Artykuł metodologiczny

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

DOI:

10.3791/57174

⸱

10 czerwca 2018

 , 
1Department of Chemistry, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele technik, które można zastosować do charakterystyki syntetycznych homopolimerów, ale niewiele dostarcza tak użytecznych informacji do analizy grup końcowych, jak wspomagana matrycą desorpcja laserowa, czas jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS). W tym samouczku przedstawiono metody optymalizacji przygotowania próbki, akwizycji spektralnej i analizy danych polimerów syntetycznych przy użyciu MALDI-TOF MS. Krytyczne parametry podczas przygotowania próbki obejmują wybór matrycy, identyfikację odpowiedniej soli kationizacyjnej oraz dostrojenie względnych proporcji matrycy, kationu i analitu. Ważne są również parametry akwizycji, takie jak tryb (liniowy lub odbłyśnik), polaryzacja (dodatnia lub ujemna), napięcie przyspieszenia i czas opóźnienia. Biorąc pod uwagę pewną wiedzę na temat chemii zaangażowanej do syntezy polimeru i optymalizacji zarówno parametrów pozyskiwania danych, jak i warunków przygotowania próbki, widma powinny być uzyskiwane z wystarczającą rozdzielczością i dokładnością masy, aby umożliwić jednoznaczne określenie grup końcowych większości homopolimerów (masy poniżej 10 000) oprócz masy jednostki powtórzenia i ogólnego rozkładu masy cząsteczkowej. Chociaż wykazano to na ograniczonym zestawie polimerów, te ogólne techniki mają zastosowanie do znacznie szerszego zakresu polimerów syntetycznych do określania rozkładów masy, chociaż określenie grupy końcowej jest możliwe tylko dla homopolimerów o wąskiej dyspersji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki ulepszeniom w technikach polimeryzacji na żywo, coraz częściej dostępne są precyzyjne polimery z ilościowo funkcjonalizowanymi grupami końcowymi1. Równoczesny rozwój chemii azydkowo-alkinowej i tiolenowej umożliwił niemal ilościowe sprzężenie makrocząsteczek z innymi cząstkami, zapewniając dostęp do szeregu materiałów hybrydowych2,3,4. Potrzebne są jednak precyzyjne techniki analityczne, aby scharakteryzować zarówno materiały wyjściowe, jak i produkty tych reakcji koniugacji polimerów. Spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS) jest cenną techniką analityczną miękkiej jonizacji do charakteryzowania polimerów, ponieważ może generować jony polimerowe w pojedynczym stanie ładunku przy minimalnej fragmentacji5,6. MALDI-TOF MS ma dużą przewagę nad innymi konwencjonalnymi metodami charakteryzowania polimerów, ponieważ może zapewnić widma masowe z rozdzielczością poszczególnych n-merów w rozkładzie masy polimeru. W konsekwencji takie widma mas mogą dostarczyć precyzyjnych informacji o średniej masie cząsteczkowej, powtarzalnej masie jednostkowej i dyspersyjności masy cząsteczkowej7, co z kolei może wyjaśnić konkurencyjne mechanizmy polimeryzacji, takie jak transfer łańcuchowy8. Jednak MALDI-TOF MS jest szczególnie skuteczny w dostarczaniu informacji o grupach końcowych polimerów9,10, które mogą być używane do potwierdzania modyfikacji grupy końcowej10,11 i inne transformacje12 takie jak cyklizacje polimerów11,13. Co równie ważne, stosunkowo niewielka ilość analitu (submikrogramów) wymagana do analizy spektrometrii mas sprawia, że technika ta jest przydatna do charakteryzacji, gdy dostępne są tylko śladowe ilości materiału.

Analizę polimerów metodą MALDI-TOF MS można podzielić na cztery odrębne etapy: przygotowanie próbki, kalibrację instrumentu, akwizycję spektralną i analizę danych. Przygotowanie próbki jest najważniejszym krokiem do generowania zoptymalizowanych widm masowych MALDI-TOF i odbywa się przed wprowadzeniem próbki do urządzenia14,15. Wybór odpowiedniej matrycy o podobnych parametrach rozpuszczalności jak analit polimerowy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości widm masowych MALDI-TOF, a wytyczne dotyczące wyboru matrycy zostały przedstawione gdzie indziej14,15,16,17. W Internecie opublikowano również bazę danych polimerowych "receptur" MALDI na przygotowanie próbek18. W przypadku nowych polimerów do wyboru matrycy można podejść, najpierw rozumiejąc rozpuszczalność polimeru i wybierając matrycę o podobnych parametrach rozpuszczalności14,19. Polimery o wysokim powinowactwie do protonów mogą być protonowane przez większość matryc14 (które często zawierają grupy kwasów karboksylowych), ale dla innych polimerów wymagany jest środek kationizacyjny14. Jony alkaliczne dobrze addukują z substancjami zawierającymi tlen (np. poliestrami i polieterami), natomiast węglowodory nienasycone (np. polistyren) addukują z metalami przejściowymi, takimi jak jony srebra i miedzi14,19. Ponieważ próbki polimerów w tym eksperymencie zawierały atomy tlenu w szkielecie, jako środek kationizacyjny użyto trifluorooctanu sodu lub potasu (TFA). Po wybraniu matrycy i środków kationizacyjnych względne proporcje analitu, kationu i matrycy muszą być starannie zoptymalizowane, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu. W tej procedurze parametry przygotowania próbki zostały już zoptymalizowane, jednak empiryczna procedura optymalizacji próbki (krok 1.4.1., Rysunek 1), która systematycznie zmienia stężenia trzech składników (analitu, matrycy i kationu) jest skuteczna w szybkim określaniu ich optymalnych proporcji.

Akwizycja danych wymaga również optymalizacji wielu parametrów. Do najważniejszych parametrów należą: tryb jonów dodatnich lub ujemnych spektrometru, tryb pracy przyrządu (liniowy kontra reflektor), napięcie przyspieszenia oraz czas opóźnienia ekstrakcji. Innym sposobem na zwiększenie rozdzielczości jest wykorzystanie trybu "reflectron"20,21,22,23. Tryb reflektronowy zasadniczo podwaja tor lotu jonów do detektora, odbijając jony na końcu rurki przelotowej z powrotem w kierunku detektora w pobliżu źródła, jednocześnie ponownie skupiając jony z różnymi pędami, a tym samym zwiększając rozdzielczość, choć zmniejszając siłę sygnału. Ponadto widma o wyższej rozdzielczości można uzyskać poprzez zmniejszenie mocy lasera, co minimalizuje stosunek sygnału do szumu poprzez zmniejszenie liczby i energii zderzeń, a tym samym zmniejszenie fragmentacji i niejednorodności kinetycznych24. Dostrajając wszystkie te parametry, jony mogą być skupione w celu zminimalizowania wpływu jakiejkolwiek niejednorodności pozycji początkowej lub prędkości, która występuje podczas procesu desorpcji laserowej. Gdy parametry akwizycji są zoptymalizowane, rozdzielczość izotopową można często osiągnąć dla jonów o masach przekraczających 10 000 Da, choć zależy to również od długości rurki przelotowej i konstrukcji instrumentu. Większość związków organicznych, które zawierają co najmniej jeden heteroatom, jest podatna na kompleksowanie z kationami alkalicznymi, takimi jak lit, sód i potas. Wiele metali alkalicznych to monoizotopy lub o ograniczonych izotopach, a zatem nie rozszerzają ich dystrybucji.

