluster ions by electrospray ionization; implications for mass calibration. J. Mass Spectrom. 31, 1314-1316 (1996).
  30. Xiang, B., Prado, M. An accurate and clean calibration method for MALDI-MS. J. Biomol. Tech. 21, 116-119 (2010).
  31. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, S. M. MALDI−TOF mass spectral characterization of polymers containing an azide group: evidence of metastable ions. Macromolecules. 43, 6225-6228 (2010).
  32. Zenobi, R. Ionization processes and detection in MALDI-MS of polymers. MALDI Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. Li, L. , John Wiley & Sons, Inc. 9-26 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka polimer wprzygotowanie pr bekakwizycja danychanaliza grup ko cowychdob r matrycys l kationizuj caparametry akwizycjianaliza spektralna
Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.