Podczas gdy parametry instrumentu można dostroić w celu optymalizacji precyzji danych, dokładność danych można osiągnąć tylko dzięki odpowiedniej kalibracji11. Białka i peptydy były pierwotnie używane jako kalibranty ze względu na ich monodyspersyjność i dostępność, ale cierpią z powodu zmiennej stabilności i występowania zanieczyszczeń25. Bardziej opłacalne i stabilne alternatywy obejmują klastry nieorganiczne i polimery polidyspersyjne26,27,28,29. Niestety, te alternatywy charakteryzują się masami rozproszonymi, które komplikują przypisywanie masy, a także mniejszymi masami ogólnie, co czyni je przydatnymi tylko do kalibracji poniżej 10 000 Da. Aby zwalczyć te problemy, Grayson i wsp. 25 opracował oparty na dendrymerach, poliestrowy system kalibracji MS, który jest monodyspersyjny i może pochwalić się zarówno szeroką kompatybilnością matryc i rozpuszczalników, stabilnością trwałości (> 8 lat) i niższymi kosztami produkcji. Opierając się na mocnych stronach tego systemu, został on wybrany jako kaliber do tych eksperymentów.

Istnieją dwa główne typy kalibracji: wewnętrzna i zewnętrzna30. Podczas kalibracji zewnętrznej wzorzec o masach zbliżonych do mas analitu umieszcza się na płytce docelowej MALDI w innej pozycji próbki niż analit, aby wygenerować oddzielne widmo masowe, z którego można wygenerować plik kalibracyjny. Z drugiej strony, zwiększoną dokładność można często osiągnąć dzięki kalibracji wewnętrznej, która polega na zmieszaniu kalibru z analitem w celu uzyskania widma hybrydowego z sygnałami zarówno kalibru, jak i analitu. W procedurze opisanej poniżej została zaimplementowana kalibracja zewnętrzna. Po prawidłowym wykalibrowaniu wagi masowej można uzyskać dokładne dane dotyczące masy analitu. Aby zapewnić jak najdokładniejszą kalibrację, ważne jest, aby akwizycja danych nastąpiła wkrótce po kalibracji.

Na koniec, po uzyskaniu zoptymalizowanych, skalibrowanych zestawów danych, a dane zostały przeanalizowane w celu dostarczenia informacji strukturalnych o próbkach polimerów. Odstępy między n-merami w rozkładzie polimeru mogą zapewnić dokładny pomiar powtarzającej się masy jednostkowej. Średnią liczbową masę cząsteczkową (Mn) i inne obliczenia rozkładu masy (np. Mw (średnia wagowo masa cząsteczkowa) i Đ (dyspersyjność)) można również wyznaczyć na podstawie rozkładu sygnału w widmach masowych (krok 4.2 dla obliczeń). Być może najbardziej unikalne, w przypadku homopolimerów, sumę mas grup końcowych można potwierdzić poprzez określenie przesunięcia rozkładu polimeru w stosunku do masy samych powtarzających się jednostek. Bogate w informacje widma masowe MALDI-TOF dostarczają cennych danych charakterystycznych, które są komplementarne z bardziej tradycyjnymi technikami charakteryzacji polimerów, takimi jak chromatografia wykluczania wielkości, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera i magnetyczny rezonans jądrowy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wszystkie reakcje były przeprowadzane w dygestorium. Prosimy o zapoznanie się ze wszystkimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla wszelkich stosowanych substancji chemicznych i podjęcie odpowiednich środków ostrożności.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych matrycy
    1. Rozpuścić 20 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA) w 1 ml niestabilizowanego tetrahydrofuranu (THF) i wirować aż do rozpuszczenia.
    2. Rozpuścić 20 mg kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) w 1 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego kationów alkalicznych
    1. Rozpuścić 2 mg trifluorooctanu sodu (NaTFA) w 1 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
    2. Rozpuścić 2 mg trifluorooctanu potasu (KTFA) w 1 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
  3. Przygotowanie roztworów podstawowych analitu
    1. Próbka 1: Rozpuścić 2 mg kwasu 2-aminoetylowego eteru poli(etylenowego) i eteru octowego (Mn = 5000) w 0,5 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
    2. Próbka 2: Rozpuścić 2 mg polioksyetylenobis(azydku) (Mn = 2000) w 0,5 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
    3. Próbka 3: Rozpuścić 2 mg poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500) w 0,5 ml THF i wirować aż do rozpuszczenia.
  4. Przygotowanie mieszanin próbek do analizy
    1. Przygotować serię roztworów, mieszając matrycę, analit i roztwór kationowy, zmieniając względne proporcje składników tak, aby uzyskać dziewięć unikalnych mieszanin próbek. Na przykład, utrzymując stałą ilość dodanego roztworu podstawowego matrycy (np. 10 μL), zmieniaj ilość roztworu analitu trzykrotnie (np. 45, 15 i 5 μL), jednocześnie zmieniając ilość roztworu kationowego trzykrotnie (np. 9, 3 i 1 μL). Próbki te efektywnie dają siatkę próbek 3 x 3 z dwiema różnymi zmiennymi stężenia na osiach x i y ( Rysunek 1).
    2. Dla reprezentatywnego przykładu należy połączyć 15 μl roztworu poli(L-laktydu) z 15 μl roztworu DHB i 1 μl roztworu NaTFA.
    3. Odpipetować 1 μl każdej mieszaniny roztworu do pojedynczej studzienki próbki na płytce docelowej MALDI (Rysunek 2). Próbki należy dodawać stopniowo małymi porcjami, aby zapobiec wypływaniu próbki z dołka próbki, pozwalając każdej podwielokrotności odparować do sucha przed dodaniem dodatkowej próbki.
      UWAGA: W przypadku rozpuszczalników o wyższej temperaturze wrzenia może być konieczne użycie pistoletu pneumatycznego w celu przyspieszenia parowania rozpuszczalnika, chociaż należy zachować ostrożność, aby uniknąć podgrzewania płytki próbki, co może spowodować jej wypaczenie.
  5. Przygotowanie próbek wzorcowych do kalibracji
    1. Przygotuj wzorce kalibracyjne, korzystając z sugerowanego protokołu dostawcy.
      UWAGA: Kalibranty dendrymerowe zostały wybrane do tego badania i są dostępne jako czyste dendrymery lub wstępnie zmieszane z matrycą, kalibrem i kationem w zoptymalizowanych proporcjach.

2. Optymalizacja akwizycji danych

  1. Inicjowanie pozyskiwania danych
    1. Otwarte oprogramowanie do akwizycji danych "FlexControl".
    2. Wysuń platformę, aby umożliwić załadowanie płyty docelowej, naciskając przycisk "figure-protocol-1".
    3. Delikatnie umieścić płytkę docelową z załadowanymi próbkami kalibru i analitu na platformie w odpowiedniej orientacji.
    4. Użyj oprogramowania akwizycyjnego, aby wstrzyknąć płytkę celowniczą na platformę, naciskając ponownie przycisk "figure-protocol-2".
    5. Wybierz odpowiednią metodę pozyskiwania danych (metoda akwizycji w trybie pozytywnym), naciskając Plik | Wybierz metodę.
      UWAGA: W przypadku większości próbek polimerów, w tym naszych reprezentatywnych analitów, oczekuje się jonizacji poprzez kompleksowanie z kationem, a zatem najbardziej odpowiednia jest metoda akwizycji w trybie dodatnim. W zależności od instrumentu, dla niższych zakresów mas (500-10 000 Da) lub gdy wymagana jest wyższa rozdzielczość, wybierz plik metody trybu reflektora. W przypadku próbek o większej masie cząsteczkowej lub gdy wymagana jest wyższa czułość sygnału, a dopuszczalna jest niższa rozdzielczość, należy wybrać plik metody w trybie liniowym.
    6. Przed uzyskaniem danych upewnij się, że wybrano odpowiedni zakres mas do zbierania danych — najlepiej byłoby, gdyby zakres mas obejmował połowę najniższej masy w oczekiwanym rozdziale, a także podwójną najwyższą masę w oczekiwanym rozdziale. Sprawdź to, klikając zakładkę Detection (Detekcja) i view Mass Range.
      UWAGA: Pomaga to zapewnić, że sygnał z fragmentów o niższej masie cząsteczkowej lub agregatów o wyższej masie cząsteczkowej (dimerów), które mogą być obecne w próbce, jest uwzględniony w zbiorze danych. Należy również zauważyć, że oligomery matrycowe są często zauważane przy wysokich intensywnościach sygnału w większości widm masowych MALDI-TOF, zapewniając szum o wysokiej intensywności o masach nawet 1000 Da, co komplikuje analizę poniżej tej masy. Chociaż kalibracja będzie wymagana przed uzyskaniem końcowego zestawu danych, dokładny plik kalibracyjny można uzyskać tylko wtedy, gdy stosuje się identyczne parametry akwizycji, jak te zoptymalizowane dla danego analitu. W związku z tym przed kalibracją wymagana jest wstępna optymalizacja widma masowego analitu, a następnie ponowne uzyskanie skalibrowanego widma masowego analitu.
  2. Wstępne pozyskiwanie danych
    1. W oprogramowaniu akwizycyjnym wybierz pozycję na tabliczce celowniczej, która odpowiada żądanemu analitowi.
    2. Zainicjuj zbieranie danych podczas przesuwania celu laserowego wokół próbki, aby zmaksymalizować sygnał. Aby rozpocząć zbieranie danych, naciśnij Start.
      UWAGA: Laser może usunąć matrycę w określonym miejscu po wielokrotnym pobraniu próbki.
    3. Za pomocą suwaka po lewej stronie okna kamery wyreguluj moc lasera tak, aby osiągnąć minimalną moc niezbędną do uzyskania rozdzielczości izotopowej.
      UWAGA: Podczas analizowania wielu próbek w celu potwierdzenia optymalnego stosunku analitu, kationu i matrycy, użyj tej samej mocy lasera na każdej z próbek analitu, aby określić, która próbka wykazuje najlepszy stosunek sygnału do szumu dla tych parametrów akwizycji. Kontynuuj przyszłą optymalizację akwizycji z próbką, która wydaje się wykazywać najlepszy stosunek sygnału do szumu.
  3. Optymalizacja akwizycji danych
    1. Przybliżając pojedynczy pik w środku interesującego nas zakresu masy, zoptymalizuj rozdzielczość, dostosowując różnicę napięć przyspieszenia (dla instrumentów w tym badaniu wiąże się to z dostosowaniem wartości "IS2"), która znajduje się w zakładce Spektrometr.
      UWAGA: Jest to najszybciej optymalizowane poprzez zmianę wartości IS2 w dużych krokach, zwracając uwagę na to, która wartość generuje najlepszą rozdzielczość (tj. najmniejsza pełna szerokość piku przy połowie maksymalnej intensywności sygnału), a następnie dalszą optymalizację wartości IS2 w mniejszych krokach. Zazwyczaj optymalna wartość IS2 jest wyższa (bliższa IS1) dla polimerów o niskiej masie i niższa dla polimerów o dużej masie.
    2. W razie potrzeby zwiększ rozdzielczość za pomocą trybu reflektronu.
      UWAGA: Tryb reflektronowy pozwala na kompensację rozbieżności w prędkości początkowej jonów o tej samej wartości m/z poprzez wymuszenie jonów o większej prędkości i tej samej wartości m/z na dłuższą drogę do detektora. To zwiększenie drogi do detektora pozwala wolniejszym jonom o tej samej wartości m/z dotrzeć do detektora jednocześnie, skutecznie skupiając jony w celu zwiększenia rozdzielczości. Chociaż tryb reflektronowy zazwyczaj poprawia rozdzielczość sygnału, w przypadku próbek o słabym natężeniu sygnału może być wymagany tryb liniowy w celu wizualizacji danych.
    3. Na koniec zoptymalizuj moc lasera, zmniejszając moc lasera tak nisko, jak to możliwe, jednocześnie generując rozsądny stosunek sygnału do szumu (np. stosunek sygnału do szumu około 10).
      UWAGA: Ponieważ wyższe moce lasera zazwyczaj zmniejszają rozdzielczość i mogą indukować fragmentację, widma masowe o najlepszej jakości są uzyskiwane przy użyciu zmniejszonej mocy lasera, ale większej liczby skanów.
    4. Po zoptymalizowaniu parametrów akwizycji zapisz nieskalibrowane widma masowe, wybierając Plik, a następnie Zapisz widmo do pliku jako. W przypadku kalibracji zewnętrznej, przed rozpoczęciem nowej akwizycji w celu wygenerowania skalibrowanego widma masowego analitu należy przeprowadzić nową akwizycję kalibru przy tych identycznych, zoptymalizowanych parametrach.

3. Kalibracja MALDI

  1. Akwizycja widma masy kalibracyjnej
    1. Korzystając z parametrów akwizycji już zoptymalizowanych dla analitu, uzyskaj zoptymalizowane widmo masowe próbki wzorców masy.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zestaw kalibracyjny zawierał jeden wzorzec powyżej zakresu zainteresowania, jeden poniżej i co najmniej jeden w zakresie zainteresowania. Dokładność kalibracji jest najlepsza, jeśli wszystkie parametry akwizycji są identyczne dla obu próbek.
  2. Tworzenie pliku kalibracyjnego
    1. Upewnij się, że każda istniejąca kalibracja została unieważniona lub znajduje się w pozycji, która może zostać nadpisana, naciskając przycisk Anuluj kalibrację na karcie Spektrometr.
    2. Korzystając z tych samych parametrów akwizycji (np. moc lasera, napięcie IS2), przenieś laser do dołka próbki zawierającego kaliber (np. wzorzec dendrymeru, peptyd), wybierając odpowiednią studzienkę za pomocą kursora i uzyskaj widmo, naciskając Start.
  3. Po uzyskaniu wystarczającego sygnału naciśnij Start, aby zakończyć pobieranie danych.
  4. Po uzyskaniu widma masowego kalibru wybierz menu rozwijane Lista kontroli masy na karcie Kalibracja, która odpowiada temu standardowi kalibracji. Odpowiednia lista kontroli masy będzie zawierała masy odniesienia kalibru wybrane za pomocą odpowiedniego kationu.
    UWAGA: Powinny one być dostępne u dostawcy kalibru i należy upewnić się, że używane są wartości masy monoizotopowej, gdy osiągana jest rozdzielczość izotopowa (np. tryb reflektora poniżej m/z = 5000), oraz średnie wartości masy, gdy nie można osiągnąć rozdzielczości izotopowej (np. tryb liniowy powyżej m/z = 5000),
  5. Przed dopasowaniem odpowiedniego piku odniesienia do każdego wybranego piku kalibru upewnij się, że używany jest odpowiedni protokół pobierania pików, wybierając kartę Przetwarzanie.
    UWAGA: Protokoły wybierania pików mogą się różnić w zależności od rozdzielczości spektralnej. W celu obliczenia średniej masy oprogramowanie powinno wziąć pod uwagę średnią masową z całej serii pików izotopowych. W przypadku obliczenia masy monoizotopowej oprogramowanie powinno być ustawione tak, aby obliczało dokładną masę tylko pierwszego piku izotopowego.
  6. Zastosuj masę odniesienia z wykazu kontroli masy do odpowiedniego sygnału dla widma mas kalibru, wybierając obszar na lewo od interesującego nas piku, a następnie klikając odpowiednią masę na liście kontrolnej, aby ją zastosować. Kontynuuj proces dla pozostałych calibrant peaks.
    UWAGA: Aby uzyskać najdokładniejszą i najbardziej precyzyjną kalibrację, należy umieścić próbki analitu i kalibru jak najbliżej siebie na płytce docelowej, ponieważ subtelne zmiany wysokości płytki docelowej mogą wpłynąć na dokładność kalibracji.
  7. Ponownie uzyskaj widmo analitu po skalibrowaniu skali masowej dla zoptymalizowanych parametrów akwizycji.

4. Analiza i interpretacja danych

  1. Szczytowe pobieranie
    1. Otwórz widmo analitu w oprogramowaniu do analizy danych (FlexAnalysis).
    2. Powiększ pik, aby określić, czy osiągnięto rozdzielczość izotopową, wybierając przycisk Powiększ w X-Range.
    3. Lista masowa prasy | Znajdź, aby wybrać szczyty. Jeśli pik monoizotopowy zostanie rozwiązany, wybierz ten pierwszy pik w rozkładzie izotopowym, aby określić jego masę przy użyciu protokołu wybierania pików monoizotopowych. Jeśli pik monoizotopowy nie zostanie rozwiązany, należy użyć protokołu wybierania piku średniej masy i określić średnią masę całego rozkładu izotopowego.
    4. Kontynuuj ten proces pobierania pików dla każdego n-meru w rozkładzie polimeru.
  2. Obliczenia charakterystyki polimerów i analizy grup końcowych
    UWAGA: Przy prawidłowym użytkowaniu MALDI-TOF MS może dostarczyć cennych, dokładnych danych do obliczeń rozkładu masy polimerów. Należy zauważyć, że dane dotyczące rozkładu masy są dokładne tylko wtedy, gdy dyspersyjność próbki polimeru jest stosunkowo niska (np. w przybliżeniu Đ=1,3 lub mniej).
    1. Obliczyć średnią liczbową masę cząsteczkową, średnią masową w odniesieniu do liczby moli każdej frakcji masowej, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-3
      gdzie Ni = liczba cząsteczek o właściwej masie cząsteczkowej, a Mi = właściwa masa cząsteczkowa tych cząsteczek.
    2. Obliczyć średnią wagową masę cząsteczkową, średnią masową w odniesieniu do masy każdej frakcji masowej, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-4
      gdzie N i = liczba cząsteczek o właściwej masie cząsteczkowej, a M i = właściwa masa cząsteczkowa tych cząsteczek.
    3. Po obliczeniu zarówno Mw, jak i Mn określ ilościowo szerokość rozkładu masy cząsteczkowej za pomocą stosunku Mw/Mn, który nazywa się dyspersją, Đ.
    4. Najbardziej unikalną i potężną cechą analizy danych MALDI-TOF MS jest możliwość określenia lub potwierdzenia końcowych grup homopolimerów. Określ grupę końcową, zmieniając następujący wzór na obserwowaną masę n-mera w widmie mas (Mn-mer):
      Mn-mer = n(MRU ) + MEG1 + MEG2 + Mion
      gdzie n = stopień polimeryzacji,
      MEG1 = masa grupy α-końca,
      MEG2 = masa grupy ω-końcowej,
      MRU = masa powtarzającej się jednostki polimeru,
      a jon M = masa jonu, który łączy się z polimerem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbka 1: Próbka kwasu poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru octowego (Mn = 5000) (Rysunek 3) została przeanalizowana przy użyciu trifluorooctanu potasu jako środka kationizacyjnego z HCCA jako matrycą. Widmo wykazało oczekiwane addukty K+, a także te obserwowane z resztkowego Na+.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 3) poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego kwasu octowego (Mn = 5000). Ponieważ pik monoizotopowy (obejmujący wyłącznie najliczniejsze izotopy pierwiastkowe, a mianowicie 12C, 1H, 16O i 14N) nie jest wystarczająco rozdzielczy, aby umożliwić jego identyfikację, stosuje się protokół pikowania kilofów, który określa średnią masę w całym rozkładzie izotopowym dla każdego piku n-merowego. Podobnie, wszystkie obliczenia teoretyczne są określane przy użyciu średnich, a nie monoizotopowych mas dla każdego pierwiastka. Korzystając z równań z kroku 4, użyto oprogramowania analitycznego do obliczenia następujących charakterystyk rozkładu masy polimeru: Mn: 4700, Mw: 4710, Đ: 1,00.

Aby potwierdzić tożsamość grup końcowych, wybrano do dalszej analizy pojedynczą n-mer (104) (Rysunek 4). Podobnie jak w przypadku obliczeń rozkładu masy, ponieważ nie można było określić piku monoizotopowego, do kolejnych obliczeń wykorzystano średnie wartości masy. Teoretyczna wartość masy 104-mera kwasu 2-aminoetylowego eteru octowego z poli(glikolu etylenowego) składa się z masy powtarzających się jednostek (44,0530 × 104) plus masy grupy końcowej α-aminowej (+ 16,02300) i masy grupy końcowej ω-karboksylowej (+ 59,0440) plus masy kationu potasu (+ 39,09775), co daje całkowitą masę 104 merów wynoszącą 4695,67675. Obserwowana wartość masy dla 104-mer + K+ wynosi 4695,5, co odpowiada wartości teoretycznej, biorąc pod uwagę precyzję obliczeń średniej masy. Szereg mniejszych, przesuniętych pików w widmie odpowiada polimerowi jonizującemu sodem, gdzie teoretyczna wartość masy 104-mera składa się z masy powtarzających się jednostek (44,0530 × 104) plus masa grupy końcowej α-aminowej (+ 16,02300) plus masa grupy końcowej ω-karboksylowej (+ 59,0440) plus masa kationu sodu (+ 22,98922), co daje całkowitą masę 104 merów 4679,56822. Obserwowana wartość masy dla 104-mer + Na+ wynosi 4679,4, co różni się tylko o 0,2 Da od wartości teoretycznej. Dokładniejsze wyznaczenia masy grupy końcowej można wyznaczyć, mierząc średnią dla wielu pików, co zostało omówione w innym miejscu11.

Próbka kwasu poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru octowego (Mn = 5000) zachowała swój wąski rozkład, gdy była selektywnie funkcjonalizowana przez reakcję (Rysunek 5) z 2,4-dinitrofluorobenzenem (DNFB) (Rysunek 6). Widmo wykazywało addukty sodu i wykorzystywało HCCA jako matrycę.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 6) poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego kwasu octowego (Mn = 5000) po modyfikacji DNFB. Korzystając z równań z kroku 4, użyto oprogramowania analitycznego do obliczenia następujących charakterystyk rozkładu masy polimeru: Mn: 4940, Mw: 4950 Đ: 1,00.

W celu ustalenia, czy nastąpiła pełna funkcjonalizacja kwasu octowego poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylowego eteru octowego (Mn = 5000), do analizy wybrano indywidualny n-mer rozkładu (Rysunek 7). Masa teoretyczna funkcjonalizowanego 104-meru kwasu 2-aminoetylowego eteru octowego z poli(glikolu etylenowego) przereagowanego z 2,4-dinitrofluorobenzenem składa się z 44,0530 × 104 (masa powtarzających się jednostek) + 182,115 (masa grupy α-aminowej przereagowanej z 2,4-dinitrofluorobenzenem) + 59,044 (masa grupy karboksylowej) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 4845,66022. Obserwowana wartość masy dla n = 104 wynosi 4845,8, co różni się od wartości teoretycznej o -0,1 Da. Ta ścisła zgodność między wartościami teoretycznymi i obserwowanymi wskazuje na całkowitą modyfikację materiału wyjściowego do produktu, ale co ważniejsze, brak sygnałów związanych z materiałem wyjściowym, 4811.72722 i 4855.78022 dla tego zakresu mas, lub jakichkolwiek dodatkowych produktów ubocznych potwierdza ilościową selektywną funkcjonalizację aminy. Drugi pik obserwuje się przy 4823.8, który odpowiada 103-merowi funkcjonalizowanego polimeru, ale z utratą protonu na grupie końcowej kwasu karboksylowego, który łączy się z innym jonem sodu o masie teoretycznej 4823.58899, który ma różnicę -0,2 Da.

Próbka 2: Próbka polioksyetylenowego bis(azydku) (Mn = 2000) (Rysunek 8) została przeanalizowana przy użyciu trifluorooctanu sodu jako środka kationizacyjnego i HCCA jako matrycy i wykazała tylko oczekiwane addukty Na+.

Ze względu na rozdzielczość osiągniętą w tym niższym zakresie mas, monoizotopowe piki dla każdego z n-merów można było łatwo rozwiązać, dlatego wybrano monoizotopowy protokół wybierania pików (uśredniając tylko sygnał masy pierwszego piku w rozkładzie izotopowym) i wszystkie odpowiednie obliczenia wykorzystywały monoizotopowe masy każdego pierwiastka. MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 8) polioksyetylenu bis(azydek) (Mn = 2000). Korzystając z równań z kroku 4, użyto oprogramowania analitycznego do obliczenia następujących charakterystyk rozkładu masy polimeru: Mn:1940, Mw: 1950, Đ: 1.01.

Aby potwierdzić funkcjonalizację grupy końcowej, wybrano indywidualny n-mer (42) (Rysunek 9). Podobnie jak w przypadku rozkładów mas określonych powyżej, zastosowano masy monoizotopowe, ponieważ piki monoizotopowe były dobrze rozdzielone w rozkładzie izotopowym każdego n-mera. Teoretyczna wartość masy 42-mera polioksyetylenu bis(azydku) odpowiada 44,02621 × 42 (masa powtarzających się jednostek) + 42,00922 (masa końcowej grupy azydoowej) + 70,04052 (masa grupy końcowej azydoetylu) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 1984,13978. Obserwowana wartość masy dla n = 42 wynosi 1983,95, czyli o 0,19 Da różną od wartości teoretycznej. Należy zauważyć, że szczególnie przy wyższych mocach lasera funkcja azydku może wykazywać fragmenty metastabilne; Jednak w tym konkretnym przypadku nie zaobserwowano tego31.

Próbka polioksyetylenowego bis(azydku) (Mn = 2000) zachowała swój wąski rozkład, gdy została selektywnie funkcjonalizowana przez katalizowaną miedzią reakcję cykloaddycji azydkowo-alkinowej (Rysunek 10) z 1-etynylo-4-fluorobenzenem(EFB) (Rysunek 11), aby uzyskać grupę 4-fluorofenylotriazolylu (FPT). Widma wykazały oczekiwane addukty Na+ przy użyciu trifluorooctanu sodu jako środka kationizującego i HCCA jako matrycy.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład (Rysunek 11) polioksyetylenowego bis(azydku) (Mn = 2000) po funkcjonalizacji za pomocą EFB. Korzystając z równań z kroku 4, użyto oprogramowania analitycznego do obliczenia następujących charakterystyk polimerów: Mn: 2240, Mw: 2250, Đ: 1,00.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację próbki, do analizy wybranego pojedynczego n-mera (42) użyto mas monoizotopowych (Rysunek 12). Teoretyczna wartość masowa 42-meru polioksyetylenu bis(azydku) przechodzącego reakcję z 1-etynylo-4-fluorobenzenem odpowiada 44,02621 × 42 (masa powtarzających się jednostek) + 162,04675 (masa grupy końcowej FPT) + 190,07805 (masa grupy etylowej FPT z 1-etynylo-4-fluorobenzenem) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2224,21484. Obserwowana wartość masy dla n = 42 wynosi 2224,16, czyli o 0,05 Da różną od wartości teoretycznej.

Próbka 3: Próbka poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500) (Rysunek 13) została przeanalizowana przy użyciu trifluorooctanu sodu jako środka kationizacyjnego i wykazała tylko oczekiwane addukty Na+ i DHB jako matrycę.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500) (Rysunek 13). Korzystając z równań z kroku 4, analiza programu została wykorzystana do obliczenia następujących charakterystyk polimerów: Mn: 2310, Mw: 2360, Đ: 1,02.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację próbki, do analizy wybranego pojedynczego n-mera (26) użyto mas monoizotopowych (Rysunek 14). Teoretyczna wartość masy 26-meru poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500) odpowiada 72,02113 × 26 (masa powtarzających się jednostek) + 17,00274 (masa grupy hydroksylowej) + 61,0112 (masa grupy końcowej ω-tiolu) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 1973,55254. Obserwowana wartość masy dla n = 26 wynosi 1973,62, czyli -0,07 Da różni się od wartości teoretycznej. Mniejszy sygnał obserwuje się przy 2045.74, co odpowiada 72.02113 × 27 (masa powtarzających się jednostek) + 17.00274 (masa hydroksylowej grupy końcowej) + 61.0112 (masa grupy końcowej ω-tiolu) + 22.98922 (masa kationu sodu). Masa teoretyczna wynosi 2045,57367, co stanowi różnicę 0,17 w stosunku do masy obserwowanej. Ta nieparzysta jednostka powtórzeń o małej intensywności wskazuje na transestryfikację podczas polimeryzacji kwasu mlekowego z otwarciem pierścienia. Trzeci, bardzo niewielki szczyt obserwowany jest w 2057,73 roku. Jest to -0,14 Da różne niż teoretyczna masa poli(L-laktydu) z grupą końcową kwasu karboksylowego (a nie grupą końcową tiolu) o masie teoretycznej 72,02113 × 27 (masa powtarzających się jednostek) + 17,00274 (masa hydroksylowej grupy końcowej) + 73,02895 (masa kwasu karboksylowego) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2057,59142. To dodatkowe drobne zanieczyszczenie jest prawdopodobnie konsekwencją inicjacji z wody podczas polimeryzacji monomeru laktydu z otwarciem pierścienia.

Próbka poli(L-laktydowa), zakończona tiolem (Mn = 2500) zachowała swój wąski rozkład, gdy została selektywnie funkcjonalizowana przez reakcję tiolowo-enową (Rysunek 15) z maleimidem (Rysunek 16). Widma wykazały oczekiwane addukty Na+ przy użyciu trifluorooctanu sodu jako środka kationizacyjnego i DHB jako matrycy.

MALDI-TOF MS potwierdza wąski rozkład poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500) po reakcji tiol-en z maleimidem (Rysunek 16). Korzystając z równań z kroku 4, użyto oprogramowania analitycznego do obliczenia następujących charakterystyk polimerów: Mn: 2310, Mw: 2340, Đ: 1,01. Należy zauważyć, że spadek Mn i Mw porównaniu z materiałem wyjściowym wynika z odchylenia jonizacyjnego (jedna z wad MALDI-TOF MS). Gdy modyfikacja materiału wyjściowego jest stosunkowo niewielka (~97 Da w tej konkretnej modyfikacji), a dyspersja zmniejsza się po modyfikacji, obliczenia MALDI-TOF MS średniej masy cząsteczkowej mogą stać się mniej dokładne.

Aby potwierdzić pełną funkcjonalizację poli(L-laktydu), tiolu zakończonego (Mn = 2500) maleimidem poprzez reakcję tiol-en, do analizy wybranego pojedynczego n-meru (26) > Teoretyczna wartość masy 26-merowego tiolu zakończonego poli(L-laktydem) odpowiada 72,02113 × 26 (masa powtarzających się jednostek) + 17,00274 (masa hydroksylowej grupy końcowej) + 158,02757 (masa grupy końcowej ω-tiolowej połączonej z maleimidem) + 22,98922 (masa kationu sodu) = 2070,56891. Obserwowana wartość masy dla n = 26 wynosi 2070,54, czyli o 0,03 Da różną od wartości teoretycznej. Ten sam gatunek jonizujący potasem obserwuje się również przy 2086,49, co odpowiada różnicy 0,05 Da od masy teoretycznej. Bardzo mały pik obserwuje się przy 2167.58, co odpowiada 72.02113 × 28 (masa powtarzających się jednostek) + 17.00274 (masa hydroksylowej grupy końcowej) + 72.02168 (masa anionu karboksylowego) + 22.98922 (masa kationu sodu) + 38.96371 (masa kationu potasu). Masa teoretyczna wynosi 2167,56844, co stanowi różnicę -0,01 w stosunku do obserwowanej masy i wskazuje na takie samo śladowe zanieczyszczenie spowodowane inicjacją wody, które zaobserwowano w materiale wyjściowym. Polimer ten wykazuje jonizację z jednym odpowiednikiem sodu, jednym z potasu i utratą protonu. Utrata protonu kwasu karboksylowego i kompleksowanie z dwoma kationami jest powszechnym sposobem jonizacji polimerów funkcjonalizowanych kwasem monokarboksylowym. Ważne jest, aby zauważyć, że to samo przesunięcie masy, które obserwuje się w przypadku produktów reakcji tiol-en, nie występuje w przypadku tego związku zakończonego kwasem karboksylowym, co dodatkowo wskazuje, że brakowało mu grupy końcowej tiolu, aby przejść reakcję funkcjonalizacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Siatka 3 x 3 do oznaczania proporcji próbki. Korzystając z siatki próbek 3 x 3, względne stężenia matrycy czynnika kationizacyjnego-analitu można systematycznie zmieniać, aby empirycznie określić zoptymalizowane przygotowanie próbki. Zwykle odbywa się to poprzez utrzymanie jednej z trzech zmiennych na stałym poziomie (15 μl roztworu analitu) przy jednoczesnym zwiększaniu ilości pozostałych dwóch składników (czynnika kationizacyjnego (oś y) i macierzy (oś x)) o wielokrotność zbioru (3-krotnie w przedstawionym przykładzie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Tarcza celownicza MALDI-TOF MS. Płytka docelowa MALDI-TOF MS jest metalową płytką, która utrzymuje próbki MALD-TOF MS w indywidualnych dołkach do analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Widmo masowe MALDI-TOF próbki 1. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład kwasu 2-aminoetylowego eteru octowego poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) zjonizowanego zarówno Na+, jak i K+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej powtarzalnej jednostki próbki 1. Widmo to pokazuje pojedynczą powtarzającą się jednostkę kwasu 2-aminoetylowego eteru octowego z poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) do analizy grupy końcowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Schemat reakcji dla modyfikacji próbki 1. Aby potwierdzić grupy końcowe materiału wyjściowego, kwas 2-aminoetylowy eteru octowego z poli(glikolu etylenowego) poddano reakcji z 2,4-dinitrofluorobenzenem (znanym również jako odczynnik Sangera). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Widmo masowe MALDI-TOF modyfikacji próbki 1. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład kwasu 2-aminoetylowego eteru octowego z poli(glikolu etylenowego) (Mn = 5000) funkcjonalizowanego 2,4-dinitrofluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzeniowej modyfikacji próbki 1. W celu potwierdzenia funkcjonalizacji grupy końcowej, widmo to pokazuje pojedynczą powtarzającą się jednostkę kwasu octowego z poli(glikolu etylenowego) 2-aminoetylu eteru octowego (Mn = 5000) po reakcji z 2,4-dinitrofluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Widmo masowe MALDI-TOF próbki 2. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład polioksyetylenobis(azydku)(Mn = 2000) zjonizowanego adduktami Na+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzenia próbki 2. To widmo pokazuje powtarzającą się jednostkę polioksyetylenowo-bis-azydku (Mn = 2000) w celu potwierdzenia grup końcowych Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Schemat reakcji dla modyfikacji próbki 2. Aby potwierdzić grupy końcowe materiału wyjściowego, polioksyetylen-bis-azydek (Mn = 2000) poddano reakcji z 1-etynylo-4-fluorobenzenem poprzez katalizowaną miedzią cyklodydcję azydkowo-alkinową (CuAAC). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Widmo masowe MALDI-TOF modyfikacji próbki 2. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład polioksyetylenobis(azydku) (Mn = 2000) funkcjonalizowanego 1-etynylo-4-fluorobenzenem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzenia modyfikacji próbki 2. Widmo to pokazuje pojedynczą powtarzającą się jednostkę polioksyetylenobis(azydku) (Mn = 2000) przereagowaną z 1-etynylo-4-fluorobenzenem przez katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkinową w celu potwierdzenia funkcjonalizacji grupy końcowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Widmo masowe MALDI-TOF próbki 3. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład poli(L-laktydu), zakończonego tiolem (Mn = 2500). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-14
Rysunek 14: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzenia próbki 3. Widmo pokazuje pojedynczą powtarzającą się jednostkę poli(L-laktydu), zakończoną tiolem (Mn = 2500) w celu potwierdzenia grup końcowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-15
Rysunek 15: Schemat reakcji dla modyfikacji próbki 3. Aby potwierdzić grupy końcowe materiału wyjściowego, poli(L-laktyd) zakończony tiolem (Mn = 2500) poddano reakcji z maleimidem za pośrednictwem sprzężenia tiol-en. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-16
Rysunek 16: Widmo masowe MALDI-TOF modyfikacji próbki 3. To pełne spektrum pokazuje ogólny rozkład produktu reakcji między poli(L-laktydem), zakończonym tiolem (Mn = 2500) i maleimidem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-17
Rysunek 17: Widmo masowe MALDI-TOF pojedynczej jednostki powtórzenia modyfikacji próbki 3. W celu potwierdzenia funkcjonalizacji grupy końcowej, widmo to pokazuje pojedynczą powtarzającą się jednostkę poli(L-laktydu), zakończoną tiolem (Mn = 2500) po reakcji tiol-en z maleimidem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas MALDI-TOF jest nieocenionym narzędziem analitycznym do charakteryzowania polimerów ze względu na jej zdolność do generowania jonów polimerowych w stanie pojedynczo naładowanym i przy minimalnej fragmentacji. Ta technika miękkiej jonizacji wykorzystuje krótkie impulsy laserowe do desorpcji próbek analitu polimerowego w stanie stałym osadzonych w związku matrycowym w celu wytworzenia jonów polimerowych w fazie gazowej. Makrocząsteczki są zwykle jonizowane przez kompleksowanie kationami, które są dodawane do matrycy, aby umożliwić ich analizę za pomocą spektrometrii mas. Te jony wielkocząsteczkowe są następnie przyspieszane przez napięcie ekstrakcyjne, aby wprowadzić je do wolnego od pola obszaru rurki przelotowej, co może umożliwić określenie ich m/z na podstawie czasu ich przelotu między źródłem jonów a detektorem 5,32.

W porównaniu z innymi technikami charakteryzacji polimerów, jakość widm MALDI-TOF MS jest silnie zależna od parametrów pozyskiwania danych i przygotowania próbki. Chociaż nie ma ustalonego wzoru na przygotowanie próbki, zrozumienie funkcji każdego składnika przygotowania próbki pozwala na szybszą optymalizację empiryczną. Najważniejszym czynnikiem w przygotowaniu próbki MALDI jest wybór matrycy, ponieważ kompatybilność matrycy z analitem polimerowym ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia wzbudzonej matrycy generowania pojedynczych, zdesorbowanych makrocząsteczek w stanie zjonizowanym 5,15,17,19. Po wybraniu odpowiedniej matrycy i środków kationizacyjnych należy określić prawidłowy stosunek analitu, matrycy i środka kationizacyjnego. Można to osiągnąć empirycznie, tworząc dwuwymiarową siatkę próbek (rysunek 1) na płytce docelowej MALDI-TOF MS (rysunek 2) ze wzrostem stężenia matrycy na jednej osi i rosnącym stężeniem środka kationizacyjnego na drugiej.

Podobnie jak w przypadku przygotowania próbki MALDI, nie ma ustalonego wzoru na określenie parametrów akwizycji danych; Należy jednak wziąć pod uwagę pewne trendy, aby przyspieszyć optymalizację widmową. Tryb reflektronowy, który zwiększa rozdzielczość, ale zmniejsza ogólny sygnał, jest zwykle wybierany dla niższych zakresów mas (w tych przykładach poniżej 4000 Da), gdzie można osiągnąć rozdzielczość izotopową. W tych przypadkach zastosowano monoizotopowe obliczenia masy i metody wybierania pików. W przypadku próbek polimerów o masach powyżej 4 000 Da zastosowano tryb liniowy z obliczeniami średniej masy i metodami pobierania szczytowego. Aby poprawić rozdzielczość sygnału, napięcia źródła jonów powinny być regulowane w małych przyrostach, zgodnie z ogólnym trendem polimerów o większej masie o większej różnicy napięć (IS1 kontra IS2).

Podczas gdy zoptymalizowane parametry przygotowania i akwizycji próbek mogą zapewnić precyzję, dokładność masy można osiągnąć tylko poprzez skuteczną kalibrację. Czas przelotu dla danej masy może się nieznacznie różnić w odniesieniu do zmiennych parametrów akwizycji, a nawet pozycji płyty, dlatego należy przeprowadzić kalibrację dla każdego zestawu zoptymalizowanych parametrów akwizycji w celu uzyskania dokładnych określeń masy 5,30. Po zoptymalizowaniu parametrów akwizycji i przygotowania próbki, widma powinny zostać skalibrowane przy użyciu dokładnie tych samych warunków.

Ze względu na wyjątkową rozdzielczość i dokładność masy obserwowaną w zoptymalizowanych widmach masowych polimerów MALDI-TOF, technika ta stała się cennym narzędziem uzupełniającym do określania danych dotyczących rozkładu masy polimerów. Jednak jego zdolność do rozdzielania pojedynczych powtarzających się jednostek w rozkładzie masy polimeru zapewnia szczególną przewagę w analizie grup końcowych w porównaniu z innymi technikami charakteryzacji polimerów, takimi jak chromatografia żelowa (GPC) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR). Jest to szczególnie cenne dla określenia wierności reakcji funkcjonalizacji grupy końcowej i ilościowego charakteru reakcji koniugacji grup końcowych. W manuskrypcie tym wykazano zdolność do rozdzielania masy pojedynczych jednostek powtórzeń polimeru z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku, co umożliwia potwierdzenie modyfikacji grup końcowych z wysokim poziomem pewności. Dzięki znacznemu postępowi, jaki dokonał się w ostatnim czasie w dziedzinie precyzyjnej syntezy polimerów, MALDI-TOF MS staje się coraz ważniejszym narzędziem do określania struktury i funkcjonalności makromolekularnej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy mają interes finansowy związany z kalibrantami sferycznymi użytymi w tym badaniu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują konsorcjum Smart MAterials Design, Analysis, and Processing (SMATDAP) finansowanemu przez National Science Foundation na mocy umowy o współpracy IIA-1430280 oraz Radę Regentów LA na stypendium dla absolwentów (MEP). Próbki polimerów do tych eksperymentów zostały dostarczone przez MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie jest sponsorowana przez MilliporeSigma.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
polioksyetylenowy bis(azydek) (Mn=2000)MiliporeSigma (Aldrich)689696http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US
poli(glikol etylenowy) 2-amino-etylowy kwas octowy (Mn= 5000)MiliporeSigma (Aldrich)757918 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US
poli(L-laktyd), tiol zakończony (Mn=2500)MilliporeSigma (Aldrich)747386http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US
sferyczny®   peptyd o niskiej zawartościmiliporówSigma (Sigma-Aldrich)PFS20http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US
sferyczny®   podłoże peptydoweMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS21http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US
sferyczne®   peptyd o wysokiejzawartości miliporówSigma (Sigma-Aldrich)PFS22http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US
2,4 dinitrofluorobenzenTCIA5512
maleimidMilliporeSigma (Aldrich)129585http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US
1-etynylofluorobenzen Fisher Scientific766-98-3
trietyloaminaMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)471283
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US N,N,N',N",N"-pentametylodietylenetriaminaMilliporeSigma (Aldrich)369497http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US
Bromek miedzi(I)MiliporeSigma (Aldrich)254185
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US lodowaty kwas octowyFisher ScientificA38212
pirosiarczyn soduMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)13459http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US
trifluorooctan potasuMilliporeSigma (Aldrich)281883 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US
trans-2-[3-(tert-butylofenylo)-2-metylo-2-properyliden]malononitrylMiliporeSigma (Aldrich)727881http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US
kwas a-cyjano-4-hydroksycynamonowyMilliporeSigma (Sigma)C8982http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US
tetrahydrofuranFisher ScientificT425-1
dichlorometanVWR AnalyticalBDH1113-4LG

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, K. J., Odom, R. W. Peer Reviewed: Characterizing Synthetic Polymers by MALDI MS. Anal. Chem. 70, 456A-461A (1998).
  2. Lowe, A. B. Thiol-ene "click" reactions and recent applications in polymer and materials synthesis: a first update. Polym. Chem. 5, 4820-4870 (2014).
  3. Shi, Y., Cao, X., Gao, H. The use of azide-alkyne click chemistry in recent syntheses and applications of polytriazole-based nanostructured polymers. Nanoscale. 8, 4864-4881 (2016).
  4. Lutz, J. F. 1,3-dipolar cycloadditions of azides and alkynes: a universal ligation tool in polymer and materials science. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 1018-1025 (2007).
  5. Montaudo, G., Samperi, F., Montaudo, M. S. Characterization of synthetic polymers by MALDI-MS. Prog. Polym. Sci. 31, 277-357 (2006).
  6. Weidner, S. M., Trimpin, S. Mass spectrometry of synthetic polymers. Anal. Chem. 80, 4349-4361 (2008).
  7. Zhu, H., Yalcin, T., Li, L. Analysis of the accuracy of determining average molecular weights of narrow polydispersity polymers by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectr. 9, 275-281 (1998).
  8. Cortez, M. A., Grayson, S. M. Application of time-dependent MALDI-TOF mass spectral analysis to elucidate chain transfer mechanism during cationic polymerization of oxazoline monomers containing thioethers. Macromolecules. 43, 10152-10156 (2010).
  9. Liu, J., Loewe, R. S., McCullough, R. D. Employing MALDI-MS on poly(alkylthiophenes): analysis of molecular weights, molecular weight distributions, end-group structures, and end-group modifications. Macromolecules. 32, 5777-5785 (1999).
  10. Zhang, B., et al. Determination of polyethylene glycol end group functionalities by combination of selective reactions and characterization by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chim. Acta. 816, 28-40 (2014).
  11. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, M. A., Grayson, S. M. The identification of synthetic homopolymer end groups and verification of their transformations using MALDI-TOF mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 587-611 (2010).
  12. Enjalbal, C., et al. MALDI-TOF MS analysis of soluble PEG based multi-step synthetic reaction mixtures with automated detection of reaction failure. J. Am. Soc. Mass Spectr. 16, 670-678 (2005).
  13. Laurent, B. A., Grayson, S. M. An efficient route to well-defined macrocyclic polymers via "click" cyclization. J. Am. Chem. Soc. 128, 4238-4239 (2006).
  14. Owens, K. G., Hanton, S. Conventional MALDI sample preparation. Maldi Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. Li, L. , John Wiley & Sons, Inc. 129-158 (2009).
  15. Hanton, S. D. Mass spectrometry of polymers and polymer surfaces. Chem. Rev. 101, 527-570 (2001).
  16. Samperi, F., Montaudo, G., Montaudo, M. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of polymers (MALDI-MS). Mass Spectrometry of Polymers. Montaudo, G., Lattimer, R. P. , CRC Press. Ch. 10 419-500 (2001).
  17. Nielen, M. W. F. Maldi time-of-flight mass spectrometry of synthetic polymers. Mass Spectrom. Rev. 18, 309-344 (1999).
  18. NIST, Synthetic Polymer MALDI Recipes Search Form. , Available from: http://maldi.nist.gov/ (2014).
  19. Hanton, S. D., Owens, K. G. Polymer MALDI sample preparation. Mass Spectrometry in Polymer Chemisty. Barner-Kowollik, C., Gründling, T., Falkenhagen, J., Weidner, S. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 119-147 (2011).
  20. Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1044-1050 (1995).
  21. Kaufmann, R., Spengler, B., Lutzenkirchen, F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization. Rapid Commun. Mass Sp. 7, 902-910 (1993).
  22. Mamyrin, B. A., Karataev, V. I., Shmikk, D. V., Zagulin, V. A. The mass-reflectron, a new nonmagnetic time-of-flight mass spectrometer with high resolution. Sov. Phys. JETP. 37, 45(1973).
  23. Belu, A. M., DeSimone, J. M., Linton, R. W., Lange, G. W., Friedman, R. M. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry for polymer characterization. J. Am. Soc. Mass Spectr. 7, 11-24 (1996).
  24. Kaufmann, R., Chaurand, P., Kirsch, D., Spengler, B. Post-source decay and delayed extraction in matrix-assisted laser desorption/ionization-reflectron time-of-flight mass spectrometry. Are there trade-offs? Rapid Commun. Mass Sp. 10, 1199-1208 (1996).
  25. Grayson, S. M., Myers, B. K., Bengtsson, J., Malkoch, M. Advantages of monodisperse and chemically robust "SpheriCal" polyester dendrimers as a "universal" MS calibrant. J. Am. Soc. Mass Spectr. 25, 303-309 (2014).
  26. McEwen, C. N., Larsen, R. S. Accurate mass measurement of proteins using electrospray ionization on a magnetic sector instrument. Rapid Commun. Mass Sp. 6, 173-178 (1992).
  27. Anacleto, J. F., Pleasance, S., Boyd, R. K. Calibration of ion spray mass spectra using cluster ions. J. Mass Spectrom. 27, 660-666 (1992).
  28. Fales, H. M. Calibration of mass ranges up to m/z 10,000 in electrospray mass spectrometers. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 273-276 (1999).
  29. Hop, C. E. C. A. Generation of high molecular weight cluster ions by electrospray ionization; implications for mass calibration. J. Mass Spectrom. 31, 1314-1316 (1996).
  30. Xiang, B., Prado, M. An accurate and clean calibration method for MALDI-MS. J. Biomol. Tech. 21, 116-119 (2010).
  31. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, S. M. MALDI−TOF mass spectral characterization of polymers containing an azide group: evidence of metastable ions. Macromolecules. 43, 6225-6228 (2010).
  32. Zenobi, R. Ionization processes and detection in MALDI-MS of polymers. MALDI Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. Li, L. , John Wiley & Sons, Inc. 9-26 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Charakterystyka polimer wprzygotowanie pr bekakwizycja danychanaliza grup ko cowychdob r matrycys l kationizuj caparametry akwizycjianaliza spektralna

Powiązane artykuły